CN105331572B - 一种发酵高产dha的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵高产DHA的方法，该方法包括利用含强氧化剂的培养基驯化裂殖壶菌菌种，利用发酵培养基培养经驯化的菌种，以此发酵高产DHA。其中，驯化后的菌种经发酵，DHA含量到达57.9%，产油效率达到0.492g/L/h，分别比对照提高了约20%，55%。本驯化方法不涉及基因工程方法，不危害环境，不增加人力物力，简单、方便且具有经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及裂殖壶菌菌种的驯化以及利用驯化的菌种进行DHA生产的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(22:6n-3)，简称DHA，是ω-3系列中一种重要的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)。DHA不仅是婴幼儿大脑、视觉正常发育的必需物质，而且还具有延缓老年人大脑和视觉功能衰退和降低血脂、抑制血栓生成、抗自身免疫反应、抑制肿瘤等功效，因此被誉为“脑黄金”。目前，DHA已广泛用于婴幼儿食品、保健食品和辅助治疗剂等产品。
目前，传统鱼油来源的DHA油脂由于易受环境、季节等的影响，导致DHA产量有限；而且，鱼油具有胆固醇和其它不饱和脂肪酸含量高，分离纯化困难的缺点。因此，利用微生物发酵制备DHA油脂越来越受到关注。能够合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壶菌、裂殖壶菌、隐甲藻等。而裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)作为海洋真菌，因其具有发酵周期短，生产DHA油脂能力强等的优点，而成为当前微生物发酵产DHA的常用菌种。裂殖壶菌合成的脂肪酸组分较为单一，总脂含量达20％，其中DHA占45％左右，其它不饱和脂肪酸百分率小于1％，因此利用裂殖壶菌生产DHA具有广大的市场前景。
目前，关于微生物发酵产DHA的现有技术主要包括两个方面：1、DHA生产菌株的诱变筛选方法，如中国海洋大学的(海洋真菌裂殖壶菌0UC88的工业应用)(中国专利申请CN200410075426.X)；南京工业大学的一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法及其应用(中国专利申请CN 200910033493.8)等；2、关于培养基的组成，如南京工业大学的一种裂殖壶菌及利用其生产DHA油脂的方法(200910033869.5)等。传统的发酵调控过程难以稳定控制，并且发酵调控主要针对油脂含量的提高，没有从根本上提高DHA含量。而菌种的传统改造主要都通过诱变筛选的方法，此方法由于缺乏针对高DHA含量菌种的筛选培养基，造成筛选工作盲目，因此，菌种筛选工作量较大，而筛选效果却往往不够理想。因此新的菌种选育方法，对提高裂殖壶菌中DHA含量具有重要意义。
发明内容
针对现有方法中，菌种选育过程相对盲目的技术问题。本发明通过提供一种驯化裂殖壶菌的方法，来实现DHA的高产。
具体的，本发明的技术方案为：
一种驯化裂殖壶菌菌种的方法，其中，在驯化培养基中添加了强氧化剂。本发明中，可以理解为，驯化裂殖壶菌的方法通过将裂殖壶菌在含有强氧化剂的培养基中培养驯化实现。
本发明所述的方法，其中，所述驯化培养基配方包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素；其中，碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉；无机盐离子为钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐和钙盐中的任意一种或多种；微量元素为Mn2+、Co2+、Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。
本发明所述的方法，其中，驯化的具体步骤为：
(1)在活化培养基中活化菌种；
(2)在添加强氧化剂的驯化培养基中，接种经活化的菌种，培养生长至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L；
(3)将步骤(2)得到的驯化菌种接入不含强氧化剂的种子培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L；
(4)提高驯化培养中强氧化剂的浓度，接种经步骤(3)得到的驯化菌种，培养生长至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L；
(5)循环步骤(2)、(3)和步骤(4)，直至驯化菌种能够在含有强氧化剂质量浓度为0.1％的驯化培养基中正常生长至细胞干重25g/L。
本发明所述的方法，其中，循环步骤(2)、(3)和步骤(4)的次数为2次以上。对于该循环此次的定义，应理解为，每循环操作培养一次，驯化培养基中强氧化剂的浓度提高一次，直至到最高的强氧化剂浓度。优选为3次，4次，5次，6次。
本发明所述的方法，其中，步骤(2)中第一次添加强氧化剂的初始质量浓度含量为0.01％。
本发明所述的方法，其中，步骤(4)所述循环步骤中，强氧化剂的质量浓度优选依次控制为：0.02％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.1％。
本发明所述的方法，其中，步骤(2)、(3)和步骤(4)中，所述接种的接种量为培养基体积的0.2～2％。
本发明所述的方法，其中，所述强氧化剂为高锰酸钾或过氧化氢。
本发明所述的方法，其中，所述强氧化剂的除菌方式为膜过滤。其中膜过滤的方式即为，将强氧化剂配制为相应浓度要求的溶液，然后通过膜过滤可以去除污染细菌，使得过滤后的溶液符合裂殖壶菌培养的要求。
一种发酵高产DHA的方法，其中，采用上述任一权利所述方法获得的菌株进行DHA发酵、提取，获得含DHA的油脂。即，利用驯化的菌种进行扩大培养发酵，最终获得裂殖壶菌菌体，并提取油脂。对于菌株的选择，可以是能够耐受质量含量0.1％强氧化剂且在培养时，生长细胞干重已经超过25g/L的菌株；也可以是耐受更低强氧化剂质量含量浓度的菌株。
更进一步的，在一个整体优选的方案中，方法包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌菌种的活化
(2)在强氧化剂质量浓度为0.01％的过氧化氢溶液的驯化培养基中，接入活化后的裂殖壶菌菌种；驯化数天，待裂殖壶菌生物量生长至25g/l以上。
(3)将步骤(2)获得的菌种接入不含强氧化剂的种子培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L；
(4)将步骤(3)获得的菌种接入强氧化剂质量浓度为0.02％的过氧化氢溶液的驯化培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L；
(5)如此不断逐步提高强氧化剂添加浓度，重复2,3步骤长期驯化，直到驯化菌种能够在含有0.1％强氧化剂培养基中正常生长，其中，驯化培养基中的强氧化剂浓度依次控制为0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.1％。。
(6)利用能够耐受质量含量0.1％强氧化剂且在培养时，生长细胞干重已经超过25g/L的菌株进行扩大培养发酵，最终获得裂殖壶菌菌体，并提取油脂。
步骤(1)中，原始菌种的活化方法为：将具有合成DHA能力的微生物接种于种子培养基中，25℃培养24小时，待种子生长至对数期。其中，所述的种子培养基包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素，其中碳源为葡萄糖，氮源为酵母粉，无机盐离子为钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐和钙盐中的任意一种或多种，微量元素为Mn2+、Co2+、Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。
步骤(2)中，将活化的种子接入含有0.02％强氧化剂培养基中，接种量为1％-3％(v/v)，25℃培养24小时，过氧化氢的除菌方式为膜过滤。
步骤(4)中，菌种适应强氧化剂环境的指标为种子液干重达到25g/L,
步骤(5)中，发酵方法为：将种子液接种于发酵培养基中，
发酵培养基配比为：葡萄糖80～100g/L、酵母膏4～6g/L、MgSO4·7H2O 3～5g/L、Na2SO46～9g/L、(NH4)2SO42～4g/L、KCl 0.1～0.5g/L、谷氨酸钠17～20g/L、KH2PO42～4g/L。接种量为10％(v/v)，培养条件为25℃～28℃，150rpm～170rpm。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供一种全新的驯化改造菌种的方法，目的性强，效率高。通过驯化得到的菌株生长活力旺盛，耗糖耗氮速率加快，发酵周期短，产油率高，DHA含量比原始菌株提高18.75％，并且驯化后菌株的生理生化稳定，具有稳定的遗传性能，是生产天然DHA的优良藻株。
(2)在实现本发明的过程中，发明人发现，在添加了强氧化剂的培养基中进行裂殖壶菌的培养，其DHA的含量会明显提高，基于此发现，发明人提供了本发明方案。
(3)本发明的技术原理可能在于，在生物体内，DHA作为一种长链多不饱和脂肪酸，具有抗氧化保护细胞的功能。在培养基中添加了强氧化剂后，细胞会主动合成DHA以适应恶劣的环境；同时，只有DHA合成能力强的菌株才能在含有强氧化剂的环境下存活，因此同时达到了筛选高产DHA菌株的目的。
具体实施方式
实施例1本实施例说明菌株的来源以及使用的培养基
菌种为裂殖壶菌HX-308，CCTCC No:M209059，由南京工业大学分离保藏。
活化培养基和种子培养基：葡萄糖20～60g/L、酵母膏2～4g/L、MgCl23～6g/L、CaCl2·2H2O1～4g/L、KH2PO42～4g/L、谷氨酸钠8～12g/L、KCl 1～4g/L、NaCl 15～20g/L、FeCl30.1～0.3g/L、MgSO4·7H2O 1～5g/L。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，可以任选一个浓度进行试验的配置。
驯化种子培养基：葡萄糖20～60g/L、酵母膏2～4g/L、MgCl23～6g/L、CaCl2·2H2O1～4g/L、KH2PO42～4g/L、谷氨酸钠8～12g/L、KCl 1～4g/L、NaCl 15～20g/L、FeCl30.1～0.3g/L、MgSO4·7H2O 1～5g/L，不同浓度的过氧化氢或高锰酸钾。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，选定与本实施例种子培养基一致的配方，但需要另外加入过氧化氢或者高锰酸钾。
发酵培养基：葡萄糖80～100g/L、酵母膏4～6g/L、MgSO4·7H2O 3～5g/L、Na2SO46～9g/L、(NH4)2SO42～4g/L、KCl 0.1～0.5g/L、谷氨酸钠17～20g/L、KH2PO42～4g/L。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，可以任选一个浓度进行试验的配置。
实施例2本实施例说明裂殖壶菌驯化的具体步骤
将具有二十二碳六烯酸产生能力的裂殖壶菌活化一代，活化的方法为：
接种于含有0.02％过氧化氢或高锰酸钾的培养基中，接种量为1％(v/v)，25℃条件下培养24小时。驯化3天，当裂殖壶菌适应了0.02％强氧化剂环境，接入正常培养基中培养一代。再将驯化菌种接入含有0.03％强氧化剂的培养基中，驯化5天，当裂殖壶菌适应了0.03％强氧化剂环境，接入正常培养基中培养一代。再将驯化菌种接入含有0.04％强氧化剂的培养基中，驯化5天。如此不断重复，逐渐提高强氧化剂浓度为0.05％，0.06％,0.07％,0.08％,0.09％,0.1％。当驯化菌种能够在含有0.1％强氧化剂培养基中正常生长时，将驯化菌种接入正常不含强氧化剂的培养基中生长一代，保藏驯化菌株。
实施例3不同驯化浓度的驯化菌株与原始菌种的发酵性能对比
每提高一个过氧化氢或者高锰酸钾浓度，就对驯化菌种进行发酵验证考察驯化菌种产生DHA能力的变化。将上述种子液以10％(v/v)接种量接入到经过121℃灭菌30min的100mL发酵培养基中，发酵培养条件为：温度25℃、转速150rpm，待培养基中90g/L葡萄糖耗尽终止发酵，分别测定细胞干重，脂肪酸含量以及DHA含量。与原始菌种同样条件下发酵参数进行对比。
表1：不同驯化浓度的过氧化氢驯化菌株及原始菌株发酵结果对比
如表1所示，最终能够在含有0.1％浓度的过氧化氢培养基中正常生长的驯化菌种发酵时间比原始菌种缩短了15％，DHA产量提高了65.48％。
表2：不同驯化浓度的高锰酸钾驯化菌株及原始菌株发酵结果对比
如表2所示，最终能够在含有0.1％浓度的高锰酸钾培养基中正常生长的驯化菌种发酵时间比原始菌种缩短了15％，DHA产量提高了51.07％。
实施例4最终驯化菌种的5L发酵罐补料发酵
将最终适应0.1％过氧化氢，高锰酸钾的驯化菌种种子液以10％(v/v)的接种量接入以及灭菌的装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵过程中以植物油为消泡剂，于25℃、1vvm的通气比率、150rpm的搅拌转速下发酵培养3-4天。结果见表3：最终利用过氧化氢驯化的菌种DHA生产能力最高，与原始菌种相比，油含量提高了20％，DHA含量提高了14.76％，DHA产量达到38.07g/L。
表3：添加强氧化剂最终驯化菌株驯化前后发酵对比
Claims (9)
1.一种驯化裂殖壶菌菌种的方法，其特征在于：将该方法用于DHA的生产，在驯化培养基中添加了强氧化剂，且该强氧化剂为高锰酸钾。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述驯化培养基配方包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素；
其中，碳源为葡萄糖；
氮源为酵母粉、谷氨酸钠、硫酸铵中的一种或者多种；
无机盐离子为钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐和钙盐中的任意一种或多种；
微量元素为Mn2+、Co2+、Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。
3.一种驯化裂殖壶菌的方法，其特征在于，驯化的具体步骤为：
（1）在活化培养基中活化菌种；
（2）在添加高锰酸钾的驯化培养基中，接种经活化的菌种，培养生长至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L；
（3）将步骤（2）得到的驯化菌种接入不含高锰酸钾的种子培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L；
（4）提高驯化培养中高锰酸钾的浓度，接种经步骤（3）得到的驯化菌种，培养生长至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L；
（5）循环步骤（3）和步骤（4），直至驯化菌种能够在含有高锰酸钾质量浓度为0.1%的驯化培养基中正常生长至细胞干重25g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，循环（3）和步骤（4）的次数为2次以上。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中第一次添加高锰酸钾的初始质量浓度含量为0.01%。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述循环步骤中，高锰酸钾的质量浓度依次控制为：0.02%，0.03%，0.04%，0.05%，0.06%，0.07%，0.08%，0.09%，0.1%。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）、（3）和步骤（4）中，所述接种的接种量为培养基体积的0.2~2%。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高锰酸钾的除菌方式为膜过滤。
9.一种发酵高产DHA的方法，其特征在于，采用权利要求1-8中任一项所述方法获得的菌株进行DHA发酵、提取，获得含DHA的油脂。
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Citations (3)
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| CN101575584A (zh) * | 2009-06-18 | 2009-11-11 | 南京工业大学 | 一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法 |
| JP2015149912A (ja) * | 2014-02-10 | 2015-08-24 | 国立大学法人 宮崎大学 | ヤブレツボカビ類を用いたカタラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法 |
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