DE10312775A1

DE10312775A1 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Alanin

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Publication number: DE10312775A1
Application number: DE10312775A
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Dr. Bott; Tanja Dr. Gerharz; Kerstin Morjan
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2004-10-07
Anticipated expiration: 2023-03-22
Also published as: DE10312775B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Alanin. DOLLAR A Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte molare Ausbeute an L-Alanin zu erhalten. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine nahezu vollständige bis vollständige Umsetzung der eingesetzten Kohlenstoffquelle in L-Alanin, d. h. beispielsweise eine Ausbeute von 2 Mol Alanin/Mol Glucose. DOLLAR A Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Alanin, bei dem eine für eine L-Alanin-Dehydrogenase kodierende ald-Gensequenz in einen Mikroorganismus, dessen vom Pyruvat ausgehende katabole Reaktionen ausgeschaltet werden, übertragen und dort exprimiert wird, dieser genetisch veränderte Mikroorganismus für die anaerobe mikrobielle Herstellung von L-Alanin eingesetzt wird und das gebildete L-Alanin aus dem Medium isoliert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Alanin.

Im industriellen Maßstab wird Alanin aus 2-Chlorpropionsäure und Ammoniak oder aus Ammoniumchlorid/Kaliumcyanid bzw. Ammoniak/Chlorwasserstoff und Acetaldehyd mit nachfolgender Hydrolyse des entstandenen α-Aminonitrils durch die Strecker-Bucher-Synthese hergestellt. Das optisch aktive Alanin erhält man außer durch Racemat-Trennung über diastereomere Salze oder enzymatische Spaltung von N-Acetyl-D,L-Alanin mit Acylasen auch durch enzymatische Decarboxylierung von L-Asparaginsäure oder asymmetrische Synthese (http://www.roempp.com/prod/).

Die L-Alanin-Synthese kann in Mikroorganismen über verschiedene enzymatische Reaktionen erfolgen: L-Alanin kann durch Transaminierung von Pyruvat mit L-Glutamat durch die L-Alanin-Glutamat-Transaminase synthetisiert werden, wobei Pyridoxalphosphat als Cofaktor fungiert (Umbarger, 1978). Daneben ist die Umsetzung von Pyruvat und L-Valin zu L-Alanin und α-Ketoisovalerat mittels Alanin-Valin-Aminotransferase (Transaminase C) bekannt (Umbarger, 1978). In manchen Bakterien kann L-Alanin auch durch eine L-Alanin-Dehydrogenase aus Pyruvat gebildet werden. So besitzen beispielsweise Streptomyceten (Aharonowitz and Friedrich, 1980), Rhodobacter (Johansson and Gest, 1976), Bacillus-Arten (Yoshida and Freese, 1964) oder Halobakterien (Keradjopoulos and Wulff, 1974) eine NAD⁺-abhängige L-Alanin-Dehydrogenase.

In den letzten Jahren wurden mehrere mikrobielle Verfahren zur Alanin-Synthese beschrieben. Es wurde beispielsweise die L-Alanin-Produktion durch Decarboxylierung von L-Aspartat mit immobilisierten Zellen von Pseudomonas dacunhae, die das Enzym L-Aspartat-β-Decarboxylase (L-Aspartat^– + H⁺ → L-Alanin + CO₂) besitzen, beschrieben (Senuma et al., 1989}. In einem ähnlichen Prozess wird zunächst Fumarat und NH₃ durch immobilisierte Escherichia coli-Zellen, die das Enzym Aspartase enthalten, zu L-Aspartat umgesetzt und dieses anschliessend wiederum mit immbolisierten Zellen von P. dacunhae zu L-Alanin decarboxyliert (Chibata et al., 1984). Das Verfahren ausgehend von L-Aspartat basiert auf einem im Vergleich zu Glucose teuren Substrat. Alternativ zu L-Aspartat wird Glucose als Substrat für die Alanin-Produktion verwendet, wobei Pyruvat durch die Reaktionen der Glykolyse gebildet wird und dieses dann zu Alanin umgesetzt wird. Hier sind Prozesse beschrieben, die thiaminauxotrophe Zymomonas mobilis-Stämme (z.B. CP4thi/pZY73) verwenden, die das aldD-Gen aus Bacillus sphaericus, welches für eine L-Alanin-Dehydrogenase kodiert, plasmidkodiert tragen. Hier wurden bei Kultivierung in einem Thiaminsäure-Mangel-Medium mit 280 mM Glucose und 85 mM NH₄ ⁺ maximal 84 mM Alanin produziert, was einer Ausbeute von 0,3 Mol Alanin/Mol Glucose entspricht (Uhlenbusch et al., 1991).

Die chemische Herstellung von Alanin durch die Strekker-Bucher-Synthese ist durch die Verwendung von Cyanid nicht sehr umweltschonend und erfordert eine Racemat-Trennung.

Die bisher beschriebenen mikrobiellen Verfahren, bei denen die Alanin-Synthese aus Glucose erfolgt, ermöglichen keine vollständige Umsetzung der Glucose zu Alanin.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, mit dem es möglich ist, L-Alanin mit maximal erreichbaren Produktausbeuten mikrobiell zu gewinnen.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 11, 21, 22, 24, 25 bzw. 26 erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 11, 21, 22, 24, 25 bzw. 26 angegebenen Merkmalen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte molare Ausbeute an L-Alanin zu erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine nahezu vollständige bis vollständige Umsetzung der eingesetzten Kohlenstoffquelle in L-Alanin, d.h. beispielsweise eine Ausbeute von 2 Mol Alanin/Mol Glucose.

Die Erfinder fanden in überraschender Weise heraus, daß durch Einbringen eines ald-Gens, welches für die L-Alanin-Dehydrogenase kodiert, in einen Mikroorganismus, dessen vom Pyruvat ausgehende katabole Reaktionen ausgeschaltet werden, dieser Mikroorganismus unter anaeroben Bedingungen die Kohlenstoffquelle, wie z.B. Glucose, stöchiometrisch in L-Alanin umsetzt, d.h. beispielsweise: Glucose + 2 NH₃ → 2 L-Alanin + 2 H₂O.

Die L-Alanin-Dehydrogenase katalysiert die reduktive Aminierung von Pyruvat zu L-Alanin bzw. die oxidative Deaminierung von L-Alanin zu Pyruvat: Pyruvat^– + NADH + H⁺ + NH₄ ⁺ ↔ L-Alanin + NAD⁺ + H₂O. Unter anaeroben Bedingungen und in Abwesenheit alternativer Elektronenakzeptoren können diese Mikroorganismen, die das ald-Gen exprimieren, das in der Glykolyse gebildete NADH nur über die reduktive Aminierung zu L-Alanin reoxidieren, nicht aber über die Atmungskette. Sie führen daher eine "Homoalanin"-Gärung nach der Gleichung: Glucose + 2 NH₃ → 2 L-Alanin + 2 H₂O durch.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Alanin, bei dem eine für eine L-Alanin-Dehydrogenase kodierende ald-Gensequenz in einen Mikroorganismus, dessen vom Pyruvat ausgehende katabole Reaktionen ausgeschaltet werden, übertragen und dort exprimiert wird, dieser genetisch veränderte Mikroorganismus für die anaerobe mikrobielle Herstellung von L-Alanin eingesetzt wird und das gebildete L-Alanin aus dem Medium isoliert wird.

Unter der Bezeichnung „Ausschalten" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Mutation, die Deletion oder geringere bis keine Expression der entsprechenden Gensequenzen verstanden, die für katabole Reaktionen des Pyruvat kodieren.

Der verwendete Begriff „geringer exprimiert" beinhaltet die Abschwächung der Synthese der entsprechenden Boten-RNA's (mRNA) oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der durch die Gensequenzen kodierten Enzyme.

In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens wird die ald-Gensequenz in Mikroorganismen übertragen, in denen das in der Glycolyse gebildete Pyruvat nicht mehr in Gärungsprodukte wie beispielsweise Acetyl-CoA, Acetat, Lactat umgewandelt werden kann oder Pyruvat nicht mehr zu Phosphoenolpyruvat umgesetzt werden kann. Dies kann beispielsweise durch Ausschalten mindestens einer Gensequenz aus der Gruppe der Gene aceEF, kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes, poxB – kodierend für die Pyruvat-Oxidase (POX); pps – kodierend für die Phosphoenol-Pyruvat-Synthetase (PPS); pflB – kodierend für die Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL); ldhA – kodierend für die NAD⁺-abhängige D-Lactat-Dehydrogenase erreicht werden. Als ganz besonders geeignet hat sich das Ausschalten der gesamten vorgenannten Gensequenzen erwiesen.

Eine geeignete ald-Gensequenz kann aus gram-positiven oder gram-negativen Mikroorganismen isoliert werden, wie beispielsweise aus Acholeplasma laidlawii, Anabaena cylindrica, Bacillus cereus, Bacillus flavothermus, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sp., Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Carnobacterium sp., Cunninghamella elegans, Desulfotomaculum ruminis, Desulfovibrio desulfuricans, Desulfovibrio sp., Enterobacter aerogenes, Euglena gracilis, Frankia sp., Halobacterium cutirubrum, Halobacterium halobium, Halobacterium salinarum, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Phormidium lapideum, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Pseudomonas sp., Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas capsulata, Saccharopolyspora erythrea, Shewanella sp., Streptococcus pneumoniae, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces fradiae, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces phaeochromogenes, Thermus thermophilus oder Vibrio proteolyticus. Als besonders geeignet hat sich die Übertragung einer ald-Gensequenz isoliert aus Bacillus subtilis erwiesen. Die vorliegende Erfindung wird durch die ausgewählten Beispiele an Mikroorganismen näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.

Die Übertragung der ald-Gensequenz erfolgt nach bekannten gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung durch Elektroporation genannt. Die ald-Gensequenz kann sowohl auf dem Plasmid als auch chromo somal im Wirtsorganismus vorliegen.

Als geeignete Wirtsorganismen haben sich gram-negative oder gram-positive Mikroorganismen oder Hefen erwiesen. Hier können beispielsweise Organismen aus der Gruppe der Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Mycobacteriaceae oder Saccharomycetaceae genannt werden. Als besonders geeignet hat sich Escherichia coli erwiesen. Als ganz besonders geeignet hat sich Escherichia coli YYC202ldhA erwiesen. Dieser Bakterienstamm weist gegenüber dem Wildtypstamm (WT) einige genetische Veränderungen auf. So ist bekannt, daß folgende Gensequenzen so verändert wurden, daß keine bzw. nur eine geringe Aktivität der von diesen Sequenzen kodierten Enzyme nachweisbar ist: aceEF – kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes, poxB – kodierend für die Pyruvat-Oxidase (POX); pps – kodierend für die Phosphoenol-Pyruvat-Synthetase (PPS); pflB – kodierend für die Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL); ldhA – kodierend für die NAD⁺-abhängige D-Lactat-Dehydrogenase. Auf Grund dieses Genotyps sind die Organismen nicht in der Lage, Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat, Lactat oder Phosphoenolpyruvat umzusetzen. Dieser Organismus ist auch in der Literatur hinsichtlich seiner genetischen Eigenschaften beschrieben (Gerharz et al., 2002). Weiterhin geeignet sind beispielsweise auch Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Saccharomyces-Species oder auch Torulopsis glabrata. Die vorliegende Erfindung wird durch die ausgewählten Beispiele an Mikroorganismen näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.

Als Kohlenstoffquellen für die mikrobielle Herstellung eignen sich Kohlenhydrate (z. B. Tetrosen, Hexosen, Pentosen, Heptosen), organische Säuren sowie auch Alkohole. Die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können L-Alanin beispielsweise aus Kohlenhydraten wie Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose, oder aus organischen Säuren wie z.B. Lactat oder auch aus Alkoholen wie z. B. Glycerin herstellen. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu gewährleisten werden Substrate bevorzugt, die als Abfallstoffe anfallen bzw. direkt verfügbar sind, d. h. nicht in besonderer Weise zur weiteren Verarbeitung für das erfindungsgemäße Verfahren vorbehandelt oder produziert werden müssen. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren, Acetat und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzu gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 30°C bis 40°C und vorzugsweise bei 37°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum des gewünschten L-Alanins gebildet hat.

Als Kultivierungsmethoden können kontinuierliche oder diskontinuierliche im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der L-Alanin-Produktion durchgeführt werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Ver lag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben. Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Die Fermentationen werden bevorzugt anaerob durchgeführt.

Es kann mit sowohl mit ruhenden Zellen als auch mit wachsenden Zellen eine Umsetzung des Substrates in L-Alanin erreicht werden, die erheblich über den mit bisher bekannten Verfahren erzielten Ausbeuten liegt. In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens haben sich ruhende Zellen als geeignet erwiesen. Da beim Wachstum ein Teil der Kohlenstoffquelle zur Biosynthese neuen Zellmaterials eingesetzt wird, ist eine maximale L-Alanin-Ausbeute mit wachsenden Zellen nicht zu erwarten. Dies ist mit Zellen möglich, die auf Grund der Medienbedingungen keine Biosynthese zum Zweck der Bildung neuen Zellmaterials betreiben, d. h. „ruhende" Zellen. Diese Zellen werden zunächst in einem Medium gebildet, im dem eine hohe Zellkonzentration erreicht werden kann. Wenn durch Limitation eines Nährstoffs, wie z.B. der Schwefelquelle, das Wachstum aufhört, können die Kohlenstoff- und die Stickstoffquelle zu L-Alanin umgesetzt werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin beispielsweise markiertes L-Alanin in hohen Ausbeuten hergestellt werden, indem z. B. C₁₃-markierte Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens wird durch die hohen Produktausbeuten erheblich verbessert.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mikroorganismen, deren vom Pyruvat ausgehende katabole Reaktionen ausgeschaltet sind und die eine L-Alanin-Dehydrogenase zur mikrobiellen Produktion von L-Alanin exprimieren. Unter der Bezeichnung Mikroorganismus werden sowohl ein- als auch mehrzellige Organismen verstanden.

Mikroorganismen, bei denen mindestens eine Gensequenz aus der Gruppe der Gene aceEF, poxB, pps, pflB oder ldhA ausgeschaltet ist und die eine L-Alanin-Dehydrogenase synthetisieren, haben sich als besonders geeignet erwiesen. Diese Organismen können aufgrund des Genotyps Pyruvat nicht mehr zu Acetyl-CoA, Acetat, Lactat oder Phosphoenolpyruvat umsetzten. Als ganz besonders geeignet haben sich Mikroorganismen erwiesen, bei denen alle der vorgenannten Gensequenzen ausgeschaltet sind.

In einer vorteilhaften Ausführung weisen die Mikroorganismen eine L-Alanin-Dehydrogenase aus gram-positiven oder gram-negativen Bakterien auf. In einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung weisen die Organismen eine L-Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis auf.

Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen können L-Alanin aus Kohlehydraten, Alkoholen oder organischen Säuren herstellen.

Die erfindungsgemäßen Organismen können gram-positive oder gram-negative Bakterien oder Hefen sein. Sie können aus der Gruppe der Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Mycobacteriaceae oder Saccharomycetaceae stammen. In einer vorteilhaften Ausführung handelt es sich um Escherichia coli. In einer besonders vorteilhaften Ausführung handelt es sich um Escherichia coli YYC202ldhA. Ebenso geeignet sind beispielsweise auch Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Saccharomyces-Spezies oder Torulopsis glabrata.

Wachsende und „ruhende" Mikroorganismen haben sich als geeignet erwiesen, wobei sich „ruhende" Zellen als besonders geeignet erwiesen haben.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der oben beschriebenen Mikroorganismen zur Herstellung von L-Alanin.

Die Erfindung betrifft ebenso Nukleotidsequenzen kodierend für eine L-Alanin-Dehydrogenase zur Verwendung in einem der oben beschriebenen Mikroorganismen. Eine Nukleotidsequenz kodierend für eine L-Alanin-Dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 1 oder entsprechend der aus der NCBI Genbank erhältlichen Gensequenz (NC_00964.1) hat sich als geeignet erwiesen.

Unter Nukleotidsequenzen werden alle Nukleotidsequenzen verstanden, die (i) exakt den dargestellten Sequenzen entsprechen oder (ii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfassen, die innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes den dargestellten Sequenzen entspricht oder (iii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfaßt, die mit einer zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplementären Nukleotidsequenz hybridisiert und gegebenenfalls (iii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfaßt. Dabei bedeutet der Begriff funktionsneutrale Sinnmutationen den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z.B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threonin.

Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA Processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u.a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.

Unter das beschriebene Enzym fallen auch Isoformen, die als Enzym mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität verstanden werden, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen. Weiterhin fallen auch modifizierte Formen des Enzyms unter das erfindungsgemäße Enzym, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C- Terminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach bekannter Methode vorgenommen werden. Die Aminosäuresequenz einer L-Alanin-Dehydrogenase kann beispielsweise aus der Proteindatenbank NCBI unter A49337 oder CAB04775 erhalten werden.

Ebenso umfaßt die Erfindung eine Genstruktur enthaltend mindestens eine der obigen Nukleotidsequenz. Ein Vektor enthaltend mindestens eine der obigen Nukleotidsequenz oder eine oder mehrere der vorgenannten Genstrukturen ist ebenfalls in der Erfindung enthalten.

Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung der vorgenannten Nukleotidsequenzen, Genstrukturen und Vektoren in den beschriebenen Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen, die diese Nukleotidsequenzen, Genstrukturen und Vektoren enthalten.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Figuren zeigen eine Übersicht des Pyruvat-Stoffwechselweges sowie experimentelle Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Es zeigt:

1: Übersicht Pyruvat-Stoffwechselweg in E. coli YYC 202ldhA mit pBR322-ald bzw. pACYC184-ald

2: Experimentelle Ergebnisse einer anaeroben Umsetzung von Glucose (⦁) zu Alanin (⟡) durch Zellsuspensionen von E. coli YYC202lpdhA/pBR322-ald (A) und E. coli YYC202ldhA/pACYC184-ald (B).

Sequenz ID No. 1 zeigt die Nukleotidsequenz kodierend für eine L-Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis.

Sequenz ID No. 2 zeigt die Aminosäuresequenz, die die L-Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis bildet.

1 zeigt beispielhaft die Alanin-Synthese aus Glucose und Ammonium mit Hilfe des Enzyms L-Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis bei einer Kultivierung in Glucosemedium mit Acetat durch Escherichia coli YYC202ldhA. Dabei bezeichnet
PTS: Phosphotransferase-System
Glucose-6-P: Glucose-6-Phosphat
PEP: Phosphoenolpyruvat
ald_Bs: Gensequenz kodierend für die L-Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis
ldhA: Gensequenz kodierend für die NAD+-abhängige D-Lactat-Dehydrogenase
pps: Gensequenz kodierend für Phosphoenolpyruvat-Synthetase (PPS)
aceEF: Gensequenz kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes
pflB: Gensequenz kodierend für Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL)
poxB: Gensequenz kodierend für Pyruvat-Oxidase (POX)

Die Glucose wird über das Phosphotransferase-System (PTS) durch die Cytoplasmamembran (1) in das Innere der Zelle transportiert und anschließend in der Glycolyse über Glucose-6-Phosphat, weitere nicht dargestelte Verbindungen und Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat umgesetzt. Pyruvat kann mit Hilfe der Pyruvat-Oxidase (POX), kodiert durch die Gensequenz poxB, zu Acetat umgesetzt werden. Mit Hilfe des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes, welcher ein Multienzymkomplex ist, der aus mehreren Untereinheiten (E1, E2) besteht, die durch die Gensequenz aceEF kodiert werden, wird die Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA katalysiert, welches dann zur weiteren Umsetzung in den Citrat-Zyklus eingeschleust werden kann. Unter anaeroben Bedingungen kann Pyruvat mit Hilfe der Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL), kodiert durch die Gensequenz pflB, zu Acetyl-CoA umgesetzt werden. Weiterhin kann Pyruvat mit Hilfe der Phosphoenol-Pyruvat-Synthetase (PPS), kodiert durch die Gensequenz pps, wieder zu Phosphoenolpyruvat (PEP) umgesetzt werden. Außerdem kann Pyruvat mit Hilfe der Lactat-Dehydrogenase (LDH), kodiert durch die Gensequenz ldhA, zu Lactat abgebaut werden. Der E. coli-Stamm YYC202ldhA kann aufgrund von Mutationen Pyruvat nicht mehr zu Acetyl-CoR, Acetat, Phosphoenolpyruvat und Lactat umsetzen und benötigt zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium Acetat. Unter aeroben Bedingungen setzt dieser Stamm Glucose hocheffizient und unter geeigneten Bedingungen sogar vollständig in Pyruvat um. Unter anaeroben Bedingungen können die E. coli YYC202ldhA-Zellen mit der übertragenen und exprimierten ald_Bs-Gensequenz das in der Glycolyse gebildete NADH nur über die reduktive Aminierung zu L-Alanin reoxidieren, nicht aber über die Atmungskette.

2 zeigt experimentelle Ergebnisse einer anaeroben Umsetzung von Glucose (⦁) zu Alanin (⟡) durch Zellsuspensionen von E. coli YYC202ldhA/pBR322-ald (A) und E. coli YYC202ldhA/pACYC184-ald (B). Die Zellen wurden zunächst anaerob in einem Medium mit 20 mM Glucose, 4 mM Acetat, 20 mM NH₄Cl und 1 % Hefeextrakt kultiviert, anschließend in MOPS-Puffer (100 mM, pH 7) gewaschen und in 100 mM MOPS-Puffer pH 7 mit 100 mM NH₄Cl zu einer OD₆₀₀ von 8,4 resuspendiert. Nach Zugabe von 20 mM Glucose wurde der Zucker innerhalb von 4 Stunden vollständig zu L-Alanin umgesetzt, d.h. 2 Mol Alanin/Mol Glucose gebildet. Pyruvat (

) war zu keinem Zeitpunkt nachweisbar. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y gibt die Konzentration von Glucose, L-Alanin bzw. Pyruvat in mM an.

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.

Der E. coli-Stamm YYC202ldhA (Gerharz et al., 2002) wird mit einem Plasmid transformiert, welches das ald- Gen für die L-Alanin-Dehydrogenase (EC 1.4.1.1) aus Bacillus subtilis unter Kontrolle des nativen Promotors und des Tetracyclin Resistenzpromotors enthält. Der Stamm YYC202ldhA kann aufgrund von Mutationen Pyruvat nicht mehr zu Rcetyl-CoA, Acetat, Lactat und Phosphoenolpyruvat umsetzen und benötigt zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium Acetat. Unter aeroben Bedingungen setzt dieser Stamm Glucose hocheffizient und unter geeigneten Bedingungen sogar vollständig in Pyruvat um. Die L-Alanin-Dehydrogenase aus B. subtilis wurde in früheren Arbeiten isoliert und biochemisch charakterisiert (Yoshida and Freese, 1964; Yoshida and Freese, 1965) Die kodierende Nukleodidsequenz bzw. Aminosäuresequenz ist beispielsweise aus der NCBI Gendatenbank unter der Nr.: NC 000964 bzw. A49337 abrufbar. Die L-Alanin-Dehydrogenase katalysiert die reduktive Aminierung von Pyruvat zu L-Alanin bzw. die oxidative Desaminierung von L-Alanin zu Pyruvat: Pyruvat^– + NADH + H⁺ + NH₄ ⁺ ↔ L-Alanin + NAD⁺ + H₂O.

Unter anaeroben Bedingungen können YYC202ldhA-Zellen, die das ald-Gen exprimieren, das in der Glykolyse gebildete NADH nur über die reduktive Aminierung zu L-Alanin reoxidieren, nicht aber über die Atmungskette.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielennäher erläutert.
1. Konstruktion von Expressionsplasmiden für das B. subtilis ald-Gen
Das ald-Gen wurde aus chromosomaler DNA des B. subtilis-Stammes DB104 (Kawamura & Doi, 1984) durch PCR amplifiziert (Bs-ald-for1/XhoI 5'-GCGGCGCTCGAGCGGAAAC AGGTAATCAAACRAAG-3', Bs-ald-rev1/XbaI 5'-GCGGCGTCTAGACCTCCTTTATGAT CAACTTCATAG-3') und mittels XhoI- und XbaI-Restriktionsschnittstellen, die mit diesen Primern eingeführt wurden, in den Vektor pBluescript KS+ (Stratagene) kloniert. Das resultierende Plasmid, das neben der kodierenden Region auch den ald-Promotor enthielt, wurde pKS-ald genannt. Anschließend wurde das ald-Gen aus pKS-ald in die Vektoren pBR322 (Bolivar et al., 1977) und pRCYC184 (Chang & Cohen, 1978) umkloniert.
Für die Konstruktion von pBR322-ald wurde pKS-ald mit XhoI und NotI verdaut und nach Auftrennung auf einem Agarose-Gel das 1,3-kb-ald-Fragment mittels des Qiaex Gel Extraction Kit isoliert. Der Vektor pBR322 wurde mit SalI (kompatibel mit XhoI) und EagI (kompatibel mit NotI) verdaut und nach Auftrennung auf einem Agarosegel das 4,1-kb-Fragment isoliert. Die beiden Fragmente wurden mit dem „Rapid DNA Ligation Kit" (Roche Diagnostics) ligiert und in E. coli DH5α transformiert. Aus rekombinanten Klonen wurden Plasmide mit dem QIAprep Spin Miniprep-Kit isoliert und durch Restriktionsverdau mit AvaI analysiert. Dabei entstanden wie erwartet Fragmente von 3614 und 1678 bp.
Für die Konstruktion von pACYC184-ald wurde wiederum das 1,3-kb-XhoI-NotI-Fragment aus pKS-ald in das 4,0-kb-SalI-EagI-Fragment von pACYC184 kloniert und die rekombinanten Plasmide durch Restriktionsverdau mit AvaI analysiert. Dabei entstanden erwartungsgemäss Fragmente von 3730 und 1678 bp.
2. Nachweis der L-Alanin-Dehydrogenase-Aktivität in rekombinanten E. coli Stämmen mit den Plasmiden pBR322-ald bzw. pACYCl84-ald
Um nachzuweisen, dass E. coli YYC202ldhA-Stämme, die mit den Plasmiden pBR322-ald bzw. pACYC184-ald transformiert wurden, eine L-Alanin-Dehydrogenase-Aktivität besitzen, wurden Zellextrakte der Stämme hergestellt (French-Press-Zellaufschluss, Zentrifugation 30 min bei 16000 g und 4°C, Überstand wurde 90 min bei 50000 g und 4°C ultrazentrifugiert). Der resultierende Überstand wurde dann als Zellextrakt für Enzymaktivitätsbestimmungen eingesetzt. Dabei wurde sowohl die oxidative Deaminierung von L-Alanin als auch die reduktive Aminierung von Pyruvat bestimmt. Dabei wurde festgestellt, daß die E.coli YYC202ldhA + pBR322-ald und E.coli YYC202ldhA + pACYCl84-ald Stämme eine L-Alanin-Dehydrogenaseaktivität aufwiesen, wohingegen die E.coli YYC202ldhA + pBR322 und E.coli YYC202ldhA + pACYC184 Stämme ohne das ald-Gen keine L-Alanin-Dehydrogenaseaktivität aufwiesen.
3. Anaerobe Umsetzung von Glucose durch Zellsuspensionen
Die anaerobe Umsetzung von Glucose wurde mit ruhenden Zellen von YYC202ldhA-Stämmen, die entweder pBR322, pBR322-ald, pACYC184 bzw. pACYCl84-ald enthielten, getestet. Hierzu wurde jeweils eine 5 ml Kultur in modi fiziertem M9-Minimalmedium (Tab. 1) mit 20 mM Glucose, 4 mM Na-Acetat, 20 mM NH₄Cl und 1 g/l Hefeextrakt über Nacht aerob bei 37°C und 170 rpm kultiviert. Mit dieser Vorkultur wurde eine Schottflasche (Nennvolumen 1 l) mit 1,1 l des gleichen Mediums inokuliert, mit einem Schraubdeckel verschlossen und ohne Schütteln bei 37°C inkubiert. Da der im Medium gelöste Sauerstoff (maximal 250 μM) relativ rasch verbraucht ist, sollten in dieser Flasche nach einer kurzen aeroben Phase anaerobe Bedingungen herrschen. Die so erhaltene Biomasse wurde sedimentiert und die Zellen mit 0,09 Kulturvolumen MOPS-Puffer (100 mM MOPS, pH 7) gewaschen und danach in 30 ml MOPS-NH₄Cl-Puffer (100 mM MOPS, 100 mM NH₄Cl, pH 7) aufgenommen. Die resultierenden Zellsuspensionen wurden in GL18-Röhrchen von Schott überführt, so dass diese annährend komplett gefüllt waren. Nach Zugabe von 20 mM Glucose wurden die Röhrchen unter Stickstoffbegasung mit Gummidichtungen und Schraubdeckeln verschlossen und bei 37°C inkubiert. Die Probenentnahme erfolgte unter Stickstoffbegasung. Wie in 2 gezeigt, setzt sowohl YYC202ldhA/pBR322-ald (A) als auch YYC202ldhA/pACYA184-ald (B) die zugesetzte Glucose mit Ammonium nahezu vollständig zu L-Alanin um. YYC202ldhA-Stämme, die pBR322 bzw. pAYCY184 enthielten, bildeten unter denselben Bedingungen kein L-Alanin.
Tabelle 1: Zusammensetzung des für das Verfahren modifizierten M9-Minimalmediums (Sambrook, 1989) zur Kultivierung von E. coli YYC202ldhA mit pBR322-ald bzw. pACYC184-ald.
Nach dem Autoklavieren wurden folgende sterile Komponenten zugesetzt:

MgSO₄ 1,0 mM

CaCl₂ 0,1 mM

Glucose 20,0 mM

Na-Acetat (pH 7) 4,0 mM
Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Alanin, dadurch gekennzeichnet, daß a) eine für eine L-Alanin-Dehydrogenase kodierende ald-Gensequenz in einen Mikroorganismus, dessen vom Pyruvat ausgehende katabole Reaktionen ausgeschaltet werden, übertragen und dort exprimiert wird, b) dieser genetisch veränderte Mikroorganismus aus a) für die anaerobe mikrobielle Herstellung von L-Alanin eingesetzt wird und c) das gebildete L-Alanin aus dem Medium isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine ald-Gensequenz isoliert aus gram-positiven oder gram-negativen Bakterien eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine ald-Gensequenz isoliert aus Bacillus subtilis eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren mindestens eine Gensequenz aus der Gruppe der Gene aceEF, poxB, pps, pflB oder ldhA ausgeschaltet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß gram-positive oder gram-negative Bakterien oder Hefen eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen aus der Gruppe der Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Mycobacteriaceae oder Saccharomycetaceae eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Saccharomyces-Spezies oder Torulopsis glabrata eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli YYC202ldhA eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle für die mikrobielle Herstellung Kohlenhydrate, organische Säuren oder Alkohole eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die mikrobielle Herstellung ruhende Zellen eingesetzt werden.
Mikroorganismus, dessen vom Pyruvat ausgehende katabole Reaktionen ausgeschaltet sind und der eine L-Alanin-Dehydrogenase zur mikrobiellen Produktion von L-Alanin exprimiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Gensequenz aus der Gruppe der Gene aceEF, poxB, pps, pflB oder ldhA ausgeschaltet ist und der eine L-Alanin-Dehydrogenase exprimiert.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet daß es sich um eine L-Alanin-Dehydrogenase aus gram-positiven oder gram-negativen Bakterien handelt.
Mikroorganimus gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine L-Alanin-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis handelt.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß er Kohlehydrate, Alkohole oder organische Säuren zu L-Alanin umsetzt.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß er aus der Gruppe der gram-positiven oder gram-negativen Bakterien oder Hefen stammt.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß er aus der Gruppe der Enterobacteriacea, Bacillaceae, Saccharomycetaceae oder Mycobacteriaceae stammt.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß es Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Saccharomyces-Spezies oder Torulopsis glabrata ist.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es Escherichia coli YYC202ldhA ist.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es „ruhende" Zellen sind.
Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 20, zur Herstellung von L-Alanin.
Nukleotidsequenz kodierend für eine L-Alanin-Dehydrogenase zur Verwendung in einem Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 20.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 22, kodierend für eine L-Alanin-Dehydrogenase gemäß SEQ ID No.1.
Genstruktur enthaltend mindestens eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 22 bis 23.
Vektor enthaltend mindestens eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 22 bis 23 oder eine Genstruktur gemäß Anspruch 24.
Verwendung einer Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 22 bis 23 zur Transformation eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 20.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 20 enthaltend mindestens eine Genstruktur gemäß Anspruch 24.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 20 enthaltend mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 25.