CN109055451A - 一种l-丙氨酸的生物发酵方法 - Google Patents

一种l-丙氨酸的生物发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑丙氨酸的生物发酵方法。本发明保护一种生产L‑丙氨酸的方法，包括如下步骤：采用种子培养基培养L‑丙氨酸菌株，所述种子培养基中采用酵母浸粉和硫酸铵作为氮源。本发明通过优化种子培养阶段的发酵工艺，提高种子的活力，进而有效提高了L‑丙氨酸的生产强度，而且不会额外增加原料成本。通过优化种子培养阶段的发酵工艺，包括优化培养基和发酵模式，提高了L‑丙氨酸的生产强度，降低了生物制备L‑丙氨酸的生产成本，有利于L‑丙氨酸的生物法工业生产。

Description

一种L-丙氨酸的生物发酵方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种L-丙氨酸的生物发酵方法。
背景技术
L-丙氨酸在日化、食品和医药领域有着广泛的用途。在日化领域，L-丙氨酸是生产无磷洗涤剂甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)的主要原料，随着欧美国家对含磷洗涤剂使用的限制，无磷洗涤剂近几年发展迅猛，对MGDA原料L-丙氨酸的需求日益提升；在食品领域，L-丙氨酸在改善风味效果的同时可显著提高食品及饮料中的蛋白质利用率，食用后能迅速消除疲劳、恢复体力；在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6的重要原料、是营养剂补糖氨基酸营养输液的主要成分、同时还是一种良好的利尿药。
微生物发酵法生产L-丙氨酸在工业生产中已逐渐代替原有的酶催化方法。其中，发酵过程技术是提高L-丙氨酸生产强度，降低生产成本的重要过程，提高L-丙氨酸的生产强度，降低生产成本是产业化发展的必由之路，目前提高L-丙氨酸生产强度如下：(1)通过采用在培养基中添加高浓度的酵母浸粉、玉米浆、大豆蛋白胨等有机氮源可以提高菌株的生长性能，提高L-丙氨酸的生产强度。(2)采用的好氧和限氧两阶段发酵，好氧阶段提高菌株生长，厌氧阶段用于生产L-丙氨酸也能有效提高L-丙氨酸的生产强度。但考虑到添加高浓度有机氮源会提高原料成本，增加后期分离提取的难度；两阶段发酵会导致后期菌株衰退太快，生产速率明显变慢。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产L-丙氨酸的方法，以达到提高发酵强度，降低发酵成本，满足工业生产的需要的目的。
本发明提供了一种生产L-丙氨酸的方法，包括如下步骤：(1)采用种子培养基培养L-丙氨酸菌株，所述种子培养基中采用酵母浸粉和硫酸铵作为氮源。
所述种子培养基中含有1-5g/L酵母浸粉和3-10g/L硫酸铵。
所述种子培养基中具体可含有2.5g/L酵母浸粉和6g/L硫酸铵。
所述种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在种子培养基中的浓度为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉1-5g/L，硫酸铵3-10g/L，磷酸氢二钠10-20g/L，磷酸二氢钠10-20g/L，七水硫酸镁1-3g/L，FeCl3·6H2O 7.5-15mg/L，CoCl2·6H2O 0.5-2mg/L，CuCl2·2H2O 0.5-2mg/L，ZnCl20.5-2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5-2mg/L，MnCl2·4H2O 1-4mg/L。
所述溶质及其在种子培养基中的浓度具体可为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉2.5g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
所述培养过程中进行批式补料，在培养过程中流加物料；所述物料包括800-1000g/L葡萄糖，10-20g/L七水硫酸镁，手动控制流加速度使葡萄糖浓度维持在6-8g/L。所述物料具体为800g/L葡萄糖和10g/L七水硫酸镁。
所述培养时间为10-12h。所述培养时间具体可为10h。
所述培养过程中通过添加氨水控制培养体系pH保持在7.0。
所述培养具体可在发酵罐中进行，所述培养条件具体可为：温度30℃，通气量0.6vvm，罐压0.04-0.06MPa，溶氧量控制为20％且与与搅拌转速关联。
所述L-丙氨酸菌株具体可以种子液的形式加至种子培养基中。所述接种量具体可为3％(v/v)。所述种子液的菌液OD550nm具体可为2.0-3.0。所述种子液的制备方法具体可为：将活化的L-丙氨酸菌株接种于LB液体培养基中，30℃、250rpm培养得到种子液。
所述方法还包括步骤(2)将步骤(1)的产物接种至发酵培养基中进行发酵；
所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度为：葡萄糖100-200g/L，硫酸铵3-10g/L，磷酸氢二钠2.5-7.5g/L，磷酸二氢钠2.5-7.5g/L，七水硫酸镁1-2g/L，FeCl3·6H2O 7.5-15mg/L，CoCl2·6H2O 0.5-2mg/L，CuCl2·2H2O 0.5-2mg/L，ZnCl20.5-2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5-2mg/L，MnCl2·4H2O 1-4mg/L。
所述溶质及其在发酵培养基中的浓度具体可为：葡萄糖160g/L，硫酸铵5g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钠5g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
所述发酵培养基的pH为6.5。
所述步骤步骤(1)的产物具体可以10％(v/v)接种量转移至发酵培养基中。
所述发酵具体可在发酵罐中进行。所述发酵条件具体可为：温度30℃，厌氧，罐压0.04-0.06MPa。所述发酵时间具体可为48h。
将步骤(2)发酵得到的产物离心取上清后得到L-丙氨酸。
以上任一所述L-丙氨酸菌株具体可为大肠埃希氏菌，更具体可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A26。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的L-丙氨酸产品。
本专利提供了一种L-丙氨酸的生产方法，通过优化种子培养阶段的发酵工艺，提高种子的活力，进而有效提高了L-丙氨酸的生产强度，而且不会额外增加原料成本。通过优化种子培养阶段的发酵工艺，包括优化培养基和发酵模式，提高了L-丙氨酸的生产强度，降低了生物制备L-丙氨酸的生产成本，有利于L-丙氨酸的生物法工业生产。
附图说明
图1为种子培养基中的氮源的优化。
图2为种子培养模式的优化。
图3为种子培养过程优化后与对照在L-丙氨酸发酵效果上的区别。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中采用的实验菌株均为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A26，该菌株记载在专利“高产L-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产L-丙氨酸的方法”中，该专利的授权公告号为：CN 103602623B。
L-丙氨酸的定量采用Primesep 100(250*4.6mm，美国SIELC)液相色谱分离柱进行，L-丙氨酸的标准品购买自sigma。流动相的为含有30％(体积百分含量)乙腈和0.1％(体积百分含量)三氟乙酸的水溶液，流速为0.5ml/min，检测波长为210nm，L-丙氨酸的出峰时间为13.086min。
实施例1、种子培养基的优化
1、菌种活化：将实验菌株在LB固体培养基上进行划线，在恒温培养箱中，30℃静置培养1-2天，用于摇瓶接种。
2、摇瓶培养：将步骤1活化的单菌落接种于含有200ml LB液体培养基的2000ml三角瓶中，30℃、250rpm培养1-2天，菌液OD550nm达到2.0-3.0。
3、种子罐培养：完成步骤2后，将菌液以3％(v/v)接种量转移至含有6L种子培养基的10L种子发酵罐中进行发酵，发酵条件如下：温度30℃，搅拌转速300rpm，通气量0.6vvm，罐压0.04-0.06MPa，培养过程中通过添加氨水控制发酵体系pH保持在7.0，发酵时间24h。
步骤3使用的种子培养基为如下种子培养基：
种子培养基I(采用酵母浸粉作为氮源)：葡萄糖80g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，酵母浸粉(安琪)5g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
种子培养基Ⅱ(采用玉米浆干粉作为氮源)：葡萄糖80g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，玉米浆干粉7g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
种子培养基Ⅲ(采用硫酸铵作为氮源)：葡萄糖80g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，硫酸铵12g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
种子培养基Ⅳ(采用酵母浸粉+硫酸铵作为氮源)：葡萄糖80g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，酵母浸粉2.5g/L，硫酸铵6g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
种子培养基Ⅴ(采用玉米浆干粉+硫酸铵作为氮源)：葡萄糖80g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，玉米浆干粉3.5g/L，硫酸铵6g/L，FeCl3·6H2O7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
4、完成步骤3后，统计发酵体系菌落数，结果如图1所示。有机氮源含有很多种有益于菌株生长的微量元素，因此效果更好。但是酵母浸粉价格相对偏高，会增加生产成本，而玉米浆杂质多，不利于分离提取。综合考虑，最终选择酵母浸粉和硫酸铵的混合物为氮源。
实施例2、种子发酵模式优化
1、菌种活化：将实验菌株在LB固体培养基上进行划线，在恒温培养箱中，30℃静置培养1-2天，用于摇瓶接种。
2、摇瓶培养：将步骤1活化的单菌落接种于含有200ml LB液体培养基的2000ml三角瓶中，30℃、250rpm培养1-2天,菌液OD550nm达到2.0-3.0。
3、完成步骤2后，采用如下两个发酵模式进行发酵：
(1)批式发酵：完成步骤2后，将菌液以3％(v/v)接种量转移至含有6L种子培养基的10L种子发酵罐中进行发酵，发酵条件如下：温度30℃，通气量0.6vvm，罐压0.04-0.06MPa，溶氧与搅拌转速关联，培养过程中通过添加氨水控制发酵体系pH保持在7.0，发酵时间24h。
种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母浸粉(安琪)2.5g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
(2)批式补料发酵：完成步骤2后，将菌液以3％(v/v)接种量转移至含有6L种子培养基的10L种子发酵罐中进行发酵，发酵条件如下：温度30℃，通气量0.6vvm，罐压0.04-0.06MPa，溶氧与搅拌转速关联，培养过程中流加物料(包括800g/L葡萄糖和10g/L七水硫酸镁)，手动控制补料速度使发酵体系中的葡萄糖浓度维持在6-8g/L，通过添加氨水控制发酵体系pH保持在7.0，发酵时间24h。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母浸粉(安琪)2.5g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
4、完成步骤3后，统计发酵体系菌落数，结果如图2所示。批式补料发酵优于批式发酵，后续实施例将选择批式补料发酵进行种子培养，培养时间选择10-12h时进行移种。
实施例3、利用优化的方法生产L-丙氨酸
1、菌种活化：将实验菌株在LB固体培养基上进行划线，在恒温培养箱中，30℃静置培养1-2天，用于摇瓶接种。
2、摇瓶培养：将步骤1活化的单菌落接种于含有200ml LB液体培养基的2000ml三角瓶中，30℃、250rpm培养1-2天,菌液OD550nm达到2.0-3.0。
3、种子罐发酵：完成步骤2后，将菌液以3％(v/v)接种量转移至含有6L种子培养基的10L种子发酵罐中进行发酵，发酵条件如下：温度30℃，通气量0.6vvm，罐压0.04-0.06MPa，溶氧控制在20％并与搅拌转速关联，培养过程中流加物料(包括800g/L葡萄糖和10g/L七水硫酸镁)，手动控制补料速度使发酵体系中的葡萄糖浓度维持在6-8g/L，通过添加氨水控制发酵体系pH保持在7.0，发酵时间10h。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母浸粉(安琪)2.5g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
4、完成步骤3后，将菌液以10％(v/v)接种量转移至含有60L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵条件如下：温度30℃，厌氧发酵，罐压0.04-0.06MPa，发酵时间48h。
发酵培养基组成：葡萄糖160g/L，硫酸铵5g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钠5g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。培养基pH6.5。
5、完成步骤4后，发酵液离心取上清，检测上清液中的L-丙氨酸浓度。结果如图3所示。采用本方法能够生产145g/L的L-丙氨酸。
对比例1、
1、菌种活化：将实验菌株在LB固体培养基上进行划线，在恒温培养箱中，30℃静置培养1-2天，用于摇瓶接种。
2、摇瓶培养：将步骤1活化的单菌落接种于含有200ml LB液体培养基的2000ml三角瓶中，30℃、250rpm培养1-2天,菌液OD550nm达到2.0-3.0。
3、种子罐培养：完成步骤2后，将菌液以3％(v/v)接种量转移至含有6L种子培养基的10L种子发酵罐中进行发酵，发酵条件如下：温度30℃，搅拌转速300rpm，通气量0.6vvm，罐压0.04-0.06MPa，培养过程中通过添加氨水控制发酵体系pH保持在7.0，发酵时间24h。
种子培养基：葡萄糖120g/L，硫酸铵5g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钠5g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
4、完成步骤3后，将菌液以10％(v/v)接种量转移至含有60L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵条件如下：温度30℃，厌氧发酵，罐压0.04-0.06MPa，发酵时间48h。
发酵培养基组成：葡萄糖160g/L，硫酸铵5g/L，磷酸氢二钠5g/L，磷酸二氢钠5g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl20.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。培养基pH6.5。
5、完成步骤4后，发酵液离心取上清，检测上清液中的L-丙氨酸浓度。结果如图3所示。采用对比例的方法能够生产108g/L的L-丙氨酸。

Claims (10)

1.一种生产L-丙氨酸的方法，包括如下步骤：(1)采用种子培养基培养L-丙氨酸菌株，所述种子培养基中采用酵母浸粉和硫酸铵作为氮源。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述种子培养基中含有1-5g/L酵母浸粉和3-10g/L硫酸铵。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述种子培养基中含有2.5g/L酵母浸粉和6g/L硫酸铵。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在种子培养基中的浓度为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉1-5g/L，硫酸铵3-10g/L，磷酸氢二钠10-20g/L，磷酸二氢钠10-20g/L，七水硫酸镁1-3g/L，FeCl3·6H2O 7.5-15mg/L，CoCl2·6H2O 0.5-2mg/L，CuCl2·2H2O 0.5-2mg/L，ZnCl2 0.5-2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5-2mg/L，MnCl2·4H2O 1-4mg/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述溶质及其在种子培养基中的浓度为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉2.5g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钠12g/L，七水硫酸镁1g/L，FeCl3·6H2O 7.5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，CuCl2·2H2O 0.5mg/L，ZnCl2 0.5mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 1mg/L。
6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述培养过程中进行批式补料，在培养过程中流加物料；所述物料包括800-1000g/L葡萄糖，10-20g/L七水硫酸镁，手动控制流加速度使葡萄糖浓度维持在6-8g/L。
7.如权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于：所述培养时间为10-12h。
8.如权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤(2)将步骤(1)的产物接种至发酵培养基中进行发酵；
所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度为：葡萄糖100-200g/L，硫酸铵3-10g/L，磷酸氢二钠2.5-7.5g/L，磷酸二氢钠2.5-7.5g/L，七水硫酸镁1-2g/L，FeCl3·6H2O 7.5-15mg/L，CoCl2·6H2O 0.5-2mg/L，CuCl2·2H2O 0.5-2mg/L，ZnCl20.5-2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5-2mg/L，MnCl2·4H2O 1-4mg/L。
9.如权利要求1至8任一所述的方法，其特征在于：所述L-丙氨酸菌株为大肠埃希氏菌。
10.权利要求1至9任一所述方法制备得到的L-丙氨酸产品。
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