CN102369290A - 发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于生产有价值的化合物的工艺，所述工艺包括：在包含非抑制性碳源的工业规模上对微生物菌株进行发酵，以及进料至少一种生长速率限制性营养物。所述工艺包括真菌、酵母、原生动物和细菌菌株。

Description

发酵工艺
技术领域
本发明涉及用于生产有价值的化合物的工业工艺。该工艺允许以具经济吸引力的产率高水平生产有价值的化合物，例如初级或次级代谢产物，药物蛋白或药物肽或工业酶。
背景技术
很多有价值的化合物是通过在大的工业规模的发酵罐中发酵生产的，即生产感兴趣的有价值的化合物的微生物在＞10m3的发酵罐中在受控条件下生长。在当前的工业规模的发酵工艺中，典型地，以微生物的生长速率为基础来选择碳源(carbon-source，也称C-source)(通常也是能源)，使得产生高的生物质比生长速率(a high biomass-specific growth rate)的碳源是优选的。一种非常常见的碳源是葡萄糖。
除了生长速率之外，碳源还可影响有价值的化合物的生产速率。在低碳源浓度下，生产速率取决于碳源浓度，使得碳源浓度的增加导致生产速率增加。但是，取决于微生物/有价值的化合物的特定组合，高于临界浓度时，碳源经常导致生产速率降低。该现象被称为“抑制”。抑制性碳源如本文下文所定义。熟知的是，葡萄糖是用于在多种条件下通过许多微生物生产代谢产物的抑制性糖。例如，Change等人(J.Industrial Microbiol.(1990)，6，165-169)描述了在用野生型Penicillium chrysogenum菌株的发酵工艺中过量葡萄糖导致青霉素V生产更低。在青霉素生产工艺发展的最初几年中已发现了下述事实：与例如乳糖相比，葡萄糖对于在分批培养中的青霉素生产而言是比较不利的碳源(例如Moyer and Coghill in J.Bacteriol.(1946)，51，57-78)。
稍后的研究显示，这些早期观测可通过下述事实解释：高于某阈值浓度时，葡萄糖抑制细胞中合成青霉素的酶的形成，而用其它碳源(包括乳糖)时该抑制不会发生(例如Revilla et al.in J.Antibiotics(1984)，37，781-789)。此类碳源因此被命名为非抑制性碳源，如本文下文将对其进一步定义的。有多种方式来避免或绕开对碳源的一般性抑制或具体对葡萄糖的抑制的抑制作用。
一种方式是分离对抑制较为不敏感的微生物的突变体。Chang等人(见上文)分离了Penicillium chrysogenum的去葡萄糖抑制型突变体，该突变体在发酵培养基中相同的葡萄糖浓度下产生较之野生型菌株而言更高的Pen-V效价。
另一种方式是在发酵过程期间保持抑制性碳源低于临界浓度。这可通过下文所述来实现：在使得发酵期间碳源浓度保持低于抑制性作用发生的值的条件下，将碳源进料到发酵罐中。Robin等人使用了限制性条件下的葡萄糖进料，用于通过经编码扩环酶基因的基因转化过的Penicilliumchrysogenum菌株来生产己二酰-7-ADCA(Metabolic Engineering(2003)，5，42048 and Biotechnology and Bioengineering(2001)，83，361-368)。但是，低浓度的碳源的缺点是，微生物的生物质比生长速率(如本文下文定义的)受碳源的可利用性限制，导致生物质形成慢，并且因此导致达到有价值的化合物的期望水平的发酵时间长。使用低浓度碳源的另一缺点是，微生物的生物质比生产速率(如本文下文所定义的)仍低，又导致生产速率低。
第三种方式是完全避免使用下述抑制性碳源而改为使用已知是非抑制性的碳源，所述抑制性碳源在使用某些微生物用于生产所选择的有价值的化合物的发酵工艺中已知是抑制性的。因此，使用代替抑制性碳源的此类非抑制性碳源是有利的，因为非抑制性碳源对生产速率不具有负面作用，并且其可有利地从发酵起始在高浓度下使用，而不需要限制浓度。
但是，与在发酵开始时使用高水平的碳源相关的问题在于，产生的高生长速率经常导致不期望的高粘度的发酵液。粘度通常由两个因素确定，即，发酵液中的生物质的量(浓度)和微生物的形态(称为“生物质比粘度”，biomass-specific viscosity)。在生长速率高的工业发酵工艺中，丝状微生物(例如丝状细菌(例如Actinomycetes)或丝状真菌(例如Penicillium或Aspergillus))典型地具有分散的菌丝体(mycelium)，其具有非常长且分支的菌丝(hyphae)，这导致不期望的高的生物质比发酵液粘度。因此，即使在发酵开始时(此时仅有极少贡献于粘度的生物质，但生长速率典型地很高)，生物质比粘度可快速增加，导致发酵液中氧输送贫乏。因而低(生物质比)粘度的发酵液对于生产速率是有利的。
当然，人们可限制发酵培养基中的非抑制性碳源的浓度，以限制生长速率，并因此限制生物质比粘度，但是该情况与本文上文所述的情况(其中抑制性碳源以低浓度进料)并无本质性不同，并且其具有同样的缺点，即降低的生长速率和因此降低的生产速率。
一种备选方法是通过供给另外的营养物而不是碳源来限制生长速率。例如，Oh等人(Biotechnology and Bioengineering(1988)，32，569-573)证实，在高浓度的非抑制性糖(即3％乳糖)的存在下，在Penicilliumchrysogenum的分批发酵中，磷酸盐限制导致青霉素的生物质比生产速率的2倍增加。但是，该分批发酵系统的大缺点在于磷酸盐受限的发酵的体积(volumetric)生产速率比对照组更低(见Oh等人中的图1)。这可能是由下述事实导致的：由磷酸盐限制导致的发酵罐中形成的活性生物质量的降低比由同样的限制导致的青霉素的生物质比生产速率的增加更强烈。Oh等人建议在半连续发酵系统中应用磷酸盐限制，其中，通过将生物质驻留在发酵罐中，通过培养作为菌丝体生物颗粒的生物质以及仅收获不含生物颗粒的发酵液，技术上解决活性生物质的量低的问题。
令人吃惊地，我们已发现，在没有生物质驻留的发酵系统中，在生长速率限制性条件下，进料至少一种营养物使得可使用高浓度的非抑制性碳源，可限制生长速率及因此的生物质比粘度，并增加生物质比生产速率，导致有价值的化合物(例如初级或次级代谢产物、药物蛋白或药物肽或工业酶)的体积生产速率高。
发明详述
定义
“生物质比生产速率”也称为“生产速率”，其在本文中被定义为每时间量(以时间倒数计)每生物质的量(基于干物质)生产的有价值的化合物的量(基于干物质)。
“体积生产速率”是每时间量(以时间倒数计)每生物反应器体积(以立方米体积倒数计)生产的有价值的化合物的量(基于干物质)。
“生物质比生长速率”也称为“生长速率”，其在本文中被定义为每时间量(以时间倒数计)每生物质的量(基于干物质)生产的生物质的量(基于干物质)。
“生长速率限制性营养物”在本文被定义为是主要的生长速率控制因素的营养物。
“抑制性碳源”是这样的碳源，在发酵罐中，其在不断增加的浓度下导致生物质比生产速率的初始增加，但高于该碳源的临界浓度时其导致生物质比生产速率减少。
“非抑制性碳源”是这样的碳源，其在不断增加的浓度下导致生物质比生产速率增加，直到高于某浓度，生物质比生产速率达到平台值。因此，非抑制性碳源不会在高于临界浓度时导致生物质比生产速率的减少。因此，非抑制性碳源可有利地以高浓度被用于发酵工艺中。
在第一方面，本发明提供了用于生产有价值的化合物的工艺，所述工艺包括：在包含非抑制性碳源的培养基中以工业规模对微生物菌株进行发酵，以及进料至少一种生长速率限制性营养物，其中具有生物质驻留的通过Penicillium chrysogenum的半连续发酵进行的青霉素-G生产被排除在外。优选地，用于有价值的化合物生产的工艺受所定义的抑制性碳源抑制。
非抑制性碳源可以是对生产所述有价值的化合物的微生物来说是非抑制性的任何可同化(assimilable)碳源。非抑制性碳源可以在发酵工艺中的任何时间点期间以高浓度存在。整个发酵工艺所需要的非抑制性碳源的总量可在发酵工艺开始时添加，产生高的浓度，如果使用抑制性碳源，这会导致显著的抑制条件。非抑制性碳源还可以在发酵期间以某种时间间隔添加或作为连续进料来添加。技术人员能很好地设计针对给定微生物和有价值的化合物的发酵工艺，以得到最优结果。
在一种实施方式中，非抑制性碳源可选自由碳水化合物、多元醇、油和甘油三酯、醇、有机酸、氨基酸和蛋白构成的组。碳水化合物可包括，例如单糖，例如葡萄糖、果糖和半乳糖；二糖，例如蔗糖、乳糖和麦芽糖；多糖，例如淀粉、糊精、麦芽糊精、菊粉和纤维素。多元醇可包括，例如甘油、山梨糖醇和甘露糖醇。油可包括，例如大豆油和菜籽油。醇可包括，例如甲醇、乙醇、丙醇和高级醇。有机酸可包括，例如甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸和苯甲酸。蛋白可包括任何大小的肽，例如二肽、三肽、寡肽和多肽，其包括经(部分)水解的蛋白(所谓的蛋白水解产物)。
生长速率限制性营养物可以是任何营养物，只要其是生长所需的并且可在生长速率限制性条件下进料即可。优选地，生长速率限制性营养物不是碳源。在一种实施方式中，生长速率限制性营养物选自由磷源、氮源、硫源、氧源、一种或多种维生素和一种或多种痕量元素构成的组。优选地，生长速率限制性营养物是磷源，或优选地，生长速率限制营养物是氮源，或优选地，生长速率限制营养物是硫源。最优选地，生长速率限制营养物是磷源。
可作为生长速率限制性营养物添加的合适的磷源是本领域熟知的，其例如可以是磷酸或含有磷酸根的盐，例如正磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐和/或焦磷酸盐。技术人员能很好地选择合适的磷源。
可作为生长速率限制性营养物添加的合适的氮源是本领域熟知的，其例如可以是尿素、氨、硝酸盐和/或铵盐(例如硫酸铵、磷酸铵和/或硝酸铵)以及氨基酸(例如谷氨酸盐/酯和/或赖氨酸)。技术人员能很好地选择合适的氮源。
可作为生长速率限制性营养物添加的合适的硫源是本领域熟知的，其例如可以是硫酸、硫酸盐和/或硫代硫酸盐。技术人员能很好地选择合适的硫源。
在一种优选的实施方式中，生长速率限制性营养物不是加进有价值的化合物中的元素(即原子)的排他性来源。在这种情况下，生长速率和生产速率是不关联的。这是有利的，因为进料此类营养物导致生长速率受限制(和因此生物质比粘度受限制)，但生产速率不受限制。技术人员知道如何选择不是组成有价值化合物的元素的排他性来源的营养物。例如，如果有价值的化合物(除O和H以外)还含有N、C和S，在该实施方式中生长速率限制性营养物应当不是N、C和S的唯一来源。一个例子是，如果该有价值的化合物是β-内酰胺化合物(例如青霉素或头孢菌素)。这些化合物含有C、H、N和S原子。因此，在，其中有价值化合物是β-内酰胺化合物的本发明发酵工艺中，生长速率限制性营养物优选选自不是元素C、H、N和S的排他性来源的营养物的组。在这种情况下的一种优选实施方式是使用合适的磷源作为生长速率限制性营养物。
已令人吃惊地发现，本发明工艺中的生产速率高于相同工艺中但没有进料至少一种生长速率限制性营养物的情况下的生产速率。进料至少一种生长速率限制性营养物有利地提供了限制生长速率并因此限制生物质比粘度的工具。
本发明的说明书通篇中，工业规模的发酵工艺或工业工艺可理解为包括在≥10m3、优选≥25m3、更优选≥50m3、最优选≥100m3，优选小于5000m3的体积规模上进行的发酵工艺。
本发明的工艺可被作为补料分批、重复补料分批、半连续补料分批或连续发酵工艺来进行。
在重复分批工艺中，对发酵液的部分收获伴随对完全培养基的部分补充，任选地，反复若干次。
在补料分批工艺中，在发酵开始之前，没有发酵培养基化合物被添加到培养基中或有部分发酵培养基化合物被添加到培养基中，并且分别地，全部化合物或剩余的部分化合物在发酵工艺期间被添加。选用来进料的化合物可被一起或彼此分开进料到发酵工艺中。
在半连续补料分批或连续发酵工艺中，在发酵期间额外添加完全起始培养基。在重复补料分批工艺中，含有生物质的发酵液的一部分以规则时间间隔被移除，而在连续工艺中，对发酵液的一部分的移除连续发生。因此，发酵工艺被对应于收回的发酵液的新鲜培养基部分再补充。
本发明的工艺适用于对感兴趣的任何有价值的化合物的发酵生产，所述化合物包括初级或次级代谢产物、药物蛋白或药物肽、或工业酶。
初级代谢产物是对生长、发育或繁殖来说必需并且是许多物种所共有的生物分子。初级代谢产物例如是主要代谢途径(例如糖酵解途径或TCA循环)的中间产物。初级代谢产物的例子是氨基酸和核酸。
次级代谢产物对生长、发育或繁殖来说不是必需的，但代替性地，其具有生态功能。次级代谢产物的例子是抗生素或β-内酰胺化合物，特别是β-内酰胺抗生素。一种优选的有价值的化合物是β-内酰胺化合物。β-内酰胺化合物的例子是克拉维酸(clavulanic acid)、青霉素(例如青霉素G、青霉素V或6-氨基青霉烷酸)和半合成青霉素，例如阿莫西林，和头孢菌素(例如头孢菌素C))。
在一个非常优选的实施方式中，β-内酰胺化合物是β-内酰胺中间产物的N-酰化衍生物，例如7-ADCA、7-ACA、7-ADAC、7-ACCA、7-PACA或7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸。如在WO93/05158、WO93/08287或WO 2004/106347中公开的，在7-氨基位置上的酰基优选是产生相应己二酰衍生物的己二酸。备选性的合适侧链已在WO95/04148、WO95/04149、WO96/38580、WO98/48034和WO98/48035中公开。
用于本发明工艺的合适的微生物菌株可以是生产感兴趣的有价值的化合物的任何野生型菌株。此外，本发明的合适的微生物菌株可以是这样的菌株，所述菌株是通过使感兴趣的亲本菌株或野生型菌株经历经典诱变处理或经历重组DNA转化而获得和/或改进的菌株。在一个优选的实施方式中，适用于本发明的工艺的微生物菌株是酵母、真菌、原生动物或细菌。微生物菌株可包括丝状菌株或非丝状菌株。优选地，微生物菌株是丝状菌株，优选地是细菌或真菌。优选的丝状细菌是Actinomycete。优选地，Actinomycete是Streptomyces clavurigerus，其优选产生作为有价值的化合物的克拉维酸。
优选地，丝状真菌选自由Aspergillus、Trichoderma、Penicillium和Acremonium构成的组。优选的例子是，用于生产PenG或PenV的Penicillium chrysogenum，用于生产头孢菌素C的Acremoniumchrysogenum，以及Aspergillus(例如Aspergillus niger或Aspergillusoryzae)，其作为野生型菌株或经经典改进的菌株，所述菌株生产酶(例如淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和已知在工业中使用的其它酶)的菌株或经遗传修饰以过量表达编码酶(例如淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和已知在工业中使用的其它酶)的基因。
在一种优选的实施方式中，真菌是Penicillium chrysogenum，并且次级代谢产物是己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACA、己二酰-7-ADAC、己二酰-7-ACCA、v7-PACA或己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸，最优选的是己二酰-7-ADCA。如在WO93/05158中公开的，Penicillium chrysogenum菌株被用编码扩环酶的基因转化并表达编码扩环酶的基因。该经工程改造的Penicillium chrysogenum菌株在存在作为侧链前体的己二酸时于发酵容器中生长时，产生并排出己二酰-7-ADCA。
图例
图1.发酵期间的磷酸盐浓度。实线：发酵A；粗实线：发酵B；虚线：发酵C。发酵A和C：左侧标度；发酵B：右侧。
图2.相对搅拌器速度。实线：发酵A；粗实线：发酵B；虚线：发酵C。
图3.己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸的生产。实线：发酵A；粗实线：发酵B；虚线：发酵C。
图4.发酵期间的磷酸盐浓度。实线：发酵D；虚线：发酵E。
图5.发酵期间的己二酰-7-ADCA浓度。实线：发酵D；虚线：发酵E。
材料和方法
己二酰-7-ADCA的测定
如在US 6,410,259中描述的，通过HPLC测定己二酰-7-ADCA浓度。
实施例
实施例1
在根据表1的培养基中发酵已经扩环酶表达盒(其中扩环酶编码盒与启动子IPNS一起提拱)转化的Penicillium chrysogenum CBS 455.95(如WO93/05158中描述的)。进行了三次单独的发酵(A-C)。痕量元素溶液根据表2所示。发酵条件在表3中列出。用针对表1中发酵A给出的相同培养基(但葡萄糖浓度为50g/kg并且不存在己二酸钾)中生长的接种物以5vol％的接种强度来接种发酵。
表1.组成培养基(g/kg)：
  化合物   发酵A   发酵B   发酵C
  葡萄糖   80   5   5
  甘油   0   76.7   76.7
  尿素   4.5   4.5   4.5
  (NH4)2SO4   1.1   1.1   1.1
  Na2SO4   2.9   2.9   2.9
  KH2PO4   0   5.2   0
  K2HPO4   0   3.66   0
  痕量元素溶液   10   10   10
  己二酸钾   30   30   30
表2.痕量元素溶液：
  化合物   浓度(g/kg)
  柠檬酸盐·1H2O   150
  FeSO4·7H2O   15
  MgSO4·7H2O   150
  H3BO3   0.0075
  CuSO4·5H2O   0.24
  CoCl2·6H2O   0.32
  ZnSO4·7H2O   1.5
  MnSO4·H2O   2.28
  CaCl2·2H2O   0.99
在发酵A和C中，初始培养基中不存在磷酸盐。代替性地，在这些发酵中，根据如在表4中列出的进料情况，将磷酸盐作为含有2.76g/kgKH2PO4和1.96g/kg K2HPO4的溶液进料到培养基中。
表3.发酵条件
表4.磷酸盐进料情况
  时间间隔(小时)   流速(g/kg/h)
  0-5   0
  5-21.5   0.11121*e0.0861*t
  21.5-120   0.5745*e0.01*t
t＝发酵时间(小时)
图1显示了发酵期间的磷酸盐浓度。图2显示了发酵期间的相对搅拌器速度。较高的搅拌器速度对应较高的粘度。图3显示了己二酰-7-ADCA的生产。
实施例2
两次发酵D和E按照实施例1中所述来进行，但培养基的组成根据表5所示。初始培养基中不存在磷酸盐，代替性地，根据表4中列出的进料情况，将磷酸盐作为含有2.76g/kg KH2PO4和1.96g/kg K2HPO4的溶液进料到培养基中。
表5.组成培养基(g/kg)
  发酵D   发酵E
  葡萄糖   80   5
  麦芽糊精   0   67.5
  尿素   4.5   4.5
  (NH4)2SO4   1.1   1.1
  Na2SO4   2.9   2.9
  KH2PO4   0   0
  K2HPO4   0   0
  痕量元素溶液(见表2)   10   10
  己二酸钾   30   30
在发酵D和E中，如实施例1中所述进料磷酸盐。
图4显示了发酵期间的磷酸盐浓度。图5显示了己二酰-7-ADCA酸的生产。
实施例3
在根据表1的培养基中发酵Penicillium chrysogenum CBS 455.95。除了培养基(表1)不含有己二酸钾而改为含有1g/kg的苯乙酸钾之外，如实施例1中所述针对A、B和C分别进行三次发酵F、G和H。另一与实施例1的不同之处是使用了未经转化的Penicillium chrysogenum CBS 455.95。发酵条件与实施例1(表6)相同，但通过每4小时分析发酵液中的浓度并将足够量的苯乙酸钾浓缩溶液加到发酵液中以将苯乙酸浓度保持在0.6和2.0g/kg之间。
三种发酵结果基本上与实施例1中相同，但发酵H结束时青霉素G的效价高于发酵F和G结束时青霉素G的效价。
表6.发酵条件
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Claims (19)

1.一种用于生产有价值的化合物的工艺，所述工艺包括：在包含非抑制性碳源的培养基中以工业规模对微生物菌株进行发酵，以及进料至少一种生长速率限制性营养物，其中，具有生物质驻留的通过Penicilliumchrysogenum的半连续发酵进行的青霉素-G生产被排除在外。
2.根据权利要求1的工艺，其中所述有价值的化合物的生产受抑制性碳源的抑制。
3.根据上述权利要求中任一项所述的工艺，其中所述非抑制性碳源选自由碳水化合物、多元醇、植物油、醇、有机酸、氨基酸和蛋白构成的组。
4.根据上述权利要求中任一项所述的工艺，其中所述生长速率限制性营养物选自由磷源、氮源、硫源、氧源、维生素和痕量元素构成的组。
5.根据上述权利要求中任一项所述的工艺，其中所述生长速率限制性营养物不是加入到有价值的化合物中的元素的排他性来源。
6.根据上述权利要求中任一项所述的工艺，其中所述发酵通过分批补料、重复分批补料或连续发酵工艺发生。
7.根据上述权利要求中任一项所述的工艺，其中所述工业规模是≥10m3。
8.根据上述权利要求中任一项所述的工艺，其中所述有价值的化合物是药物蛋白或药物肽、初级代谢产物或次级代谢产物或工业酶。
9.根据上述权利要求中任一项所述的工艺，其中所述有价值的化合物是次级代谢产物。
10.根据上述权利要求中任一项所述的工艺，其中所述微生物菌株是酵母、真菌、原生动物或细菌。
11.根据权利要求10的工艺，其中所述真菌选自Aspergillus、Trichoderma、Acremonium和Penicillium构成的组，优选选自Penicilliumchrysogenum。
12.根据权利要求9到10中任一项所述的工艺，其中所述次级代谢产物是β-内酰胺化合物。
13.根据权利要求12的工艺，其中所述β-内酰胺化合物是头孢菌素。
14.根据权利要求13的工艺，其中所述头孢菌素是己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸。
15.根据权利要求12的工艺，其中所述β-内酰胺化合物是青霉素。
16.根据权利要求10的工艺，其中所述细菌是丝状菌株。
17.根据权利要求16的工艺，其中所述丝状菌株是细菌，优选是Actinomycete。
18.根据权利要求17的工艺，其中所述Actinomycete是Streptomycesclavuligerus。
19.根据权利要求18的工艺，其中所述Actinomycete是Streptomycesclavuligerus，并且所述次级代谢产物是克拉维酸。
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