CN105431044A

CN105431044A - 微生物农业

Info

Publication number: CN105431044A
Application number: CN201480030693.7A
Authority: CN
Inventors: 露诗·艾美莉亚·威廉敏娜·唐纳斯; 曼杰·库马尔
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2016-03-23
Also published as: US20160128336A1; WO2014191450A1; ES2694810T3; DK3003047T3; EP3003047B1; EP3003047A1

Abstract

本发明涉及用于增强植物生长和作物产量的组合物。此外，本发明涉及这些组合物的生产和这些组合物的用途。

Description

微生物农业

发明领域

本发明公开了用于控制植物疾病和防止作物的微生物腐败的新的抗微生物组合物。

发明背景

在世界范围内，影响植物健康的病原微生物是对食品生产和生态系统稳定的主要和长期的威胁。从经济学角度以及人道主义角度来看，预防食物产品腐败都非常重要。毕竟世界上许多地方的人们在遭受饥饿。

随着过去几十年间农业生产的加强，生产者变得越来越依赖于将农用化学品(例如杀真菌剂)作为有助于其操作的经济稳定性的相对可靠的作物保护方法。然而，杀真菌剂越来越多的使用导致一些负面影响，即对所施用的杀真菌剂产生的病原体抗性和它们的非靶向的环境影响。此外，增加的杀真菌剂成本(特别是在世界上不太富裕的区域)和对无杀虫剂食物的消费者需求已导致对这些产品的替代物的寻找。还存在一些苛刻的疾病，对于其的化学解决方案很少、无效或不存在。生物控制因此被认为是减少农业中化学品使用的一个替代方式或者补充方式。

在过去四十年间，许多新的杀真菌剂已被开发和销售。然而，这些杀真菌剂仍面临其发展和维持的挑战。一个大的顾虑是抗性发生。对于一些疾病，目前已观察到了对杀真菌剂抗性。

因此，可以得出结论：迫切需要开发出用于控制植物疾病的杀真菌剂的替代物。开发这些替代物时应该考虑到可持续农业，从而替代常规杀真菌剂并帮助克服抗性这一越来越大的问题。

附图说明

图1：种植后84天/用产生那他霉素的菌株ATCC27448(在图1中被称为菌株B)和/或Cercosporazeae-maydis接种后42天时玉米的株高。不同字母(a、b、c)表示在α＝0.05的显著差异结果。

发明描述

本发明通过提供产生那他霉素的细菌菌株解决了所述问题。

在一种实施方式中，本发明涉及用于增强植物生长、作物产量或二者的方法，所述方法包括以下步骤：将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至植物。

通过将产生那他霉素的细菌菌株施用至植物，可在植物中获得正面(positive)的产量响应。此外，通过将产生那他霉素的细菌菌株施用至植物，可改善收获的植物材料的质量，因为植物和/或收获的植物材料中霉菌毒素的含量可被降低。

在一种实施方式中，本发明涉及用于控制植物中的真菌疾病的方法，所述方法包括以下步骤：将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至植物。所述产生那他霉素的细菌菌株在有效治疗由真菌植物病原体介导的植物疾病并抑制真菌植物病原体的生长的条件下被施用。产生那他霉素的细菌菌株可被用于在施用所述菌株后的一定时间段内控制植物中的真菌疾病。所述时间段通常跨越处理植物或其部分后的1-50天。在一个优选的实施方式中，产生那他霉素的细菌菌株为植物及其部分提供持续(consistent)的真菌疾病控制。它可被用于真菌植物病原体的治愈性和/或保护性控制。它以有效量被施用，有效量表示：足以控制或者甚至完全杀灭真菌疾病且同时不展示出植物毒性症状的量。将要施用的量可在宽范围内变化并依赖于许多因素包括但不限于，待被控制的真菌疾病的类型、待被处理的植物和气候条件。

当在本文中使用时，“植物”表示：产生那他霉素的细菌菌株可被施用至整株植物或其部分。因此，在本发明的一个实施方式中，产生那他霉素的细菌菌株可被施用至整株植物或其部分。可被处理的植物多样，从野生植物(需要的或不需要的)到作物植物(例如，通过常规育种和优化技术(例如，杂交或原生质体融合)、通过生物技术和基因工程技术(例如，诱变或重组DNA技术)或通过其组合得到的作物植物)。植物的部分包括植物的所有地上和地下部分以及器官。例如，产生那他霉素的细菌菌株可被施用至例如根、芽、块茎、根茎、幼苗、茎干、枝叶(foliage)、插条(cuttings)、针叶(needles)、秆、叶(leaves)、果实、树干花。

优选地，施用时所述菌株是活的。所述菌株可以在任何生理状态(例如活的的或休眠的(dormant))下被施用。在一种实施方式中，所述菌株是孢子形成菌株。所述菌株可以是纯化的或者未纯化的。所述菌株可以作为生物学上纯净的培养物或接种物被施用。当在本文中使用时，术语“产生那他霉素的细菌菌株”还包括产生那他霉素的细菌的孢子或孢子样结构。所述孢子或孢子样结构自身可以能够产生那他霉素。或者，孢子或孢子样结构可以不能产生那他霉素，但一旦条件适宜，便可生长成产生那他霉素的细菌菌株。

在一种实施方式中，所述产生那他霉素的细菌菌株选自：Streptomycesnatalensis菌株、Streptomycesgilvosporeus菌株、Streptomyceschattanoogensis菌株和Streptomyceslydicus菌株。生产产生那他霉素的细菌菌株的方法在本领域是已知的，例如在WO93/03171、WO93/03169、WO2004/087934、Martin和McDaniel(1977)、Chen等人(2008)、Farid等人(2000)、El-Enshasy等人(2000b),He等人(2002)和Liang等人(2008)中。Streptomycesnatalensis菌株包括但不限于以下菌株：ATCC27448、BCRC15150、CBS668.72、CBS700.57、CCRC15150、CCTMLa2923、CECT3322、CGMCC100017、CGMCC100019、DSM40357、FATCC27448、霍赫海德(Hoogerheide)菌株KNGSF、IFO13367、ISP5357、JCM4693、JCM4795、KCC693、KCCS-0693、KCCS-0795、KCCS-0693、KCCS-0795、KNGS菌株F、NBRC13367、NCIB10038、NCIM2933、NCIM5058、NCIMB10038、NRRL2651、NRRLB-2651、NRRLB-5314、RIA1328、RIA976、VKMAc-1175、VKMAc-1175。此外，实施例中所述的Streptomycesnatalensis菌株可被用在本发明中。在一个优选的实施方式中，Streptomycesnatalensis菌株被用在本发明中。在一个甚至更优选的实施方式中，具有内部编码DS73870和DS73871的Streptomycesnatalensis菌株被用在本发明中。所述菌株根据布达佩斯条约的条款于2014年5月20日被保藏在荷兰真菌培养物保藏中心(CentraalBureauvoorSchimmelcultures，CBS)，乌特勒支，荷兰。S.natalensis菌株DS73870已被保藏为菌株CBS137965。S.natalensis菌株DS73871已被保藏为菌株CBS137966。

Streptomycesgilvosporeus菌株包括但不限于下列菌株：A-5283,ATCC13326,NRRLB-5623。Streptomyceschattanoogensis菌株包括但不限于下列菌株：AS4.1415、ATCC13358、ATCC19739、BCRC13655、伯恩斯(Burns)J-23、CBS447.68、CBS477.68、CCRC13655、CCTMLa2922、CECT3321、CGMCC100020、CGMCC4.1415、CUB136、DSM40002、DSMZ40002、霍特曼(Holtman)J-23、IFO12754、ISP50002、ISP5002、J-23、JCM4299、JCM4571、KCCS-0299、KCCS-0571、KCCS-0571、KCCS-0299、KCTC1087、兰奥特(Lanoot)R-8703、LMG19339、NBRC12754、NCIB9809、NCIMB9809、NRRLB-2255、NRRL-ISP5002、R-8703、RIA1019、VKMAc-1775、VKMAc-1775。Streptomyceslydicus菌株包括但不限于下列菌株：CGMCCNo.1653。

为了控制真菌植物病原体并因此增强植物生长和作物产量，将产生那他霉素的细菌菌株以有效控制真菌疾病的量施用至植物。所述菌株在以每克10³–10¹¹个菌落形成单位(cfu)的浓度递送时有效。对于施用在植物上，可使用0.1-10,000g/ha。可通过例如浸渍(dipping)、喷雾(spraying)、灌溉(irrigating)、浇水(watering)、洒粉(dusting)、湿透(drenching)、发泡(foaming)、涂(painting)、洒(sprinkling)或散布(spreading-on)将产生那他霉素的细菌菌株施用至植物。细菌菌株可以以液体形式例如作为悬液或乳液被施用，或者，当处于干燥形式例如作为颗粒、小球或粉末时，可将产生那他霉素的细菌菌株首先与合适的液体载体混合，然后施用至植物。

产生那他霉素的细菌菌株可被用于控制不同种类植物上的真菌植物病原体，所述植物包括但不限于，玉米(corn)、玉蜀黍(maize)、黑小麦、花生、亚麻、油菜籽(canola)、油菜(rape)、罂粟、橄榄、椰子、草、大豆、棉花、甜菜(例如，糖用甜菜和饲用甜菜)、水稻(任何水稻均可被使用，但优选地选自Oryzasativasp.japonica、Oryzasativasp.javanica、Oryzasativasp.indica及其杂交种)、高粱、小米、小麦、硬质小麦、大麦、燕麦、黑麦、向日葵、甘蔗、草皮、牧草、苜蓿或烟草。它还可被用于控制水果植物的真菌植物病原体，所述水果植物包括但不限于，蔷薇科水果，例如苹果和梨；核果，例如桃、油桃、樱桃、李子和杏子；柑橘类水果，例如，橘子、葡萄柚、酸橙、柠檬、金橘、柑橘(mandarins)和无籽蜜桔(satsumas)；坚果，例如，开心果、杏仁、核桃、咖啡、可可豆和山核桃；热带水果，例如，芒果、木瓜、菠萝、枣和香蕉；和葡萄；和蔬菜包括但不限于叶菜类蔬菜，例如苣荬菜(endives)、野苣(lambslettuce)、芝麻菜(rucola)、茴香、结球莴苣(globe(headlettuce))和散叶色拉(loose-leafsalad)、糖莴苣、菠菜和菊苣(chicory)；芸苔属植物，例如，花椰菜、绿花椰菜、大白菜、甘蓝(冬季甘蓝(winterkale)或卷叶甘蓝(curlykale))、球茎甘蓝、抱子甘蓝、红球甘蓝、白球甘蓝和皱叶甘蓝(savoy)；果菜类，例如茄子、黄瓜、红辣椒、西葫芦、西红柿、密生西葫芦(courgette)、甜瓜、西瓜、南瓜和甜玉米；根菜类，例如块根芹(celeriac)、芜菁(turnip)、胡萝卜、瑞典芜菁(swede)、小萝卜(radishes)、辣根、甜菜根(beetroot)、婆罗门参(salsify)、芹菜；豆类植物，例如豌豆和菜豆；和鳞茎菜类，例如韭菜、大蒜和洋葱。产生那他霉素的细菌菌株也可用来处理观赏植物例如三色堇、凤仙花、牵牛、秋海棠、洋菊梗、向日葵、藿香蓟、菊花和天竺葵。

产生那他霉素的细菌菌株可被原样施用至植物，即不稀释或者不存在额外成分。然而，产生那他霉素的细菌菌株通常以组合物的形式被施用。因此，在一种实施方式中，本发明涉及组合物，其包含产生那他霉素的细菌菌株和农业上可接受的载体。所述组合物可以是即用型组合物或者需要在使用前稀释的浓缩物。优选地，所述组合物包含农业上可接受的载体。当在本文中使用时，术语“农业上可接受的载体”表示：惰性的、固体的或液体的、天然的或合成的、有机的或无机的物质，其与活性剂(例如，产生那他霉素的细菌菌株)混合或组合，用于在植物和其部分上更好的适用性。它涵盖了(生物)杀真菌剂制剂技术中通常使用的所有载体，包括但不限于，水、保护胶体、粘合剂、盐、缓冲剂、稀释剂、矿物质、填充剂、着色剂、消泡剂、胶黏剂、固定剂、增粘剂、树脂、防腐剂、稳定剂、肥料、抗氧化剂、基因激活剂、增稠剂、塑化剂、干燥剂、表面活性剂、分散剂、醇、复合体形成剂、润湿剂、蜡、溶剂、乳化剂、矿物油或植物油、螯合剂及其衍生物和/或混合物。所述组合物可与一种或多种固体或液体载体混合并通过多种方法制备，例如，通过使用常规配制技术将菌株与合适的载体均匀混合或共混。根据所制备的组合物的类型，可需要其它加工步骤例如粒化。

在一个实施方式中，细菌菌株可以以10³-10¹⁰cfu/g载体的水平存在。在一个实施方式中，产生那他霉素的细菌菌株以全部组合物重量的1％(重量/重量)-99％(重量/重量)、优选地10％(重量/重量)-75％(重量/重量)存在。因此，本发明还涉及组合物，其包含产生那他霉素的细菌菌株和农业上可接受的载体。

产生那他霉素的细菌菌株可与其它化合物同时或依次施用至植物。所述化合物的实例是肥料、生长调节剂、(微量)营养素、除草剂、灭鼠剂、杀螨剂(miticides)、避鸟剂、引诱剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀疥虫剂(acaricides)、消毒剂(sterilants)、杀细菌剂、杀线虫剂、杀蝇剂(mollusicides)或其混合物。如果期望，这些其它化合物还可包括农业上可接受的载体。如果同时施用，产生那他霉素的细菌菌株和其它化合物可作为一种组合物被施用或者可作为两种或更多种单独的组合物被施用。如果依次施用，可首先施用产生那他霉素的细菌菌株，随后施用其它化合物；或者可首先施用其它化合物，随后施用产生那他霉素的细菌菌株。当顺序施用产生那他霉素的细菌菌株和其它化合物时，两种施用之间的时间可从例如10分钟到100天不等。

本发明还涉及植物，其包含至少一种产生那他霉素的菌株或根据本发明的组合物。

本发明还涉及使植物生长的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至植物，和(b)使植物生长。所述植物可以根据通常的方法栽植和培养。显然，需要添加足够量的水和养分来实现植物的生长。当然，还可以使用根据本发明的组合物来代替产生那他霉素的细菌菌株。

本发明还涉及生产作物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至植物，和(b)使植物生长以生产作物，和(c)收获作物。可根据本领域已知的方法使植物生长和收获作物。当然，还可以使用根据本发明的组合物来代替产生那他霉素的细菌菌株。

本发明还涉及产生那他霉素的细菌菌株作为生物杀真菌剂的用途。当然，根据本发明的组合物也可被用作生物杀真菌剂。此外，本发明涉及产生那他霉素的细菌菌株作为植物生长强化剂和/或作物产量强化剂的用途。当然，根据本发明的组合物也可被用作植物生长强化剂和/或作物产量强化剂。

在一种实施方式中，本发明的组合物还包含至少一种其它抗微生物化合物。所述抗微生物化合物可以是抗真菌化合物或对抗昆虫、线虫、螨虫和/或细菌的化合物。当然，根据本发明的组合物还可包含任何上述抗微生物化合物中的两种或更多种。本文所使用的化合物还包括另一种抗微生物菌株。优选地，所述菌株是抗微生物细菌菌株。

根据本发明的组合物的pH可以为1-10、优选地2-9、更优选地3-8和最优选地4-7。它们可以是固体，例如粉末组合物，或者可以是液体。本发明的组合物可以是含水的或不含水的即用型组合物，但也可以是需要在使用前用合适的稀释剂(例如水或缓冲体系)稀释的含水的或不含水的浓缩的组合物/悬浮物或储备组合物、悬浮物和/或溶液。本发明的组合物的形式还可以是浓缩的干燥产品例如粉末、颗粒和片剂。它们可被用来制备用于浸渍或者喷洒植物和/或作物的组合物。

产生那他霉素的细菌菌株和任何其它化合物可存在于组分试剂盒(kitofparts)中。所述试剂盒的两个或更多个组分可被单独包装。从而，试剂盒包括一个或多个单独的容器例如小瓶、罐、瓶子、小袋、包或筒，每个容器包含用于农业化学组合物的单独组分。试剂盒的组分在包装中可以是干燥形式或液体形式。如果需要，试剂盒可包含关于溶解化合物的说明。此外，试剂盒可包括关于施用化合物的说明。

在另一方面，本发明涉及通过用产生那他霉素的细菌菌株处理产品来针对真菌保护产品的方法。当然，还可以使用根据本发明的组合物来代替产生那他霉素的细菌菌株。

此外，可以在用产生那他霉素的细菌菌株或者根据本发明的组合物处理产品之前、同时或之后，用至少一种上文所限定的额外抗微生物化合物处理产品。可通过有顺序地施用产生那他霉素的细菌菌株(或者根据本发明的组合物)和额外的抗微生物化合物来处理产品，或者反之亦然。或者，可通过同时施用产生那他霉素的细菌菌株(或者根据本发明的组合物)和额外的抗微生物化合物来处理产品。在同时施用的情况下，活性成分可存在于同时施用的不同组合物中或者活性成分可存在于单一组合物中。在另一种实施方式中，可通过以分开或者交替模式施用活性成分来处理产品。

在一种实施方式中，本发明涉及通过将产生那他霉素的细菌菌株施用至产品来处理产品的方法。通过施用菌株，可防止产品上或中的真菌生长。换言之，菌株保护产品免受真菌生长和/或真菌感染和/或真菌腐败。菌株还可被用于处理已被真菌感染的产品。通过施用菌株，可减缓、终止因这些产品上或中的真菌而导致的疾病发展或者甚至可治愈产品的疾病。在发明的一种实施方式中，用根据本发明的组合物或试剂盒处理产品。

在一种实施方式中，所述产品是食品、饲料、药物、化妆品或农业产品。在一个优选的实施方式中，所述产品是农业产品。

在一个特定的实施方式中，可在收获后处理农业产品。然而优选地，在收获前处理农业产品。

本发明的另一方面涉及产生那他霉素的细菌菌株针对真菌保护产品的用途。在一种实施方式中，本发明涉及用途，其中根据本发明的组合物或者试剂盒被施用至产品。在一种实施方式中，所述产品是食品、饲料、药物、化妆品或农业产品。在一个优选的实施方式中，所述产品是农业产品。

在一种实施方式中，本发明还涉及用产生那他霉素的细菌菌株处理的产品。在一种实施方式中，用根据本发明的组合物或者试剂盒处理产品。因此，本发明涉及包含产生那他霉素的细菌菌株的产品。在一种实施方式中，所述产品包含根据本发明的组合物。经处理的产品可包含在其表面上和/或产品内部的产生那他霉素的细菌菌株。在一种实施方式中，所述产品是食品、饲料、药物、化妆品或农业产品。在一个优选的实施方式中，所述产品是农业产品。

当在本文中使用时，术语“农业产品”还应该被非常广义地理解，其包括但不限于，植物或其部分例如作物例如蔬菜、水果或花。农业产品的实例是谷物，例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、高粱等；甜菜，例如糖用甜菜和饲用甜菜；梨果和核果和浆果，例如苹果、梨、李子、杏子、桃、杏仁、樱桃、草莓、树莓和黑莓；豆类植物，例如菜豆、扁豆、豌豆、大豆；产油植物，例如油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可、落花生(ground-nut)；葫芦科，例如南瓜、小黄瓜、甜瓜、黄瓜、西葫芦、茄子；纤维植物，例如，棉花、亚麻、大麻、黄麻；柑橘类水果，例如，橘子、柠檬、葡萄柚、柑橘、酸橙；热带水果，例如，木瓜、百香果、芒果、杨桃、菠萝、香蕉、猕猴桃；蔬菜，例如菠菜、莴苣、芦笋、十字花科例如卷心菜和芜菁、胡萝卜、洋葱、西红柿、土豆、种用土豆(seed-potatoes)、红辣椒和甜辣椒；月桂类植物，例如鳄梨、肉桂、樟脑树；或产品例如玉蜀黍、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄树、啤酒花、橡胶植物，以及观赏植物，例如瓶花、玫瑰、郁金香、百合花、水仙、番红花、风信子、大丽花、非洲菊、康乃馨、倒挂金钟、菊花，和鳞茎花卉，灌木，落叶树和常青树例如松柏类、温室中的植物和树。

实施例

实施例1

选择产生那他霉素的Streptomycesnatalensis菌株

从内部培养物保藏中选择以下8种产生那他霉素的Streptomycesnatalensis菌株并在体外实验中检测它们的抗真菌活性：DS10599、DS73309、DS10601、DS73871、DS73870、DS73311、DS73352和DS73312。

针对所选择的S.natalensis菌株，检测3种真菌植物病原体：Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici(CBS414.90)、Colletotrichumgloeosporioides(CBS272.51)和Alternariaalternata(CBS103.33)。Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici是在例如西红柿作物中引起产量损失的土传真菌(镰刀菌萎蔫病)。Colletotrichumgloeosporioides导致例如炭疽病，这是可通过叶子和果实上的深褐色病变被辨认的植物疾病。Alternariaalternata是在世界范围内出现的腐生物，其可在经济上重要的宿主植物中引起植物致病性反应。如下所述针对这些真菌植物病原体，检测所选择的S.natalensis菌株。

将来自所选择的S.natalensis菌株的冻结小瓶(甘油储液)或冻干管转移至含20ml酵母麦芽提取培养液(YME)的100ml带有挡板的锥形瓶中。将冻干管重新悬浮在生理盐水中并在转移至培养基之前，在室温下贮存1小时。将锥形瓶在培养摇床中在28℃、180rpm下培养3天。

对于每种菌株，将200μl液体培养基转移至YME琼脂平板(含20ml培养基的90mm培养皿)并利用无菌涂布器使其分散在培养基表面。随后，将琼脂平板在28℃下培养4天以增强平板表面的完全菌落覆盖。

将所选择的真菌从甘油储液(200μl)直接涂布至YME琼脂并随后在28℃下培养4天。

如下所述进行生物检测。如上所述制备的过度生长的Streptomyces和真菌平板被用于产生琼脂栓塞(plug)。通过使用无菌穿孔器(直径为11mm)切掉琼脂并随后用预先灭菌的刮铲(spatula)除去它来制备栓塞。用在培养皿背面的线标记新鲜产生的未接种的YME琼脂平板。将这条具有4cm的固定长度的线置于培养皿的中央。随后，将经Streptomyces接种的琼脂栓塞转移至新鲜YME琼脂平板上所述线的左端。对于各种真菌，重复上述“栓塞转移”步骤。将各种真菌栓塞放置在相同YME琼脂平板上所述线的右端。一式三份地，用每种真菌挑战每种Streptomyces菌株。对于每种被检测的真菌，通过使用被放置在培养皿左侧的未经接种的琼脂栓塞来取得(一式三份地)对照样品。接下来，将平板放置在培养箱中，其中栓塞在上。随后，将平板在28℃贮存7天。7天后，在琼脂栓塞(Streptomyces样品)的相反方向上测量真菌菌落的半径。对于对照样品，重复该步骤。通过使用下式来计算抑制区(以百分比计)：100％*(r₀-r₁)/r₀，其中r₀是来自对照样品的真菌菌落的半径(以mm计，针对栓塞半径进行校正)且其中r₁是来自Streptomyces抑制的样品的真菌菌落的半径(以mm计，针对栓塞半径进行校正)

结果显示：朝向产生那他霉素的S.natalensis菌株的真菌生长被显著抑制。所有菌株均胜过无S.natalensis的对照样品且根据被检测的菌株，平均抑制从53％到66％不等(参见表1)。结果清楚显示：S.natalensis菌株具有抑制不同种类的真菌植物病原体的潜能。

具有内部编码DS73870和DS73871的S.natalensis菌株被选择用于进一步的研究。根据布达佩斯条约的条款，所述菌株于2014年5月20日被保藏在荷兰真菌培养物保藏中心(CBS)，乌特勒支，荷兰。S.natalensis菌株DS73870已被保藏为菌株CBS137965。S.natalensis菌株DS73871已被保藏为菌株CBS137966。

实施例2

产生那他霉素的Streptomyces菌株的抗真菌活性

在体外实验中检测下列产生那他霉素的Streptomyces菌株的抗真菌活性：StreptomycesnatalensisATCC-27448(模式菌株)、StreptomycesnatalensisDS73871、StreptomycesnatalensisDS73870和StreptomyceschattanoogensisATCC-19673。

针对所选择的Streptomyces菌株，检测5种真菌植物病原体：Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici(CBS414.90)、Colletotrichumgloeosporioides(CBS272.51)、Alternariaalternata(CBS103.33)、Aspergillusniger(ATCC16404)和Botrytiscinerea(CBS156.71)。Aspergillusniger(也被称为黑霉菌)是最常见的Aspergillus物种之一。这种普遍存在的土壤居住者是不同类型作物严重损失的原因，例如：洋葱(黑腐病)、葡萄(果腐病)和花生(冠腐病)。Botrytiscinerea是灰霉病的引发剂。该疾病在大范围作物中被记录并具有高的经济影响。对于与Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici、Colletotrichumgloeosporioides和Alternariaalternata相关的植物疾病，参见实施例1。如下所述，针对这些真菌植物病原体检测所选择的S.natalensis菌株。

将来自所选择的S.natalensis菌株的冻结小瓶(甘油储液)转移至含20ml酵母麦芽提取培养液(YME)的100ml带有挡板的锥形瓶中。将锥形瓶在培养摇床中在28℃、180rpm下培养3天。

对于每种菌株，将200μl液体培养基转移至YME琼脂平板并在28℃下培养4天以增强平板表面的完全菌落覆盖。

将Botrytiscinerea从甘油储液(100μl)直接涂布至YME琼脂并随后在28℃下培养9天。将所有其它所选择的真菌从甘油储液(200μl)直接涂布至YME琼脂并随后在28℃下培养4天。

根据实施例1中所述的程序进行生物检测，其中变化是：所有变量以五倍被检测。根据对照样品的真菌菌落生长，将平板在28℃下储存7天或11天。培养之后，根据实施例1中所述的方法测量真菌菌落的半径。

结果显示：在所有被检测的样品中，与对照样品相比，朝向产生那他霉素的菌株(Streptomycesnatalensis&Streptomyceschattanoogensis)的真菌生长被抑制。根据所测试的菌株，平均抑制从2％到78％不等(参见表2)。因此，这些结果清楚显示：产生那他霉素的Streptomyces菌株具有抑制不同物种真菌植物病原体的潜能。

与S.chattanoogensis相比，S.natalensis菌株显示出真菌半径发展的更大降低。此外，S.natalensis菌株DS73870和DS73871明显胜过S.natalensisATCC-27448菌株(＝模式菌株)。根据所检测的真菌菌株，S.natalensisATCC-27448的平均抑制在26％-53％之间不等，而S.natalensisDS73870和DS73871的平均抑制在59％-78％之间不等(参见表2)。

实施例3

产生那他霉素的Streptomycesnatalensis菌株DS73871&DS73870抵抗Verticilliumalbo-atrum的抗真菌活性

在另一个实验中，检测产生那他霉素的StreptomycesnatalensisDS73871和StreptomycesnatalensisDS73870抵抗Verticilliumalbo-atrum(CBS321.91)的抗真菌活性。

Verticilliumalbo-atrum与黄萎病有关。这种土传真菌可导致多种作物(主要在较冷气候区域)严重的收获损失。

根据实施例1中所述的方法进行实验，条件是：所有变量以五倍被检测。为了产生真菌栓塞，将Verticilliumalbo-atrum(CBS321.91)从甘油储液(200μl)直接涂布至YME琼脂并随后在28℃下培养4天。

朝向产生那他霉素的Streptomycesnatalensis菌株DS73871和DS73870的Verticilliumalbo-atrum的真菌半径在第11天时分别减小44％和45％。25天之后，对于菌株DS73871和DS73870，抑制区甚至分别进一步减小至76％和71％(参见表3)。

这些结果清楚显示：S.natalensisDS73870和DS73871具有抑制Verticilliumalbo-atrum的能力。

实施例4

产生那他霉素的StreptomycesnatalensisDS73871&DS73870抵抗Cercosporazeae-maydis的抗真菌活性

在另一个实验中，检测产生那他霉素的Streptomycesnatalensis菌株DS73871和DS73870抵抗Cercosporazeae-maydis(CBS117757)的抗真菌活性。Cercosporazeae-maydis导致“灰色叶斑病”，其是玉蜀黍上最重要的叶部疾病之一。

根据实施例1中所述的方法进行实验，唯一例外是：将用于“生物检测”的培养皿(包含细菌和霉菌栓塞二者)在28℃下培养28天而非7天。

结果(参见表4)清楚显示了S.natalensis菌株DS73870和DS73871对Cercosporazeae-maydis生长的抑制效果。对于S.natalensisDS73871和S.natalensisDS73870，朝向细菌菌株的真菌菌落的半径分别减少84％和63％。

实施例5

与其它Streptomycessp.相比，产生那他霉素的StreptomycesnatalensisDS73871和DS73870抵抗Colletotrichumgloeosporioides的抗真菌活性

该实施例描述了产生那他霉素的菌株StreptomycesnatalensisDS73871&DS73870和一些不产生那他霉素的Streptomycessp.(S.griseus,S.griseoviridis和S.rochei)抵抗真菌植物病原体Colletotrichumgloeosporioides的抗真菌活性的比较。所分析的不产生那他霉素的菌株获取自下列公共保藏：S.griseus(NRRLB1354)、S.griseoviridis(NRRL2427)和S.rochei(CBS939.68)。

根据实施例1中所述的方法进行实验，条件是：所有变量以五倍被检测且预培养时间(培养液)从3天增加至4天以使所有菌株完全生长。在28℃下培养6天后，测定对Colletotrichumgloeosporioides(CBS272.51)的菌落半径的真菌抑制。

结果可在表5中找到。在所有样品中，与对照相比(无Streptomycessp.)，朝向相对的Streptomyces物种的C.gloeosporioides的真菌半径明显减小。此外，与不产生那他霉素的Streptomyces物种(在7％-33％之间)相比，StreptomycesnatalensisDS73871和DS73870二者均显示出更强的抑制效果(分别为56％和54％)。

实施例6

与其它Streptomycessp.相比，产生那他霉素的StreptomycesnatalensisDS73871&DS73870抵抗Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici的抗真菌活性

在另一个实验中，比较产生那他霉素的Streptomycesnatalensis菌株DS73871&DS73870与不产生那他霉素的Streptomyces物种Snoursei和S.griseus的抵抗Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici的抗真菌活性。

文献中充分描述了所有3种被选择的Streptomyces物种产生抗真菌组分的能力。所分析的不产生那他霉素的菌株获取自下列公共保藏：Streptomycesnoursei(CBS240.57)和S.griseus(NRRLB1354)。

根据实施例1中所述的方法进行实验，条件是：所有变量以五倍被检测且预培养时间(培养液)从3天增加至4天以使所有菌株完全生长。在28℃下培养7天后，测定Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici(CBS414.90)菌落半径的真菌抑制。

Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici(CBS414.90)的菌落生长可在表6中找到。当针对Streptomyces物种挑战时，平均抑制区明显减小(在11％-60％之间)。然而，与不产生那他霉素的Streptomyces物种(对于S.griseus和S.noursei，分别为11％和32％)相比，产生那他霉素的Streptomyces物种的真菌抑制明显更强(对于DS73870和DS73871，分别为60％和54％)。

实施例7

与纯净的那他霉素相比，产生那他霉素的StreptomycesnatalensisATCC27448抵抗Colletotrichumgloeosporioides的抗真菌活性

在另一个实验中，在YME琼脂平板上培养产生那他霉素的菌株StreptomycesnatalensisATCC27448以测定琼脂培养基中的那他霉素浓度。在下一步中，将Streptomycesnatalensis菌株与一定浓度范围的纯净那他霉素(溶解在甲醇中)抵抗Colletotrichumgloeosporioides的生物活性进行比较。

将包含StreptomycesnatalensisATCC27448培养基的冻结小瓶转移至含20ml酵母麦芽提取培养液(YME)的100ml带有挡板的锥形瓶中。将锥形瓶在培养摇床中在28℃、180rpm下培养4天。将200μl完全生长的培养液转移(一式两份地)至精确包含20mlYME琼脂(YMEA)的90mm培养皿。随后，利用无菌涂布器将接种物分散在培养基表面。将平板在28℃下培养4天以增强完全的菌落覆盖。培养后，将平板冻干(Alpha2-4LD冻干机,Christ)。将每个琼脂平板的冻干内容物转移至容量瓶中并用预热的MilliQ(50℃)填充至终体积为500ml。

搅拌该溶液持续约30分钟、离心(8分钟，21000rcf)并随后检测上清液的那他霉素浓度。通过使用众所周知的基于文献的方法(HPLC-UV)来测定那他霉素浓度并反算在培养基平板中的平均浓度。

在下一步中，采用上述流程，在YMEA(每个90mm培养皿中20ml培养基)上繁殖完全生长的StreptomycesnatalensisATCC27448培养物。利用如实施例1中所述的生物检测，该培养物被用于针对Colletotrichumgloeosporioides(CBS272.51)的生物检测。除了经StreptomycesnatalensisATCC27448接种的样品之外，通过使用未接种的琼脂栓塞来获取对照样品。

平行地，生产含不同浓度的纯净那他霉素的YMEA平板。因此，通过将那他霉素(分析级,DSMFoodSpecialties,Delft,荷兰)溶解在甲醇(Merck,用于液相色谱的梯度级,≥99.9％)中来制备那他霉素储液。随后，以1:19的比率将那他霉素储液加入到液体YME琼脂中(45℃，通过降低含水量从而针对甲醇加入进行校正)并在培养基中彻底混合。琼脂中的最终那他霉素浓度分别为：500、375、250、175、100、75、50、25、10和0ppm那他霉素。0ppm的那他霉素YMEA平板仅包含5％(重量/重量)甲醇。将液体YEMA转移至培养皿(每个90mm培养皿中20ml培养基，以三倍进行)。凝固后，YEMA平板被用于如实施例1中所述的针对Colletotrichumgloeosporioides(CBS272.51)的生物检测。在同一天内处理所有样品。

在28℃下培养7天后，测定Colletotrichumgloeosporioides(CBS272.51)的真菌半径和抑制区(参见实施例1中所述的方法)。

在琼脂培养基中预培养期间由StreptomycesnatalensisATCC27448产生的那他霉素的平均浓度被测定为低于10ppm(但不是0ppm)。通过将10ppm纯净的那他霉素直接溶解在琼脂栓塞中，Colletotrichumgloeosporioides的抑制区没有由StreptomycesnatalensisATCC27448琼脂栓塞产生的抑制区大(参见表7)。在高得多的浓度等级(约375ppm)下，匹配到相似的抑制区。

实施例8

处理玉米植物

提供产生那他霉素的细菌菌株(ATCC27448)的孢子的甘油储液。来自储液的等分试样被用于在含有200mL不含蔗糖的YEME液体培养基(参见www.elabprotocols.com)和玻璃珠(用于打碎凝聚体)的1l烧瓶中培养菌株。将培养瓶放在28℃的200rpm摇床中持续72小时。将产生的悬浮物转移至250ml管中并在8000rpm下离心15分钟。将产生的沉淀物重新悬浮在无菌水中至终浓度为200mg/ml。这种悬浮物被用作用于以下温室实验的菌株接种物。

在30％V8汁液(juice)琼脂平板中培养Cercosporazeae-maydis并在日见光、25℃下培养2周(参见Beckman和Payne,1983)。为了制备用于温室研究的接种物，通过用3ml0.01％Tween-20灌注(flood)平板并用无菌的移液吸头轻轻地取出孢子来收获分生孢子。进行该过程两次。所产生的分生孢子悬浮物获得约10⁴个分生孢子/ml。

通过将玉米种子(PioneerHybrid35F40)首先用70％乙醇冲洗、然后浸在次氯酸钠溶液中来对其进行表面消毒。将得到的玉米种子浸在0.5％NaClO+一滴Tween-20中持续20分钟。然后用无菌蒸馏水冲洗种子5次。

将种子播撒在含粗糙的/膨胀的蛭石(Therm-O-RockWest,Inc.,AZ)的3.25”x3.25”x3.25”的盆中。每个盆中播撒两粒种子。当幼苗出现时，将它们变稀疏以在每个盆中留下一株植物。

使植物在具有以下条件的温室中生长：白天温度为25℃且夜间温度为18℃；14小时日光和10小时黑暗。在整个生长阶段，向植物提供完全肥料。

种植后四十二(42)天，开始处理。所施加的处理为：

a)处理1：对照；

b)处理2：首先用产生那他霉素的细菌菌株接种植物，4天后，用Cercosporazeae-maydis接种植物；

c)处理3：首先用Cercosporazeae-maydis接种植物，4天后，用产生那他霉素的细菌菌株接种植物；

d)处理4：用产生那他霉素的细菌菌株接种植物；

e)处理5：用Cercosporazeae-maydis接种植物。

每种处理进行10个生物学重复。

通过将Cercosporazeae-maydis孢子悬浮物直接喷洒在叶子上来用病原体接种玉米植物。然后将玉米植物封闭在透明塑料篷中以维持植物周围相对高的湿度。高相对湿度是在玉米叶片上建立Cercosporazeae-maydis感染的要求。施用处理后5天，除去塑料覆盖。

通过将2ml产生那他霉素的细菌菌株添加在植物的根部区域来施用该菌株。这等效于每盆400mg接种物。

开始每种处理后，监测植物的疾病发展以及生长促进五周。

为了评估生长是否存在统计学显著差异，在种植后天数(DAP)为84天时测量株高(立高法(standingheightmethod))。结果显示：在84DAP时，用单独的产生那他霉素的细菌菌株处理的植物比任何其它处理产生更高的植物(参见图1)。这证明：产生那他霉素的细菌菌株增强了植物生长。

实施例9

利用StreptomycesnatalensisDS73870和DS73871的植物处理对人为地用Rhizoctoniasolani感染的生长在土壤中的莴苣(lettuce)的影响

从9日龄的MEA培养基琼脂平板(培养温度为24℃)中获得Rhizoctoniasolani(CBS323.84)(土传的植物病原体)并将其溶解在水中。将真菌接种物(50ml/l土壤)穿过土壤(90％泥炭、10％沙)彻底混合。用经接种的土壤填充苗盘(每个苗盘7.5升土壤)并培养2天。随后，将种子放置在土壤中约1cm深度处。

播种后第4天(苗期)开始植物处理并每周重复持续最多3周。对于每种植物处理，制备新鲜的S.natalensis培养液。因此，将来自Streptomycesnatalensis菌株DS73870的冻结小瓶转移至含20ml酵母麦芽提取培养液(YME)的100ml带有挡板的锥形瓶中。将锥形瓶在培养摇床中在28℃、180rpm下培养3-4天(G24环境培养振荡器,NewBrunswickScientificCo.)。随后，将2ml培养的培养液转移至含200mlYME培养液的500ml带有挡板的锥形瓶中。将培养基在28℃、180rpm下培养另外4天(轨道孵育器，Inr200-010V,Gallenkamp)。培养S.natalensisDS73870样品之后，平均细菌计数为7.1(+/-0,6)logCFU/ml。

将样品运送(在冷却条件下)至温室实验室设施中并在24小时内处理。因此，将包含S.natalensisDS73870的培养基在饮用水中稀释100倍。通过给幼苗或茎周围的土壤浇水，将7ml这种经稀释的培养基加入到每种植物中。在与经S.natalensis处理的样品相同的条件下处理对照样品，例外是：仅加入饮用水。

每种处理重复检验4次。每次重复由含96粒种子的1个苗盘组成。根据EPPO指南PP1/148(2)、PP1/135(3)和PP1/152(4)进行试验。将处理维持在受控制的温室条件下并以设定的时间间隔浇水。播种后，每周评估幼苗或植物的：萌发率和疾病严重度持续最长1个月。

表8(萌发率)和表9(植物疾病严重度)总结了该研究的结果。与利用无菌培养基的处理(对照)相比，当利用StreptomycesnatalensisDS73870处理植物时，观察到的未受影响植物的数目增加。此外，与经S.natalensis处理的样品相比，对照样品中未萌发或者萌发后死亡的莴苣植物(被归类为未出现)的量要高得多。对于植物疾病严重度，也观察到了这种趋势，其中与对照相比，经S.natalensisDS73870处理的植物显示出明显降低(参见表9)。

总之，通过向植物施用产生那他霉素的S.natalensis菌株，受真菌植物病原体影响的作物的植物生长和生命力二者均被增强。

表1：在YME琼脂平板上在28℃下培养7天后，针对一些Streptomycesnatalensis菌株检测的不同植物病原体的真菌半径

表2：在YME琼脂平板上在28℃下培养7天或11天后，针对一些产生那他霉素的Streptomyces物种的菌株检测的不同植物病原体的真菌半径

表3：在YME琼脂平板上在28℃下培养11天和25天后，针对StreptomycesnatalensisDS73870和DS73871检测的Verticilliumalbo-atrum(CBS321.91)的真菌半径

表4：在YME琼脂平板上在28℃下培养28天后，针对StreptomycesnatalensisDS73870和DS73871检测的Cercosporazeae-maydis(CBS117757)的真菌半径

表5：在YME琼脂平板上在28℃下培养6天后，针对一些Streptomycessp.检测的Colletotrichumgloeosporioides(CBS272.51)的真菌半径

表6：在YME琼脂平板上在28℃下培养7天后，针对一些Streptomycessp.检测的Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici(CBS414.90)的真菌半径

表7：琼脂栓塞生物检测。针对S.natalensisATCC27448和不同比率的溶解在甲醇(5％重量/重量)中的纯净那他霉素检测的Colletotrichumgloeosporioides(CBS272.51)的真菌半径。在28℃下培养7天后，在YME琼脂平板上产生的结果。

*溶解在含5％重量/重量甲醇的YMEA中，给出的浓度是琼脂栓塞的浓度表8：利用StreptomycesnatalensisDS73870的植物处理对人为地用Rhizoctoniasolani感染的生长在土壤中的莴苣的萌发率的影响。

*从播种日(第0天)开始测量

**未萌发或者萌发后死亡

表9：利用StreptomycesnatalensisDS73870的植物处理对人为地用Rhizoctoniasolani感染的生长在土壤中的莴苣的植物疾病严重度的影响。

*从播种日(第0天)开始测量

**未萌发或者萌发后死亡

参考文献

BeckmanPMandPayneGA(1983),CulturaltechniquesandconditionsinfluencinggrowthandsporulationofCercosporazeae-maydisandlesiondevelopmentincorn.Phytopathology73:286-289.

ChenGQ,LuFPandDuLX(2008),NatamycinproductionbyStreptomycesgilvosporeusbasedonstatisticaloptimization.J.Agric.FoodChem.56:5057-5061.

FaridMA,El-EnshasyHA,El-DiwanyAIandEl-Sayed,EA(2000),OptimizationofthecultivationmediumfornatamycinproductionbyStreptomycesnatalensis.J.BasicMicrobiol.40:157-166.

El-EnshasyHA,FaridMAandEl-Sayed,EA(2000),InfluenceofinoculumtypeandcultivationconditionsonnatamycinproductionbyStreptomycesnatalensis.J.BasicMicrobiol.40:333-342.

HeYL,WuJG,LuFPandDuLX(2002)Fed-batchfermentationtoimprovetheyieldofnatamycin.Med.Biotechnol.9:224-226.

LiangJG,XuZN,LiuTF,LinHPandCenPL(2008),EffectsofcultivationconditionsontheproductionofnatamycinwithStreptomycesgilvosporeusLK-196.EnzymeMicrob.Technol.42:145-150.

MartinJFandMcDanielLE(1977),Productionofpolyenemacrolideantibiotics.AdvancesinAppl.Microbiol.21:1-52.

申请人或代理人文件参考编号29371-WO-PCT

国际申请号

与被保藏的微生物相关的说明

(PCTRule13bis)

表PCT/RO/134(1992年7月)

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国际申请号

与被保藏的微生物相关的说明

(PCTRule13bis)

表PCT/RO/134(1992年7月)

Claims

1.一种用于增强植物生长、作物产量或二者的方法，所述方法包括将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至植物的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述菌株以包含农业上可接受的载体的组合物的形式被施用。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物包含10³-10¹⁰cfu/g载体。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述产生那他霉素的细菌菌株选自Streptomycesnatalensis菌株、Streptomycesgilvosporeus菌株和Streptomyceschattanoogensis菌株。

5.组合物，其包含产生那他霉素的细菌菌株和农业上可接受的载体。

6.植物，其包含至少一种产生那他霉素的细菌菌株或根据权利要求5的组合物。

7.一种使植物生长的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至植物，和

b)使所述植物生长。

8.一种生产作物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至植物，

b)使所述植物生长以生产作物，和

c)收获所述作物。

9.一种通过用至少一种产生那他霉素的细菌菌株处理产品来保护所述产品免受真菌的方法。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述产品是农业产品。

11.根据权利要求10所述的方法，其中在收获前处理所述产品。

12.农业产品，其包含至少一种产生那他霉素的细菌菌株。

13.至少一种产生那他霉素的细菌菌株用于保护产品免受真菌的用途。