DE60038565T2 - Verfahren zur herstellung von ubiquinon-10 - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10, das nützlich ist, um die Zustände von Herzkrankheit zu verbessern und das als eine Substanz nützlich ist, die eine antioxidative Funktion hat. DNA und ein Polypeptid, die für den Herstellungsprozess nützlich sind, ein Mikroorganismus, der für die Herstellung nützlich ist, die Expression eines neuartigen Gens in Mikroorganismen und eine neuartige Züchtung von Mikroorganismen werden ebenfalls in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschrieben.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Ubichinon ist ein allgemeiner Begriff für 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-polyprenyl-1,4-benzochinon, das man auch Coenzym Q nennt. Ubichinon ist in der Welt der Biologie als Bestandteil von Elektronentransfersystemen weit verbreitet. Die Polyprenylseitenkette von Ubichinon weist je nach biologischer Spezies eine unterschiedliche Länge auf, und man hat in der Natur die Homologen Ubichinon-1 bis 13 gefunden. Die wichtigsten Homologe sind Ubichinon-6 bis 10. Viele Säuger einschließlich Menschen stellen Ubichinon-10 biosynthetisch her.
  • Ubichinon-10 ist wirksam zur Verbesserung von Zuständen, die an Herzversagen und anderen ischämischen Herzfunktionsstörungen beteiligt sind, und ist als Arzneimittel zugelassen. Es hat einen Bericht gegeben, dass diese Substanz bei der Verringerung von Herz-Nebenwirkungen von Krebsmitteln wie z. B. Adriamycin und der Verbesserung von Parodontose sowie beim Schutz der Skelettmuskulatur vor Trainingsbelastungen wirksam ist [Bitamin no Jiten (Wörterbuch der Vitamine), The Vitamin Society of Japan (1996)].
  • In den letzten Jahren haben die Aktivierung des Energiemetabolismus durch Ubichinon und die antioxidativen Wirkungen von Ubichinon Aufmerksamkeit erregt, und die Nachfrage danach als gesundem Nahrungsmittel ist vor allem in den USA und Europa gestiegen.
  • Derzeit wird Ubichinon-10 mit Hilfe von Syntheseverfahren oder durch Extraktion aus Mikroorganismen wie z. B. Hefen und photosynthetischen Bakterien hergestellt. Auf Grund der erhöhten Nachfrage wird jedoch ein effizienteres Herstellungsverfahren benötigt.
  • Eines der wirksamen Mittel, um eine spezifische Substanz mit Hilfe eines Mikroorganismus zu bilden und anzureichern, besteht darin, den Fluss eines intermediären Metaboliten auf dem zu einem Zielprodukt führenden biosynthetischen Reaktionsweg in andere Reaktionswege zu blockieren, damit mehr des intermediären Metaboliten in das Zielprodukt fließt.
  • Ubichinon ist, was seine Struktur angeht, hauptsächlich in den Teil des Ubichinon-Gerüsts und den Teil der Polyprenylseitenkette unterteilt. Die Polyprenylseitenkette ist eine Art von Isoprenoid, das 5-Kohlenstoff-isopentenylpyrophosphat (IPP) als eine Grundeinheit des Gerüsts enthält und das durch Kondensation mehrerer IPPs biosynthetisch hergestellt wird.
  • Eine Reihe von Enzymen, die an dieser Reaktion beteiligt sind, nennt man Prenyltransferasen.
  • Man hat Prenyltransferasen in vielen biologischen Spezies gefunden. Man hat zum Beispiel in Escherichia coli die Existenz von drei Enzymen mit unterschiedlichen Längen von synthetischen Ketten, Farnesyltransferase [J. Biochem. 108 (6): 995–1000 (1990)], Octaprenyltransferase [J. Bact. 179: 3058–3060 (1997)] und Undecaprenyltransferase [J. Bact. 181: 483–492 (1999)], bestätigt und das Gen für alle von ihnen identifiziert. In Rhodobacter sphaeroides (hierin nachfolgend als R. sphaeroides bezeichnet), das ein photosynthetisches Bakterium ist, hat man Geranylgeranyltransferase (crtE) identifiziert [J. Bact. 177: 2064–2073 (1995)].
  • Man geht davon aus, dass das Ausgangssubstrat für Prenyltransferase, die die Ubichinonseitenkette anbringt, Farnesylpyrophosphat (FPP) ist, das auch das Ausgangssubstrat für die Biosynthese verschiedener Isoprenoide darstellt.
  • Im Fall von R. sphaeroides ist es bekannt, dass sich eine beträchtliche Menge an Carotinoid aus Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) anreichert, das durch die Aktivität von crtE gebildet wird [Biosynthesis of Isoprenoid Compounds, Bd. 2, John Wiley & Sons (1983)].
  • Bei den Gattungen Pseudomonas und Rhodotorula ist von einer erhöhten Anreicherung von Ubichinon-10 durch Ausschaltung ihrer Fähigkeit zur Produktion von Carotinoiden berichtet worden [Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldungen Nr. 68792/82 und 39790/82 ].
  • Bei R. sphaeroides ist es bereits bekannt gewesen, dass die Fähigkeit zur Produktion von Carotinoiden verschwindet, wenn crtE fehlerhaft ist, aber es hat keinen Befund gegeben, dass eine solche Fehlerhaftigkeit eine Veränderung im Ausmaß der intrazellulären Anreicherung von Ubichinon-10 verursacht [Mol. Microbiol. 4: 977–989 (1990)].
  • In der vorstehenden Literatur erhält man Mutanten, in denen die Fähigkeit zur Biosynthese von Carotinoiden verändert ist, durch das Verfahren, bei dem man den Stämmen des Mikroorganismus eine mutagene Behandlung verabreicht, wobei man Strahlungsarten wie ultraviolette Strahlen, Röntgenstrahlen und Gammastrahlen oder Chemikalien wie z. B. Natriumnitrit, Nitrosoguanidin und Ethylmethylsulfonat einsetzt; Stämme, die eine Farbveränderung zeigen, werden aus den mutierten Stämmen ausgewählt; und Stämme, bei denen die Fähigkeit zur Biosynthese von Carotinoiden fehlerhaft ist, werden weiter ausgewählt. [J. Gen. Appl. Microbiol. 44: 19–26 (1988)].
  • Um auf einfache Weise zu bewirken, dass die Aktivität eines bestimmten Enzyms fehlerhaft wird, verwendet man auch ein Verfahren, eine Mutation direkt in ein Gen einzuführen, das das Enzym codiert. Bis heute sind verschiedene Verfahren bekannt. Darunter sind ein Verfahren, in dem die Aktivität des Zielenzyms dadurch inaktiviert wird, indem man das Gen, das das Enzym codiert, durch den Einbau eines Vektors, der ein an den 5' und 3'-Enden unvollständiges Gen enthält, in die homologe Region auf dem Chromosom unterbricht, sowie ein Verfahren, bei dem DNA verwendet wird, die ein Gen enthält, das seine Funktion durch vollständige oder teilweise Deletion, Substitution oder Insertion bei dem Gen verloren hat, und bei dem das Gen, das das Enzym codiert, durch Übertragen der Deletion, Substitution oder Insertion auf das Chromosom unterbrochen wird, um zu bewirken, dass die Aktivität des Zielenzyms fehlerhaft wird, für ihre Schnelligkeit und ihre häufige Verwendung bekannt.
  • Zur Einführung einer Orts-spezifischen Mutation in photosynthetische Bakterien einschließlich R. sphaeroides ist ein Verfahren, bei dem ein Zielgen mittels Konjugationstransfer mit einem speziellen Escherichia coli, sowie einem Vektor unterbrochen wird bekannt. Dieses Verfahren ist jedoch insofern mit Schwierigkeiten verbunden, als man nur begrenzte Vektoren einsetzen kann und der Trennungsprozess zwischen Escherichia coli und einem photosynthetischen Bakterium nach der Konjugation kompliziert ist. Der Aufbau eines Orts-spezifischen homologen rekombinanten Verfahrens, das unabhängig von der Art der Vektoren breit anwendbar ist, ist wünschenswert.
  • Eine andere wirksame Methode, eine bestimmte Substanz mit Hilfe von Mikroorganismen zu bilden und anzureichern, besteht darin, die Expression eines Gens für ein Enzym auf dem Biosynthese-Reaktionsweg zu verstärken.
  • Im Fall der Ubichinone ist p-Hydroxybenzoesäure, die über Chorisminsäure biosynthetisch hergestellt wird, die durch den Shikimisäure-Reaktionsweg biosynthetisch hergestellt wird, das Ausgangssubstrat für den Chinon-Gerüstteil. Auf der anderen Seite ist das Ausgangssubstrat für den Polyprenylseitenketten-Teil Polyprenyldiphosphat, das durch Kondensation mehrerer IPPs gebildet wird, die über den Mevalonsäure-Reaktionsweg oder über den vor Kurzem aufgeklärten nicht-Mevalonsäure-Reaktionsweg [Biochem. J. 295: 517 (1993)] biosynthetisch hergestellt werden. P-Hydroxybenzoesäure und Polyprenyldiphosphat werden durch die Einwirkung von p-Hydroxybenzoesäure-Polyprenyltransferase (EC 2.5.1.39) zu 4-Hydroxy-3-polyprenylbenzoesäure umgewandelt, die verschiedene Modifikationen durchläuft, um zu Ubichinon umgewandelt zu werden.
  • Diese Enzyme in den Biosynthese-Reaktionswegen und deren Gene sind zum größten Teil in Escherichia coli und in Hefen identifiziert worden. Obwohl alle Aspekte dieser Gene noch nicht aufgeklärt sind, sind mehrere Beispiele bekannt, die eine erhöhte Anreicherung von Ubichinon durch eine verstärkte Expression von Enzymgenen in dem Biosynthese-Reaktionsweg von Ubichinon zeigen. Zum Beispiel zeigten Zhu et al., dass das Ausmaß der Anreicherung von Ubichinon dadurch zunahm, dass man verschiedene Enzymgene der Biosynthese von Ubichinon, die von Escherichia coli abgeleitet waren, stromabwärts mit dem lac-Promotor verknüpfte und diese in hoher Menge in Escherichia coli exprimierte. [J. Fermentation and Bioengineering 79, 493 (1995)]. Auch Kawamukai et al. zeigten eine erhöhte Fähigkeit zur Produktion von Ubichinon-10 durch Einführen von aus Escherichia coli abgeleiteten ubiA und ubiC in ein photosynthetisches Bakterium, R. capsulatus, und Durchführen einer anaeroben Züchtung (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 107789/96 )]. Es gibt auch die Beschreibung in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 178590/99 über den Prozess zur Herstellung von Ubichinon-10 mit Hilfe von Escherichia coli, der Decaprenyltransferase überexprimiert, die von Paracoccus denitrificans abgeleitet ist.
  • Wo jedoch der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Biosynthese von Ubichinon liegt und welcher Kontrolle er unterzogen ist, muss erst noch aufgeklärt werden.
  • Um das Ubichinon-Biosynthese-System in photosynthetischen Bakterien zu verstärken, sieht man es am geeignetsten an, Enzymgene der photosynthetischen Bakterien selbst zu verwenden. Es ist jedoch in photosynthetischen Bakterien so gut wie kein Enzymgen bekannt, das an der Biosynthese von Ubichinon beteiligt ist.
  • Um das Ubichinon-Biosynthese-System in photosynthetischen Bakterien zu verstärken, ist es wichtig, den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in dem Biosynthese-Reaktionsweg zu bestimmen, Gene in dem Biosynthese-Reaktionsweg von Ubichinon zu isolieren, wozu das Gen gehört, das an dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt beteiligt ist, und die Nucleotidsequenz der Gene und um die Gene herum zu bestimmen.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein industriell verwendbares Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10 bereitzustellen, das nützlich ist, um die Zustände bei einer Herzkrankheit zu verbessern, und das als eine Substanz nützlich ist, die eine antioxidative Funktion aufweist. Darüber hinaus beschreibt die Beschreibung DNA und Polypeptide, die für das Herstellungsverfahren nützlich sind, Mikroorganismen, die für die Herstellung nützlich sind, die Expression von Genen in den Mikroorganismen und ein Verfahren zur Züchtung der Mikroorganismen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine gründliche Untersuchung zu industriell verwendbaren Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10 durchgeführt. Als Ergebnis haben sie Gene gefunden, die an der Verbesserung der Biosynthese von Ubichinon-10 in Mikroorganismen beteiligt sind, die zu photo synthetischen Bakterien gehören. Die vorliegende Erfindung ist auf der Basis dieses Ergebnisses fertiggestellt worden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden Punkte (1)–(41).
    • (1) Ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10, welches umfasst:
    • (a) Züchten in einem Medium eines Stammes, der erhältlich ist von einem Mikroorganismus mit der Fähigkeit, Ubichinon-10 zu bilden, und welcher umfasst:
    • (i) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, wobei ein oder mehrere Nucleotidrest(e) deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n) in einer Nucleotidsequenz von einer DNA, die Geranylgeranyltransferase codiert, so dass die Geranylgeranyltransferaseaktivität fehlerhaft ist, und
    • (ii) zusätzlich eine DNA eines Decaprenyldiphosphatsynthasegens, das in den hinsichtlich der Geranylgeranyltransferase fehlerhaften Stamm eingeführt wurde;
    • (b) Ermöglichen, dass sich Ubichinon-10 bildet und in einer Kultur anreichert; und
    • (c) Gewinnen von Ubichinon-10 aus der Kultur.
  • Deletion, Substitution oder Hinzufügung eines Nucleotidrests, auf die in der vorliegenden Beschreibung Bezug genommen wird, kann mit Hilfe von Orts-spezifischer Mutagenese durchgeführt werden, bei der es sich um eine Technik handelt, die vor der vorliegenden Anmeldung bekannt war. Genauer gesagt kann man diese nach Methoden ausführen, die in Molecular Cloning: A Laborstory Manual, zweite Auflage, herausgegeben von: Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989) (hierin nachfolgend als Molecular Cloning, zweite Auflage bezeichnet); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987–1997) (hierin nachfolgend als Current Protocols in Molecular Biology bezeichnet); Nucleic Acids Research 10: 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79: 6409 (1982); Gene 34: 315 (1985); Nucleic Acids Research 13: 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82: 488 (1985); etc. beschrieben sind.
    • (2) Das Verfahren nach vorstehendem (1), wobei die DNA, die Geranylgeranyltransferase codiert, eine DNA ist, die die Geranylgeranyltransferase von Rhodobactersphaeroides codiert.
    • (3) Das Verfahren nach vorstehendem (1), wobei die DNA, die Geranylgeranyltransferase codiert, eine DNA ist, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst.
    • (4) Das Verfahren nach vorstehendem (1), wobei der Stamm erhältlich ist durch das Verfahren, welches das Einführen einer DNA, die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, in den Mikroorganismus umfasst.
    • (5) Das Verfahren nach vorstehendem (4), wobei die DNA, die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, eine DNA ist, die die von Rhodobacter sphaeroides abgeleitete Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert.
    • (6) Das Verfahren nach vorstehendem (4), wobei die DNA, die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, eine DNA ist, die ein Polypeptid codiert, das aus den folgenden (a), (b) und (c) ausgewählt ist:
    • (a) einem Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst,
    • (b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, in der ein oder mehrere Aminosäurerest(e) in der Aminosäuresequenz des Polypeptids des vorstehenden (a) deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n), und welches Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist, und
    • (c) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 60% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist und welches Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist.
  • Wie in dem vorstehend beschriebenen Fall einer Deletion, Substitution oder Hinzufügung von Nucleotidresten kann eine Deletion, Substitution oder Hinzufügung von Aminosäureresten, auf die sich hierin bezogen wird, mit Hilfe von Ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt werden, bei der es sich um eine Technik handelt, die vor der vorliegenden Anmeldung bekannt war. Die Anzahl der Aminosäurereste, die deletiert, substituiert oder hinzugefügt werden, ist nicht spezifisch beschränkt, liegt aber bevorzugt in einem Bereich von einer bis zu mehreren zehn Aminosäuren, stärker bevorzugt von einer bis zu mehreren Aminosäuren.
  • Damit die vorstehende Decaprenyldiphosphatsynthetase die Enzymaktivität behält, ist es bevorzugt, dass die Homologie, die die Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, mindestens 60%, im Allgemeinen 80% und bevorzugt 95% oder mehr beträgt.
  • Homologie, auf die hier Bezug genommen wird, kann mit Hilfe eines Homologie-Analyse-Programms wie z. B. BLAST [J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)], FASTA [Meth. Enzymol. 183: 63 (1990)] etc. berechnet werden.
    • (7) Das Verfahren nach vorstehendem (4), wobei die DNA, die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, eine DNA der folgenden (a) oder (b) ist:
    • (a) Eine DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz, oder
    • (b) Eine DNA, die unter stringenten Bedingungen an die DNA des vorstehenden (a) hybridisiert und die ein Polypeptid codiert, das Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist.
  • Die Beschreibung „DNA, die unter stringenten Bedingungen hybridisiert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf DNA, die man durch Kolonie-Hybridisierung, Plaque-Hybridisierung oder Southern-Blot-Hybridisierung erhält, in der die DNA der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon als eine Sonde eingesetzt wird. Man kann eine solche DNA zum Beispiel identifizieren, indem man Hybridisierung bei 65°C in Gegenwart von 0,7–1,0 Mol/l NaCl durchführt, wobei ein Filter mit aus einer Kolonie oder aus einem Plaque gewonnenen DNA oder einem Fragment davon verwendet wird, die oder das daran immobilisiert ist, und man den Filter dann bei 65°C wäscht, wobei 0,1- bis 2-fach konzentrierte SSC-Lösung verwendet wird (1-fach konzentrierte SSC-Lösung: 150 mMol/l Natriumchlorid und 15 mMol/l Natriumcitrat).
  • Die Hybridisierung kann dann nach der in Molecular Cloning, zweite Auflage beschriebenen Methode durchgeführt werden. Bei der hybridisierbaren DNA der vorstehenden DNA handelt es sich zum Beispiel um eine DNA, die mindestens 70% Homologie, bevorzugt 90% oder mehr Homologie zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz aufweist.
    • (8) Das Verfahren nach (1), wobei der Stamm erhältlich ist durch das Verfahren, welches das Einführen einer DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, in den Mikroorganismus umfasst.
    • (9) Das Verfahren nach vorstehendem (8), wobei die DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, eine DNA ist, die die von Rhodobacter sphaeroides abgeleitete p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert.
    • (10) Das Verfahren nach vorstehendem (8), wobei die DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, eine DNA ist, die ein Polypeptid codiert, das aus den folgenden (a), (b) und (c) ausgewählt ist:
    • (a) einem Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst,
    • (b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, in der ein oder mehrere Aminosäurerest(e) in der Aminosäuresequenz des Polypeptids des vorstehenden (a) deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n), und das p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist, und
    • (c) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 60% Homologie zu der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist und welches p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist.
  • Damit das vorstehende Polypeptid, das p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist, die Aktivität des Polypeptids behält, ist es bevorzugt, dass die Homologie, die die Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, mindestens 60%, im Allgemeinen 80% und speziell 95% oder mehr beträgt.
    • (11) Das Verfahren nach vorstehendem (8), wobei die DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, eine DNA aus dem folgenden (a) oder (b) ist:
    • (a) eine DNA, die die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, oder
    • (b) eine DNA, die unter stringenten Bedingungen an die DNA des vorstehenden (a) hybridisiert und die ein Polypeptid codiert, das p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist.
  • Bei der hybridisierbaren DNA der vorstehenden DNA handelt es sich zum Beispiel um eine DNA, die mindestens 70% Homologie, bevorzugt 90% oder mehr Homologie zu der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Nucleotidsequenz aufweist.
    • (12) Das Verfahren nach einem der vorstehenden (1), (4) oder (8), wobei der Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Mikroorganismen, die zu der Gattung Agrobacterium gehören, Mikroorganismen, die zu der Gattung Paracoccus gehören, sowie Mikroorganismen, die zu photosynthetischen Bakterien gehören.
    • (13) Das Verfahren nach dem vorstehenden (12), wobei es sich bei den Mikroorganismen, die zu den photosynthetischen Bakterien gehören, um Mikroorganismen handelt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen, die zu der Gattung Rhodobacter, der Gattung Rhodomicrobium, der Gattung Rhodopila, der Gattung Rhodospirillum oder der Gattung Rhodopseudomonas gehören.
    • (14) Das Verfahren nach dem vorstehenden (13), wobei es sich bei den Mikroorganismen, die zu der Gattung Rhodobacter gehören, um Mikroorganismen handelt, die zu der Spezies Rhodobacter sphaeroides oder Rhodobacter capsulatus gehören.
    • (15) Das Verfahren nach einem der vorstehenden (4) oder (8), wobei die Einführung der DNA in einen Wirtsmikroorganismus, der zu der Gattung Rhodobacter gehört, mittels Elektroporation durchgeführt wird.
  • Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschreibt auch die folgenden Punkte (17) bis (41).
    • (17) Decaprenyldiphosphatsynthetase, die von Rhodobacter sphaeroides abgeleitet ist.
    • (18) Ein Polypeptid, das aus den folgenden (a), (b) und (c) ausgewählt ist:
    • (a) einem Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst,
    • (b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, in der ein oder mehrere Aminosäurerest(e) in der Aminosäuresequenz des Polypeptids des vorstehenden (a) deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n), und das Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist, und
    • (c) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 60% Homologie zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist und welches Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist.
    • (19) p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase, die von Rhodobacter sphaeroides abgeleitet ist.
    • (20) Ein Polypeptid, das aus den folgenden (a), (b) und (c) ausgewählt ist:
    • (a) einem Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst,
    • (b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, in der ein oder mehrere Aminosäurerest(e) in der Aminosäuresequenz des Polypeptids des vorstehenden (a) deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n), und das p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist, und
    • (c) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 60% Homologie zu der in SEQ. ID NO: 4 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist und welches p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist.
    • (21) Eine DNA, die aus den folgenden (a), (b) und (c) ausgewählt ist:
    • (a) einer DNA, die das Polypeptid der vorstehenden (17) oder (18) codiert,
    • (b) einer DNA, die die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst,
    • (c) einer DNA, die unter stringenten Bedingungen an die DNA der vorstehenden (a) oder (b) hybridisiert und die ein Polypeptid codiert, das Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist.
    • (22) Eine DNA, die aus den folgenden (a), (b) und (c) ausgewählt ist:
    • (a) einer DNA, die das Polypeptid der vorstehenden (19) oder (20) codiert,
    • (b) einer DNA, die die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst,
    • (c) einer DNA, die unter stringenten Bedingungen an die DNA der vorstehenden (a) oder (b) hybridisiert und die ein Polypeptid codiert, das p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist.
    • (23) Rekombinante DNA, die durch Einfügen der DNA der vorstehenden (21) oder (22) in einen Vektor erhalten wird.
    • (24) Die rekombinante DNA nach dem vorstehenden (23), wobei die DNA stromabwärts von der DNA eingefügt wird, die eine Nucleotidsequenz eines Promotors umfasst, der in einem ribosomalen RNA-Gen vorhanden ist.
    • (25) Die rekombinante DNA nach dem vorstehenden (24), wobei es sich bei dem ribosomalen RNA-Gen um ein ribosomales RNA-Gen handelt, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zur Gattung Rhodobacter gehört.
    • (26) Die rekombinante DNA nach dem vorstehenden (24), wobei es sich bei der DNA, die eine Nucleotidsequenz eines Promotors umfasst, um eine DNA handelt, die die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst.
    • (27) Eine Transformante, die die rekombinante DNA nach einem der vorstehenden (23) bis (26) trägt.
    • (28) Die Transformante nach dem vorstehenden (27), wobei es sich bei der Transformante um einen Mikroorganismus handelt, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden.
    • (29) Die Transformante nach dem vorstehenden (28), wobei es sich bei dem Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, um einen Mikroorganismus handelt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen, die zu der Gattung Agrobacterium gehören, Mikroorganismen, die zu der Gattung Paracoccus gehören, und Mikroorganismen, die zu photosynthetischen Bakterien gehören.
    • (30) Die Transformante nach dem vorstehenden (29), wobei es sich bei den Mikroorganismen, die zu photosynthetischen Bakterien gehören, um Mikroorganismen handelt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen, die zu der Gattung Rhodobacter, der Gattung Rhodomicrobium, der Gattung Rhodopila, der Gattung Rhodospirillum und der Gattung Rhodopseudomonas gehören.
    • (31) Die Transformante nach dem vorstehenden (30), wobei es sich bei den Mikroorganismen, die zur Gattung Rhodobacter gehören, um Mikroorganismen handelt, die zu den Spezies Rhodobacter sphaeroides oder Rhodobacter capsulatus gehören.
    • (32) Ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10, umfassend das Züchten der Transformante nach einem der vorstehenden (27) bis (31) in einem Medium, das es ermöglicht, Ubichinon-10 zu bilden und in der Kultur anzureichern, und das Gewinnen des Ubichinon-10 aus der Kultur.
    • (33) Ein Verfahren zur Expression von DNA, die ein Polypeptid von Interesse codiert, umfassend das Einfügen einer das Polypeptid codierenden DNA stromabwärts von einer DNA, die eine Nucleotidsequenz eines Promotors umfasst, der in einem ribosomalen RNA-Gen vorhanden ist.
    • (34) Das Verfahren zur Expression eines Gens nach dem vorstehenden (33), wobei es sich bei dem ribosomalen RNA-Gen um ein ribosomales RNA-Gen handelt, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Rhodobacter gehört.
    • (35) Das Verfahren zur Expression eines Gens nach dem vorstehenden (34), wobei es sich bei der DNA, die eine Nucleotidsequenz eines Promotors umfasst, um DNA handelt, die die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist.
    • (36) Das Verfahren zur Expression eines Gens nach einem beliebigen der vorstehenden (33) bis (35), wobei die Expression in einem Mikroorganismus durchgeführt wird, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden.
    • (37) Ein Verfahren zur Konstruktion einer Mutante eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, umfassend das Einführen durch Elektroporation einer DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, in der ein oder mehrere Nucleotidreste in der Nucleotidsequenz einer DNA deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n), die ein Polypeptid codiert, welches von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, und die ein Polypeptid codiert, dessen Polypeptidaktivität verändert wurde, in einen Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden.
    • (38) Das Verfahren nach dem vorstehenden (37), wobei es sich bei der DNA, die ein Polypeptid codiert, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, um DNA handelt, die die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst.
    • (39) Das Verfahren nach einem der vorstehenden (36) bis (38), wobei es sich bei dem Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, um einen Mikroorganismus handelt, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Mikroorganismen, die zu der Gattung Agrobacterium gehören, Mikroorganismen, die zu der Gattung Paracoccus gehören, und Mikroorganismen, die zu photosynthetischen Bakterien gehören.
    • (40) Das Verfahren nach dem vorstehenden (39), wobei es sich bei den Mikroorganismen, die zu photosynthetischen Bakterien gehören, um Mikroorganismen handelt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen, die zu der Gattung Rhodobacter, der Gattung Rhodomicrobium, der Gattung Rhodopila, der Gattung Rhodospirillum und der Gattung Rhodopseudomonas gehören.
    • (41) Das Verfahren nach dem vorstehenden (40), wobei es sich bei den Mikroorganismen, die zur Gattung Rhodobacter gehören, um Mikroorganismen handelt, die zu der Spezies Rhodobacter sphaeroides oder Rhodobacter capsulatus gehören.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.
    • [1] Konstruktion eines Mikroorganismus, in dem die Geranylgeranyltransferase (crtE)-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist.
  • Zur Konstruktion eines Mikroorganismus, in dem die crtE-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung verringert oder fehlerhaft ist, kann man beliebige Mikroorganismen verwenden, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden. Man kann zum Beispiel Mikroorganismen verwenden, die zu der Gattung Agrobacterium oder Paracoccus gehören, sowie jene, die zu photosynthetischen Bakterien gehören.
  • Beispiele für geeignete Mikroorganismen, die zu photosynthetischen Bakterien gehören, sind jene, die zu der Gattung Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopila, Rhodospirillum oder Rhodopseudomonas gehören, genau gesagt Rhodobacter sphaeroides und Rhodobacter capsulatus, und noch genauer R. sphaeroides ATCC 17023 und R. sphaeroides FERM-4675.
  • Die Konstruktion eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, in dem die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, wird mit Hilfe einer Methode durchgeführt, bei der ein Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, nach einem herkömmlichen Verfahren einer mutagenen Behandlung unterzogen wird, wobei Strahlung wie z. B. ultraviolette Strahlen, Röntgenstrahlen und Gamma-Strahlen oder Chemikalien wie z. B. Natriumnitrit, Nitrosoguanidin und Ethylmethylsulfonat eingesetzt werden, und Stämme, in denen die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, werden aus den Stämmen ausgewählt, deren Kolonien eine Farbveränderung zeigen, wenn man sie auf Agarmedium wachsen lässt.
  • Während Wildtyp-Stämme zum Beispiel auf Grund der Anreicherung von Carotinoid rote Kolonien bilden, ist der Farbton der Kolonien, die von den vorstehenden Mutanten gebildet werden, variabel und je nach der Stelle, an dem das Gen deletiert ist, rosa, gelb oder hellviolett, daher können die Zielmutanten auf der Basis des Farbtons der Kolonien ausgewählt werden.
  • Man kann die Zielstämme auch gewinnen, indem man ein Verfahren verwendet, eine Mutation direkt in das Gen einzuführen, das crtE codiert, wobei man gentechnische Methoden einsetzt.
  • Das Verfahren zur Gewinnung der Zielstämme durch Einführen einer Mutation direkt in das crtE codierende Gen mit Hilfe von gentechnischen Methoden wird nachstehend ausführlich erklärt.
    • (1) Extraktion chromosomaler DNA aus einem Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden
  • Chromosomale DNA kann aus einem Mikroorganismus extrahiert werden, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, zum Beispiel nach dem Verfahren, das in Molecular and General Genetics, 213: 78–83 (1988) oder in Nucleic Acids Res. 18: 7267 (1990) beschrieben worden ist.
    • (2) Isolierung eines DNA-Fragments, das das crtE-Gen enthält, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden.
  • Die Nucleotidsequenz eines an der Biosynthese von Carotinoiden beteiligten Enzym-Genclusters, der crtE von R. sphaeroides enthält, ist bereits veröffentlicht worden [J. Bacteriology 177: 2064–2073 (1995)]. Primer-DNA wird auf der Grundlage der Nucleotidsequenzinformation hergestellt, wobei man zum Beispiel ein DNA-Synthesegerät verwendet.
  • Mit Hilfe der Primer-DNA kann jedes DNA-Fragment, das crtE enthält, mittels einer PCR unter Verwendung von chromosomaler DNA als Matrize isoliert werden, die von dem vorstehend in (1) erhaltenen Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden.
  • Ein Beispiel für den Sense-Primer, der für die PCR zu verwenden ist, stellt die in SEQ ID NO: 7 gezeigte Sequenz dar, und die des Antisense-Primers ist die in SEQ ID NO: 8 gezeigte Sequenz. Mit Hilfe der Kombination dieser Primer, zusätzlich zu einem ORF, das crtE codiert, kann man die Volllängen-Version des crtE-Gens amplifizieren, das stromaufwärts und stromabwärts gelegene Bereiche von crtE enthält.
  • Als für die PCR zu verwendende DNA-Polymerase können im Handel erhältliche Enzyme eingesetzt werden, zum Beispiel Takara-Taq-DNA-Polymerase (Takara-Shuzo Co. Ltd.), TaKaRa-LA-PCRTM-Kit Ver. 2 (Takara-Shuzo Co. Ltd.) sowie das ExpandTM High-Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim), während das Takara-PCR-Thermocycle-Gerät 480 (Takara-Shuzo Co. Ltd.) dazu verwendet werden kann, die PCR durchzuführen.
  • PCR wird zum Beispiel mit 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus einer Reaktion für 30 Sekunden bei 94°C, einer Reaktion für 30 Sekunden bis zu einer Minute bei 55°C und einer Reaktion für 2 Minuten bei 72°C besteht, wobei DNA-Fragmente von 2 kb oder weniger amplifiziert werden, bzw. einer Reaktion für 20 Sekunden bei 98°C und einer Reaktion für 3 Minuten bei 68°C besteht, wobei DNA-Fragmente über 2 kb amplifiziert werden, gefolgt von einer Reaktion für 7 Minuten bei 72°C.
  • Das so erhaltene amplifizierte DNA-Fragment wird mittels Agarose-Gelelektrophorese oder anderen Methoden aufgetrennt und isoliert.
  • Das aufgetrennte und isolierte amplifizierte DNA-Fragment wird zum Beispiel mit dem Mermaid Kit (Bio 101 Inc. CA, USA) aus dem Agarosegel extrahiert und aufgereinigt.
  • Die aufgereinigte DNA wird mit einem geeigneten Vektor verknüpft, zum Beispiel mit pCR2.1 (Invitrogen), wobei zum Beispiel der TA Cloning Kit (Invitrogen) eingesetzt wird.
  • Die DNA kann auch nach der folgenden Methode mit einem geeigneten Vektor verknüpft werden, der in Escherichia coli replikationsfähig ist.
  • Das vorstehend erhaltene amplifizierte DNA-Fragment und ein geeigneter Vektor, der in Escherichia coli replikationsfähig ist, werden mit Restriktionsenzymen geschnitten, die die Restriktionsenzymstellen erkennen, die von den vorstehenden Primern bereitgestellt werden. Die so erhaltenen geschnittenen DNA-Fragmente werden fraktioniert bzw. mittels Agarose-Gelelektrophorese gewonnen. Die DNA-Fragmente, bei denen beide Enden geschnitten sind, werden unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens verknüpft.
  • Ein geeigneter Wirt von Escherichia coli, zum Beispiel INVαF' (Invitrogen) und DH5-α (Toyobo Co. Ltd.) wird mit dem Plasmid transformiert, das durch Verknüpfen mit dem Vektor nach dem vorstehenden Verfahren erhalten wurde.
  • Man kann Transformanten selektieren, indem man die Zellen auf Agar-Medium ausstreicht, das einen Wirkstoff enthält, gegen den ein von dem Vektor mitgeführtes Arzneistoff-Resistenzgen resistent ist, zum Beispiel LB-Agar-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und über Nacht bei 37°C züchtet.
  • Ein Plasmid, das Ziel-DNA enthält, wird aus den so erhaltenen Transformanten-Stämmen erhalten, zum Beispiel mit Hilfe des in Molecular Cloning, zweite Auflage beschriebenen Verfahrens.
  • Die Nucleotidsequenz des Bereichs des PCR-amplifizierten Fragments, das in dem erhaltenen Plasmid enthalten ist, lässt sich zum Beispiel mit Hilfe des DyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Japan) und einem 373A-Sequenziergerät (Perkin Elmer Japan) bestimmen.
  • Indem man die Nucleotidsequenz der amplifizierten Sequenz mit Informationen über die bekannte Sequenz vergleicht, ist es möglich zu bestätigen, dass die amplifizierte Sequenz crtE enthält.
    • (3) Herstellung eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, in dem die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist.
  • Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden, in denen die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, lassen sich auf der Grundlage der nach dem vorstehenden (2) erhaltenen DNA gewinnen, die crtE codiert, oder auf der Grundlage der Information über deren Nucleotidsequenz.
  • Eine Verringerung oder eine Fehlerhaftigkeit der crtE-Aktivität in photosynthetischen Bakterien Isst sich erreichen, indem man das auf der chromosomalen DNA vorhandene crtE-Gen einer vollständigen oder teilweisen Deletions-, Substitutions- oder Additions-Mutation unterzieht. Diese kann auch dadurch bewirkt werden, dass man die Expression des crtE-Gens unterdrückt.
  • Um eine vollständige oder teilweise Deletions-, Substitutions- oder Additions-Mutation in dem auf dem Chromosom vorhandenen crtE-Gen zu bewirken, lassen sich beliebige Verfahren verwenden, die üblicherweise zum Einführen von Mutationen eingesetzt werden.
  • Man kann zum Beispiel die folgenden Verfahren (a) und (b) verwenden.
    • (a) Ein Verfahren, bei dem circuläre DNA, die DNA enthält, in der die 5'- und 3'-Enden des crtE-Gens deletiert sind, in den Zielstamm eingeführt wird und es ermöglicht wird, dass eine Rekombination zwischen der eingeführten DNA und einer homologen Region auf der entsprechenden chromosomalen DNA stattfindet, wodurch man bewirkt, dass das Gen auf dem Chromosom unvollständig ist.
  • Bei diesem Verfahren kann die Deletion der 5'- und 3'-Enden beliebiger Art sein, solange die crtE-Aktivität des Stamms, der eine Rekombination durchlaufen hat, abnimmt oder fehlerhaft wird. Statt der Deletion eines 5'-Endes ist es auch möglich, eine Deletion der Region zu verwenden, die für die Transkription des Gens notwendig ist, oder der Region, die für die Translation des crtE-Proteins notwendig ist.
  • Eine bevorzugte circuläre DNA ist eine, die ein Markergen wie z. B. ein Wirkstoff-Resistenzgen enthält, um die Selektion rekombinanter Stämme zu erleichtern, und die gleichzeitig nicht in der Lage ist, sich selbst in dem Stamm zu amplifizieren, in den sie eingeführt wird, um die Expression des Markergens in anderen Stämmen als den rekombinanten Stämmen zu unterdrücken, oder die unter bestimmten Bedingungen nicht replizierbar wird, wie im Fall eines Plasmids, das eine Temperatur-sensitive Replikationsregion enthält. Die circuläre DNA kann eine Replikationsfähigkeit in anderen Stämmen als in dem Stamm aufweisen, in den sie eingeführt werden soll.
  • (b) Ein Verfahren, bei dem DNA, die ein mutiertes Gen enthält, in dem eine vollständige oder teilweise Deletions-, Substitutions- oder Additions-Mutation in dem crtE-Gen bewirkt worden ist, in den Zielstamm eingeführt wird und es ermöglicht wird, dass eine Rekombination zwischen der Region, die die zwei Stellen der Deletions-, Substitutions- oder Additions-Mutation umspannt, und der entsprechenden homologen Region auf dem Chromosom stattfindet, wodurch die Deletion, Substitution oder Addition in ein Gen auf dem Chromosom eingeführt wird.
  • Bei diesem Verfahren kann die Deletions-, Substitutions- oder Additions-Mutation, die von dem mutierten Gen, das eingeführt werden soll, beliebiger Art sein, solange die Mutation dazu führt, dass die crtE-Aktivität des Stamms, in den eine solche Mutation in das Gen auf seinem Chromosom eingeführt wird, abnimmt oder fehlerhaft wird.
  • Man kann auch DNA verwenden, in der die Deletion, Substitution oder Addition in die Region, die für die Replikation des Gens notwendig ist, oder in die Region eingeführt wird, die die für die Translation des crtE-Proteins notwendig ist, solange die Mutation dazu führt, dass die crtE-Aktivität des Stamms, in den eine solche Mutation in das Gen auf seinem Chromosom eingeführt wird, abnimmt oder fehlerhaft wird.
  • Es ist auch in diesem Verfahren bevorzugt, circuläre DNA zu verwenden, die die vorstehende DNA enthält und die die Eigenschaften hat, die in dem vorstehenden (a) beschrieben sind, um die Selektion rekombinanter Stämme zu erleichtern.
  • Die Einführung eines DNA-Fragments in photosynthetische Bakterien kann mit Hilfe eines Verfahrens des Transfers mittels Konjugation durchgeführt werden, zum Beispiel gemäß den Verfahren, die in Bio/Technology 1: 784–791 (1983) und Gene 118: 145–146 (1992) beschrieben sind. Es ist auch möglich, Elektroporation einzusetzen, die mit einem im Handel erhältlichen Gerät durchgeführt werden kann, zum Beispiel mit dem Gene Pulser-II (Biorad).
  • Die Stämme, in denen die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, können selektiert werden, indem man eine Wirkstoffresistenz, die von einem Wirkstoffresistenzgen exprimiert wird, das gleichzeitig in das Chromosom eingebaut wird, als einen Marker verwendet. Des Weiteren kann man die Zielstämme erhalten, indem man die Stämme selektiert, deren Kolonien eine Farbveränderung zeigen, die auf die Verringerung oder die Fehlerhaftigkeit der Fähigkeit Carotinoid zu synthetisieren zurückzuführen ist.
  • Es ist möglich zu bestätigen, dass die Mutation in das crtE-Gen eingeführt ist, indem man das normale crtE-Gen, das im vorstehenden (2) isoliert worden ist, in die vorstehenden Stämme einführt, in denen die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, und überprüft, ob die Fähigkeit Carotinoid biosynthetisch herzustellen wiedererlangt wird oder nicht.
    • [2] Clonierung des Decaprenyldiphosphatsynthetasegens, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden.
  • Man kann DNA der vorliegenden Erfindung, die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, nach dem folgenden Verfahren aus dem in [1] vorstehend beschriebenen Mikroorganismus gewinnen, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden.
    • (1) Isolierung eines Teilfragments des Decaprenyldiphosphatsynthetasegens DNA, die ein Teilfragment des Decaprenyldiphosphatsynthetasegens enthält, das von dem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, lässt sich erhalten, indem man zwei oder mehr Bereiche auswählt, die eine hohe Homologie in bekannten Aminosäuresequenzen des Polyprenyldiphosphatsynthetasegens aufweisen, und eine PCR mit einem Oligodesoxynucleotid, das eine Nucleotidsequenz enthält, die die ausgewählte Aminosäuresequenz codiert, als einem Sense-Primer und mit einem Oligodesoxynucleotid, das eine Sequenz enthält, die komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die die ausgewählte Aminosäuresequenz codiert, als einem Antisense-Primer und mit chromosomaler DNA des Mikroorganismus als einer Matrize durchführt.
  • Beispiele für bekannte Sequenzen des Polyprenyidiphosphatsynthetasegens sind jene, die von Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Escherichia coli, Gluconobacter suboxidans, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Rhodobacter capsulatus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Synechocystis sp. PCC6803 abgeleitet sind. Diese Sequenzen sind aus den Datenbanken öffentlicher Organisationen verfügbar, zum Beispiel aus GenBank.
  • Ein Beispiel für den für die PCR zu verwendenden Sense-Primer ist die Sequenz, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist, und ein Beispiel für den Antisense-Primer ist die Sequenz, die in SEQ ID NO: 10 gezeigt ist. Diese Oligodesoxynucleotide können mit einem allgemein verwendeten DNA-Synthesegerät synthetisiert werden.
  • Als die für die PCR einzusetzende DNA-Polymerase können im Handel erhältliche Enzyme verwendet werden, zum Beispiel Takara-Taq DNA-Polymerase (Takara-Shuzo Co. Ltd.), während das Takara PCR-Thermocycle-Gerät 480 (Takara-Shuzo Co. Ltd.) etc. dazu verwendet werden kann, die PCR durchzuführen.
  • PCR wird zum Beispiel mit 5 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus einer Reaktion für 45 Sekunden bei 94°C, einer Reaktion für 45 Sekunden bei 35°C und einer Reaktion für 1 Minute bei 72°C besteht, gefolgt von 30 Zyklen, wobei ein Zyklus aus einer Reaktion für 45 Sekunden bei 94°C, einer Reaktion für 45 Sekunden bei 45°C und einer Reaktion für 1 Minute bei 72°C besteht.
  • Isolierung und Aufreinigung von amplifizierten DNA-Fragmenten, deren Verknüpfung mit einem geeigneten Vektor, Transformation mit einer rekombinanten DNA, die durch eine solche Verknüpfung gewonnen wird, und Erzeugung von Transformanten, Präparation von Plasmid-DNA, die die Ziel-DNA aus den erhaltenen Transformantenstämmen enthält, und Bestimmung der Nucleotidsequenz eines mittels PCR amplifizierten Fragment-Bereichs, der in der erhaltenen Plasmid-DNA enthalten ist, können gemäß den vorstehend in [1] beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
  • Indem man die Nucleotidsequenz der amplifizierten Sequenz mit Informationen über bekannte Sequenzen vergleicht, ist es möglich zu bestätigen, dass die amplifizierte Sequenz das Polyprenyldiphosphatsynthetasegen enthält.
    • (2) Isolierung des Volllängen-Gens unter Verwendung eines Teilfragments des Polyprenyldiphosphatsynthetasegens
  • Ein DNA-Fragment, das das vollständige Decaprenyldiphosphatsynthetasegen enthält, das aus dem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, kann zum Beispiel gemäß der folgenden Methode aus einer Genombank isoliert werden, die von dem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, indem man DNA verwendet, die eine Teilsquenz des Gens aufweist.
  • Chromosomale DNA, die von dem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, wird nach der in [1] (1) vorstehend beschriebenen Methode einer Extraktion und dann einer partiellen Verdauung mit einem geeigneten Restriktionsenzym wie z. B. Sau3Al unterzogen. Das so erhaltene verdaute DNA-Fragment wird mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens wie z. B. einer Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation fraktioniert.
  • 30 bis 40 kb große DNA-Fragmente, die mit Hilfe der Fraktionierung erhalten werden, werden mit einem Cosmid-Vektor, zum Beispiel mit SuperCosI, der mit einem geeigneten Restriktionsenzym wie z. B. BamHI verdaut worden ist, zur Verpackung in den λ-Phagen verknüpft.
  • Unter Verwendung des auf diese Weise hergestellten rekombinanten Phagen wird durch Transformation einer geeigneten Wirtszelle, zum Beispiel Escherichia coli DH5-α, nach einer herkömmlichen Methode (zum Beispiel der in Molecular Cloning, zweite Auflage beschriebenen Methode) eine chromosomale DNA-Bank hergestellt und man erhält Transformanten.
  • Die Transformanten können selektiert werden, indem man die Zellen auf einem Agar-Medium ausstreicht, das einen Wirkstoff enthält, gegen den ein von dem Vektor mitgeführtes Wirkstoff-Resistenzgen resistent ist, zum Beispiel LB-Agar-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und über Nacht bei 37°C züchtet.
  • Von den Cosmiden, die die Transformanten enthalten, lässt sich das Cosmid, das ein DNA-Fragment aufweist, das das vollständige Decaprenyldiphosphatsynthetasegen enthält, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, mit Hilfe der Southern-Blot-Hybridisierung bestätigen, wobei die folgende DNA als Sonde eingesetzt wird.
  • Die als Sonde zu verwendende DNA lässt sich herstellen, indem man DNAs, die die gesamte oder einen Teil der Nucleotidsequenz enthalten, die vorstehend in [2] (1) bestimmt worden ist, sowie den DIG Oligonucleotide Tailing Kit (Boehringer Mannheim) verwendet. Die Ziel-DNA kann dann mit der Sonde und dem DIG DNA Detection Kit (Boehringer Mannheim) nachgewiesen werden.
  • Es ist auch möglich, das Cosmid, das ein DNA-Fragment enthält, das das vollständige Decaprenyldiphosphatsynthetasegen enthält, mit Hilfe der Anwesenheit des amplifizierten Fragments auf der Grundlage einer PCR zu bestätigen, wobei das aus der vorstehend erhaltenen Transformante extrahierte Cosmid als Matrize verwendet wird, sowie ein Sense-Primer und ein Antisense-Primer, die basierend auf der früher bestimmten partiellen Sequenz des Decaprenyldiphosphatsynthetasegens konstruiert wurden.
  • Man kann ein DNA-Fragment, das das Decaprenyldiphosphatsynthetasegen enthält, nach Verdauung des das DNA-Fragment enthaltenden Cosmids mit einem Restriktionsenzym mittels Agarose-Gelelektrophorese isolieren und gewinnen.
  • Man kann die Größe des DNA-Fragments, das das Decaprenyldiphosphatsynthetasegen enthält, bestimmen, indem man zum Beispiel DNA, die das Gen enthält, nach einer herkömmlichen Methode, zum Beispiel der in Molecular Cloning, zweite Auflage beschriebenen Methode, mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, gefolgt von einer Fraktionierung durch Agarose-Gelelektrophorese und Transfer und Immobilisierung auf einer geeigneten Membran und Durchführen von Southern-Blut-Hybridisierung mit dem vorstehenden DIG-markierten DNA-Fragment als einer Sonde.
  • Man kann die aus dem Agarosegel gewonnene DNA aufreinigen, indem man zum Beispiel den Geneclean II Kit (Bio 101 Inc., CA, USA) verwendet.
  • Um rekombinante DNA zu erzeugen, wird die aufgereinigte DNA mit einem geeigneten Vektor verknüpft, der mit einem Restriktionsenzym verdaut worden ist, wobei zum Beispiel der Ligation Kit Ver. 2 (Takara-Shuzo Co. Ltd.) verwendet wird.
  • Mit Hilfe der rekombinanten DNA lassen sich durch Transformation von Escherichia coli, zum Beispiel E. coli DH5-α, Transformanten erhalten, die die rekombinante DNA enthalten. Von den Transformanten mitgeführte Plasmid-DNA kann nach einer herkömmlichen Methode extrahiert werden.
  • Gegebenenfalls kann Plasmid-DNA, die ein DNA-Fragment enthält, das von mit Restriktionsenzymen verdauter Plasmid-DNA abgeleitet ist, durch Verdauen der Plasmid-DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym nach einer herkömmlichen Methode, zum Beispiel der in Molecular Cloning, zweite Auflage beschriebenen Methode, und durch Verknüpfen der erhaltenen Restriktionsenzymfragmente nach der Fraktionierung und Aufreinigung mit einem geeigneten Vektor erhalten werden.
  • Die Nucleotidsequenz der gesamten oder eines Teils der so erhaltenen Plasmid-DNA kann mit Hilfe des DyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Japan) und einem 373A-Sequenziergerät (Perkin Elmer, Japan) bestimmt werden.
  • Auf der Grundlage der Information der bestimmten Nucleotidsequenz kann man den ORF und die davon codierte Aminosäuresequenz bestimmen, indem man eine im Handel erhältliche Nucleotidsequenz-Analyse-Software verwendet, zum Beispiel Genetyx Mac (Software Development).
  • Indem man die bestimmte Aminosäuresequenz mit der bekannten Aminosäuresequenz der Decaprenyldiphosphatsynthetase vergleicht, ist es möglich zu bestätigen, dass die DNA die Ziel-Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert.
  • Ein Beispiel für eine DNA, die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, die nach der vorstehenden Methode erhalten wurde, ist DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, die ein Polypeptid codiert, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
  • Zusätzlich zu der vorstehend erhaltenen DNA schließt die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene DNA auch DNA ein, die unter stringenten Bedingungen an DNA hybridisiert, die aus der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz besteht, und die ein Polypeptid codiert, das Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität hat.
    • [3] Clonierung einer DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, die von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden.
  • Man kann DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, nach dem folgenden Verfahren aus dem in [1] vorstehend beschriebenen Mikroorganismus gewinnen, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, indem man Escherichia coli verwendet, in denen die p-Hydroxybenzoesäure-Octaprenyltransferase (ubiA) fehlerhaft ist (hierin nachfolgend als hinsichtlich ubiA fehlerhafter Stamm bezeichnet).
  • Chromosomale DNA, die von dem Mikroorganismus abgeleitet ist, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden, wird nach der in [1] (1) vorstehend beschriebenen Methode extrahiert und dann partiell mit einem geeigneten Restriktionsenzym wie z. B. Sau3Al verdaut. Die so erhaltenen verdauten DNA-Fragmente werden mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens wie z. B. einer Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation fraktioniert.
  • 2 bis 8 kb große DNA-Fragmente, die mit Hilfe der Fraktionierung erhalten werden, werden mit einem Plasmid-Vektor verknüpft, zum Beispiel mit pUC19, der mit einem geeigneten Restriktionsenzym wie z. B. BamHI verdaut worden ist, um rekombinante DNA zu erzeugen.
  • Mit der rekombinanten DNA kann durch Transformation einer geeigneten Wirtszelle, zum Beispiel Escherichia coli DH5-α, nach einer herkömmlichen Methode (zum Beispiel der in Molecular Cloning, zweite Auflage beschriebenen Methode) eine chromosomale DNA-Bank hergestellt werden und Transformanten können erhalten werden.
  • Die Transformanten können selektiert werden, indem man die Zellen auf einem Agar-Medium ausstreicht, das einen Wirkstoff enthält, gegen den ein von dem Vektor mitgeführtes Wirkstoff-Resistenzgen resistent ist, zum Beispiel LB-Agar-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und über Nacht bei 37°C züchtet.
  • Plasmide, die von den Transformanten mitgeführt werden, werden nach einer herkömmlichen Methode extrahiert und ein hinsichtlich ubiA fehlerhafter Stamm wird mit den Plasmiden transformiert.
  • Ein hinsichtlich ubiA fehlerhafter Stamm ist vom National Institute of Genetics erhältlich, einer öffentlichen Organisation für die Sammlung von Kulturen. Ein hinsichtlich ubiA fehlerhafter Stamm ist lebensfähig, wenn man Glucose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet, ist aber nicht lebensfähig, wenn Sukzinsäure als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird. Daher wird, sofern Plasmide, die von den vorstehenden Transformanten extrahiert werden, DNA enthalten, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, ein hinsichtlich ubiA fehlerhafter Stamm, in den das Plasmid eingeführt wird, auf einem Agar-Medium lebensfähig, das Sukzinsäure als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Ein Plasmid, das DNA enthält, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, kann selektiert werden, indem man diese Eigenschaft der Lebensfähigkeit als Index verwendet.
  • Aus Transformanten des hinsichtlich ubiA fehlerhaften Stamms, die auf einem Agar-Medium lebensfähig sind, das Sukzinsäure als einzige Kohlenstoffquelle enthält, wird Plasmid-DNA, die von den Transformanten mitgeführt wird, extrahiert und die Nucleotidsequenz der Plasmid-DNA wird mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt, wobei zum Beispiel der DyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Japan) und ein 373A-Sequenziergerät (Perkin Elmer, Japan) eingesetzt wird.
  • Aus der bestimmten Nucleotidsequenz kann man den ORF und die davon codierte Aminosäuresequenz bestimmen, indem man eine im Handel erhältliche Nucleotidsequenz-Analyse-Software verwendet, zum Beispiel Genetyx Mac (Software Development).
  • Indem man die bestimmte Aminosäuresequenz mit der bekannten Aminosäuresequenz von p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase vergleicht, kann man bestimmen, dass die DNA die Ziel-p-Hydroxybenzoesäure-Polyprenyltransferase codiert.
  • Ein Beispiel für die DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Polyprenyltransferase codiert, die nach der vorstehenden Methode erhalten wurde, ist DNA, die die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, die ein Polypeptid codiert, das die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresequenz hat.
  • Zusätzlich zu der vorstehend erhaltenen DNA schließt die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene DNA auch DNA ein, die unter stringenten Bedingungen an die DNA hybridisiert, die aus der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Nucleotidsequenz besteht und die p-Hydroxybenzoesäure-Polyprenyltransferase codiert.
    • [4] Produktion von Decaprenyldiphosphatsynthetase oder p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase.
  • Das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid kann hergestellt werden, indem man DNA, die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, oder DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, mittels der in Molecular Cloning, zweite Auflage oder in Current Protocols in Molecular Biology beschriebenen Methode in einer Wirtszelle exprimiert, zum Beispiel mittels der folgenden Methode.
  • Auf der Grundlage der Volllängen-DNA der DNA der vorliegenden Erfindung, die Decaprenyldiphosphatsynthetase oder p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, wird je nach Bedarf ein DNA-Fragment mit einer zweckdienlichen Länge hergestellt, das einen Bereich umfasst, der das Polypeptid codiert.
  • Des Weiteren kann man DNA, die für die effiziente Produktion des in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptids nützlich ist, nach Bedarf herstellen, indem man ein Nucleotid in der Nucleotidsequenz des Bereichs, der das Polypeptid codiert, in einer solchen Weise ersetzt, dass man ein Codon erzeugt, das am besten für die Expression in einer Wirtszelle geeignet ist.
  • Das vorstehende DNA-Fragment oder das Volllängen-Gen wird stromabwärts von einer Promotorregion in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt, um rekombinante DNA zu konstruieren.
  • Die rekombinante DNA wird in eine Wirtszelle eingeführt, die für den Expressionsvektor geeignet ist.
  • Als Wirtszelle können beliebige bakterielle Zellen, Hefezellen, Tierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen etc. verwendet werden, die in der Lage sind, das Zielgen zu exprimieren.
  • Die Expressionsvektoren, die man verwenden kann, sind solche, die zu autonomer Replikation oder Integration in ein Chromosom in den vorstehenden Wirtszellen fähig sind und die einen Promotor an einer Position umfassen, an der die Transkription der DNA, die das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid codiert, möglich ist.
  • Wenn man eine prokaryontische Zelle wie z. B. eine bakterielle Zelle als Wirtszelle verwendet, ist es bevorzugt, dass rekombinante DNA, welche die DNA umfasst, die das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid codiert, zu autonomer Replikation in der prokaryontischen Zelle fähig ist, wobei es sich gleichzeitig um einen Vektor handelt, der einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle, die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene DNA und eine Transkriptionsterminationssequenz umfasst. Der Vektor kann ferner ein Gen umfassen, das den Promotor reguliert.
  • Beispiele für geeignete Expressionsvektoren sind pBTrp2, pBTac1 und pBTac2 (alle von Boehringer Mannheim erhältlich), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYP10 (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 110600/83 ), pKYP200 [Agric. Biol. Chem. 48: 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem. 53: 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82: 4306 (1985)], pBluescript II SK(–) (Stratagene), pTrs30 [hergestellt aus Escherichia coli JM109/pTrs30 (FERM BP-5407)], pTrs32 [hergestellt aus Escherichia coli JM109/pTr532 (FERM BP-5408)], pGHA2 [hergestellt aus Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400), ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 221091/85 ], pGKA2 [hergestellt aus Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798), ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 221091/85 ], pTerm2 ( US 4,686,191 , US 4,939,094 , US 5,160,735 ), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol. 172: 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia) und das pET-System (Novagen).
  • Als Promotor können beliebige Promotoren verwendet werden, die in der Lage sind, in Wirtszellen zu funktionieren. Man kann zum Beispiel Promotoren verwenden, die von Escherichia coli oder von Phagen abgeleitet sind, wie z. B. den trp-Promotor (Ptrp), den lac-Promotor, den PL-Promotor, den PR-Promotor und den T7-Promotor. Man kann auch künstlich modifizierte Promotoren verwenden, wie z. B. einen Promotor, in dem zwei Ptrp hintereinander kombiniert sind (Ptrp × 2), den tac-Promotor, den lacT7-Promotor und den letl-Promotor etc.
  • Im Fall der Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden, ist es bevorzugt, einen Promotor zu verwenden, der in einem ribosomalen RNA-Gen vorhanden ist. Ein Beispiel ist ein Promotor, der in einem ribosomalen RNA-Gen vorhanden ist, das aus Mikroorganismen der Gattung Rhodobacter abgeleitet ist, speziell ein Promotor, der eine DNA umfasst, die die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Nucleotidsequenz enthält.
  • Es ist bevorzugt, ein Plasmid zu verwenden, in dem die Distanz zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz (Ribosomen-Bindungsstelle) und dem Startcodon auf eine geeignete Länge angepasst ist (z. B. auf 6–18 Basen).
  • Im Fall der rekombinanten DNA, die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, ist die Transkriptionsterminationssequenz nicht notwendig für die Expression der DNA, die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, aber es ist bevorzugt, dass die Transkriptionsterminationssequenz unmittelbar stromabwärts von dem Strukturgen liegt.
  • Beispiele für geeignete Wirtszellen sind Zellen von Mikroorganismen, die zu den Gattungen Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas etc. gehören, speziell jene von Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5-α, Escherichia coli MC 1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli Nr. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichla coli Gl698, Escherichia coli TB1, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtills, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. D-0110, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Anabaena cylindrica, Anabaena doliolum, Anabaena flos-aquae, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter mysorens, Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter protophormiae, Arthrobacter roseoparaffinus, Arthrobacter sulfureus, Arthrobacter ureafaciens, Chromatium buderi, Chromatium tepidum, Chromatium vinosum, Chromatium warmingii, Chromatium fluviatile, Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwinia ananas, Erwinia herbicola, Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methyiobacterium rhodesianum, Methylobacterium extorquens, Phormidium sp. ATCC 29409, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marina, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexigens, Rhodospirillum salinarum, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Streptomyces fungicidius, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus und Zymomonas mobilis.
  • Die Einführung des rekombinanten Vektors kann mit einer beliebigen der Methoden zur Einführung von DNA in die vorstehenden Wirtszellen durchgeführt werden, zum Beispiel mit der Methode, bei der Calciumionen verwendet werden [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69: 2110 (1972)], der Protoplasten-Methode (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 248394/88 ) und den in Gene 17: 107 (1982) und in Molecular & General Genetics 168: 111 (1979) beschriebenen Methoden.
  • Wenn eine Hefezelle als Wirtszelle verwendet wird, kann man YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419), pHS19, pHS15 etc. als Expressionsvektor einsetzen.
  • Als Promotor kann man beliebige Promotoren verwenden, die in der Lage sind, in Hefezellen zu funktionieren. Geeignete Promotoren umfassen Promotoren von Hexokinase und anderer glycolytischer Gene, den PHO5-Promotor, den PGK-Promotor, den GAP-Promotor, den ADH-Promotor, den gal 1-Promotor, den gal 10-Promotor, den Hitzeschockpolypeptid-Promotor, den MFα1-Promotor, den CUP-Promotor etc.
  • Beispiele für geeignete Wirtszellen sind Zellen von Mikroorganismus-Stämmen, die zur Gattung Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia oder Candida gehören, speziell zu den Spezies Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius oder Candida utilis.
  • Einführung des rekombinanten Vektors kann mit Hilfe einer beliebigen der Methoden zur Einführung von DNA in Hefezellen durchgeführt werden, z. B. durch Elektroporation [Methods Enzymol. 194: 182 (1990)], mit der Sphäroplasten-Methode [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75: 1929 (1978)], der Lithiumacetat-Methode [J. Bacteriol. 153: 163 (1983)] und mit der in Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75: 1929 (1978) beschriebenen Methode.
  • Wenn eine Tierzelle als Wirtszelle verwendet wird, kann man pcDNAI und pcDM8 (beide von Funakoshi erhältlich), pAGE107 [ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 22979/91 ; Cytotechnology 3: 133 (1990)], pAS3-3 (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 227075/90 ), pCDM8 [Nature 329: 840 (1987)], pcDNAI/Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Biochem. 101: 1307 (1987)], pAGE210 etc. als Expressionsvektor einsetzen.
  • Als Promotor kann man beliebige Promotoren verwenden, die in der Lage sind, in Tierzellen zu funktionieren. Geeignete Promotoren umfassen den Promotor des IE (sehr frühen)-Gens von Cytomegalievirus (CMV), den frühen SV40-Promotor, den Promotor eines Retrovirus, den Metallothionein-Promotor, den Hitzeschockpromotor, den SRα-Promotor etc. Der Enhancer des IE-Gens von menschlichem CMV kann in Kombination mit dem Promotor eingesetzt werden.
  • Beispiele für geeignete Wirtszellen sind von Menschen abgeleitete Namalwa-Zellen, von Affen abgeleitete COS-Zellen, von Chinesischem Hamster abgeleitete CHO-Zellen und HBT5637 (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 299/88 ).
  • Einführung des rekombinanten Vektors in Tierzellen kann mit Hilfe einer beliebigen der Methoden zur Einführung von DNA in Tierzellen durchgeführt werden, z. B. durch Elektroporation [Cytotechnology 3: 133 (1990)], mit der Calciumphosphat-Methode (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 227075/90 ), mittels Lipofection [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 7413 (1987)] und mit der in Virology 52: 456 (1973) beschriebenen Methode.
  • Wenn eine Insektenzelle als Wirtszelle verwendet wird, kann man das Polypeptid exprimieren, indem man die in Current Protocols in Molecular Biology; Baculovirus Expression Vectors, A Laborstory Manual, W. H. Freeman and Company New York (1992); Bio/Technology 6: 47 (1988) beschriebenen Methoden etc. verwendet.
  • Das bedeutet, der rekombinante Gentransfer-Vektor und ein Baculovirus werden in eine Insektenzelle cotransfiziert, um ein rekombinantes Virus in dem Kulturüberstand der Insektenzelle zu erhalten, und dann wird eine Insektenzelle mit dem rekombinanten Virus infiziert, wodurch das Polypeptid exprimiert werden kann.
  • Beispiele für Gentransfervektoren, die zur Verwendung in diesem Verfahren geeignet sind, sind pVL1392, pVL1393 und pBlueBaclII (Produkte von Invitrogen).
  • Ein Beispiel für das Baculovirus ist das Kernpolyedervirus von Autographs californica, bei dem es sich um ein Virus handelt, das Insekten infiziert, die zur Familie Barathra gehören.
  • Beispiele für Insektenzellen sind Sf9 und Sf21, bei denen es sich Ovarialzellen von Spodoptera frugiperda handelt [Baculovirus Expression Vectors, A Laborstory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)], sowie High 5, bei der es sich um eine Ovarialzelle von Trichoplusia ni handelt (Invitrogen).
  • Cotransfektion des vorstehenden rekombinanten Gentransfer-Vektors und des vorstehenden Baculovirus in eine Insektenzelle zur Herstellung des rekombinanten Virus kann mit der Calciumphosphat-Methode (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 227075/90 ), durch Lipofection [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 7413 (1987)] etc. durchgeführt werden.
  • Wenn eine Pflanzenzelle als Wirtszelle verwendet wird, sind das Ti-Plasmid, der Tabakmosaikvirus-Vektor etc. nützliche Expressionsvektoren.
  • Als Promotor können beliebige Promotor verwendet werden, die in der Lage sind, in Pflanzenzellen zu funktionieren. Geeignete Promotoren umfassen den 35S-Promotor von Blumenkohlmosaikvirus (CaMV), den Actin 1-Promotor von Reis etc.
  • Beispiele für geeignete Wirtszellen sind Zellen von Pflanzen wie z. B. Tabak, Kartoffel, Tomate, Karotte, Sojabohne, Raps, Alfalfa, Reis, Weizen und Gerste.
  • Einführung des rekombinanten Vektors kann mit Hilfe einer beliebigen der Methoden zur Einführung von DNA in Pflanzenzellen durchgeführt werden, z. B. der Agrobacterium-Methode (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldungen Nr. 140885/84 und 70080/85 , WO 94/00977 ), mittels Elektroporation (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 251887/85 ) und mit der Methode, bei der eine Partikelkanone (Genkanone) eingesetzt wird ( japanische Patente Nr. 2606856 und 2517813 ).
  • Das Gen kann nach den in Molecular Cloning, zweite Auflage etc. beschriebenen Verfahren entweder direkt exprimiert werden oder in Form eines sezernierten Produkts oder durch Expression eines Fusionsproteins.
  • Wenn die Expression in Hefezellen, Tierzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen durchgeführt wird, kann man ein Polypeptid erhalten, bei dem ein Zucker oder eine Zuckerkette angehängt ist.
  • Das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid kann erzeugt werden, indem man die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Transformante, die man nach den vorstehenden Prozeduren erhält, in einem Medium züchtet, es ermöglicht, dass sich das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid, das Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität oder p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist, bildet und in der Kultur anreichert und das Polypeptid aus der Kultur gewinnt.
  • Züchten der vorstehend erhaltenen, in der Beschreibung beschriebenen Transformante kann mit Hilfe von herkömmlichen Methoden für das Züchten einer Wirtszelle einer Transformante durchgeführt werden.
  • Wenn die Transformante der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines Prokaryonten wie z. B. Escherichia coli oder eines Eukaryonten wie z. B. Hefe als Wirt erzeugt wird, kann man beliebige natürliche und synthetische Medien für das Züchten der Transformante verwenden, solange es sich um ein Medium handelt, das für das effiziente Züchten der Transformante geeignet ist und welches Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze etc. enthält, welche von der verwendeten Transformante assimiliert werden können.
  • Als Kohlenstoffquellen kann man beliebige Kohlenstoffquellen verwenden, die von der Transformante assimiliert werden können. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse, die diese enthält, Stärke und Stärkehydrolysat; organische Säuren wie z. B. Essigsäure und Propionsäure; und Alkohole wie z. B. Ethanol und Propanol.
  • Als Stickstoffquellen kann man Ammoniak, Ammoniumsalze verschiedener organischer und anorganischer Säuren wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat verwenden sowie andere Stickstoff enthaltende Verbindungen ebenso wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Sojabohnenkuchen, Sojabohnenkuchenhydrolysat und verschiedene fermentierte Mikrobenzellen und verdaute Produkte davon.
  • Beispiele für anorganische Salze umfassen Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat.
  • Züchten wir unter aeroben Bedingungen durchgeführt, zum Beispiel durch Schüttelkultur oder Tauch-Spinnerkultur unter Belüftung, üblicherweise für 16 Stunden bis zu 7 Tagen bei 15–40° C. Der pH-Wert wird während des Züchtens bevorzugt bei 3,0–9,0 konstant gehalten. Die Einstellung des pH-Werts wird durchgeführt, indem man eine organische oder eine anorganische Säure, eine Alkalilösung, Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniak etc. verwendet.
  • Gegebenenfalls können Antibiotika wie z. B. Ampicillin und Tetracyclin während des Züchtens zu dem Medium hinzugefügt werden.
  • Wenn ein Mikroorganismus gezüchtet wird, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, der einen induzierbaren Promotor umfasst, kann gegebenenfalls ein Induktor zu dem Medium hinzugegeben werden. Zum Beispiel kann im Fall eines Mikroorganismus, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, der den lac-Promotor umfasst, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid oder dergleichen zu dem Medium hinzugefügt werden; und im Fall eines Mikroorganismus, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, der den trp-Promotor umfasst, kann Indolacrylsäure oder dergleichen zugegeben werden.
  • Für das Züchten der Transformante, die unter Verwendung einer Tierzelle als Wirtszelle hergestellt wird, können allgemein verwendete Medien wie z. B. das RPMI 1640-Medium [The Journal of the American Medical Association 199: 519 (1967)], Eagle-MEM [Science 122: 501 (1952)], nach Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium [Virology 8: 396 (1959)] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73: 1 (1950)], Medien, die hergestellt worden sind, indem man fötales Kälberserum oder dergleichen zu diesen Medien hinzugefügt hat, etc. als Medium verwendet werden.
  • Züchten wird üblicherweise für 1–7 Tage bei pH 6–8 bei 30–40° C in Gegenwart von 5% CO2 durchgeführt.
  • Gegebenenfalls können Antibiotika wie z. B. Kanamycin und Penicillin während des Züchtens zu dem Medium hinzugefügt werden.
  • Für das Züchten der Transformante, die unter Verwendung einer Insektenzelle als Wirtszelle hergestellt wurde, können allgemein verwendete Medien wie z. B. das TNM-FH-Medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM-Medium (Life Technologies), ExCell 400 und ExCell 405 (beide JRH Biosciences) und Grace-Insektenmedium [Nature 195: 788 (1962)] als Medium verwendet werden.
  • Züchten wird üblicherweise für 1–5 Tage bei pH 6–7 bei 25–30° C durchgeführt. Gegebenenfalls können Antibiotika wie z. B. Gentamycin während des Züchtens zu dem Medium hinzugefügt werden.
  • Die Transformante, die unter Verwendung einer Pflanzenzelle als Wirtszelle hergestellt wurde, kann als eine Zelle oder als eine Zelle oder als ein Organ einer Pflanze in differenzierter Form gezüchtet werden. Kulturmedien, die zur Verwendung beim Züchten der Transformante geeignet sind, umfassen allgemein verwendete Medien wie z. B. das Murashigo-Skoog (MS) Medium und das White Medium sowie Medien, die hergestellt werden, indem man Phytohormone wie z. B. Auxin, Cytokinin und so weiter zu diesen Medien hinzugibt.
  • Züchten wird üblicherweise für 3–60 Tage bei pH 5–9 bei 20–40°C durchgeführt.
  • Gegebenenfalls können Antibiotika wie z. B. Kanamycin und Hygromycin während des Züchtens zu dem Medium hinzugefügt werden.
  • Das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid kann erzeugt werden, indem man die vorstehende Transformante, die von einem Mikroorganismus, einer Tierzelle oder einer Pflanzenzelle abgeleitet ist und die einen rekombinanten Vektor enthält, in den die DNA, die das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid codiert, eingebaut ist, nach einer üblichen Züchtungsmethode züchtet, es ermöglicht, dass sich das Polypeptid bildet und in der Kultur anreichert, und das Polypeptid aus der Kultur gewinnt.
  • Das Gen kann nach den in Molecular Cloning, zweite Auflage etc. beschriebenen Verfahren entweder direkt oder in Form eines sezernierten Produkts oder durch Expression eines Fusionsproteins exprimiert werden.
  • Das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid kann intrazellulär erzeugt werden, extrazellulär sezerniert oder an den äußeren Membranen der Wirtszellen produziert werden. Solche Herstellungsverfahren können je nach der Art der verwendeten Wirtszelle oder nach der Veränderung der Struktur des herzustellenden Polypeptids ausgewählt werden.
  • Wenn das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid in Wirtszellen oder auf den äußeren Membranen von Wirtszellen produziert wird, ist es möglich vorzugeben, dass das Polypeptid außerhalb der Wirtszellen sezerniert wird, indem man die Methode von Paulson et al., [J. Biol. Chem. 264: 17619 (1989)], die Methode von Lowe et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 8227 (1989); Genes Develop. 4: 1288 (1990)] oder die in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 336963/93 , WO94/23021 beschriebenen Metho den etc. anwendet.
  • Das bedeutet, dass man die extrazelluläre Sekretion des in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptids durch Wirtszellen bewirken kann, indem man es durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken in Form eines Polypeptids exprimiert, in dem ein Signalpeptid stromaufwärts von einem Polypeptid hinzugefügt wird, das das aktive Zentrum des in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptids enthält.
  • Es ist auch möglich, die Produktion des Polypeptids zu erhöhen, indem man nach der in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 227075/90 beschriebenen Methode ein Genamplifikationssystem benutzt, bei dem das Dihydrofolatreduktasegen oder dergleichen verwendet wird.
  • Des Weiteren ist es möglich, die Tierzellen oder Pflanzenzellen, die das eingeführte Gen mitführen, zu veranlassen, sich zu redifferenzieren, um ein Tier zu erzeugen, das das eingeführte Gen besitzt (ein nicht-menschliches transgenes Tier), oder eine Pflanze zu erzeugen, die das eingeführte Gen besitzt (eine transgene Pflanze), und das Polypeptid der Erfindung mit diesen Individuen herzustellen.
  • Wenn es sich bei der Transformante um ein einzelnes Tier oder um eine einzelne Pflanze handelt, kann das Polypeptid hergestellt werden, indem man das einzelne Tier oder die einzelne Pflanze auf eine übliche Art und Weise aufzieht oder züchtet, es ermöglicht, dass sich das Polypeptid darin bildet und anreichert, und das Polypeptid aus dem Tier oder der Pflanze gewinnt.
  • Wenn ein einzelnes Tier verwendet wird, kann das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid nach bekannten Methoden [American Journal of Clinical Nutrition 63: 639S (1996); American Journal of Clinical Nutrition 63: 627S (1996); Bio/Technology 9: 830 (1991)] in dem Tier hergestellt werden, das das eingeführte Gen trägt.
  • Im Fall eines einzelnen Tieres kann man das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zum Beispiel dadurch produzieren, indem man ein nicht-menschliches transgenes Tier aufzieht, das DNA trägt, die das Polypeptid codiert, es ermöglicht, dass sich das Polypeptid in dem Tier bildet und anreichert, und das Protein aus dem Tier gewinnt. Die Orte, an denen das Polypeptid gebildet wird und sich anreichert, umfassen Milch (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 309192/ 88 ), Ei etc. des Tiers. Als zu verwendender Promotor können beliebige Promotoren verwendet werden, die in der Lage sind, in einem Tier zu funktionieren. Bevorzugte Promotoren umfassen Promotoren, die spezifisch für Milchdrüsenzellen sind, wie z. B. den α-Casein-Promotor, den β-Casein-Promotor, den β-Lactoglobulin-Promotor und den Promotor des sauren Proteins aus Molke („whey acidic Protein").
  • Im Fall einer einzelnen Pflanze kann man das Polypeptid der Erfindung zum Beispiel dadurch produzieren, indem man nach bekannten Verfahren [Soshiki Baiyo (Tissue Culture) 20 (1994); Soshiki Baiyo (Tissue Culture) 21 (1995); Trends in Biotechnology 15: 45 (1997)] eine transgene Pflanze züchtet, die DNA trägt, die das Polypeptid codiert, es ermöglicht, dass sich das Polypeptid in der Pflanze bildet und anreichert, und das Polypeptid aus der Pflanze gewinnt.
  • Isolierung und Aufreinigung des Polypeptids, das Decaprenyldiphosphatsynthetase-Aktivität oder p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Aktivität aufweist und das von der in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebenen Transformante produziert worden ist, können mittels herkömmlicher Methoden zur Isolierung und Aufreinigung von Enzymen durchgeführt werden.
  • Wenn das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid zum Beispiel in einer löslichen Form in Zellen exprimiert wird, werden die Zellen nach Ablauf der Züchtung mittels Zentrifugation gewonnen und in einem wässrigen Puffer suspendiert, gefolgt von einem Aufschluss mit Hilfe eines Ultraschallgeräts, einer French-Presse, einem Manton-Gaulin-Homogenisator, einer Dynomühle oder dergleichen, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Aus dem durch Zentrifugieren des zellfreien Extrakts erhaltenen Überstand kann man durch eine einmalige Anwendung oder eine Kombination von herkömmlichen Methoden zur Isolierung und Aufreinigung von Enzymen, nämlich durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, Aussalzen mit Ammoniumsulfat etc., Entsalzen, Präzipitation mit einem organischen Lösungsmittel, Anionenaustauschchromatographie mit Harzen wie z. B. Diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose und DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei Corporation), Kationenaustauschchromatographie mit Harzen wie z. B. S-Sepharose FF (Pharmacia), hydrophober Chromatographie mit Harzen wie z. B. Butyl-Sepharose und Phenyl-Sepharose, Gelfiltration mit einem Molekularsieb, Affinitäts-Chromatographie, Chromatofokussierung, Elektrophorese wie z. B. isoelektrische Fokussierung oder dergleichen eine aufgereinigte Polypeptidpräparation gewinnen.
  • Wenn das Polypeptid in Zellen als ein Einschlusskörper exprimiert wird, werden die Zellen auf ähnliche Weise gewonnen und aufgeschlossen, gefolgt von einer Zentrifugation, um den Einschlusskörper des Polypeptids als eine Präzipitat-Fraktion zu erhalten, die dann mit einem Protein-Denaturierungsmittel solubilisiert wird. Die solubilisierte Lösung wird verdünnt oder dialysiert, um die Konzentration des Protein-Denaturierungsmittels zu verringern, wodurch die normale dreidimensionale Struktur des Polypeptids wiederhergestellt wird. Nachdem man diese Operationen durchgeführt hat, kann man eine aufgereinigte Polypeptidpräparation mit Hilfe der gleichen Isolierungs- und Aufreinigungsprozeduren erhalten, wie vorstehend erwähnt.
  • Wenn das in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebene Polypeptid oder ein Derivat davon wie z. B. ein Polypeptid, bei dem eine Zuckerkette an dem Polypeptid angehängt ist, extrazellulär sezerniert wird, kann das Polypeptid oder das Derivat davon aus dem erhaltenen Kulturüberstand gewonnen werden, indem man die Kultur mit einer ähnlichen Zentrifugationsmethode behandelt, wie es vorstehend beschrieben ist. Aus dem Kulturüberstand kann man eine aufgereinigte Präparation des Polypeptids mit denselben Isolierungs- und Aufreinigungsprozeduren erhalten, wie vorstehend beschrieben.
  • Beispiele für die auf diese Weise erhaltenen Polypeptide sind ein Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, was die Polypeptide betrifft, die Decaprenyldiphosphatsynthetase-Aktivität aufweisen, und ein Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, was Polypeptide betrifft, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Aktivität aufweisen.
  • Zusätzlich zu den vorstehend erhaltenen Polypeptiden umfassen die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptide auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, in der ein oder mehrere Aminosäurerest(e) in der Aminosäuresequenz der vorstehenden Polypeptide deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n), und die entweder Decaprenyldiphosphatsynthetase-Aktivität oder p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Aktivität aufweisen.
  • Die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptide können auch durch chemische Syntheseverfahren hergestellt werden, wie z. B. durch die Fmoc-Methode (die Fluorenylmethyloxycarbonyl-Methode) und die tBoc-Methode (die t-Butyloxycarbonyl-Methode). Des Weiteren können die Poly peptide chemisch synthetisiert werden, indem man Peptid-Synthesegeräte von Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation etc. einsetzt.
    • [5] Produktion von Ubichinon-10
  • Als für die Produktion von Ubichinon-10 zu verwendende Mikroorganismen sind Mikroorganismen bevorzugt, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden und die eine oder mehrere Eigenschaften aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus der Eigenschaft, dass die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, der Eigenschaft, dass die Decaprenyldiphosphatsynthetase-Aktivität verstärkt ist, und der Eigenschaft, dass die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Aktivität verstärkt ist.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden, und die die Eigenschaft aufweisen, dass die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, sind jene, die in [1] vorstehend erhalten worden sind.
  • Mikroorganismen, die die Eigenschaft aufweisen, dass die Decaprenyldiphosphatsynthetase-Aktivität verstärkt ist, oder jene, die die Eigenschaft aufweisen, dass die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Aktivität verstärkt ist, können nach dem in [1] vorstehend beschriebenen Verfahren zur Einführung von Mutationen aus Mikroorganismen erhalten werden, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden. Man kann sie auch gewinnen, indem man DNA, die Decaprenyldiphosphatsynthetase oder p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, die durch das in [2] und [3] vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wurde, nach dem in [4] vorstehend beschriebenen Verfahren in Mikroorganismen einführt, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden.
  • Des Weiteren können Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden und die eine oder mehrere Eigenschaften aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus der Eigenschaft, dass die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, der Eigenschaft, dass die Decaprenyldiphosphatsynthetase-Aktivität verstärkt ist, und der Eigenschaft, dass die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Aktivität verstärkt ist, durch eine Kombination der vorstehend beschriebenen Methoden erhalten werden.
  • Ubichinon-10 kann hergestellt werden, indem man einen Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Ubichinon-10 zu bilden und der eine oder mehrere Eigen schalten aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus der Eigenschaft, dass die crtE-Aktivität verringert oder fehlerhaft ist, der Eigenschaft, dass die Decaprenyldiphosphatsynthetase-Aktivität verstärkt ist, und der Eigenschaft, dass die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Aktivitt verstärkt ist, in einem Kulturmedium züchtet, es ermöglicht, dass sich Ubichinon-10 bildet und in der Kultur anreichert, und das Ubichinon-10 aus der Kultur gewinnt.
  • Züchten kann nach dem in [4] vorstehend beschriebenen Züchtungsverfahren durchgeführt werden. Gegebenenfalls können aromatische Verbindungen wie z. B. Shikimisäure, Chorisminsäure, p-Hydroxybenzoesäure etc., die Vorläufer der Ubichinon-10-Biosynthese sind, sowie Isoprenoide wie z. B. IPP, FPP etc. zu dem Medium hinzugefügt werden.
  • Ubichinon-10 kann aus der Kultur durch ein Gewinnungsverfahren gewonnen werden, das üblicherweise in der synthetischen organischen Chemie verwendet wird, wie z. B. Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Kristallisierung, Dünnschichtchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie etc.
  • Eine Bestätigung und eine quantitative Analyse des gewonnenen Ubichinon-10 kann mit Hilfe eines 13C-NMR-Spektrums, eines 3H-NMR-Spektrums, eines Massenspektrums, von Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), der Farbentwicklungsmethode etc. durchgeführt werden.
    • [6] Effiziente Expression des Gens
  • Der in dem ribosomalen RNA-Gen vorhandene Promotor, der in dem Verfahren zur Polypeptid-Herstellung in [4] vorstehend beschrieben ist, ist nicht nur in dem Verfahren zur Polypeptid-Herstellung des vorstehenden [4] nützlich, sondern in Verfahren zur Polypeptid-Herstellung im Allgemeinen.
  • Indem man eine DNA, die ein Polypeptid codiert, für das Expression vorgesehen ist, stromabwärts von einer DNA einführt, die die Nucleotidsequenz des in dem ribosomalen RNA-Gen vorhandenen Promotors umfasst, kann man die DNA, die das Polypeptid codiert, effizient exprimieren, und das Polypeptid kann somit hergestellt werden.
  • Nützliche ribosomale RNA-Gene sind solche, die von Mikroorganismen abgeleitet sind, die zu der Gattung Rhodobacter gehören.
  • Ein Beispiel für den in dem ribosomalen RNA-Gen vorhandenen Promotor ist DNA, die die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist.
  • Nachstehend sind Beispiele der vorliegenden Erfindung gezeigt. Diese Beispiele sind nicht so zu interpretieren, dass sie den Geltungsbereich der Erfindung beschränken. Sofern nichts Anderweitiges angegeben ist, wurden die in den folgenden Beispielen gezeigten rekombinanten DNA-Experimente nach dem in Molecular Cloning, zweite Auflage beschriebenen Verfahren durchgeführt (hierin nachfolgend als „ein herkömmliches Verfahren" bezeichnet.
  • Beste Art und Weise die Erfindung auszuführen
  • Beispiel 1 Konstruktion eines Mikroorganismus-Stamms, in dem crtE verringert oder fehlerhaft ist
  • (1) Herstellung von DNA, die DNA umfasst, die crtE codiert
  • Oligodesoxyribonucleotide mit der in SEQ ID NO: 7 oder 8 gezeigten Nucleotidsequenz wurden synthetisiert, indem man sich die früher veröffentlichte Nucleotidsequenz eines Carotinoid-Biosynthese-Genclusters zunutze machte, das crtE von R. sphaeroides enthält [J. Bacteriol. 177: 2064–2073 (1995)], wobei ein DNA-Synthesegerät verwendet wurde. Sie wurden als ein Satz von Primern in der PCR eingesetzt.
  • Chromosomale DNA von R. sphaeroides KY4113 (FERM BP-4675) wurde über Nacht gezüchtet, wobei 50 ml LB-Medium [1% Bacto Trypton (Difco), 0,5% Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5% NaCl] verwendet wurden, und die Zellen wurden gewonnen.
  • Nachdem sie einmal Einfrieren und Auftauen unterzogen worden waren, wurden die Zellen in 10 ml eines Puffers resuspendiert [50 mMol/l Tris-HCl, 20 mMol/l EDTA (pH 8,0)], der 0,5 mg/ml Lysozym enthielt, und wurden für 3 Stunden bei 37°C inkubiert.
  • Zu der Suspension wurden 1 ml Proteinase K (1 mg/ml) und 100 μl 10% SDS hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 3 Stunden bei 50°C inkubiert. Dann ließ man das Gemisch auf Raumtemperatur zurückkommen und unterzog es einer Extraktion mit Phenol-Chloroform, gefolgt von einer Präzipitation mit Ethanol, wodurch die chromosomale DNA aufgereinigt wurde.
  • Mit der chromosomalen DNA als Matrize führte man eine PCR-Amplifikation mit einem Satz von Primern durch, die die in SEQ ID NO: 7 oder 8 gezeigte Nucleotidsequenz aufwiesen, die vorstehend synthetisiert wurde.
  • Die PCR wurde in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus einer Reaktion für 20 Sekunden bei 98°C und einer Reaktion für 5 Minuten bei 68°C bestand, wobei TaKaRa-LA-Taq verwendet wurde.
  • Bei einem etwa 2,5 kb großen PCR-amplifizierten Ziel-DNA-Fragment wurden glatte Enden hergestellt und es wurde einer Phosphorylierung unterzogen und in die SmaI-Stelle eines Plasmidvektors, pUC19, eingesetzt, um ein rekombinantes Plasmid herzustellen.
  • Escherichia coli DH5-α (Toyobo) wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert und auf LB-Agarmedium ausgestrichen, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, um Transformanten zu erhalten. Ein Plasmid wurde aus der Transformante extrahiert und die Nucleotidsequenz der in die SmaI-Stelle des Plasmids eingesetzten DNA wurde bestimmt.
  • Auf der Grundlage der bestimmten Nucleotidsequenz wurde bestätigt, dass die DNA Teile von ORFs enthält, die stromaufwärts und stromabwärts von crtE vorhanden sind.
  • Das Plasmid wurde pUCRTE-1 genannt.
  • Eine Analyse der Restriktionsenzymstellen von pUCRTE-1 ergab, dass jeweils eine Ball- und StuI-Stelle nur im Innern von crtE vorhanden sind und dass der Abstand zwischen beiden Restriktionsenzymstellen etwa 450 bp beträgt. Somit hielten es die Erfinder der vorliegenden Erfindung für möglich, dass die GGPP-Synthetase-Aktivität von crtE verringert oder fehlerhaft gemacht werden konnte, indem sie diesen Bereich von etwa 450 bp deletierten, und führten das folgende Experiment durch.
  • pUCRTE-1 wurde einem Doppelverdau mit Ball und StuI unterzogen und dessen vollständiger Verdau wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Dann wurde ein etwa 4,6 kb großes DNA-Fragment aufgetrennt und mit QIAEX II (Qiagen) aufgereinigt. Bei dem aufgereinigten DNA-Fragment wurden glatte Enden hergestellt und es wurde einer Dephosphorylierung unterzogen.
  • Um die Selektion von hinsichtlich crtE fehlerhaften Stämmen zu erleichtern, wurde ein Plasmid, das ein in die erhaltene DNA eingesetztes Kanamycin-Resistenzgen trug, nach der folgenden Prozedur hergestellt.
  • Das von Tn5 abgeleitete Kanamycin-Resistenzgen und die von R. sphaeroides abgeleitete gInB-Promotorregion [Microbiology 140: 2143–2151 (1994)] wurden jedes mittels PCR isoliert und miteinander ligiert, gefolgt von einer Überführung der Enden in glatte Enden und Phosphorylierung; dieses Konstrukt wurde dann mit dem früher hergestellten 4,6 kb großen Fragment ligiert wurde, wodurch ein rekombinantes Plasmid erzeugt wurde.
  • Escherichia coli DH5-α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert und dann auf LB-Agar-Medium ausgestrichen, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, um Transformanten zu erhalten.
  • Ein Plasmid wurde aus den Transformanten extrahiert und es wurde bestätigt, dass es das Kanamycin-Resistenzgen trug, das in die Stelle eingesetzt war, an der crtE deletiert wurde.
  • Das Plasmid wurde pUΔCRTE-1 genannt.
  • (2) Herstellung eines Stamms, in dem die Aktivität der GGPP-Synthetase verringert oder fehlerhaft ist
  • Das in (1) vorstehend erhaltene pUΔCRTE-1 wurde nach der folgenden Methode in R. sphaeroides KY4113 eingeführt.
  • KY4113 wurde in flüssiges LB-Medium angeimpft und bis zur logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Nach dem Züchten wurden die Zellen mittels Zentrifugation gewonnen. Die Zellen wurden zweimal mit einer wässrigen Lösung gewaschen, die 10% Glycerin und 1 mMol/l HEPES enthielt, um die Bestandteile des Mediums so weit wie möglich zu entfernen.
  • Die gewaschenen Zellen und 10 μg pUΔCRTE-1 wurden in eine 0,1 cm breite Elektroporationsküvette (Bio-Rad) gegeben und es wurde eine Elektroporation unter den Bedingungen 400 Ω, 25 μF und 12,5 kV/cm durchgeführt, wobei ein Gene Pulser (Bio-Rad) verwendet wurde, um pUΔCRTE-1 in die Zellen einzuführen.
  • Die so erhaltenen Zellen wurden für 3 Stunden bei 30°C in Kultur gehalten, wobei SOC-Medium verwendet wurde (ein Medium, das durch Zusammengeben von 20 g Bacto Trypton (Difco), 5 g Bacto Hefeextrakt (Difco), 2 ml von 5 Mol/l NaCl und 1,25 ml von 2 Mol/l KCl, wozu Wasser hinzugefügt wird, um eine Lösung von 990 ml herzustellen, Autoklavieren der Lösung und Zugabe von 10 ml einer 2 Mol/l Glucose-Lösung zu der Lösung hergestellt wird). Die erhaltene Kultur wurde auf LB-Agar-Medium ausgestrichen, das 10 μg/ml Kanamycin enthielt, und für 3 Tage bei 30°C gezüchtet.
  • Als Ergebnis der Züchtung bildeten sich 18 Kolonien, von denen 11 einen roten Carotinoid-Farbstoff bildeten wie im Fall des Wildtyp-Stamms, und bei 7 fehlte die Fähigkeit zur Carotinoid-Produktion.
  • Nach dem Züchten von jeder der Kolonien wurde chromosomale DNA extrahiert und analysiert.
  • Es stellte sich heraus, dass die 7 Stämme, die die Fähigkeit zur Carotinoid-Produktion verloren hatten, das Kanamycin-Resistenzgen trugen, das innerhalb des crtE-Gens auf dem Chromosom eingesetzt worden war.
  • Wir waren der Ansicht, dass das durch Elektroporation eingeführte pUΔCRTE-1 ein Crossing-over an zwei Stellen stromaufwärts und stromabwärts von dem Kanamycin-Resistenzgen mit den homologen Regionen des Chromosoms durchlief und eingesetzt wurde, was eine Deletion des crtE-Gens und daher einen Verlust der von dem crtE-Gen codierten Enzymaktivität (GGPP-Synthetase-Aktivität) bewirkte, so dass die Stämme kein Carotinoid mehr produzieren konnten.
  • Das von dem pUΔCRTE-1 mitgeführte Ampicillin-Resistenzgen wurde nicht in die chromosomale DNA dieser Stämme eingeführt, und von dem Vektor abgeleitete DNA wurde nicht in deren chromosomale DNA eingebaut.
  • In den 11 Stämmen, die die Fähigkeit zur Produktion von Carotinoid behielten, wurde bestätigt, dass sowohl das Ampicillin-Resistenzgen als auch das Kanamycin-Resistenzgen auf dem Chromosom lagen, und somit ergab sich, dass sie das normale crtE enthielten, wobei die Sequenz von pUΔCRTE-1 durch ein einseitiges Crossing-over in die chromosomale DNA eingesetzt war.
  • Die hinsichtlich crtE fehlerhaften Stämme, die man so erhalten hatte, nannte man KY4113ΔcrtE-1 bis 7.
  • Es wurde bestätigt, dass die Stämme KY4113ΔcrtE-1 bis 7 hinsichtlich crtE fehlerhafte Stämme waren, da deren Fähigkeit zur Produktion von Carotinoid durch Einführen des normalen crtE-Gens in diese wiederhergestellt wurde. Das bedeutet, es wurde ein rekombinantes Plasmid, welches das normale crtE-Gen in einen Vektor mit breitem Wirtsbereich, pEG400, eingesetzt hatte [J. Bacteriology 172: 2392 (1990)] erzeugt und in diese Stämme eingeführt und es wurde bestätigt, dass diese Carotinoid-Farbstoff produzierten.
  • Beispiel 2 Produktion von Ubichinon-10 durch hinsichtlich crtE fehlerhafte Stämme
  • Mit einer Platinimpföse von jedem der in Beispiel 1 erhaltenen Stämme KY4113ΔcrtE-1 bis 7 wurden 5 ml eines Anzuchtmediums [2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,5% NaCl(pH 7,2, mit NaOH eingestellt)] in einem Teströhrchen angeimpft und für 24 Stunden bei 30°C gezüchtet.
  • Mit der so erhaltenen Kultur (0,5 ml) wurden 5 ml eines Ubichinon-10-Produktionsmediums [hergestellt, indem man ein Medium, das 4% Melasse, 2,7% Glucose, 4% Maisquellwasser, 0,8% Ammoniumsulfat, 0,05% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,025% Magnesiumsulfat-7-hydrat, 3 mg/l Eisensulfat-7-hydrat, 8 mg/l Thiamin, 8 mg/l Nicotinsäure und 1 ml/l Spurenelemente (eine Lösung, die 88 mg/l Na2B4O7·10 H2O, 37 mg/l (NH4)6Mo7O24·4 H2O, 8,8 mg/l ZnSO4·7 H2O, 270 mg/l CuSO4·5 H2O, 7,2 mg/l MnCl2·4 H2O und 970 mg/l FeCl3·6 H2O enthielt) enthielt auf pH 9 einstellte, dazu 1% Calciumcarbonat hinzufügte und das so erhaltene Gemisch autoklavierte] in einem Teströhrchen angeimpft und unter Schütteln für 5 Tage bei 30°C gezüchtet.
  • Nach dem Abschluss der Züchtung wurden 300 μl 2-Butanol und 300 μl Glaskügelchen zu 300 μl der Nährlösung hinzugefügt und es wurde eine Extraktion mit Lösungsmittel durchgeführt, während man die Zellen mit einem Multi Beads Shocker MB-200 (Yasui Kiki) 5 Minuten aufschloss.
  • Der flüssige Extrakt wurde durch Zentrifugation aufgetrennt, um eine Schicht von 2-Butanol zu gewinnen. Die produzierte Menge von Ubichinon-10 in der Schicht von 2-Butanol wurde berechnet, indem man eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter den folgenden Bedingungen durchführte:
  • Bedingungen für die HPLC
    • Gerät: IC-10A (Shimadzu Corporation)
    • Säule: Develosil ODS-HG-5 (Nomura Kagaku)
    • Mobile Phase: Methanol : n-Hexan = 8 : 2
    • Geschwindigkeit: 1 ml/min
    • Gemessene Wellenlänge: 275 nm
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Wachstum (OD660) Titer von Ubichinon-10 (mg/l) Gehalt (Titer/Wachstum)
    KY4113 23.6 90.8 3.9
    KY4113ΔcrtE-1 21.7 127.3 5.9
    KY4113ΔcrtE-2 21.4 120.6 5.6
    KY4113LcrtE-3 22.9 112.2 5.1
    KY4113ΔcrtE-4 21.8 120.1 5.5
    KY4113ΔcrtE-5 20.1 112.6 5.6
    KY4113ΔcrtE-6 20.9 128.2 6.1
    KY4113ΔcrtE-7 24.7 159.5 6.5
  • Die produzierte Menge von Ubichinon-10 war bei den Stämmen KY4113ΔcrtE-1 bis 7 im Vergleich zu dem als Kontrolle eingesetzten KY4113 deutlich höher. Das bedeutet, man hat zum ersten Mal festgestellt, dass die Fähigkeit zur Produktion von Ubichinon-10 verbessert werden konnte, indem man dafür sorgte, dass die crtE-Aktivität von R. sphaeroides fehlerhaft wurde.
  • Man stellte auch fest, dass die Genzerstörung durch Elektroporation mit einem DNA-Fragment, in das die Deletion eingeführt war, eine hervorragende Methode war.
  • Nach dieser Methode ist kein spezieller Vektor oder keine spezielle Wirtszelle, der oder die bei dem Konjugationsverfahren benötigt wird, erforderlich, und man kann beliebige Vektoren, die nicht in der Lage sind, in photosynthetischen Bakterien autonom zu replizieren, zum Beispiel pUC19, ebenso wie geradkettige DNA wie z. B. durch PCR amplifizierte Fragmente verwenden.
  • Wir sind der Ansicht, dass die Menge des angereicherten Ubichinon-10 zunahm, weil FPP, das früher über die crtE-Genprodukte zum Carotinoid oder zu der Seitenkette des Bakteriochlorophylls geflossen ist, nach dieser Methode nun in den Ubichinon-Biosyntheseweg fließt. Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Mutanten haben ähnliche Wachstumseigenschaften und Nährstoffauxotrophie wie diejenigen, die der parentale Sramm aufweist, da außer der crtE-Mutation keine Mutation neu eingeführt wird.
  • Beispiel 3 Clonierung des Decaprenyldiphosphatsynthetasegens (DPPS) aus einem photosynthetischen R. sphaeroides-Bakterium
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung waren der Ansicht, dass Ubichinon-10 effizient produziert werden könnte, indem man den Ubichinon-Biosyntheseweg verstärkt, und versuchten ein Gen zu erhalten, das an dem System der Ubichinon-10-Biosynthese beteiligt ist.
  • Als Gen bemerkten wir zuerst das Decaprenyldiphosphatsynthetasegen (DPPS).
  • Es ist sehr wahrscheinlich, dass DPPS effizient FPP, von dem man annimmt, dass es durch die Fehlerhaftigkeit von crtE im Überschuss vorliegt zum Biosyntheseweg von Ubichinon hinzieht; daher ist es möglich, dass ein Stamm, den man dadurch erhält, dass man das DPPS in einen hinsichtlich crtE fehlerhaften Stamm einführt, Ubichinon-10 effizienter produziert als ein Stamm, bei dem DPPS in einen Stamm eingeführt wird, der hinsichtlich crtE nicht fehlerhaft ist.
  • Um das von R. sphaeroides abgeleitete Decaprenyldiphosphatsynthetasegen zu erhalten, wurde die degenerierte PCR-Methode [Bio Experiments Illustrated (3), Shujunsha (199)] durchgeführt.
  • Man führte in der DNA-Datenbank von Genbank eine Suche nach dem bekannten Decaprenyldiphosphatsynthetasegen durch, das von anderen biologischen Spezies abgeleitet war. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass das Gen in B. subtilis, B. stearothermophilus, E. coli, G. suboxidans, Haemophilus influenzae, H. pylori, R. capsulatus, S. cerevisiae, S. pombe, Synechocystis sp. PCC6803 etc. vorhanden war. Deren Sequenzen wurden verglichen und hoch konservierte Aminosäuresequenzen wurden ausgewählt. Nucleotidsequenzen, die den ausgewählten Aminosäuresequenzen entsprachen, wurden konstruiert, wobei man die Häufigkeit der Codonbenutzung des verwendeten R. sphaeroides berücksichtigte, und man synthetisierte als Sense-Primer ein DNA-Fragment, das die in SEQ ID NO: 9 gezeigte Nucleotidsequenz aufwies, und als Antisense-Primer ein DNA-Fragment, das die in SEQ ID NO: 10 gezeigte Nucleotidsequenz aufwies, wobei man ein DNA-Synthesegerät benutzte.
  • Es wurde eine PCR mit den vorstehenden Primern und dem ExpandTM High-Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) mit chromosomaler DNA von R. sphaeroides KY4113 (FERM P-4675) als Matrize in einem DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer, Japan) durchgeführt.
  • Die PCR wurde in 35 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus einer Reaktion für 40 Sekunden bei 94°C, einer Reaktion für 40 Sekunden bei 60°C und einer Reaktion für 45 Sekunden bei 72°C bestand.
  • Durch die PCR erhielt man ein etwa 400 bp großes amplifiziertes DNA-Fragment.
  • Die Nucleotidsequenz des DNA-Fragments wurde bestimmt und es wurde bestätigt, dass das DNA-Fragment eine hohe Homologie zu der bekannten Polyprenyldiphosphatsynthetase aufwies. Das DNA-Fragment wurde aufgereinigt und einer DIG-Markierung unterzogen, wofür der DIG DNA Labeling Kit (Boehringer Mannheim) eingesetzt wurde.
  • Um die Volllängen-Version des Decaprenyldiphosphatsynthetasegens von R. sphaeroides KY4113 zu erhalten, wurde eine genomische DNA-Bank des Stamms KY4113 nach der folgenden Methode hergestellt.
  • KY4113 wurde über Nacht auf LB-Medium gezüchtet und chromosomale DNA wurde extrahiert. Der Extrakt wurde partiell mit Sau3Al verdaut und 4 bis 6 kb große DNA-Fragmente wurden mittels Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation aufgereinigt.
  • Die DNA-Fragmente und ein Vektor, pUC19, der mit BamHI verdaut war, wurden mit dem Ligation Pack (Nippon Gene) einer Ligierung unterzogen, um rekombinante Plasmide zu erzeugen.
  • E. coli DH5-α wurde mit dem erhaltenen rekombinanten Plasmid transformiert und auf eine LB-Platte ausgestrichen, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wodurch man etwa 10.000 rekombinante Stämme erhielt.
  • Die rekombinanten Stämme wurden einer Durchmusterung nach der Koloniehybridisierungsmethode unterworfen, indem man das vorstehend erhaltene DIG-markierte DNA-Fragment als Sonde verwendete, und man erhielt 5 Kolonien, die mit dem DIG-markierten DNA-Fragment hybridisierten.
  • Nach einem herkömmlichen Verfahren wurde ein Plasmid aus den Stämmen, die von den Kolonien abgeleitet worden waren, extrahiert und mit einem Restriktionsenzym verdaut, und man verglich die Größe der eingesetzten DNA-Fragmente.
  • Die vorstehenden 5 Stämme enthielten die eingesetzten DNA-Fragmente mit derselben Größe und es zeigte sich durch Sequenzierung, dass die DNA-Fragmente eine gemeinsame Sequenz enthielten.
  • In der Sequenz war ein ORF vorhanden, der 333 Aminosäuren codierte, die eine hohe Homologie zu dem Polyprenyldiphosphatsynthetasegen von anderen biologischen Spezies aufweisen.
  • Die Nucleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt und die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2.
  • Beispiel 4 Produktion von Ubichinon-10 durch rekombinanten R. sphaeroides
  • Man stellte ein rekombinantes Plasmid her, in dem ein etwa 4 kb großes DNA-Fragment, das das in Beispiel 3 clonierte DPPS-Gen enthielt, mit einem Vektor mit einem breiten Wirtsbereich, pEG400, verknüpft war. Das Plasmid wurde pEGDPPS-1 genannt.
  • pEGDPPS-1 bzw. pEG400 als Kontrolle wurden mittels Elektroporation in die in Beispiel 1 erhaltenen KY4113 und KY4113ΔcrtE-1 eingeführt. Man führte eine Elektroporation unter den Bedingungen 400 Ω, 25 μF und 12,5 kV/cm durch, wobei man einen Gene Pulser (Bio-Rad) verwendete.
  • Nach dem Durchführen der Elektroporation wurden die Zellen, die das eingeführte Plasmid trugen, für 3 Stunden bei 30°C in Kultur gehalten, wobei SOC-Medium verwendet wurde, und dann auf LB-Agar-Medium ausgestrichen, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, gefolgt von Züchten für 3 Tage bei 30°C.
  • Gewachsene Transformanten werden gezüchtet, Plasmid wurde aus den Zellen extrahiert und es wurde bestätigt, dass jeder Stamm das eingeführte Plasmid enthielt.
  • Die erhaltenen Transformanten nannte man KY4113/pEGDPPS-1, KY4113/pEG400, KY4113ΔcrtE-1/pEGDPPS-1 bzw. KY4113ΔcrtE-1/pEG400.
  • Mit einer Platinimpföse von jedem der Transformanten wurden 5 ml eines Anzuchtmediums, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, in einem Teströhrchen angeimpft und für 24 Stunden bei 30°C gezüchtet.
  • 0,5 ml der so erhaltenen Kultur wurden zu 5 ml eines Ubichinon-10-Produktionsmediums, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, in einem Teströhrchen hinzugefügt und für 5 Tage unter Schütteln bei 30°C gezüchtet.
  • Nach dem Abschluss der Züchtung wurde Ubichinon-10 nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode aus der Kultur extrahiert und die produzierte Menge an Ubichinon-10 wurde durch quantitative Analyse mittels HPLC berechnet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    Wachstum. (OD660) Titer von Ubichinon-10 (mg/l) Gehalt (Titer/ Wachstum)
    KY4113/pEG400 26.8 72.5 2.7
    KY4113/pEGDPPS-1 26.98 119.9 4.4
    KY4113ΔcrtE-1/pEG400 31.16 119.2 3.8
    KY4113ΔcrtE-1/pEGDPPS-1 29.56 151.1 5.1
    (170.9) (5.8)
  • Die Werte in Klammern schließen Ubichinon-10-Vorläufer ein.
  • Die produzierte Menge von Ubichinon-10 war für KY4113/pEGDPPS-1 deutlich höher im Vergleich zu KY4113/pEG400, das als Kontrolle eingesetzt worden war. Des Weiteren zeigte sich eine höhere Fähigkeit zur Produktion von Ubichinon-10, wenn man KY4113ΔcrtE-1 als Wirt verwendete.
  • Anhand dieser Ergebnisse stellte man fest, dass die Synthese von Decaprenyldiphosphat in der Biosynthese von Ubichinon-10 geschwindigkeitsbestimmend ist und dass der Pool von FPP, einem Substrat der Decaprenyldiphosphatsynthetase, durch die Deletion des crtE-Gens zunimmt.
  • Mittels HPLC-Analyse entdeckte man eine unbekannte Substanz in KY4113 ΔcrtE-1/pEGDPPS-1, die in anderen rekombinanten Stämmen nicht beobachtet wurde. Daher wurde die Substanz isoliert und für Absorptionsspektral- und Massenspektralanalysen aufgereinigt.
  • Als Ergebnis der Analysen stellte sich heraus, dass die unbekannte Substanz ein Intermediat für die Biosynthese von Ubichinon-10 darstellte. Da die DPPS-Aktivität verstärkt war, nahm man an, dass ein neuer geschwindigkeitsbestimmender Punkt in dem Biosyntheseweg stromabwärts von der Synthese von Decaprenyldiphosphat vorlag oder entstanden war. Diese Befunde sind zum ersten Mal von den Erfindern der vorliegenden Erfindung festgestellt worden.
  • Beispiel 5 Suche nach starken Promotoren
  • Aus den Ergebnissen von Beispiel 4 stellte sich heraus, dass die Synthese von Decaprenyldiphosphat geschwindigkeitsbestimmend in der Biosynthese von Ubichinon-10 war. Daher nahm man an, dass die Fähigkeit zur Produktion von Ubichinon-10 weiter verbessert werden würde, wenn man die Expression von DPPS durch Verwenden eines stärkeren Promotors forcieren könnte.
  • Im Hinblick auf Promotoren von Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, Ubichinon-10 zu bilden, gibt es einen Befund, der einen Promotor betrifft, der zu einer hohen Expression unter anaeroben photosynthetischen Züchtungsbedingungen führt, aber es gibt so gut wie keinen Befund, was die Expression unter aeroben heterotrophen Bedingungen betrifft.
  • Was den Promotor angeht, der unter anaeroben photosynthetischen Züchtungsbedingungen zu einer hohen Expression führt, gibt es einen Bericht über die anaerobe Züchtung von R. capsulatus, in den ein rekombinantes Plasmid eingeführt wurde, das durch Verwendung eines Promotors des von R. capsulatus abgeleiteten Glutaminsynthetasegens (gInB) konstruiert worden war (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 107789/96 ).
  • Auf der Grundlage des Berichts konstruierten wir das rekombinante Plasmid pEGginB-DPPS-1, in dem eine stromaufwärts gelegene Sequenz des gInB-Gens [Microbiology 140: 2143–2151 (1994)], die von R. sphaeroides abgeleitet ist, stromaufwärts von der DPPS codierenden DNA verknüpft war, und stellten einen Stamm her, in dem das rekombinante Plasmid in R. sphaeroides KY4113 eingeführt war. Die Fähigkeit zur Produktion von Ubichinon-10 konnte jedoch nicht verbessert werden.
  • Auf Grund der neu durchgeführten Suche nach stark exprimierenden Promotoren stellte man fest, dass ein rRNA-Promotor wirksam war.
  • Die Sequenz des rRNA-Gens von R. sphaeroides ist bereit veröffentlicht worden und es sind 3 Arten bekannt, nämlich rrnA, rrnB und rrnC [Nucleic Acids Res. 18: 7267–7277 (1990)]. Die Sequenz stromaufwärts von dem rRNA-Gen wurde mit der folgenden Methode einer PCR-Clonierung unterzogen.
  • Auf der Grundlage der bekannten Sequenzinformation wurde zum Beispiel für die Clonierung des stromaufwärts gelegenen rrnC-Gens ein DNA-Fragment als Sense-Primer konstruiert, das die in SEQ ID NO: 11 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, und ein DNA-Fragment, das die in SEQ ID NO: 12 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, als Antisense-Primer konstruiert. Bei der Konstruktion wurde eine Stelle für das Restriktionsenzym XbaI zu dem Sense-Primer hinzugefügt und eine Stelle für das Restriktionsenzym Kpn I wurde zu dem Antisense-Primer hinzugefügt und außerdem wurde eine Ribosomen-Bindungsstelle für den Antisense-Primer konstruiert.
  • Mit den vorstehenden Primern und dem ExpandTM High-Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) wurde eine PCR mit chromosomaler DNA von R. sphaeroides KY4113 (FERM P-4675) als Matrize in einem DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer, Japan) durchgeführt.
  • Die PCR wurde in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus einer Reaktion für 40 Sekunden bei 94°C, einer Reaktion für 40 Sekunden bei 60°C und einer Reaktion für 45 Sekunden bei 72°C bestand.
  • Durch die PCR erhielt man ein etwa 200 bp großes amplifiziertes DNA-Fragment. Die Nucleotidsequenz des DNA-Fragments wurde bestimmt und es wurde bestätigt, dass es sich bei dem DNA-Fragment um dasjenige handelte, auf das man abgezielt hatte.
  • Man stellte ein rekombinantes Plasmid her, in dem das DNA-Fragment, das stromaufwärts von einem Kanamycin-Resistenzgen verknüpft war, in einen Vektor mit breitem Wirtsbereich, pEG400, eingesetzt wurde.
  • Das rekombinante Plasmid wurde mittels Elektroporation in R. sphaeroides KY4113 eingeführt und die Zellen des so erhaltenen Stamms wurden auf LB-Agar-Medium ausgestrichen, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, und für 3 Tage bei 30°C gezüchtet, um Transformanten zu erhalten.
  • Die Transformanten wurden auf LB-Agar-Medium getestet, das Kanamycin enthielt.
  • Die Transformanten, in die ein Kontroll-PEG400 eingeführt wurde, wuchsen nicht auf dem Medium, das 10 μg/l Kanamycin enthielt, aber jene, in die das rekombinante Plasmid eingeführt wurde, das die stromaufwärts von rrnC gelegene DNA aufwies, waren sogar in Gegenwart von 100 μg/l Kanamycin lebensfähig. Es wurde demnach bestätigt, dass die vorstehend erhaltene stromaufwärts gelegene Sequenz von rRNA eine starke Promotoraktivität besitzt. Expression des DPPS-Gens mit dem Promotor wurde nach der folgenden Methode versucht.
  • Auf der Grundlage der Information über die Sequenz des in Beispiel 3 bestätigten, von R. sphaeroides abgeleiteten DPPS-Gens wurde die ORF-Region mittels PCR amplifiziert. DNA, in der die Restriktionsenzymstelle KpnI (5' ccggtacc 3') zu dem 5'-Ende einer DNA hinzugefügt wird, die die Nucleotidsequenz der Nucleotide 1–24 in SEQ ID NO: 1 aufweist, wurde als Sense-Primer und DNA, in der die zusätzliche Sequenz (5' cc 3')-Restriktionsenzymstelle von EcoRI (5' gaattc 3')-Initiations-[Terminationscodon (5' tca 3') zu dem 5'-Ende der komplementären Sequenz der Nucleotidsequenz der Nucleotide 979-990 in SEQ ID NO: 1 hinzugefügt wurde, wurde als Antisense-Primer verwendet. Man führte eine PCR nach der Methode von Beispiel 3 durch, wobei ein Satz dieser Primer verwendet wurde.
  • Nach Verdauen beider Enden des amplifizierten, durch PCR erhaltenen DNA-Fragments mit KpnI und EcoRI wurde das DNA-Fragment mit einer herkömmlichen Methode aufgereinigt.
  • Man erhielt ein rekombinantes Plasmid, indem man die vorstehenden zwei DNA-Fragmente an ein Produkt eines XbaI- und EcoRI-Doppelverdaus eines Vektors mit breiten Wirtsbereich, pEG400, ligierte, die Nucleotidsequenz der in das rekombinante Plasmid eingesetzten DNA wurde bestimmt,, und es wurde bestätigt, dass das rekombinante Plasmid das DPPS-Gen trug, das unmittelbar unterhalb der stromaufwärts gelegenen Sequenz des rrnC verknüpft war, auf das man abgezielt hatte. Das rekombinante Plasmid wurde pEGrrnC-DPPS-1 genannt.
  • Des Weiteren wurde auf ähnliche Weise das Plasmid pEGginB-DPPS-1 konstruiert, so dass die Expression des DPPS-Gens mit Hilfe der stromaufwärts gelegenen Sequenz von gInB ermöglicht wird, über die bereits berichtet wurde.
  • Beispiel 6 Produktion von Ubichinon-10 mit Hilfe von Transformanten, die ein Plasmid tragen, welches das Decaprenyldiphosphatsynthetasegen in hoher Menge exprimiert.
  • Das rekombinante Plasmid pEGrrnC-DPPS1 und ebenso pEG400, pEGDPPS-1 und pEGgInB-DPPS1 als Kontrollen wurden mittels Elektroporation in KY4113 eingeführt.
  • Die Zellen, in die das Plasmid eingeführt wurde, wurden für 3 Stunden bei 30°C in Kultur gehalten, wobei SOC-Medium eingesetzt wurde. Die erhaltene Kultur wurde auf LB-Agar-Medium ausgestrichen, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, und für 3 Tage bei 30°C gezüchtet.
  • Aus den durch Züchten der Transformanten erhaltenen Zellen wurde Plasmid extrahiert. Es wurde bestätigt, dass die Transformanten das darin eingeführte Plasmid enthielten.
  • Die nach der vorstehenden Methode erhaltenen Transformanten nannte man KY4113/pEGrrnC-DPPS1, KY4113/pEG400, KY4113/pEGDPPS-1 bzw. KY4113/pEGgInB-DPPS1.
  • Mit einer Platinimpföse von jeder der Transformanten wurden 5 ml eines Anzuchtmediums, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, in einem Teströhrchen angeimpft und für 24 Stunden bei 30°C gezüchtet.
  • Die so erhaltenen Kulturen, jeweils 0,5 ml, wurden zu 5 ml eines Ubichinon-10-Produktionsmediums, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, in einem Teströhrchen hinzugefügt und für 5 Tage unter Schütteln bei 30°C gezüchtet.
  • Nach dem Abschluss der Züchtung wurde Ubichinon-10 nach der im vorstehenden Beispiel 2 beschriebenen Methode aus einer Kultur gewonnen und die produzierte Menge an Ubichinon-10 wurde durch quantitative Analyse mittels HPLC berechnet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
    Wachstum (OD660) Titer von Ubichinon-10 (mg/l) Gehalt (Titer/ Wachstum)
    KY4F13/pEG400 27.5 83.7 3.0
    KY4113/pEGDPFS-1 29.9 132.9 4.4
    KY4113/pEGgInB-DPPS-1 29.5 117.1 4.0
    KY4113/pEGrrnC-DPPS-1 28.6 188.8 6.6
  • Aus der Tatsache, dass die produzierte Menge von Ubichinon-10 in KY4113/pEGrrnC-DPPS-1 am höchsten war, stellte man fest, dass die Fähigkeit zur Produktion von Ubichinon-10 sehr effizient durch Verstärken der Expression von Decaprenyldiphosphatsynthetase verbessert werden konnte. Es stellte sich auch heraus, dass der von rRNA abgeleitete Promotor viel stärker war als der bislang bekannte und für die Produktion von Ubichinon-10 nützliche gInB-Promotor.
  • Beispiel 7 Clonierung des von R. sphaeroides abgeleiteten p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Gens
  • Chromosomale DNA von R. sphaeroides FERM BP-4675 wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode erhalten (1) und 200 μg der erhaltenen chromosomalen DNA wurden partiell mit Sau3Al verdaut.
  • Die so erhaltenen partiell verdauten DNA-Fragmente wurden durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert und 2–8 kb große DNA-Fragmente wurden mit einem Plasmidvektor, pUC19, ligiert, der mit BamHI verdaut worden war. E. coli DH5-α wurde mit Hilfe einer herkömmlichen Methode mit dem Ligierungsprodukt transformiert und die so erhaltenen Zellen wurden auf LB-Agar-Medium ausgestrichen, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, und über Nacht bei 37°C gezüchtet, um eine genomische DNA-Bank zu erzeugen, die aus etwa 50.000 Transformanten bestand.
  • Man extrahierte ein Plasmid, das von den Transformanten mitgeführt wurde, welche die genomische DNA-Bank darstellten, nach einer herkömmlichen Methode und transformierte mit dem Plasmid hinsichtlich ubiA fehlerhafte Stämme, d. h. Stämme, in denen p-Hydroxybenzoesäuretransferase fehlerhaft ist.
  • Die erhaltenen Transformanten wurden auf M9-Minimalmedium ausgestrichen (einem Medium, das hergestellt wurde, indem man eine Lösung, die 6 g/l Na2HPO4, 3 g/l KH2PO4, 5 g/l NaCl, 1 g/l Na4Cl und 1,8% Bacto Agar enthielt, autoklavierte und dann dazu 1 mMol/l MgSO4, 4 mg Vitamin B1, 0,4% Sukzinsäure und 50 mg Methionin hinzufügte, die getrennt autoklaviert wurden), das Sukzinsäure als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, und gezüchtet.
  • Man extrahierte ein Plasmid aus einem Transformanten-Stamm, der auf M9-Minimalmedium gewachsen war, das Sukzinsäure als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, nach einer herkömmlichen Methode und führte das Plasmid nochmals in den hinsichtlich ubiA fehlerhaften Stamm ein, um zu bestätigen, dass der hinsichtlich ubiA fehlerhafte Stamm durch das Plasmid die Fähigkeit erhielt, zu wachsen, wenn Sukzinsäure die einzige Kohlenstoffquelle ist.
  • Man bestimmte die Nucleotidsequenz des in das Plasmid eingesetzten DNA-Fragments mit Hilfe eines 373A-Sequenziergeräts (Perkin Elmer, Japan).
  • Die bestimmte Nucleotidsequenz wurde mit Genetyx Mac (Software Development) analysiert, um zu bestätigen, dass der ORF, der ein Polypeptid codiert, das in hohem Maße homolog zu der bekannten Aminosäuresequenz von p-Hydroxybenzoesaure-Polyprenyltransferase ist, vorhanden war.
  • Beispiel 8 Produktion von Ubichinon-10 durch Transformanten, die ein Plasmid enthalten, das das p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase-Gen in hoher Menge exprimiert
  • Auf der Grundlage der in Beispiel 7 gefundenen Sequenzinformation konstruierte man Primer für PCR. Bei dem verwendeten Sense-Primer und Antisense-Primer handelte es sich um den Primer, in dem für den ersteren die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym KpnI an das 5'-Ende hinzugefügt wurde, und den Primer, in dem für den letzteren die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI an ein 5'-Ende hinzugefügt wurde.
  • Mittels PCR amplifizierte man DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codierte, wobei man chromosomale DNA von R. sphaeroides KY4113 (FERM BP-4675) als Matrize verwendete.
  • Beide Enden des so erhaltenen amplifizierten DNA-Fragments wurden mit KpnI und EcoRI verdaut und das DNA-Fragment wurde mit Hilfe einer herkömmlichen Methode aufgereinigt.
  • Zwei DNA-Fragmente, d. h. das vorstehend erhaltene DNA-Fragment und die in Beispiel 5 erhaltene, von rrnC abgeleitete Promotor-DNA, die die XbaI- und KpnI-Erkennungssequenzen an den jeweiligen Enden enthielten, wurden mit dem Produkt eines XbaI- und EcoRI-Doppelverdaus eines Vektors mit einem breiten Wirtsbereich, pEG400, ligiert, um rekombinantes Plasmid zu erhalten.
  • E. coli DH5-α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert und dann wurde Plasmid, das von den so erhaltenen Transformanten mitgeführt wurde, mit Hilfe einer herkömmlichen Methode extrahiert. Die Nucleotidsequenz des in das Plasmid eingesetzten DNA-Fragments wurde bestimmt.
  • Indem man die Nucleotidsequenz des eingesetzten DNA-Fragments analysierte, bestätigte man, dass das rekombinante Plasmid die DNA trug, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codierte, die unmittelbar stromabwärts von dem von rrnC abgeleiteten Promotor verknüpft war. Dieses Plasmid nannte man pEGrrnC-ubiA1.
  • Man konstruierte auf ähnliche Weise ein Plasmid, in dem p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codierende DNA stromabwärts von einem gInB-Promotor verknüpft ist, der von KY4113 abgeleitet ist, und nannte das Plasmid pEGgInB-ubiA1.
  • Die Plasmide pEGrrnC-ubiA1 und pEGgInB-ubiA1 sowie pEG400 als Kontrolle wurden mittels Elektroporation in KY4113 eingeführt.
  • Die Zellen, in die das Plasmid eingeführt wurde, wurden für 3 Stunden bei 30°C in Kultur gehalten, wobei SOC-Medium verwendet wurde. Die so erhaltene Kultur wurde auf LB-Agar-Medium ausgestrichen, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, und für 3 Tage bei 30°C gezüchtet.
  • Man züchtete die gewachsenen Transformanten und extrahierte Plasmid aus den so erhaltenen Zellen. Es wurde bestätigt, dass die Transformanten das darin eingeführte Plasmid enthielten.
  • Die auf diese Weise erhaltenen Transformanten nannte man KY4113/pEGrrnC-ubiA1, KY4113/pEGgInB-ubiA1 bzw. KY4113/pEG400.
  • Mit einer Platinimpföse der Zellen von jedem der erhaltenen Stämme wurden 5 ml eines Anzuchtmediums, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, in einem Teströhrchen angeimpft und für 24 Stunden bei 30°C gezüchtet.
  • Die so erhaltenen Kulturen wurden in einer Menge von 0,5 ml zu 5 ml eines Ubichinon-10-Produktionsmediums, das 100 μg/ml Spectinomycin enthielt, in einem Teströhrchen hinzugefügt und für 5 Tage unter Schütteln bei 30°C gezüchtet.
  • Nach dem Abschluss der Züchtung wurde Ubichinon-10 nach der im vorstehenden Beispiel 2 beschriebenen Methode aus einer Kultur gewonnen und die produzierte Menge an Ubichinon-10 wurde durch quantitative Analyse mittels HPLC berechnet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
    Wachstum (OD660) Titer von Ubichinon-10) (mg/l) Gehalt (Titer/ Wachstum)
    KY4113/pEG400 23.42 58.3 2.5
    24.22 63.6 2.6
    KY4113/ 23.14 85.4 3.7,
    pEGrrnC-ubiA1 22.8 . 81.8 3.6
    KY4113/ 24.2 78.6 3.2
    gEGgInB-ubiA1 22.26 74.7 3.4
  • Die produzierte Menge von Ubichinon-10 war für KY4113/pEGgInB-ubiA1 und KY4113/pEGrrnC-ubiA1 deutlich höher im Vergleich zur Kontrolle KY4113/pEG400.
  • Unter den verglichenen Transformanten zeigte KY4113/pEGrrnC-ubiA1 die höchste Fähigkeit zur Produktion von Ubichinon-10.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10, das für die Verbesserung der Zustände von Herzkrankheit und als eine Substanz mit antioxidativer Funktion nützlich ist, DNA und ein Polypeptid, die für den Produktionsprozess nützlich sind, Mikroorganismen, die für die Produktion nützlich sind, ein Verfahren zur Expression eines Gens in den Mikroorganismen und ein Verfahren zum Züchten der Mikroorganismen bereitgestellt werden.
  • [Sequenzprotokoll als Freitext]
    • SEQ ID NO: 7 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 8 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 9 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 10 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 11 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: synthetische DNA
    • SEQ ID NO: 12 – Beschreibung der künstlichen Sequenz: synthetische DNA
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00590001
    Figure 00600001
    Figure 00610001
    Figure 00620001
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    Figure 00650001
    Figure 00660001

Claims (15)

  1. Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10, welches umfasst: (a) Züchten in einem Medium eines Stammes, der erhältlich ist von einem Mikroorganismus mit der Fähigkeit, Ubichinon-10 zu bilden, und welcher umfasst: (i) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, wobei ein oder mehrere Nucleotidrest(e) deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n) in einer Nucleotidsequenz von einer DNA, die Geranylgeranyltransferase codiert, so dass die Geranylgeranyltransferaseaktivität des genannten Stammes fehlerhaft ist, und (ii) zusätzlich eine DNA eines Decaprenyldiphosphatsynthasegens, das in den hinsichtlich der Geranylgeranyltransferase fehlerhaften Stamm eingeführt wurde; (b) Ermöglichen, dass sich Ubichinon-10 bildet und in einer Kultur anreichert; und (c) Gewinnen von Ubichinon-10 aus der Kultur.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA, die Geranylgeranyltransferase codiert, eine DNA ist, die die Geranylgeranyltransferase von Rhodobacter sphaeroides codiert.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA, die die Geranylgeranyltransferase codiert, eine DNA ist, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Stamm erhältlich ist durch das Verfahren, welches das Einführen einer DNA, die die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, in einen Mikroorganismus umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die DNA, die die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, eine DNA ist, die die Decaprenyldiphosphatsynthetase von Rhodobacter sphaeroides codiert.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die DNA, die die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, eine DNA ist, die ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das die Aminosäuressequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst; (b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, in der ein oder mehrere Aminosäurerest(e) deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n) in der Aminosäuresequenz des Polypeptids von (a), und welches Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist; und (c) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 60% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist und welches Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die DNA, die die Decaprenyldiphosphatsynthetase codiert, eine DNA ist ausgewählt aus: (a) einer DNA umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1; oder (b) einer DNA, die an die DNA von (a) bei 65°C in Anwesenheit von 0,7–1,0 mol/l NaCl hybridisiert und nach dem Waschen bei 65°C unter Verwendung von 0,1 bis 2fach konzentrierter SSC-Lösung hybridisiert und welche ein Polypeptid codiert, das Decaprenyldiphosphatsynthetaseaktivität aufweist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Stamm erhältlich ist durch das Verfahren, welches das Einführen einer DNA, die p-Hydroxybenzoesäure–Decaprenyltransferase codiert, in einen Mikroorganismus umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die DNA, welche die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, eine DNA ist, die die p-Hydroxybenzoesäure von Rhodobacter sphaeroides codiert.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die DNA, die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, eine DNA ist, die ein Polypeptid codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 umfasst; (b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, in der ein oder mehrere Aminosäurerest(e) deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurde(n) in der Aminosäuresequenz des Polypeptids von (a), und welches p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist; und (c) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 60% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist und welches p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die DNA, die die p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferase codiert, ausgewählt ist aus: (a) einer DNA umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3; oder (b) einer DNA, die an die DNA von (a) bei 65°C in Anwesenheit von 0,7–1,0 mol/l NaCl hybridisiert und nach dem Waschen bei 65°C unter Verwendung von 0,1 bis 2fach konzentrierter SSC-Lösung hybridisiert und welche ein Polypeptid codiert, das p-Hydroxybenzoesäure-Decaprenyltransferaseaktivität aufweist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 und 8, wobei der Mikroorganismus mit der Fähigkeit Ubichinon-10 zu bilden ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen, die zur Gattung Agrobacterium gehören, Mikroorganismen, die zur Gattung Paracoccus gehören, und Mikroorganismen, die zu den Photosynthesebakterien gehören.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Mikroorganismen, die zu den Photosynthesebakterien gehören, Mikroorganismen sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen, die zu der Gattung Rhodobacter, der Gattung Rhodomicrobium, der Gattung Rhodopila der Gattung Rhodospirillum oder der Gattung Rhodopseudomonus gehören.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Mikroorganismen, die zu der Gattung Rhodobacter gehören, Mikroorganismen der Art Rhodobacter sphaeroides oder Rhodobacter capsulatus sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 4 oder 8, wobei das Einführen der DNA in einen Wirtsorganismus durch Elektroporation ausgeführt wird.
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