CN110846232B - 一株可高温发酵生产dha的菌株及其应用 - Google Patents

一株可高温发酵生产dha的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株可高温发酵生产DHA的菌株及其应用，该菌株可在35℃条件下高产二十二碳六烯酸油脂，本发明利用菌种连续驯化技术定向改造菌株，结合发酵控制策略，获取可在高温下快速生长、快速积累DHA的菌株，连续高温驯化后的裂殖壶菌，菌种的生长速度大幅度提升，在正常发酵温度下培养，细胞生长速度提高了75.43％，在高温发酵条件下发酵周期缩短25h，细胞生长速度是原始菌株的2.10倍。另外，该菌株的β‑胡萝卜素产率提高了57.75％。本发明的菌株在高温35℃条件下也可实现DHA的高效生产，减少了在高温地区生产的能耗，降低了发酵成本，适合工业化生产。

Description

一株可高温发酵生产DHA的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株可高温发酵生产DHA的菌株及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)，是一种重要的ω-3长链多不饱和脂肪酸，俗称“脑黄金”，是备受瞩目的功能性油脂之一。DHA主要存在于人体大脑的神经元表层，对细胞突出的再生有着极为重要的作用。研究表明，DHA能够促进神经系统发育，有效抑制老年痴呆的发病机率，减少动脉硬化和血栓形成的机率，并有抑癌抗炎提高水产存活率等生理功能。
DHA的主要来源有深海鱼油与产油微生物，由于微生物发酵生产油脂具有不受季节气候影响等优点，故微生物发酵产DHA得到了广泛的应用。在全世界范围内，商业化微生物发酵生产DHA的菌株主要由有寇氏隐甲藻、破囊壶菌和裂殖壶菌三种。其中裂殖壶菌的油脂含量高可达到细胞干重的50％，DHA占总脂肪酸的含量更高达40％～60％。此外，该菌株还具有易培养、生长速度快，发酵周期短等优点，是目前工业化生产中最理想的DHA菌株。
但现有方法中，裂殖壶菌发酵产DHA的适宜温度一般为25-30度，发酵温度超过30℃，裂殖壶菌会受到生长抑制，DHA产量明显降低，且其发酵生产成本高，市场价格昂贵，因此利用微生物生产的DHA油脂商业化应用范围仍受到限制。中国专利CN104974944A公开了一种产DHA的裂殖壶菌基因工程菌及其构建方法和应用，通过基因工程的手段进行菌株改造，获得的裂殖壶菌在20～30℃条件下生长；中国专利CN102888348A公开了一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产DHA油脂的方法，当温度在25～28℃时，裂殖壶菌的生长量最大，但当温度高于30℃时，裂殖壶菌的生物量和油脂含量均迅速下降，且油脂中DHA含量低。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可高温发酵生产DHA的菌株，该菌株可实现在高温环境下高产DHA。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株可高温发酵生产DHA的菌株，分类命名为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)ALE-HT，保藏编号为GDMCC NO：60885。
本发明的另一目的在于提供上述菌株在发酵生产DHA中的应用。
本发明提供了一种具体的应用方式，包括：将所述菌株进行种子培养和发酵培养，获取产物。
进一步的，发酵培养的温度为30～35℃。
进一步的，所述种子培养的方式为：将菌株以1％接种量接种至种子培养基活化培养，进行三代活化。每代种子活化的时间为24～48h。
进一步的，种子培养的培养基成分为：葡萄糖30～60g/L，酵母粉3～5g/L，MgSO4·7H2O 4～6g/L，Na2SO4 3～5g/L、(NH4)2SO4 4～6g/L，KH2PO4 2～4g/L，KCl 1～2g/L，谷氨酸钠18～20g/L。
进一步的，发酵培养的培养基成分为：葡萄糖80～100g/L，酵母粉4～6g/L，MgSO4·7H2O 3～5g/L，Na2SO4 6～9g/L、(NH4)2SO4 2～4g/L，KH2PO4 2～4g/L，KCl 0.1～0.5g/L，NaCl 5～8g/L，谷氨酸钠18～20g/L。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的菌株具有在高温下快速生长、快速积累DHA的能力，驯化后的菌株在高温环境下进行补料发酵，生物量、油脂含量、DHA产量分别是原始菌株的1.88、2.73、2.59倍，表明驯化菌株在高温培养条件下，展现了更佳的生长能力和油脂积累能力。
(2)本发明获取的经连续高温驯化后的裂殖壶菌，菌种的生长速度大幅度提升。在正常温度下进行分批发酵，细胞生长速度提高了75.43％，在高温条件下发酵周期缩短25h，细胞生长速度是原始菌株的2.10倍。同时，该菌株的β-胡萝卜素产率提高了57.75％。
(3)在工厂生产中，7-8月份一般都是停产状态，不能生产，温度很难控制在30度，此外高温条件下进行生产，需要大量的冷却手段，能耗高，采用本发明的菌株进行发酵生产可大量降低能耗，降低发酵成本，适合工业化生产。
附图说明
图1是原始菌株和驯化菌株发酵性能对比；图中A：原始菌株；B：驯化菌株。
本发明所述的生物材料，其分类命名为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)ALE-HT，已于2019年10月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60885，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体实施方式
实施例涉及的原始菌株为Schizochytrium sp.HX-308，由实验室自主筛选获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 209059。
实施例1
本实施例具体说明本发明菌株的筛选方法。
(1)在30℃下对原始裂殖壶菌菌种进行活化；将原始菌株活化3代，每代时间为24-48小时。
(2)将经过活化的种子以1％(v/v)的接种量接入种子培养基中，培养温度为32℃、34℃、34.5℃和35℃，可根据菌种的生长情况进行升温驯化，例如菌种在32℃生长良好时，下一代驯化温度可设置为34℃，以此类推，转速170rpm，摇床培养至菌株对数生长期转接下一代；
种子培养基成分为：葡萄糖30～60g/L，酵母粉3～5g/L，MgSO4·7H2O 4～6g/L，Na2SO4 3～5g/L、(NH4)2SO4 4～6g/L，KH2PO4 2～4g/L。
(3)待步骤(2)中的菌种培养至对数生长期，即完成第一代驯化，对种子液进行转接，温度设置与步骤(2)中相同，此即为第二代驯化，以此类推，进行十代驯化；
(4)在驯化温度为35℃时，每第十代驯化菌进行单菌落平板划线分离，挑选生长占优势的单菌落进行种子性能测试；进行后续升温传代培养，直至获得在35℃下生长性能稳定的菌株，保藏最终获得的35℃驯化菌株。
实施例2
本实施例具体说明本发明利用裂殖壶菌发酵产DHA的方法。
(1)种子培养
种子培养基成分为：葡萄糖30～60g/L，酵母粉3～5g/L，MgSO4·7H2O 4～6g/L，Na2SO4 3～5g/L、(NH4)2SO4 4～6g/L，KH2PO4 2～4g/L，KCl 1～2g/L，谷氨酸钠18～20g/L。
将菌种以1％接种量接入种子培养基，培养时间为24-48小时，转速为170转/min，即完成第一代活化，用相同的方法进行第二代种子活化，以此活化三代，获得种子。
(2)发酵培养
发酵培养基成分为：葡萄糖80～100g/L，酵母粉4～6g/L，MgSO4·7H2O 3～5g/L，Na2SO4 6～9g/L、(NH4)2SO4 2～4g/L，KH2PO4 2～4g/L，KCl 0.1～0.5g/L，NaCl 5～8g/L，谷氨酸钠18～20g/L。
将种子液以10％(v/v)接种量接入发酵培养基中，发酵温度为30～35℃，转速为170rpm，当发酵培养基中的葡萄糖耗尽时停止发酵。
实施例3
本实施例具体说明驯化菌株与原始菌株的摇瓶发酵性能对比
挑选出35℃下生长优良的菌种，采用实施例2的发酵方法，分别在在28℃、31℃和35℃下进行发酵，以比较不同驯化菌株和原始菌株在正常温度下的发酵性能(DHA生产能力)。记录发酵时间，发酵完毕后分别测定细胞干重，脂肪酸产量以及DHA含量等。不同驯化菌株和原始菌株的发酵参数对比见表1。
表1 原始菌株与驯化菌株在不同温度下的发酵参数对比
Figure BDA0002301674050000041
由表中数据显示：在一定的初糖条件下，随着温度的升高，原始菌株的发酵时间逐渐延长。其中，35℃条件下的发酵时间延长至73小时。驯化后的菌株在正常28度发酵条件下，细胞生长速度大幅度提升，提高了75.43％，β-胡萝卜素积累速率提高了57.75％；在35度高温条件下，周期缩短25h，细胞生长速度是原始菌株的2.10倍，DHA产量提高了38.58％。油脂积累方面，随着温度的升高，出发菌株的油脂产量逐渐降低。28℃的油脂积累速率为0.380g/(L·h)，是35℃的2.70倍。然而驯化后的菌株在不同温度条件下的油脂积累速率都稳定于0.4左右，说明驯化菌株油脂合成更为稳定。
实施例4
补料发酵效果对比
在实施例2摇瓶发酵的基础上进行葡萄糖补料发酵。发酵温度为28℃和35℃，转速为170rpm，配制600g/L的葡萄糖溶液于三角瓶中，灭菌后作为补料液，发酵过程保持葡萄糖的浓度在1～10g/L。发酵参数对比如图1、表2所示。
表2 原始菌株与驯化菌株补料发酵参数对比
Figure BDA0002301674050000042
发酵条件为28℃时，驯化菌株的最终生物量、油脂含量分别为82.3g/L、40.2g/L，比原始菌株提高了11.82％、11.05％，DHA含量从原始菌株的17.83g/L提高至19.49g/L。发酵条件为35℃时，驯化菌株的生物量、油脂含量、DHA产量分别是原始菌株的1.88、2.73、2.59倍，表明驯化菌株在高温培养条件下，展现了更佳的生长能力和油脂积累能力。
可以看出，本发明的菌株不仅可在高温下生长，且生长速度大幅提升，并缩短了发酵周期，其原理可能在于，在生物体内，有系列热激蛋白，可在高于正常生长温度刺激下，诱导合成新蛋白。功能上防止蛋白变形，使其恢复原有的空间构象和生物活性。在连续高温刺激下，细胞被迫高表达大量的热激蛋白以适应恶劣的环境，同时只有表达量高的菌株才能在高温下存活，因此，同时达到筛选高产DHA菌株的目的。

Claims (7)

1. 一株可高温发酵生产DHA的菌株，其特征在于，分类命名为裂殖壶菌（Schizochytriumsp.）ALE-HT，保藏编号为GDMCC NO：60885。
2.权利要求1所述菌株在生产DHA中的应用，其特征在于，发酵培养的温度为30~35℃。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述菌株进行种子培养和发酵培养，获取产物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述种子培养的方式为：将菌株以1%接种量接种至种子培养基活化培养，进行三代活化。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，每代种子活化的时间为24~48h。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，种子培养的培养基成分为：葡萄糖30～60g/L，酵母粉3～5g/L，MgSO4·7H2O 4～6g/L，Na2SO4 3～5g/L、(NH4)2SO4 4～6g/L，KH2PO42～4g/L，KCl 1～2 g/L，谷氨酸钠18～20 g/L。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养的培养基成分为：葡萄糖80～100g/L，酵母粉4～6g/L，MgSO4·7H2O 3～5g/L，Na2SO4 6～9g/L、(NH4)2SO4 2～4g/L，KH2PO42～4g/L，KCl 0.1～0.5 g/L，NaCl 5～8 g/L，谷氨酸钠18～20 g/L。
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