CN1768146B - 用低浓度的含碳和含氮营养物来进行发酵的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于生产目标化合物(例如游霉素)的方法，所述方法包括：在液体发酵培养基中培养丝状细菌菌株，其中，发酵培养基中的含碳营养物和含氮营养物都保持为低浓度。本发明的方法降低了培养基的粘度，因此增加了目标化合物的产量。

Description

用低浓度的含碳和含氮营养物来进行发酵的方法
技术领域
本发明涉及对目标化合物(例如次级代谢产物、蛋白质和肽)发酵生产的领域。
背景技术
丝状细菌中的actinomycetes科对发酵工业来说非常重要。该科中的很多成员都已知能生产次级代谢产物或胞外酶，细菌代谢的这些产物中的若干种都具有工业应用价值。为获得这些产物，通常在液体培养基(深层培养物，submerged culture)中培养细菌，使得产物被排进液体，从中将其分离。产物的形成可以发生于生物的初始快速生长期间和/或培养物被保持于缓慢生长或不生长状态的第二阶段。此过程中每单位时间形成的产物的量(生产率)通常是很多因子的函数：生物的内在代谢活性；培养物的主要生理条件(例如pH、温度和培养基组成)；以及在用于该方法的设备中存在的生物的量。通常，对发酵方法的优化期间，优选获得尽可能高的细菌浓度，因为如果假设每单位生物的内在生产率是恒定的，这样就能获得最高量的产物。但是，actinomycetes科的细菌的一个特殊特征却使得这个目的很难达到。Actinomycetes在深层培养物中生长时具有丝状形态，其通常会导致培养液具有高粘度。培养物的高粘度限制了氧向培养物中的转运。事实上，所有使用到actinomycetes的方法都依赖氧的存在和消耗，因此对氧转运的限制会对整个过程的生产率加以限制。培养液的粘度是由很多因素决定的，例如培养基的组成、微生物排出的产物的存在情况和性质、以及(最重要的)微生物的形态。如果人们可以对微生物的形态特征施以有利的影响(即降低比粘度)，那么就可以以更高的生产率来实现该方法，或者可以获得更高浓度的细菌。对该方法的这两种改变都能获得更高的生产率。
发明内容
本发明提供了一种用于生产目标化合物的发酵方法，所述方法包括：在液体发酵培养基中培养丝状细菌菌株，其中，发酵培养基中的含碳营养物和含氮营养物都保持为低浓度。
优选地，包含含碳和含氮营养物的养料被提供给培养基，养料中营养物的比例可以使含碳和含氮营养物在培养基中保持低浓度。
丝状细菌优选是Actinomyces科的，更优选是Streptomyces属的。
发明详述
我们惊奇地发现，某些培养基组成会使得包含丝状细菌菌株的发酵方法中培养物粘度降低，而不会影响到对目标化合物的生产。一个重要的因素是培养基中含氮营养物(N)与含碳营养物(C)的比。高N/C比(氮化合物相对过量)导致粘性培养物，而低N/C比使得培养液的粘度相对较低。当对培养基中的氮量控制过多时，会使得生物生长极为不良，形成的产物的量也很低。但是，在适中的N/C比下，生物生长良好，产物形成正常，而同时生物的形态明显改变，使得培养液的粘度显著降低。此发现的结果就是，通过仔细控制培养基，或更具体地，通过控制培养基中含碳和含氮营养物的比，可显著地改进包含丝状细菌菌株的方法。
Actinomycetes科的细菌菌株已知能生产具有商业应用价值的目标化合物，例如次级代谢产物、蛋白质和肽。其例子是游霉素、nistatine、葡萄糖异构酶和棒酸(clavulanic acid)。
例如，actinomycetes菌株Streptomyces natalensis和Streptomycessilvosporens可生产抗真菌化合物游霉素，其作为抗真菌化合物具有多种应用。包含此类丝状细菌的发酵方法通常特征在于两个阶段。通常，所述方法起始于微生物开始生长的阶段，直到生长条件变得不利，例如，由于支持生长的营养物中的一种从培养基中耗尽。该初始(分批)阶段之后可以是微生物被保持于可存活状态的阶段。通常，大多数的目标产物都形成于该第二阶段。在该第二阶段，更多的营养物可被提供给培养物，其可以作为单独或重复进料的新鲜营养物被不连续地加入，或者可以将含有一种或多种营养物的流体连续进料到发酵容器中。该种发酵模式被称为补料分批发酵。优选地，通过移出部分发酵混合物可以进一步地令发酵过程延长，例如，当由于补充含有营养物的流体导致发酵容器被完全充满时移出。该方法被称为延伸(extended)发酵或重复(补料)分批发酵。
当营养物中的一种耗尽时，初始(分批)阶段就结束了。该阶段之后可以对氧吸收进行测量，在接近初始阶段末尾时，氧吸收会降低。通常，初始阶段持续6至48小时。当开始补充营养物时，第二阶段就开始了。营养物的补充使得发酵过程较之简单的分批发酵过程可持续更长时间。
通常，对每种生产方法而言，含碳和含氮营养物的最佳比例是由技术人员确定的，这取决于生物的基本成分、产物、N/C比对生物生理的影响，以及，更具体地，生物的产物形成能力。我们发现，碳过量和氮过量都无法获得人们期待的结果。在最佳状态下，在分批过程结束时和/或延长的补料分批类型的发酵过程中，可利用的碳和氮都几乎被耗尽。第二阶段中，培养基里含氮营养物的浓度优选小于0.5g/l，更优选小于0.25g/l，最优选小于0.1g/l(表示为每升中氮的克数)。含碳营养物的浓度优选小于5g/l，更优选小于2.5g/l，最优选小于1g/l(表示为每升中碳的克数)。养料(feed)可作为含有所有营养物的一种养料来提供，或者优选地，作为多于一种的亚养料(subfeed)来提供，其中每种亚养料中包含含氮营养物、含碳营养物或含氮和含碳营养物的组合。
还可对养料进行控制，使得氧的量在20至70％的空气饱和度之间，优选在30至60％的空气饱和度之间。
氧，典型地，以空气形式存在的氧，通常在发酵罐底部或接近底部的地方被引入。装置有一个或多个喷嘴用于引入空气或其它含氧气体，例如(经纯化的)氧。
可选地，反应器中存在搅拌器，以促进氧的吸收。此外，搅拌器还防止发酵罐中形成养料或亚养料的浓度梯度。
附图说明
图1：氮过量的培养物(●)和氮-碳均受限制的培养物(◆)中粘度的发展情况。
图2：将溶解氧浓度控制在30％空气饱和度所需要的搅动力。氮过量的培养物(●)和氮-碳均受限制的培养物(◆)都在类似的条件下被操作。
图3：氮过量的培养物(●)和氮-碳均受限制的培养物(◆)中粘度的发展情况。
图4：氮过量的培养物(●)和氮-碳均受限制的培养物(◆)中产物积累情况。
图5：对Streptomyces natalensis的完整规模的发酵，来生产游霉素。最初的方法(●)中使用了大豆油限制性养料，而NH3的浓度则保持在不受限制的水平。在改进方法(◆)中，通过以与补充油的速度成比例的速度来连续补充NH3溶液，将NH3浓度保持在较低的值上。培养物粘度降低使得对油的补充更快。产物形成的增加与补充油的速度的增加几乎成比例。
实施例
实施例1
在含有500mL生长培养基的2000ml锥形摇瓶中培养Steptomycesnatalensis菌株ATCC27448，培养基成分如下：
                        g/L
葡萄糖·1H2O            30
酪蛋白水解物            15
酵母提取物(干)          10
消泡剂Basildon          0.4
通过加入NaOH/H2SO4将pH调为7.0，通过高压灭菌对培养基进行灭菌(120℃，20分钟)。将生长完全的摇瓶中的内容物用于接种含有6L培养基的发酵容器，所述培养基成分如下：
                          g/L
大豆花                    25
大豆油                    8
玉米浸出物(干)            1
KH2PO4                    0.45
微量元素溶液              17
消泡剂Basildon            0.4
微量元素溶液的组成如下所示：
                          g/L
柠檬酸·1H2O              175
FeSO4·7H2O               5.5
MgSO4·7H2O               100
H3BO3                     0.06
CuSO4·5H2O               0.13
ZnSO4·7H2O               1.3
CoSO4·7H2O               0.14
培养基的温度和pH被分别控制为25℃和7.0。通过在必要的时候增加气流和/或搅拌器速度，将溶解氧浓度保持在大于30％空气饱和度上。在分批培养物中进行大约24小时的初始生长之后，培养物进入发酵的第二阶段。在第二阶段，通过补充纯的大豆油来使生长和产物形成都得以持续。第二进料线被用于补充氨。大豆油的平均补充速度为3g/h。以与大豆油补充速度成比例的速度来提供氨。进行一系列的发酵，其中应用不同的速度来补充氨，而补充大豆油的速度保持恒定。就该菌株而言，当NH3与油的比例在30-40mg NH3/g油的范围内时，碳源和氮源全部被消耗掉。C-N均受限制的条件使得培养物具有最低的比粘度。氮过量(NH3/油的比例＞40mg/g)导致培养物的粘度大幅增加。碳过量(NH3/油的比例＜30mg/g)具有类似效果。此外，油的积聚对培养物的存活能力具有负面效应。含氮营养物与含碳营养物之比的范围取决于菌株以及氮源和碳源的性质。因此对每种新方法而言，可以通过本发明的方法来确定最佳的范围。
根据上述方法进行了两项实验。其中一项用于达到氮过量的条件(即，然后通过大豆油补充速度来对培养物进行单一控制)。在另一项实验中，氨补充速度相对大豆油补充被降低，以达成发酵容器中两种营养物(大豆油和氨)的浓度都非常低的条件。对于试验生物(Strepromycesnatalensisi)而言，在选择的条件下，氨补充速度相对大豆油补充速度的比例应当在每g油35mg NH3左右。氨过剩的实验被开展于每g油45mgNH3的比例之下。
图1中清楚地展示了碳-氮均受限制的效果。在氮过量的条件下，粘度达到通常的高值。在同时对碳和氮进行限制的条件下，粘度降低至低很多的值，使得通气条件更好。对好的生产而言，优选将溶解氧浓度保持在大于30％空气饱和度的水平上。图2显示，当培养物在碳-氮均受限制的条件下时，为保持该溶解氧浓度需要的搅动力(能量)要小很多。
实施例2
用Streptomyces natalensis的菌株，按照与实施例1中相同的手段来进行另一项发酵实验。该菌株是抗真菌化合物游霉素的生产者。在该实验中，进行两项发酵。其中一项是在碳受限但氮过量的情况下(补充油的阶段，NH3水平保持在150-200mg/L)进行的。第二项进行的条件是：补充油的阶段，氮-碳均受限制，其中使用的NH3/油的比为32mg/g。图3和4中显示了一些结果。明显能观察到两种发酵模式中粘度有非常显著的差异。低粘度对于有效的过程操作来说是非常有好处的。但是，低粘度和不利的产物形成趋势的组合则是不好的。在本实验中，产物的形成则完全不受导致低粘度的条件的影响(图3)。在氮-碳均受限制的实验中，在发酵的第二部分，产物形成的速率更快，只是除了在起始时稍慢之外。
实施例3
实施例1和2所述的实验中获得的信息被用于改进对游霉素进行的工业规模(100m3规模)的实际生产方法。降低的粘度下，通过主营养物大豆油更快的补充，使得该方法被强化。NH3的补充速度与对油的补充成比例，如实施例1和2中所示，这使得补充阶段(开始于对发酵容器的接种之后24小时)中碳-氮均受限制。工艺条件和培养基的成分都与实施例1和2所述的小规模实验相似。补充油的速度最初小量增加，然后一轮一轮地逐步增加，直到达到可被保持在最小溶解氧压力下的过程强度。图5显示，更高的油补充速度导致的产物产量增加相当显著。

Claims (6)

1.一种用于生产游霉素的发酵方法，所述方法包括：在液体发酵培养基中培养链霉菌属(Streptomyces)的细菌，其中，包含含碳营养物和含氮营养物的养料被提供给培养基，以及，其中，养料中所述营养物的比例使得：所述培养基中含氮营养物的浓度小于0.5g/l(表示为每升中氮的克数)，以及，所述培养基中含碳营养物的浓度小于5g/l(表示为每升中碳的克数)。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其中，所述养料通过多于一种的亚养料被提供给培养基，以及，其中，每种亚养料包含含氮营养物、含碳营养物或含氮和含碳营养物的组合。
3.如权利要求1所述的发酵方法，其中培养基中氧的量在20-70％空气饱和度之间。
4.如权利要求3所述的发酵方法，其中培养基中氧的量在30-60％空气饱和度之间。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌是纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)或褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)。
6.如权利要求1所述的发酵方法，其中所述含碳营养物中以碳的克数计算大豆油超过50％，这所述含氮营养物中以氮的克数计算氨超过50％。
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