LU88123A1 - Verbessertes verfahren zur herstellung von glycosyltransferasen - Google Patents

Description

V

Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Glycosyltransferasen

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA-Technik und stellt ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Glycosyltransferasen raittels transformierter Hefestämme bereit.

Glycosyltransferasen übertragen Zuckerreste von einem aktivierten Donorsubstrat, üblicherweise einem Nukleotidzucker, auf einen spezifischen Akzeptorzucker unter Ausbildung einer glycosidischen Bindung. Je nach der Art des übertragenen Zuckers werden diese Enzyme in Familien unterteilt, wie z.B. Galactosyltransferasen, Sialyltransferasen und Fucosyltransferasen. Als membrangebundene Proteine, die hauptsächlich im Golgi-Apparat vorkommen, verfügen die Glycosyltransferasen über eine gemeinsame Domänenstruktur, die aus einem kurzen aminoterminalen cytoplasmatischen Schwanz, einer Signal-Ankerdomäne und einer erwêiterten Stammregion besteht, an die sich eine große carboxyl-terminale katalytische Domäne anschließt. Die Signal-Ankerdomäne hat sowohl die Funktion eines nichtspaltbaren Signalpeptids als auch die eines sich über die Membran erstreckenden Ankers und richtet die katalytische Domäne der Glycosyltransferase innerhalb des Lumens des Golgi-Apparats aus. Von der luminalen Stammregion, auch Spacer-Region genannt, wird angenommen, daß sie die Funktion einer flexiblen Kette hat, die der katalytischen Domäne die Glycosylierung von Kohlehydratgruppen membrangebundener und löslicher Proteine des "Secretory Pathway" ermöglicht, die den Golgi-Apparat passieren. Ausserdem wurde entdeckt, daß der Stammabschnitt die Funktion eines Retentionssignals ausübt, um die Enzyme an die Golgi-Membran gebunden zu halten (PCT Anmeldung Nr. 91/06635). Lösliche Formen der Glycosyltransferasen fmden sich in der Milch, im Serum und in anderen Körperflüssigkeiten. Es wird angenommen, daß diese löslichen Glycosyltransferasen durch proteolytische Freisetzung der entsprechenden membrangebundenen Formen der Enzyme durch endogene Proteasen entstehen, vermutlich durch Spaltung zwischen der katalytischen Domäne und der durch die Membran ragenden Domäne.

Die enzymatische Synthese von Kohlehydratstrukturen hat den Vorteil, daß Stereoselektivität imd Regioselektivität hoch sind, wodurch die Glycosyltransferasen zu einem wertvollen Werkzeug für die Modifizierung Oder Synthese von Glycoproteinen, Glycolipiden und Oligosacchariden werden. Im Gegensatz zu chemischen Methoden ist die zeitaufwendige Einfiihrung von Schutzgruppen iiberfliissig.

Da Glycosyltransferasen in der Natur in sehr geringen Mengen vorkommen, sind ihre Isolierung aus Naturstoffen und ihre anschließende Reinigung schwierig. Es wurde daher an ihrer Produktion mittels der rekombinanten DNA-Methode gearbeitet. Zum Beispiel wurden Galactosyltransferasen in Zeilen von E. coli (PCT 90/07000) und Ovarien des chinesischen Hamsters (CHO) exprimiert (Smith, D.F. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 6225-34), Sialyltransferasen wurden in CHO-Zellen (Lee, E.U. (1990) Diss. Abstr. Int.B.50,3453-4) und COS-l-Zellen (Paulsen, J.C. et al. (1988) J. Cell. Biol. 107,10A) exprimiert, und Fucosyltransferasen wurden in COS-l-Zellen (Goelz, S.E. et al. (1990) Cell 63,1349-1356; Larsen R.D. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,6674-6678) und CHO-Zellen (Potvin, B. (1990) J. Biol. Chem. 265,1615-1622) produziert. Beriicksichtigt man, daß heterologe Expression in Prokaryonten den Nachteil hat, daß nicht glycosylierte Produkte erhalten werden, Glycosyltransferasen jedoch Glycoprotéine sind, und daß die Produktion von Glycosyltransferasen mittels Säugetierwirten sehr teuer, und auf Grund der Gegenwart vieler endogener Glycosyltransferasen, die das erwiinschte Produkt verunreinigen wiirden, kompliziert ist, so besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren, die die wirtschaftliche Produktion von Glycosyltransferasen in großem Maßstab ermöglichen.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, solche Verfahren bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Produktion von biologisch aktiven Glycosyltransferasen mittels der rekombinanten DNA-Technik bereit, in dem ein Hefe-Vektor-Expressionssystem verwendet wird.

Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Produktion einer membrangebundenen Glycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransférase, einer Sialyltransferase und einer Fucosyltransferase, beziehungsweise einer deren Varianten, bereit, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette bestehend aus einem Promoter und einer für die genannte

Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierenden DNA-Sequenz enthält, wobei diese DNA vom genannten Promoter kontrolliert wird, transformiert wurde, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird.

In einer ersten Ausfiihrangsform stellt die Erfindung ein Verfahren fiir die Produktion einer membrangebundenen Glycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransférase, einer Sialyltransferase und einer Fucosyltransferase, beziehungsweise einer deren Varianten, bereit, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Promoter, eine fiir die genannte Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierenden DNA-Sequenz, wobei diese DNA von besagtem Promoter kontrolliert wird, und eine DNA-Sequenz mit Hefe-Transkriptionsterminationssignalen, enthält, transformiert wurde, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird.

In einer zweiten Ausfiihrungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren fiir die Herstellung einer membrangebundenen Glycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransférase, einer Sialyltransferase und einer Fucosyltransferase beziehungsweise einer deren Varianten, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Hefepromoter, der funktionell mit einer ersten, ein Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, die im richtigen Leseraster mit einer zweiten, fiir die genannte Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, und eine DNA-Sequenz mit Hefe-Transkriptions-terminationssignalen, transformiert wurde, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird.

Der Begriff "Glycosyltransferase", wann immer dieser im vorstehenden oder folgenden Text verwendet wird, ist so zu verstehen, daß er die Familie der Galactosyltransferasen, die Familie der Sialyltransferasen und die Familie der Fucosyltransferasen umfaßt. Die genannten Glycosyltransferasen sind natiirlich vorkommende Enzyme, die in Säugetieren, Z.B. Rindem, Mäusen, Ratten und Menschen, vorkommen. Bevorzugte Glycosyltransferasen sind natiirlich vorkommende menschliche Glycosyltransferasen in ihrer vollen Länge, inklusive jener Enzyme, die im folgenden Text mit ihren EC-Nummem bezeichnet sind.

Die membrangebundenen Galactosyltransferasen und ihre Varianten, die nach dem erfinderischen Verfahren erhältlich sind, katalysieren die Übertragung eines Galactoserests von einem aktivierten Donor, iiblicherweise einem nucleotidaktivierten Donor, wie z.B. Uridindiphosphatgalactose (UDP-Gal), auf eine Kohlehydratgruppe.

Beispiele membrangebundener Galactosyltransferasen sind UDP-Galactose: ß-Galactosid-a(l-3)-galactosyltransferase (EC 2.4.1.151), fiir die Galactose als Akzeptorsubstrat unter Ausbildung einer a(l-3)-Bindung dient, und UDP-Galactose: ß-N-Acetylglucosamin-ß(l-4)-galactosyltransferase (EC 2.4.1.22), die Galactose auf N-Acetylglucosarain (GlcNAc) unter Ausbildung einer ß(l-4)-Bindung überträgt, ihre jeweiligen Varianten miteingeschlossen. In der Gegenwart von a-Lactalbumin dient der ß-(l-4)-Galactosyltransferase auch Glucose als Akzeptorsubstrat, wodurch die Lactosesynthese katalysiert wird.

Die am meisten bevorzugte membrangebundene Galactosyltransférase ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, die unter der SEQ ID-Nr. 1 im Sequenzprotokoll angegeben ist.

Die membrangebundenen Sialyltransferasen und ihre Varianten, die nach dem erfmdungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, katalysieren die Übertragung von Sialinsäuren (zum Beispiel N-Acetylneuraminsäure (NeuAc)) von einem aktivierten Donor, iiblicherweise einer Cytidinmonophosphatsialinsäure (CMP-SA), auf einen Kohlehydratakzeptorrest. Ein Beispiel einer membrangebundenen Sialyltransferase, die nach dem erfinderischen Verfahren erhältlich ist, ist CMP-NeuAc: ß-Galactosid-a(2-6)-sialyltransferase (EC 2.4.99.1), die die NeuAc-a(2-6)Gal-ß(l-4)GlcNAc-Sequenz bildet, die in vielen N-gebundenen Kohlehydratgruppen zu finden ist.

Die am meisten bevorzugte membrangebundene Sialyltransferase ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, die im Sequenzprotokoll unter der SEQ ID-Nr. 3 angefiihrt ist.

Die membrangebundenen Fucosyltransferasen und ihre Varianten, die nach dem erfinderischen Verfahren erhältlich sind, katalysieren die Übertragung eines Fucoserests von einem aktivierten Donor, iiblicherweise einem nucleotidaktivierten Donor wie z.B. Guanosindiphosphatfucose (GDP-Fuc), auf eine Kohlehydratgruppe. Beispiele solcher Fucosyltransferasen sind GDP-Fucose: ß-Galactosid-a(l-2)-fucosyltransferase (EC 2.4.1.69) und GDP-Fucose:N-Acetylamin-a(l-3/4)-fucosyltransferase (EC 2.4.1.65).

Die am meisten bevorzugte membrangebundene Fucosyltransferase ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, die im Sequenzprotokoll unter der SEQ ID-Nr. 5 angeführt ist.

Unter dem Begriff Varianten sind in der vorliegenden Anmeldung sowohl membrangebundene als auch lösliche Varianten der natürlich vorkommenden membrangebundenen Glycosyltransferasen zu verstehen, mit der Massgabe, dass diese Varianten enzymatisch aktiv sind. Bevorzugt sind beim Menschen vorkommende Varianten.

Zum Beispiel ist der Begriff "Varianten" so zu verstehen, daß er natürlich vorkommende membrangebundene Varianten von membrangebundenen Glycosyltransferasen beinhaltet, die sich innerhalb einer bestimmten Art finden, wie z.B. eine Variante einer Galactosyltransférase, die sich vom Enzym mit der unter SEQ ID-Nr. 1 angegebenen Aminosäuresequenz insofern unterscheidet, als ihr das Serin in der Position 11 fehlt und in den Positionen 31 und 32 Valin und Tyrosin an Stelle von Alanin beziehungsweise Leucin vorkommen. Solch eine Variante kann von einem verwandeten Gen derselben Genfamilie oder von einer allelen Variante eines bestimmten Gens kodiert werden. Der Begriff "Varianten" schließt auch Glycosyltransferasen mit ein, die von einer in vitro-mutierten DNA produziert werden, solange das von der genannten DNA kodierte Protein die enzymatische Aktivität der nativen Glycosyltransferase aufweist. Solche Modifikationen können in einer Addition, einem Austausch und/oder einer Deletion von Aminosäuren bestehen, wobei im letzteren Fall verkürzte Varianten entstehen.

Bevorzugte Varianten, die nach der erfindungsgemäßen Methode hergestellt werden, sind verkürzte Varianten, insbesondere lösliche Varianten, d.h. Varianten, die nicht membrangebunden sind. Verkürzte Varianten sind zum Beispiel lösliche Formen von membrangebundenen Glycosyltransferasen und ihren membrangebundenen Varianten, Z.B. jene oben genannten Varianten, welche von einem transformierten, im erfmdungs-gemäßen Verfahren verwendeten Hefestamm sezerniert werden können. Gemäß der vorliegenden Erfïndung sind diese löslichen Enzyme die bevorzugten verkürzten Varianten.

Die Erfïndung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer löslichen Variante einer membrangebundenen Glycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer

Galactosyltransférase, einer Sialyltransferase und einer Fucosyltransferase, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Promoter, eine mit diesem Promoter funktionell verbundene DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, und die im richtigen Leseraster mit einer zweiten, für die genannte Variante kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthâlt, transformiert wurde, und daß besagte Variante isoliert wird.

Die lösliche Form einer Glycosyltransferase ist per definitionem eine verkürzte Variante, die sich von der ent sprechenden Form mit der vollen Länge, d.h. der membrangebundenen Form, die sich natürlicherweise im endoplasmatischen Reticulum oder im Golgi-Komplex befindet, durch das Fehlen des cytoplasmatischen Schwanzes, des Signalankers und, gegebenenfalls, eines Teils der Stammregion unterscheidet. Der Begriff "Teil der Stammregion" ist ira Zusammenhang mit dem vorliegenden Text so definiert, daß er einen kleineren Teil der N-terminalen Seite der Stammregion bezeichnet und aus bis zu 12 Aminosäuren besteht. Das heißt in anderen Worten, daß die löslichen Varianten, die gemäß der vorliegenden Erfmdung hergestellt werden, aus der im wesentlichen ganzen Stammregion und der katalytischen Domäne bestehen.

Die löslichen Varianten sind enzymatisch aktive Enzyme, die sich von den jeweiligen Formen mit der vollen Lange dadurch unterscheiden, daß ein NH2-terminales Peptid bestehend aus 26 bis 61 Aminosäuren fehlt, mit der Maßgabe, daß bei denjenigen Formen, bei denen ein Teil der Stammregion fehlt, lediglich der oben definierte kleinere Teil dieser Region fehlt. Bevorzugte lösliche Varianten sind diejenigen, die aus den membrangebundenen Glycosyltransferasen erhältlich sind, für die EC-Nummem angegeben sind, und zusätzlich lösliche Varianten, die aus der membrangebundenen Fucosyltransferase mit der SEQ. ID-Nr. 5 erhältlich sind.

Bevorzugte lösliche Varianten der Galactosyltransferasen unterscheiden sich von den jeweiligen Formen mit der vollen Lange dadurch, daß ihnen ein NH2-terminales Peptid fehlt, welches aus 37 bis 55, insbesondere 41 bis 44 Aminosäuren besteht. Die am meisten bevorzugte lösliche Variante, die gemäß dem erfïnderischen Verfahren hergestellt wird, ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, das unter der SEQ ID-Nr. 2 im Sequenzprotokoll angeführt ist.

Bevorzugten löslichen Varianten von Sialyltransferasen fehlt verglichen mit den Formen der vollen Lange ein NH2-terminales Peptid, das aus 26 bis 38 Aminosäuren besteht. Die am meisten bevorzugte lösliche Variante, die gemäß dem erfinderischen Verfahren hergestellt wird, ist das Enzym mit der Aminosäuresequenz, das im Sequenzprotokoll tinter der SEQ ID-Nr. 4 angeführt ist. Ebenfalls bevorzugt ist die mit ST(Lys27-Cys406) bezeichnete lösliche Variante, die aus den Aminosäuren 27 bis 406 der in SEQ ID-Nr. 3 angegebenen Aminosäuresequenz besteht.

Bevorzugte lösliche Varianten der Fucosyltransferasen unterscheiden sich von den jeweiligen Enzymen mit der vollen Länge dadurch, daß ihnen ein NH2-terminales Peptid fehlt, das aus 56 bis 67, insbesondere 56 bis 61 Aminosäuren besteht. Besonders bevorzugt ist die mit FT(Arg62-Arg405) bezeichnete lösliche Variante, die aus den Aminosäuren 62 bis 405 der in SEQ ID-Nr. 5 angeführten Aminosäuresequenz besteht.

Die Hefe-Wirtsstämme und die Bestandteile der Hybridvektoren sind die unten angegebenen.

Die transformierten Hefestämme werden nach Methoden gezüchtet, die dem Fachmann bekannt sind.

So werden die erfindungsgemäßen transformierten Hefestämme in einem Flüssigmedium gezüchtet, das assimilierbare Quellen an Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen enthält.

Eine Reihe von Kohlenstoffquellen können verwendet werden. Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Maltose, Mannit, Fructose oder Lactose, Oder ein Acetat wie Natriumacetat, welche entweder allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Zu den geeigneten Stickstoffquellen gehören zum Beispiel Aminosäuren wie Casaminosäuren, Peptide und Proteïne und ihre Abbauprodukte wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte, weiterhin Hefeextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, ebenso Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Ammoniumnitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Zu den anorganischen Salzen, die verwendet werden können, zählen zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Kalziumsulfate, -chloride, -phosphate und -carbonate. Das Nährmedium kann zusätzlich auch wachstumsfördemde Substanzen enthalten. Zu den wachstumsfördernden Substanzen zählen zum Beispiel Spurenelemente wie Eisen, Zink, Mangan u.ä., oder einzelne Aminosäuren.

Wegen der Inkompatibilität zwischen der endogenen zwei-Mikron-DNA und Hybridvektoren mit deren Replicon zeigen Hefezellen, die mit solchen Hybridvektoren transformiert wurden, eine Tendenz, diese zu verlieren. Solche Hefezellen müssen unter selektiven Bedingungen gezüchtet werden, d.h. Bedingungen, unter welchen die Expression eines plasmidkodierten Gens für das Wachstum erforderlich ist. Die meisten derzeit verwendeten selektiven und in den erfindungsgemäßen Hybridvektoren vorkommenenden (siehe unten) Marker sind Gene, die Enzyme für die Aminosäure- Oder Purinbiosynthese kodieren. Daher müssen synthetische Minimalmedien, in denen die jeweilige Aminosäure oder Purinbase fehlt, verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich, Gene zu verwenden, die Resistenz gegen ein geeignetes Biocid verleihen [z.B. ein Gen, das Resistenz gegen das Aminoglycosid G418 verleiht]. Hefezellen, die mit Vektoren transformiert wurden, die Gene für Antibiotika-Resistenz enthalten, werden in komplexen Medien gezüchtet, die das jeweilige Antibiotikum enthalten, wodurch hôhere Wachstumsraten und größere Zelldichte erreicht werden.

Hybridvektoren, die die vollstândige zwei-Mikron-DNA (inklusive einer funktionellen Replikations-Startstelle) enthalten, bleiben stabil innerhalb von Saccharomvces cerevisiae-Stâmmen erhalten, denen endogene zwei-Mikron-Plasmide fehlen (sogenannte cir°-Stämme), so daß sie unter nicht selektiven Wachstumsbedingungen gezüchtet werden können, d.h. in einem komplexen Medium.

Hefezellen, die Hybridplasmide mit einem konstitutiven Promoter enthalten, exprimieren die DNA, die für eine vom obengenannten Promoter kontrollierte Glycosyltransferase, oder eine Variante davon kodiert, ohne Induktion. Wenn jedoch die obengenannte DNA von einem regulierten Promoter kontrolliert wird, muß die Zusammensetzung des Kulturmediums geândert werden, um ein Maximum an mRNA-Transkripten zu erhalten, so muß beispielsweise, wenn der PH05-Promoter verwendet wird, die Konzentration an anorganischem Phosphat im Kulturmedium niedrig sein, um diesen Promoter zu dereprimieren.

Die Züchtung erfolgt mittels üblicher Techniken. Die Züchtungsbedingungen wie Temperatur, pH des Mediums und Fermentationszeit, werden so gewählt, daß ein Maximum an heterologem Protein produziert wird. Ein ausgewählter Hefestamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in einer Submerskultur unter Schiitteln Oder Riihren bei einer Temperatur von ca. 25° bis 35°C, vorzugsweise bei ca. 28°C, und bei einem pH von 4 bis 7, z.B. ungefähr pH 5, mindestens 1 bis 3 Tage geziichtet, vorzugsweise so lange wie zufriedenstellende Proteinausbeuten erhalten werden.

Nach ihrer Expression in Hefe wird die raembrangebundene Glycosyltransferase Oder ihre Variante entweder innerhalb der Zeilen angereichert Oder in das Kulturmedium sezerniert und auf konventionellem Weg isoliert.

Beispielsweise besteht der erste Schritt üblicherweise darin, daß die Zeilen durch Zentrifugieren von der Kulturflüssigkeit abgetrennt werden. Hat sich die membrangebundene Glycosyltransferase Oder ihre Variante innerhalb der Zeilen angereichert, muß das Protein aus dem Zellinneren durch Zellaufschluß freigesetzt werden. Hefezellen können auf verschiedenen Wegen, die dem Fachmann geläufig sind, aufgeschlossen werden: z.B. durch Ausübung mechanischer Kräfte wie Schiitteln mit Glasperlen, durch Ultraschallvibration, osmotischen Schock und/oder durch enzymatische Verdauung der Zellwand. 1st die gewiinschte membrangebundene Glycosyltransferase Oder ihre Variante an eine Membranfraktion assoziiert Oder gebunden, kann eine weitere Anreicherung z.B. dadurch erreicht werden, daß der Zellextrakt einer differentiellen Zentrifugation unterworfen wird, und die jeweilige Fraktion gegebenenfalls anschließend mit einem Detergenz wie z.B. Triton behandelt wird. Zu den fiir die Reinigung der "Roh"glycosyltransferase, oder deren Variante geeigneten Methoden zählen die üblichen chromatographischen Verfahren wie Affmitätschromatographie, zum Beispiel mit einem geeigneten Substrat, mit Antikörpern oder mit Concanavalin A, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Verteilungschromatographie, HPLC, Elektrophorese, Fällungsschritte wie die Ammoniumsulfatfällung, und andere Verfahren, insbesondere die aus der Literatur bekannten Verfahren.

Wird die Glycosyltransferase Oder ihre Variante von der Hefezelle in den periplasmatischen Raum sezerniert werden, kann ein vereinfachtes Isolierungsprotokoll verwendet werden: das Protein wird ohne Zell-Lyse durch enzymatische Entfemung der Zellwand oder durch Chemikalien, z.B. Thiol-Reagenzien oder EDTA, welche Zellwandschäden induzieren und so die Freisetzung der produzierten Glycosyltransferase ermöglichen, gewonnen. Wird die Glycosyltransferase, oder die Vaiante, in die Kulturflüssigkeit sezerniert, kann sie direkt daraus gewonnen und mittels der obengenannten Methoden gereinigt werden.

Zum Nachweis von Glycosyltransferase-Aktivität können literaturbekannte Tests verwendet werden. Galactosyltransferaseaktivität kann z.B. dadurch bestimmt werden, daß die Menge an radioaktiv markierter Galactose, die in ein geeignetes Akzeptormolekül wie ein Glycoprotein oder einen freien Zuckerrest eingebaut wird, gemessen wird. Auf analoge Weise kann Sialyltransferaseaktivität dadurch getestet werden, daß z.B. Sialinsäure in geeignete Substrate eingebaut wird, und Fucosyltransferase-Aktivität kann durch die Übertragung von Fucose auf einen geeigneten Akzeptor getestet werden.

Die erfindungsgemäßen transformierten Hefe-Wirtszellen können unter Anwendung . rekombinanter DNA-Techniken nach den folgenden Schritten hergestellt werden: - Herstellung eines Hybridvektors, der einen Hefe-Promoter und eine für eine membran- gebundene Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierende DNA-Sequenz umfaßt, wobei diese DNA-Sequenz von besagtem Promoter kontrolliert wird, - Transformation eines Hefe-Wirtsstamms mit dem genannten Hybridvektor, - und Selektion der transformierten Hefezellen von den untransformierten Hefezellen.

Expressionsvektoren

Der erfindungsgemäße Hefe-Hybridvektor enthält eine Expressionskassette, die einen Hefe-Promoter und eine für die membrangebundene Glycosyltransferase oder eine Variante davon kodierende DNA-Sequenz umfaßx, wobei diese DNA-Sequenz von besagtem Promoter kontrolliert wird.

In einer ersten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Hefe-Hybridvektor eine Expressionskassette, die einen Hefe-Promoter, einer für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodierende DNA-Sequenz, wobei diese DNA-Sequenz vom genannten Promoter kontrolliert wird, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, umfaßt.

In einer zweiten Ausführungsform enthält der erfmdungsgemäße Hefe-Hybridvektor eine Expressionskassette, die einen Hefe-Promoter, der funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die für ein Signalpeptid kodiert, und die im richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine Variante davon kodiert, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, umfaßL

Der Hefe-Promoter ist ein regulierter (induzierbarer) oder konstitutiver Promoter, der vorzugsweise von einem hochexprimierten Hefegen, insbesondere einem Saccharomyces cerevisiae-Gen stammt. So können die Promoter des TRPl-Gens, des ADHI- oder ADHII-Gens, des Saure-Phosphatase (PH05)-Gens, ein Promoter der Hefe-Paarungspheromongene, die für den a- oder a-Faktor kodieren, Oder ein Promoter aus einem für ein glycolytisches Enzym kodierenden Gen, wie der Promoter der Enolase-, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP)-, 3-Phosphoglyceratkinase (PGK)-, Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- oder Glucokinase-Gene verwendet werden. Weiterhin ist es möglich, Hybridpromoter enthaltend "upstream activation sequences" (UAS) von einem Hefegen und "downstream promoter elements" mit einer funktionellen "TATA-Box" eines anderen Hefegens zu verwenden, zum Beispiel einen Hybridpromoter mit den UAS des Hefe-PH05-Gens und "downstream promoter elements" mit einer funktionellen "TATA-Box" des Hefe-GAP-Gens (PH05-GAP-Hybrid promoter). Ein bevorzugter Promoter ist der Promoter des GAP-Gens, insbesondere dessen funktionelle Fragmente, die bei Nucleotiden zwischen den Positionen -550 und -180, insbesondere bei Nucleotid -540, -263 oder -198, beginnen und bei Nucleotid -5 des GAP-Gens enden. Ein weiterer bevorzugter Promoter des regulierten Typs ist der PH05-Promoter. Ein bevorzugter konstitutiver Promoter ist ein verkürzter Saure-Phosphatase-PH05-Promoter, dem die "upstream regulatory elements" (UAS) fehlen, ebenso wie das PH05(-173)-Promoter-Element, das bei Nucleotid -173 des PH05-Gens beginnt und bei Nucleotid -9 dieses Gens endet.

Die ein Signalpeptid ("signal sequence") kodierende DNA-Sequenz stammt vorzugsweise aus einem Hefegen, das für ein Polypeptid kodiert, welches normalerweise sezerniert wird. Andere Signalsequenzen heterologer Proteine, die normalerweise sezerniert werden, können ebenfalls gewählt werden. Hefe-Signalsequenzen sind beispielsweise die Signal-und Prepro-Sequenzen des Hefe-Invertase-Gens, α-Faktor-Gens, pheromone Peptidase (KEXl)-Gens, "Killer toxin"-Gens und des reprimierbaren Saure-Phosphatase (PH05)-Gens, und die Glucoamylase-Signalsequenz aus Aspergillus awamori. Alternativ können kombinierte Signalsequenzen dadurch konstruiert werden, daß ein Teil der Signalsequenz (falls vorhanden) des mit dem verwendeten Promoter auf natürlichem Weg verbundenen Gens (zum Beispiel PH05) mit einem Teil der Signalsequenz eines anderen heterologen Proteins ligiert wird. Bevorzugte Kombinationen sind solche, die präzises Schneiden zwischen der Signalsequenz und der Glycosyltransferase-Aminosäuresequenz erlauben. Zusätzliche Sequenzen wie Pro- oder Spacer-Sequenzen mit Oder ohne spezielle Processing-Signale können ebenfalls in die Konstruktionen miteinbezogen werden, um genaues Processing von Vorläufermolekülen zu ermöglichen. Es ist jedoch auch möglich, Fusionsproteine mit internen Processing-Signalen herzustellen, die das Reifen in vivo oder in vitro ermöglichen. Zum Beispiel enthalten die Processing-Signale Lys-Arg, das von einer Hefe-Endopeptidase in den Golgi-Membranen erkannt wird. Die gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugte Signalsequenz ist die des Hefe-Invertase-Gens.

Wenn eine Glycosyltransferase mit der vollen Lange oder eine ihrer membrangebundenen Varianten in Hefe exprimiert wird, enthält der bevorzugte Hefehybridvektor eine Expressionskassette, die einen Hefepromoter, eine für die genannte Glycosyltransferase oder Variante kodierende DNA-Sequenz, die vom genannten Promoter kontrolliert wird, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, umfaßt.

Wird eine lösliche Variante einer Glycosyltransferase in Hefe exprimiert, so enthält der bevorzugte Hefe-Hybridvektor eine Expressionskassette, die einen Hefepromoter, der funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die für ein Signalpeptid kodiert und die im richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, die für die genannte Variante kodiert, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminations-signale enthält, umfaßt. DNA, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, kann mittels dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden und enthält genomische DNA, z.B. DNA, die aus einer genomischen DNA-Bibliothek von Säugetieren, z.B. Ratten-, Mäuse- und Rinderzellen oder menschlichen Zeilen, isoliert wurde. Falls erforderlich, werden die Introns, die in der genomischen DNA, die für das Enzym kodiert, vorkommen, entfernt. Eine für eine membrangebundene Glycosyltranferase oder eine ihrer Varianten kodierende DNA umfaßt auch cDNA, die aus einer Säugetier-cDNA-Bibliothek isoliert oder aus der entsprechenden mRNA hergestellt werden kann. Die cDNA-Bibliothek kann aus Zeilen verschiedener Gewebe, z.B. Plazentazellen oder Leberzellen, stammen. Die cDNA wird über die mRNA mittels üblicher Methoden wie der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt.

Zum Beispiel erfolgt die Isolierung von Poly(A)+RNA aus Säugetierzellen, z.B. HeLa-Zellen, und die anschließende Synthese des ersten Stranges der cDNA nach der Fachwelt bekannten Standardmethoden. Von dieser synthetisierten DNA-Matrize ausgehend kann mittels PCR die Zielsequenz, d.h. die Glycosyltransferase-DNA Oder eines ihrer Fragmente, amplifiziert werden, während die Amplifizierung der im Überschuß vorliegenden unerwiinschten Sequenzen minimiert wird. Zu diesem Zweck muß die Sequenz eines kleinen Nucleotidabschnittes beidseitig der Zielsequenz bekannt sein. Mit diesen flankierenden Sequenzen werden zwei synthetische einzelsträngige Primer-Oligonucleotide aufgebaut, deren Sequenz so gewählt wird, daß die Basen zu der jeweiligen flankierenden Sequenz komplementär sind. PCR beginnt mit der Denaturierung des mRNA-DNA-Hybridstranges, darauf folgt die Anlagerung des Primers an die die Zielsequenz flankierenden Sequenzen. Durch Zusatz einer DNA-Polymerase und von Deoxynucleosid-Triphosphaten werden zwei Stücke Doppelstrang-DNA gebildet, wobei jedes beim Primer beginnt und sich über die Zielsequenz erstreckt, wobei letztere kopiert wird. Jedes der neu synthetisierten Produkte kann als Matrize für das Anheften von Priment und für Verlängerungen (im nächsten Zyklus) verwendet werden, wodurch dies zu einem exponentiellen Anstieg an doppelsträngigen Fragmenten diskreter Länge führt.

Darüberhinaus kann eine DNA, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase Oder eine ihrer Varianten kodiert, enzymatisch oder chemisch synthetisiert werden. Eine Variante einer membrangebundenen Glycosyltransferase mit enzymatischer Aktivität und einer Aminosäuresequenz, in der eine oder mehrere Aminosäuren deletiert (DNA-Fragmente) und/oder gegen eine oder mehrere andere Aminosäuren ausgetauscht werden, wird von einer DNA-Mutante kodiert. Unter einer mutierten DNA ist auch eine stille Mutante zu verstehen, in der ein oder mehrere Nucleotide durch andere Nucleotide ersetzt werden, wobei die neuen Codons für dieselbe(n) Aminosäure(n) kodieren. Solch eine mutierte Sequenz kann auch eine degenerierte DNA-Sequenz sein. Letztere sind insofern bezüglich des genetischen Codes degeneriert, als eine unbegrenzte Anzahl von Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt werden kann, ohne daß dies eine Änderung der anfänglich kodierten Aminosäuresequenz bedeutet. Solche degenerierten DNA-Sequenzen können von Nutzen sein, da sie über unterschiedliche Restriktionsstellen und/oder Häufigkeiten gewisser Codons verfügen, die von einem spezifischen Wirt für die optimale Expression einer Glycosyltransferase bevorzugt werden. Solche DNA-Sequenzen haben vorzugsweise Codons, wie sie vorzugsweise von Hefe verwendet werden.

Eine DNA-Mutante kann auch dadurch erhalten werden, daß eine natürlich vorkommende genomische DNA oder eine cDNA nach der Fachwelt bekannten Methoden in vitro mutiert wird. Zum Beispiel kann aus einer für die jeweilige membrangebundene Glycosyltransferase kodierende DNA mit der vollen Lange eine Teil-DNA, die für eine lösliche Form einer Glycosyltransferase kodiert, unter Verwendung von Restriktionsenzymen herausgeschnitten werden. Für diesen Zweck ist es von Vorteil, wenn eine geeignete Restriktionsstelle zur Verfügung steht.

Fine bevorzugte DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, ist die 3'-flankierende Sequenz eines Hefegens, das korrekte Signale für Transkriptionster-mination und die Polyadenylation enthält. Geeignete 3'-Bankierende Sequenzen sind z.B. die Sequenzen des Hefegens, die natürlicherweise mit dem verwendeten Promoter verbunden sind. Die bevorzugte flankierende Sequenz ist die des Hefe-PH05-Gens.

Der Hefepromoter, die gegebenenfalls vorhandene DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid kodiert, die DNA-Sequenz, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, und die DNA-Sequenz, die die Hefe-Trans-kriptionsterminationssignale enthält, sind funktionell in einer Tandemanordnung verbunden, d.h. sie sind auf solche Wêise nebeneinandergesetzt, daß ihre normalen Funktionen erhalten bleiben. Sie sind so angeordnet, daß der Promoter eine richtige Expression der DNA-Sequenz, die eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, bewirkt (gegebenenfalls mit einer vorgeschalteten Signalsequenz), daß die Transkriptionsterminationssignale eine richtige Termination der Transkription und der Polyadenylation bewirken, und daß die gegebenenfalls vorhandene Signalsequenz im richtigen Leseraster mit der obengenannten DNA-Sequenz in solch einer Weise verbunden ist, daß das letzte Codon der Signalsequenz direkt mit dem ersten Codon der genannten DNA-Sequenz verbunden ist und das Protein sezerniert wird. Wenn der Promoter und die Signalsequenz von verschiedenen Genen stammen, wird der Promoter vorzugsweise an die Signalsequenz an einer Stelle zwischen dem mRNA-Hauptbeginn und dem ATG des mit dem Promoter natürlich verbundenen Gens angefügt. Die Signalsequenz sollte ihr eigenes ATG für die Translationsinitiation besitzen. Diese Sequenzen können mittels synthetischer Oligodeoxynucleotid-Linker mit der Erkennungssequenz einer Endonuclease zusammengefügt werden.

Vektoren, die für die Replikation und Expression in Hefe geeignet sind, enthalten eine Hefe-Replikationsstartstelle. Hybridvektoren, die eine Hefe-Replikationsstartstelle enthalten, zum Beispiel das chromosomale autonom replizierende Segment (ARS), bleiben nach der Transformation extrachromosomal in der Hefezelle und werden während der Mitose autonom repliziert. Hybridvektoren, die Sequenzen enthalten, die mit der Hefe^-Plasmid-DNA homolog sind, können ebenfalls verwendet werden. Solche

Hybridvektoren werden durch Rekombination in 2p-Plasmide integriert, die bereits in der Zelle existieren, oder sie replizieren autonom.

Die erfmdungsgemäßen Hybridvektoren enthalten vorzugsweise einen oder mehrere, insbesondere einen oder zwei selektive genetische Marker für Hefe und solch einen Mrker und eine Replikationsstartstelle für einen bakteriellen Wirt, insbesondere Escherichia coli.

Was die selektiven Gen-Marker für Hefe betrifft, so können sämtliche Markergene verwendet werden, die die Selektion auf Transformanten auf Grund der phenotypischen Expression des Markergens ermöglichen. Beispiele geeigneter Marker für Hefe sind diejenigen, die Resistenz gegen Antibiotika exprimieren oder, im Fall auxotropher Hefemutanten, Gene, die Defizienzen des Wirts kompensieren. Die betreffenden Gene verleihen zum Beispiel Resistenz gegen die Antibiotika G418, Hygromycin oder Bleomycin, oder vermitteln Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, zum Beispiel das URA3-, LEU2-, LYS2- oder TRP1 Gen.

Da die Amplifizierung der Hybridvektoren auf bequemem Weg in E. coli durchgeführt werden kann, ist es vorteilhaft, einen genetischen Marker für E. coli und eine R coli-Replikationsstartstelle einzubauen. Diese können aus R coli-Plasmiden wie z.B. pBR322, oder einem pUC-Plasmid, zum Beispiel pUC18 oder pUC19, erhalten werden, welche sowohl eine E. coli-Replikationsstartstelle und einen genetischen Marker für E. coli, der Resistenz gegen Antibiotika wie Ampicillin verleiht, enthalten.

Die erfindungsgemässen Hybridvektoren werden mittels der Fachwelt bekannten Methoden hergestellt, zum Beispiel dadurch, daß die Expressionskassette umfassend einen Hefe-Promoter und eine für eine Glycosyltransferase, oder eine Variante, kodierende DNA-Sequenz, die vom genannten Promoter kontrolliert wird, beziehungsweise mehrere Komponenten der Expressionskassette, mit den DNA-Fragmenten, die selektive genetische Marker für Hefe und für einen bakteriellen Wirt und Replikationsstartstellen für Hefe und für einen bakteriellen Wirt enthalten, in der vorherbestimmten Reihenfolge verbunden werden.

Hefestämme und ihre Transformation

Geeignete Hefe-Wirtsorganismen sind Stämme der Gattung Saccharomvces, insbesondere Stämme von Saccharomvces cerevisiae. Die genannten Hefestämme umfassen Hefestämme, die gegebenenfalls von endogenen zwei-Mikron-Plasmiden befreit wurden und/oder die gegebenenfalls keine Hefe-Peptidaseaktivität(en), z.B. Peptidase ysca-, yscA-, yscB-, yscY-, und/oder yscS-Aktivität aufweisen.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Hefestamm, der mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der eine Expressionskassette umfassend einen Hefepromoter und eine für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodierende DNA-Sequenz enthält, wobei diese DNA vom genannten Promoter kontrolliert wird.

In einer ersten Ausführungsform wurde der erfindungsgemäße Hefestamm mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Hefe-Promoter, eine DNA-Sequenz, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, wobei diese DNA-Sequenz vom genannten Promoter kontrolliert wird, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transformationsterminationssignale enthâlt, transformiert.

In einer zweiten Ausführungsform wurde der erfmdungsgemäße Hefestamm mit einem Hybridvektor transformiert, der eine Expressionskassette umfasssend einen Hefepromoter, der funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die für ein Signalpeptid kodiert und die im richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, die für eine membrangebundene Glycosyltransferase oder eine ihrer Varianten kodiert, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthâlt, transformiert.

Die Transformation von Hefe mit den erfindungsgemäßen Hybridvektoren wird nach der Fachwelt bekannten Verfahren durchgeführt, zum Beispiel nach den von Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75,1929) und Ito et al. (J. Bact. (1983) 153,163-168) beschriebenen Methoden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten membrangebundenen Glycosyltransferasen und ihre Varianten können auf an sich bekannte Weise verwendet werden, z.B. für die Synthese und/oder Modifizierung von Glycoproteinen, Oligosacchariden und Glycolipiden (US-Patent 4,925,796; EP-Anmeldung 414,171).

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf das Verfahren fiir die Herstellung membrangebundener Glycosyltransferasen und ihrer Varianten, der Hybridvektoren und der transformierten Hefestämme, wie sie in den Beispielen beschrieben sind.

In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: GT = Galactosyltransférase (EC 2.4.1.22); PCR έ Polymerase-Kettenreaktion; ST s Sialyltransferase (EC 2.4.99.1) Varianten; FT= Fucosyltransferase

Beispiel 1: Klonierung der Galactosyltransférase (GT)-cDNA aus HeLa Zeilen GT-cDNA wird aus HeLa-Zellen (Watzele, G. und Berger, E.G. (1990) Nucleic Acids Res. 18,7174) mit dem Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren isoliert: 1.1 Präparation von Poly(A)+RNA aus HeLa-Zellen.

Fiir die RNA-Präparation werden HeLa-Zellen auf 5 Platten (23x23cm) in einer Einzelzellschicht-Kultur gezüchtet. RNA wird aus den kultivierten Zeilen schnell und wirksam mittels Extraktion mit Guanidin-HCl wie von MacDonald, R. J. et al (Meth. Enzymol. (1987) 152,226-227) beschrieben, isoliert. Im allgemeinen sind die Ausbeuten ca. 0.6 bis 1 mg Gesamt-RNA pro Platte konfluent gewachsener Zeilen. Die Poly(A)+RNA wird durch Affmitätschromatographie an 01igo(dT)-Zellulose nach der im Maniatis-Handbuch beschriebenen Methode angereichert (Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA), wobei 4 mg Gesamt-RNA auf eine 400pl-Säule aufgetragen werden. 3% der aufgetragenen RNA werden als angereicherte Poly(A)+RNA zuriickerhalten, mit dem dreifachen Volumen an Ethanol gefällt und aliquotiert bei -70°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.

1.2 Synthese von Erststrang-cDNA fiir die PCR

Poly(A)+RNA (mRNA) wird mit Moloney Murine Leukemia Virus RNase H'Reverse Transcriptase (M-MLV H'RT) (BRL) in DNA revers-transkribierL Bei der Herstellung der 20μ1 Reaktionsmischung wird mit geringen Abweichungen nach dem von BRL bereitgestellten Protokoll vorgegangen: 1 pg HeLa -Zellen-Poly(A)+RNA und 500 ng Oligo (dT)12_18(Pharmacia) in 11,5 μΐ sterilem H20 werden 10 Minuten lang auf 70°C erhitzt und dann schnell auf Eis abgekiihlt. Dann werden 4 μΐ Reaktionspuffer (BRL; 250 mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KC1,15 mM MgCl2), 2 μΐ 0,1 M Dithiothreitol, 1 μΐ gemischtes dNTP (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP, TTP, Pharmacia), 0,5 μΐ (17,5 U) RNAguard (RNase-Inhibitor von Pharmacia) und 1 μΐ (200 U) M-MLVH'RT zugesetzt. Die Reaktion wird bei 42°C durchgeführt und nach einer Stunde durch 10-minütiges Erhitzen des Röhrchens auf 95°C abgestoppt.

Um die Wirksamkeit der Reaktion zu überprüfen, wird ein Aliquot der Mischung (5 μΐ) in der Gegenwart von 2 pCi α-32Ρ dCTP inkubiert. Durch Messung des eingebauten dCTP wird die Menge an synthetisierter cDNA berechnet. Die Ausbeute bei der Synthese des ersten Stranges ist routinemäßig zwischen 5 und 15%. 1.3 Polymerase-Kettenreaktion

Die für die PCR verwendeten Oligodeoxynucleotid-Primer werden in vitro nach dem Phosphoramidit-Verfahren (M.H. Caruthers, in Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, H.G. Gassen und A. Lang, Hrsg. Verlag Chemie, Weinheim, BRD) in einem Applied Biosystems Synthesizer, Modell 380B, synthetisiert. Sie sind in Tabelle 1 angeführt.

Tabelle 1: PCR-primers entsprechend

Primer Sequenz (5' to 3')1} bp in GT cDNA2)

Plup (Kpnl) cgcggtACCdTCTTAAAGCGGCGGCGGGAAGATG (-26)- 3 PI (EcoRI) gccgaattcATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAGCG 1 - 28 P3 (Sad) CTGGAGCTCGTGGCAAAGCAGAACCC 448 - 473 P2d (EcoRI) gccgaaTTCAGTCTCTTATCCGTGTACCAAAACGC CTA 1222-1192 P4 (HindlII) cccaagctTGGAATGATGATGGCCACCTTGTGAGG 546- 520 L Großbuchstaben steben für GT-Sequenzen, Kleinbuchstaben sind zusätzliche Sequenzen, Stellen für

Restriktionsenzyme sind unterstrichen, "Start"- und "Stop"-Codons für die RNA-Translation sind fettgedruckt 2) DT-cDNA-Sequenz aus der mensclichen Plazenta wie in GenBank veröffenlicht (Eingangs-Nr. M22921).

Die folgenden sind Standard-PCR-Bedingungen für einen 30 μΐ Inkubationsansatz: 1 μΐ der Reverse-Transkriptase-Reaktion (siehe Beispiel 1.2), die ca. 5 ng Erststrang-cDNA enthält, jeweils 15 pmol der relevanten Primer, jeweils 200 pmol der vier Desoxynucleosid-Triphosphate (dATP, dCTP, dGTP und TTP) in PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,3 (bei 23°C), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2,0,001% Gelatine) und 0,5 U

AmpliTaq Polymerase (Perkin Elmer). Die Araplifizierung wird im Thermocycler 60 (Biomed) unter den folgenden Bedingungen durchgefiihrt: 0,5 Minuten Denaturierung bei 95°C, 1 Minute Anlagerung bei 56°C und 1 Minute 15 Sekunden Verlängerung bei 72°C, über insgesamt 20-25 Zyklen. Im letzten Zyklus dauert die Primer-Verlängerung bei 72°C 5 Minuten lang. Für das Sequenzieren und Subklonieren wird die HeLa-GT-cDNA in zwei überlappenden Teilstücken amplifïziert, wobei verschiedene Primer-Kombinationen verwendet werden: (1) Fragment PI -P4: Die Primer PI und P4 werden für die Amplifikation eines 0,55 kb DNA-Fragments verwendet, das sich über die Nucleotidpositionen 7-556 in HeLa-GT-cDNA erstreckt (SEQID-NR. 1) (2) Fragment P3 - P2d: Die Primer P3 und P2d werden für die Amplifikation eines 0,77 kb Fragments verwendet, das sich über die Nucleotidpositionen 457-1232 erstreckt (SEQID-Nr. 1).

Um Irrtümer während der Amplifizierung zu vermeiden, werden 4 unabhängige PCR pro Fragment durchgeführt. Primer PI up (Kpnl) wird zusammen mit Primer P4 verwendet, um die DNA-Sequenz, an die sich das "Start"-Codon anschließt, zu bestimmen.

Nach der PCR-Amplifizierung wird Fragment P1-P4 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Hindïïl verdaut, der Verdau auf einem 1,2%-igen Agarosegel analysiert, vom Gel mittels GENECLEAN (BIO 101) eluiert und in den Vektor pUC18 (Pharmacia), der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, subkloniert Fragment P3-P2d wird mit SacI und EcoRI verdaut, der Verdau wird auf einem 1,2%-igen Gel analysiert, eluiert und in pUC18, das mit SacI und EcoRI verdaut wurde, subkloniert. Die erhaltenen Subklone sind pUC18/Pl - P4 bzw. pUC18/P3 - P2d. Für das Subklonieren, die Ligation und die Transformation von E. coli-Stamm DH5a wird nach Standardprotokollen, wie in Beispiel 2 beschrieben, veifahren. Minipräparationen der Plasmide pUC18/Pl - P4 bzw. pUC18/P3 - P2d werden für die Didesoxy-Sequenzierung von denaturierter Doppelstrang-DNA mit dem T7-Polymerase-Sequenzierkit (Pharmacia) verwendet Zur Sequenzierung überlappender Fragmente, die aus beiden DNA-Strängen durch Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen hergestellt wurden, werden M13/pUC Sequenzierungsprimer und reverse Sequenzierungsprimer (Pharmacia) eingesetzt.

Weiteres Subklonieren von Restriktionsfragmenten des GT-Gens ist für ausführliche Sequenzierung überlappender Fragmente beider Strange erforderlich. Die Sequenz von

Fragmenten, die mittels unabhängiger PCR amplifiziert wurden, zeigt, daß der Amplifizierungsfehler kleiner als 1 in 3000 Nucleotiden ist. Die vollständige Nucleotidsequenz der HeLa-Zellen-GT-cDNA, die in SEQ ID-Nr. 1 dargestellt ist, ist zu 99,2% mit der der menschlichen Plazeiita homolog (Genbank-Eingangs Nr. M22921). Es finden sich drei Unterschiede: (a) Drei zusätzliche Basenpaare in den Nucleotidpositionen 37-39 (SEQ ID-Nr. 1), die eine zusätzliche Aminosäure (Ser) in der N-terminalen Region des Proteins ergeben; (b) bp 98 bis 101 sind "CTCT" anstelle von "TCTG" in der Sequenz der menschlichen Plazenta, was zwei konservative Aminosäuresubstitutionen (Ala Leu anstelle von ValTyr) in den Aminosäurepositionen 31 und 32 in der membranumfassenden Domäne von GT zur Folge hat; (c) das Nucleotid in Position 1047 ändert sich von "A" auf "G", ohne daß dies Änderungen in der Aminosäuresequenz bewirkt.

Die zwei iiberlappenden DNA-Fragmente PI - P4 und P3 - P2d, die die HeLa-GT-cDNA kodieren, sind liber die Notl-Restriktionsstelle in der Nucleotidposition 498 zusammengefiigt, die in beiden Fragmenten existiert.

Die vollständige HeLa-Zellen-GT-cDNA (SEQ ID-Nr. 1) wird als 1,2 kb EcoRI-EcoRI Restriktionsfragment in Plasmid pIC-7 kloniert, wobei pIC-7 ein Abkömmling von pUC8 mit zusätzlichen Restriktionsschnittstellen in der multiplen Klonierungsstelle ist (Marsh, J.L., Erfle, M. und Wykes, EJ. (1984) Gene 32,481-485), was den Vektor p4ADl 13 ergibt. Um die GT-Expressionskassette zu konstruieren, wird die EcoRI-Restriktionsstelle (bp 1227) am 3'-Ende der cDNA-Sequenz folgendermaßen eliminiert: Vektor p4AD113 wird zuerst mittels Verdau mit EcoRV linearisiert und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Außerdem wird 1 pg der linearisierten Plasmid-DNA mit 0,25 U EcoRI 1 Stunde lang bei 37°C teilverdaut. Nach Elektrophorese auf Agarosegel wird aus dem Gel mittels GENECLEAN (Bio 101) ein Fragment isoliert, das der Größe des linearisierten Plasmids (3,95 kb) entspricht. Das überstehende EcoRI-Ende wird mit Klenow-Polymerase, wie im Maniatis-Handbuch beschrieben (siehe oben), aufgefiillL Nach Phenolisierung und Fällung mit Ethanol wird das Plasmid wieder ligiert und fiir die Transformierung von E, coli DH5a (Gibco/BRL) verwendet. Von sechs Transformanten werden Plasmid-Minipräparationen hergestellL Die erhaltenen Plasmide werden mittels Restriktionsanalyse auf das Fehlen der EcoRI- und EcoRV-Restriktionsstellen am 3'-Ende der HeLa-GT-cDNA iiberprilft. Das mit p4AE113 bezeichnete Plasmid wird fiir die folgenden Expérimente ausgewählt, da seine DNA-Sequenz identisch mit der von Plasmid p4AD113 ist, mit der Ausnahme daß bp 1232-1238 mit den

EcoRI-EcoRV-Restriktionsstellen eliminiert sind.

Beispiel 2: Konstruktion von Expressionskassetten für vollständige GT Für heterologe Expression in Saccharomvces cerevisiae wird die vollständige HeLa-GT-cDNA-Sequenz (SEQ ID-Nr. 1) mit Transkriptionskontrollsignalen der Hefe kombiniert, um wirksame Initiierung und Termination der Transkription zu erreichen. Die Promoter- und Terminatorsequenzen stammen vom Saure-Phosphatase-Gen der Hefe (PH05) (EP 100561). Der vollständige PH05 Promoter wird durch den Vorrat an anorganischem Phosphat im Kulturmedium reguliert. Hohe PrKonzentrationen führen zu Reprimierung des Promoters, während ein niedriger Pj-Gehalt induzierend wirkt. Es kann jedoch auch ein kurzes 173 bp PH05-Promoterfragment verwendet werden, dem alle regulierenden Elemente fehlen und das sich deshalb wie ein konstitutiver Promoter verhält. 2.1 Konstruktion einer phosphatinduzierbaren Expressionskassette

Die GT-cDNA-Sequenz wird folgendermaßen mit dem Hefe-PH05-Promoter und

Transkriptionsterminationssequenzen kombiniert: (a) Vollständige HeLa-GT-cDNA-Sequenz:

Vektor p4AE113 mit der vollständigen GT-cDNA-Sequenz wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BglII verdaut. Die DNA-Fragmente werden elektrophoretisch auf einem 1%-igen Agarosegel getrennt. Ein 1,2 kb DNA-Fragment, das die komplette cDNA-Sequenz für HeLa-GT enthält, wird vom Gel durch Adsorption an "Glasmilk" mittels des GENECLEAN-Kits (B10 101) isoliert. Auf diesem Fragment ist das "ATG"-Startcodon für die Proteinsynthese von GT direkt hinter der Schnittstelle für EcoRI angeordnet, während sich an das "TAG"-Stopcodon 32 bp anschließen, an deren Zusammensetzung die 3'-untranslatierte Region der HeLa-GT und die multiple Klonierungsstelle des Vektors mit der BglII-Restriktionsstelle beteiligt sind. (b) Vektor für die Amplifizierung in E. coli:

Der Amplifizierungsvektor, Plasmid p31R (vgl. EP 100561), ein pBR322-Abkömmling, wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Sali verdaut. Die Restriktionsfragmente werden auf einem 1%-igem Agarosegel aufgetrennt, und ein 3,5 kb Vektorfragment wie oben beschrieben aus dem Gel isoliert. Dieses DNA-Fragment enthält das große SalI-HindlII-Vektorfragment des pBR322-Abkömmlings und eine 337 bp PH05 -Transkriptionsterminationssequenz anstelle der HindlII - BamHI-Sequenz von pBR322. (c) Sequenz für den induzierbaren PH05-Promoter:

Das die Regulationselemente (UASp) für Phosphat-Induktion enthaltende PH05-Promoterfragment wird aus Plasmid p31R (vgl. EP 100561) durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen Sali und EcoRI isoliert. Das 0,8 kb Sali - EcoRI-DNA-Fragment enthält die 276 bp Sali - BamHI pBR322-Sequenz und das 534 bp BamHI-EcoRI PH05-Promoterfragment mit dem EcoRI-Linker (5'-GAATTC-3'), der in Position -8 der PH05-Promotersequenz eingeführt wurde. (d) Konstruktion von Plasmid pGTA 1132

Die drei DNA-Fragmente (a) bis (c) werden in einer 12 μΐ Ligationsmischung ligiert: 100 ng DNA-Fragment (a) und jeweils 30 ng der Fragmente (b) und (c) werden bei 15°C 18 Stunden lang mit 0,3 U T4-DNA-Ligase (Boehringer) im mitgelieferten Ligasepuffer (66 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM Dithioerythritol, 5 mM MgCl2,1 mM ATP) ligiert. Mit der Hälfte der Ligationsmischung werden kompetente Zeilen vom E. coli Stamm DH5a (Gibco/BRL) transformiert. Für die Herstellung von kompetenten Zeilen und für die Transformation wird nach dem Standardprotokoll, wie im Maniatis-Handbuch (siehe oben) angegeben, vorgegangen. Die Zeilen werden auf selektivem, mit 75 μg/ml Ampicillin ergänztem LB-Medium ausgestrichen und bei 37°C inkubiert. Man erhält ca. 120 Transformanten. Von sechs unabhängigen Transformanten werden Plasmid-Minipräparationen nach dem modifizierten alkalischen Lyse-Protokoll von Birnboim, H.C. und Doly, J., wie im Maniatis-Handbuch angegeben (siehe oben), durchgeführt. Die isolierten Plasmide werden durch Restriktionsanalyse mit 4 verschiedenen Enzymen charakterisiert (EcoRI, PstI, Hindïïl, Sali, und Kombinationen). Alle sechs Plasmide zeigen die erwarteten Restriktionsfragmente. Einer der Klone wird ausgewählt und als pGTA 1132 bezeichnet. Plasmid pGTA 1132 enthält die Expressionskassette mit der vollständigen HeLa-GT-cDNA, die unter der Kontrolle des phosphatregulierten PH05-Promoters steht, und die PH05-Transkriptionsterminations-sequenz. Diese Expressionskassette kann aus pGTA 1132 als ein 2,35 kb Sali -Hindlïï-Fragment herausgeschnitten werden und wird als DNA-Fragment (IA) bezeichnet. 2.2 Konstruktion einer konstitutiven Expressionskassette: Für die Konstruktion einer Expressionskassette mit einem konstitutiven, nicht regulierten Promoter wird ein am 5'-Ende verkürztes PH05-Promoterfragment ohne Phosphat-Regulationselemente verwendet, das aus Plasmid p31/PH05(-173)RIT isoliert wird.

(a) Konstruktion von Plasmid p31/PH05(-173)RIT

Plasmid p31 RIT12 (EP 288435) enthält den vollständigen regulierten PHQ5-Promoter (mit einer in der Nucleotidposition -8 auf einem 534bp BamHI - EcoRI-Fragment eingeführten EcoRI-Stelle), woran sich die kodierende Sequenz fiir die Hefe-Invertase-Signalsequenz (72bp EcoRI -Xhol) und das PH05-Transkriptionsterminationssignal (135bp Xhol - Hindlll), kloniert in Tandemanordnung zwischen BamHI und Hindin des von pBR322 abgeleiteten Vektors, anschließt.

Das konstitutive PH05(-173)-Promoterelement aus Plasmid pJDB207/PH05(-173)-YHIR (EP 340170) umfaßt die Nucleotidsequenz des Hefe-PH05-Promoters von der Nucleotidposition -9 bis -173 (BstEII-Restriktionsstelle), hataber "stromaufwärts" keine regulierenden Sequenzen (UASp). Per PH05(-173)-Promoter verhält sich daher wie ein konstitutiver Promoter. Dieses Beispiel beschreibt den Ersatz des regulierten PH05-Promoters in Plasmid p31RIT12 durch das kurze, konstitutive PH05(-173)-Promoterelement, um Plasmid p31/PH05(-173)RIT zu erhalten.

Die Plasmide p31RIT12 (EP 288,435) und pJDB207/PH05(-173)-YHIR (EP 340,170) werden mit den Restriktionsendonucleasen Sail und EcoRI verdaut. Die jeweiligen 3,6 kb und 0,4 kb Sail - EcoRI-Fragmente werden auf einem 0,8%-igen Agarosegel isoliert, aus dem Gel eluiert, mit Ethanol gefällt und in H20 in einer Konzentration von 0,1 pmol/μΐ resuspendiert. Die beiden DNA-Fragmente werden ligiert, und Aliquots der Ligationsmischung von 1 μΐ werden ftir die Transformation von kompetenten E. coli HB101 (ATCC)-Zellen verwendet. Ampicillinresistente Koloniën werden individuell in mit Ampicillin (100 pg/ml) ergänztem LB-Medium geziichtet. Plasmid-DNA wird nach der Methode von Holmes, D.S. et al. (Anal. Biochem. (1981) 144,193) isoliert und mittels Restriktionsverdau mit Sail und EcoRI analysiert. Das Plasmid eines Klones mit den richtigen Restriktionsfragmenten wird als p31/PH05(-173)RIT bezeichnet. (b) Konstruktion von Plasmid pGTB1135

Plasmid p31/PH05(-173)RIT wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Sail verdaut. Nach Trennung auf einem 1%-igen Agarosegel wird ein 0,45 kb Sail - EcoRI-Fragment aus dem Gel mittels GENECLEAN (BIO 101) isoliert. Dieses Fragment enthält die 276 bp Sall-BamHI-Sequenz von pBR322 und das 173bp BamHI(BstEII)-EcoRI-Fragment des konstitutiven PH05-Promoters. Das 0,45 kb SalI-EcoRI-Fragment wird mit der 1,2 kb EcoRI-Bglïï GT-cDNA (Fragment (a)) ligiert und der 3,5 kb BamHI-Sall-Vektorteil wird für Amplifizierung in E. coli mit dem in Beispiel 2.1. beschriebenen PH05-Terminator (Fragment (b)) ligiert. Ligation und Transformierung von E. coli-Stamm DH5oc werden wie oben durchgeführt, wobei 58 Transformanten erhalten werden. Plasmide werden aus sechs unabhängigen Koloniën mittels Minipräparationen isoliert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Alle sechs Plasmide zeigen das erwartete Fragmentierungsmuster. Ein richtiger Klon wird als pGTB 1135 bezeichnet und für weitere Klonierungsexperimente verwendet, um die Expressionskassette für HeLa-GT unter der Kontrolle des konstitutiven PH05(-173)-Promoterfragments bereitzustellen. Diese Expressionskassette kann aus Vektor pGTB 1135 als 2 kb Sali - HindlII-Fragment herausgeschnitten werden und wird als DNA-Fragment (1B) bezeichnet.

Beispiel 3: Konstruktion der Expressionsvektoren PDPGTA8 und pDPGTB5 Der für heterologe Expression verweridete Hefevektor ist der episomale Vektor pDP34 (11,8 kb), welcher ein Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor mit dem Ampicillinresistenz-Marker für E. çoli und den für Hefe selektiven Markern URA3 und dLEU2 ist. Vektor pDP34 (vgl. EP 340,170) wird mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Der linearisierte Vektor wird mittels GENECLEAN isoliert, und die überstehenden Enden werden mittels Klenow-Polymerasebehandlung, wie im Maniatis-Handbuch beschrieben (siehe oben), aufgefüllt. Die Reaktion wird nach 30 Minuten durch 20-minütiges Erhitzen auf 65°C zusammen mit 10 mM EDTA abgestoppt. Nach Ethanolfällung wird das Plasmid mit Sali verdaut und der Verdau mittels Gelelektrophorese auf einem 0,8%-igen Agarosegel aufgetrennt. Der (BamHI)-stumpfendige, mit Sali geschnittene Vektor pDP34 wird mittels des GENECLEAN-Kits als 11,8 kb DNA-Fragments aus dem Gel isoliert.

Analog zur Vektorpräparation werden die Plasmide pGTA 1132 und pGTB 1135 jeweils mit HindlII verdaut. Die überstehenden Enden der linearisierten Plasmide werden mittels Klenow-Polymerase-Behandlung aufgefüllt und anschließend einem Sali-Verdau unterworfen, wobei (2A) ein 2,35 kb (Hindïïl)-stumpfendiges Sall-Fragment mit der phosphatregulierten Expressionskassette oder (2B) ein 2,0 kb (Hindlïï)-stumpfendiges Sall-Fragment mit der konstitutiven Expressionskassette entsteht.

Die Ligation des stumpfendigen Sali pDP34-Vektorteils mit Fragment 2A Oder Fragment 2B und die Transformation kompetenter Zeilen des E. coli-Stamms DH5a werden wie oben in Beispiel 2 beschrieben durchgefiihrt, wobei 80 ng des Vektorteils und 40 ng Fragment 2A bzw. 2B verwendet werden. 58 bzw. 24 Transformanten werden erhalten. Von jeder Transformation werden sechs Plasmide präpariert und mittels Restriktionsanalyse charakterisiert. 2 Plasmide weisen das fiir die Konstruktion mit der regulierten Expressionskassette erwartete Restriktionsmuster (Fragment 2A) auf. Einer der Klone wird gewählt und mit pDPGTA8 bezeichnet.

Ein Plasmid weist das fiir die Konstruktion mit der konstitutiven Expressionskassette (Fragment 2B) erwartete Restriktionsmuster auf und wird als pDPGTB5 bezeichnet.

Beispiel 4: Transformation des S. cerevisiae-Stammes BT 150 Mittels CsCl gereinigte DNA der Expressionsvektoren pDPGTA8 und pDPGTB5 wird nach dem Protokoll von R. Treisman im Maniatis-Handbuch (siehe oben) hergestellt. Jeder der proteasedefizienten S. cerevisiae-Stämme BT 150 (MATa, his4, leu2, ura3, pral, prbl, prcl, cpsl) und H 449 (MATa, prbl, cpsl, ura3A5, leu 2-3,2-112, cir°) wird mit jeweils 5 pg der Plasmide pDPGTA8, pDPTGB5 und pDP34 (Kontrolle ohne Expressionskassette) nach der Lithiumacetat-Transformationsmethode (Ito, H. et al., siehe oben) transformierL Ura+-Transformanten werden isoliert und fiir ein Screening auf GT-Aktivität (siehe oben) verwendet. Einzelne transformierte Hefezellen werden selektiert und folgendermaßen bezeichnet:

Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPGTA8 Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPGTB5 Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDP34

Saccharomvces cerevisiae H 449/pDPGTA8 Saccharomvces cerevisiae H 449/pDPGTB5 Saccharomvces cerevisiae H 449/pDP34

Beispiel 5: Enzymaktivität vollständiger, in Hefe exprimierter GT 5.1 Herstellung von Zellextrakten

Zeilen der transformierten Saccharomvces cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 werden jeweils unter Uracilselektion in mit Histidin und Leucin angereicherten Hefe-Minimal-medien (Difco) geziichtet. Die Wachstumsrate der Zeilen wird in keinem Fall durch die

Einführung eines Expressionsvektors beeinflußt. Exponentiell wachsende Zeilen (bei einer OD578 von 0,5) Oder stationäre Zeilen werden durch Zentrifugation geerniet, einmal mit 5 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,4 (Puffer 1), gewaschen und in einer Konzentration entsprechend 0,1-0,2 OD578 in Puffer 1 suspendiert. Die Zeilen werden mechanisch durch 4-minütiges starkes Schütteln auf einem Vortexmixer mit Glaskugeln (0,45 - 0,5 mm Durchmesser) aufgebrochen, wobei zwischendurch gekühlt wird. Die Rohextrakte werden direkt für die Bestimmung der Enzymaktivität verwendeL

Durch différentielles Zentrifugieren des Extrakts wird eine Fraktionierung der Zellkomponenten erreicht. Der Extrakt wird zuerst 5 Minuten bei 450 g zentrifugiert; der erhaltene Überstand wird anschließend 45 Minuten bei 20,000 g zentrifugiert.

Der Überstand wird abgezogen, und die Pellets werden in Puffer 1 suspendiert. Für die Phosphatinduktion der GT-Ex'pression unter der Kontrolle des induzierbaren PH05-Promoters werden jeweils Zeilen der Transformanten BT 150/pDPGTA8 und H 449/pDPGTA8 in der Masse auf ein Minimalmedium mit niedrigem Phosphatgehalt umgesetzt (Meyhack, B. et a. Embo J. (1982) 1,675-680). Die Zellextrakte werden wie oben beschrieben hergestellt. 5.2 Proteintest

Die Proteinkonzentration wird durch die Verwendung eines BCA-Proteinassaykit (Pierce) bestimmt. 5.3 Test auf GT-Aktivität GT-Aktivität kann mit radiochemischen Methoden entweder unter der Verwendung von Ovalbumin, eines Glycoproteins, das ausschließlich GlcNAc als Akzeptor aufweist, oder von freiem GlcNAc als Akzeptorsubstrat gemessen werden. Zellextrakte (mit 1-2 zellbedingten ODs578) werden 45 oder 60 Minuten lang bei 37°C in 100 μΐ Inkubationsmischung mit 100 mM Tris-HCl pH 7,4,50 nCi UDP-14C-Gal (325 mCi/mmol), 80 nmol UDP-Gal, 1 pmol MnCl2,1 % Triton X-100 und 1 mg Ovalbumin oder 2 μηιοί GlcNAc als Akzeptor getestet. Wenn ein Glycoprotein-Akzeptorsubstrat verwendet wird, wird die Reaktion durch Säurefällung des Proteins abgestoppt, und die Menge an 14C-Galactose, die in das Ovalbumin eingebaut wurde, wird mittels Flüssigszintillationszählung bestimmt (Berger, E.G. et al. (1978) Eur. J. Biochem. 90, 213-222). 1st GlcNAc das Akzeptorsubstrat, wird die Reaktion durch Zugabe von 0,4 ml eiskaltem H20 abgesloppt, und die nicht aufgenommene UDP-14C-Galactose wird von den 14C-Produkten auf einer Anionenaustauschersäule (AG Xl-8, BioRad), wie beschrieben, getrennt (Masibay, A.S. und Qasba, P.K. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,5733-5737). Tests mit und ohne Akzeptormoleküle werden durchgeführt, um das Ausmaß der Hydrolyse von UDP-Gal durch Nucleotidpyrophosphatasen zu beurteilen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: GT-Aktivität im mit verschiedenen Plasmiden transformierten S. cerevisiae-Stamm BT 150.

Die GT-Aktivität von auf induzierbare Bedingungen umgestellte Kuituren (Minimalmedium mit niedrigem Pj-Gehalt) ist ungefähr gleich der Aktivität von Kuituren in Minimalmedien, die GT konstitutiv exprimieren (Tabelle 2). Wie erwartet, fïndet sich keine Enzymaktivität in Zeilen, die nur mit dem Vektor transformierten werden. Während der Fraktionierung findet sich die meiste GT-Aktivität (70 - 90%, siehe Tabelle 3) und die höchste spezifische Aktivität immer im bei der hohen Beschleunigung erhaltenen Pellet (20,000 g). Die Enzymaktivität kann durch einen Zusatz von 1-2% Triton X-100 zum Enzymtest erhöht werden. Beide Ergebnisse lassen darauf schließen, daß rekombinante GT in Hefezellen sowohl als in HeLa-Zellen membrangebunden vorliegt.

Tabelle 3: Verteilung der GT-Aktivität während der Fraktionierung von BT 150/pDPGT5-Zellen

Beispiel 6: Reinigung der rekombinanten GT

Um das membrangebundene Enzym freizusetzen, wird die 20000 g-Pelletfraktion der BT 150/pDPGTB5-Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1% (w/v)Triton X-100 behandelt und mit 50 mM Tris HCl pH 7,4,25 mM MgCl2,0,5 mM UMP und 1% (w/v) Triton X-100 äquilibriert. Der nach Zentrifugation erhaltene Überstand wird 0,2 pm filtriertund eine GlcNAc-p-Aminophenyl-Sepharosesaule (Berger, E.G. et al. (1976) Experientia 32, 690-691) wird mit dem Filtrat beschickt, wobei das Bettvolumen 5 ml und die Durchflußrate 0,2 ml/min bei 4°C beträgt. Das Enzym wird mit 50 mM Tris-HCl pH 7,4,5 mM GlcNAc, 25 mM EDTA und 1% Triton X-100 eluiert. Ein einziger Peak mit Enzymaktivität wird innerhalb von fünf Fraktionen (Größe: 1 ml) eluiert. Diese Fraktionen werden zusammengegeben und gegen 2x 1150 mM Tris-HCl pH 7,4,0,1% Triton X-100 dialysiert. Die gereinigte GT ist enzymatisch aktiv.

Beispiel 7: Konstruktion einer Expressionskassette für lösliche GT In Hefe exprimierte Galactosyltransférase kann in das Kulturmedium sezerniert werden, wenn ein Hefepromoter funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die für die Signalsequenz des Hefe-Invertasegens SUC2 kodiert und diese im richtigen Leseraster mit einer cDNA verbunden ist, die für eine lösliche GT kodiert. (a)HeLa-GT-cDNA-Teilsequenz GT-cDNA wird aus Plasmid p4AD113 (Beispiel 1) mittels EcoRI-Verdau freigesetzt. Das 1,2 kb Fragment mit der vollständigen GT-cDNA wird isoliert und mit Mvnl (Boehringer) teilverdaut, wobei die GT-Sequenz in den Positionen 43, 55,140 und 288 der in SEQ ID-Nr. 1 abgebildeten Nucleotidsequenz geschnitten wird. Wenn 0,2 pg des EcoRI-EcoRI-Fragments eine Stunde lang mit 0,75 p Mvnl verdaut werden, wird die GT-cDNA nur ein einziges Mal in der Nucleotidposition 134 geschnitten, wobei ein 1,1 kb Mvnl-EcoRI-Fragment entsteht (b) Vektor für die Amplifizierung in E. coli

Plasmid pUC18 (Pharmacia) wird mit BamHI und EcoRI an der multiplen Klonierungsstelle geschnitten. Das Plasmid wird anschließend mit alkalischer Phosphatase, wie im Maniatis-Handbuch (siehe oben) beschrieben, behandelt, einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, und aus dem Gel als 2,7 kb DNA-Fragments isoliert. (c) Der konstitutive PH05 (-173)-Promoter und die SUC2-Signalsequenz

Der Vektor p31/PH05 (-173) RIT(Beispiel 2) wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut. Ein 0,25 kb BamHI-XhoI-Fragment mit dem konstitutiven PH05-Î- 173)-Promoter und der benachbarten Sequenz, die für die Invertase-Signalsequenz (inv ss) kodiert, wird isoliert. Das Fragment wird dann nochmals mit Hgal (BioLabs) geschnitten. Die Hgal-Erkennungssequenz befmdet sich auf dem DNA-Antisensestrang. Das Restriktionsenzym schneidet "stromaufwärts" der Erkennungssequenz auf solche Weise, daß das 5-überstehende Ende des Antisensestrangs mit dem Ende der kodierenden Sequenz der Invertase-Signalsequenz übereinstimmt. Das mit BamHI und Hgal geschnittene 0,24 kb DNA-Fragment enthält die konstitutive PH05 (-173)-Promotersequenz, die mit der Hefe-Invertase-Signalsequenz verbunden ist. (d) Adaptor

Fragment (a) ist mit Fragment (c) mittels einer Adaptorsequenz verbunden, die aus äquimolaren Mengen der synthetischen Oligonucleotide (Microsynth) 5'CT GCA CTG GCT GGC CG 3' und 5'CG GCC AGC CAG 3' für den Komplementärstrang hergestellt wird. Die Oligonucleotide werden aneinander dadurch angelagert, daß sie zuerst auf 95°C erhitzt werden und dann langsam auf 20°C gekühlt werden. Der angelagerte Adaptor wird in gefrorenem Zustand aufbewahrt.

(e) Konstruktion des Plasmids psGT Für die Ligation werden der linearisierte Vektor (b), das GT-cDNA Fragment (a),

Fragment (c) mit dem Promoter und der Sequenz, die für das Signalpeptid kodiert, und Adaptor (d) in einem molaren Verhältnis von 1: 2: 2: 30-100 eingesetzt. Die Ligation wird in 12 μΐ Ligasepuffer (66 mM Tris-HCl pH 7,5,1 mM Dithioerythritol, 5 mM MgCl2,1 mM ATP) 18 Stunden lang bei 16°C durchgeführt. Die Ligationsmischung wird für die

Transformation kom peten ter E. coli-Stamm DH5a-Zellen (siehe oben) verwendet. Von 24 unabhängigen Transformanten werden Plasmid-Minipräparationen durchgeführt. Die isolierten Plasmide werden durch Restriktionsanalyse mit vier verschiedenen Enzymen (BamHI, PstI, EcoRI, Xhol, auch in Kombination) charakterisiert. Ein Einzelklon mit dem erwarteten Restriktionsmuster wird als psGT bezeichnet.

Die richtige Sequenz an der Fusionsstelle der Sequenz, die Invertase-Signalpeptid kodiert, mit der cDNA, die für lösliche GT kodiert, wird für Plasmid-psGT dadurch bestätigt, daß das T7-Sequencing Kit (Pharmacia) und Primer 5'AGTCGAGGTTAGTATGGC 3', der in Position -77 im konstitutiven PH05 (-173)-Promoter beginnt, verwendet werden. DNA- Mvnl

Sequenz-1·) : 5' AAA ATA Tct gca ctg get ggc cgC GAC CTG AGC 3' 3' TTT TAT AGA CGT gac ega ccg gcG CAG GAC TCG 5'

Protein: Lys Ile Ser Ala Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 16 19 42 inv ss GT Sequenz

Schnittstelle für Signal-Endopeptidase

Kleinbuchstaben bezeichnen die Adaptersequenz

Die Expressionskassette für lösliche GT, die den konstitutiven PH05 (-173)-Promoter, die für Invertase-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz und die partielle GT-cDNA aus dem Plasmid psGT enthält, kann in Form eines 1,35 kb Sail (BamHI)-EcoRI-Fragments herausgeschnitten werden. Der Expressionskassette fehlen noch immer die PH05-Terminatorsequenzen, die im anschließenden Klonierungsschritt zugefügt werden.

Beispiel 8: Konstruktion des Expressionsvektors pDPGTS

Die folgenden Fragmente werden zusammengefügt, um den Expressionsvektor für lösliche GT zu konstruieren: (a) Vektorteil

Plasmid pDP34 wird verdaut und wie in Beispiel 3 beschrieben vorbehandelt, wobei ein stumpfendiges Sall-Vektorfragment von 11,8 kb entsteht. (b) Expressionskassette

Plasmid psGT wird erst durch Verdau mit Sali (an der multiplen Klonierungsstelle) linearisiert und anschließend mit EcoRI teilverdaut. Ein 1,35 kb DNA-Fragment, das den konstitutiven PH05 (-173)-Promoter, eine das Hefe-Invertase-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz und die partielle GT-cDNA enthâlt, wird isoliert. (c) PH05-Terminatorsequenz

Die PH05-Terminatorsequenz wird aus Plasmid p31 isoliert, welches wie in EP 100561 beschrieben aus Plasmid p30 konstruiert wird. Nach Verdau mit dem Restriktionsenzym Hindlïï werden die überstehenden Enden mittels Klenow-Polymerasebehandlung, wie oben beschrieben, aufgefüllt. Das Plasmid wird dann mit EcoRI verdaut, und ein stumpfendiges EcoRI-Fragment von 0,39 kb mit den PH05-Terminatorsequenzen isoliert.

Die Ligation der Fragmente (a), (b) und (c) und die Transformation kompetenter Zeilen des E. coIi-Stamms DH5a werden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Aus den erhaltenen Transformanten werden Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Das Plasmid eines Klons mit den richtigen Restriktionsfragmenten wird als pDPGTS bezeichnet.

Beispiel 9: Expression löslicher GT in Hefe

Analog zu Beispiel 4 wird mittels CsCl gereinigte DNA des Expressionsvektors pDPGTS für die Transformation der R, cerevisiae-Stämme BT150 und H 449 verwendet. Ura+-Transformanten werden isoliert und einem Screening auf GT-Aktivität unterworfen. Jeweils eine Transformante wird ausgewählt und jeweils als Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPGTS und Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPGTS bezeichnet. Bei Durchführung des in Beispiel 5 beschriebenen Tests findet sich GT-Aktivität in den Kulturbrühen beider Transformanten.

Beispiel 10: Klonierung der Sialyltransferase (ST)-cDNA aus menschlichen HepG2-Zellen ST-cDNA wird aus HepG2-Zellen mittels PCR analog zur GT-cDNA isoliert. Die Präparation von Poly(A)+RNA und die Synthese von Erststrang-cDNA werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die für die PCR verwendeten Primer (Microsynth) sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5: PCR-Primer enspricht bp

Primer Sequenz (5' to 3')^ in ST cDNA2)

PstFEcoRI SI Al cgctgcagaattcaaaATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGT 1 - 28

BamHI SIA3 cgcggatCCTGTGCTTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGCC 1228 - 1198 ^ Grossbuchstaben stehen für ST-Sequenzen, Kleinbuchstaben sind zusätzliche Sequnzen mit Restriktionsstellen (unterstrichen). "Start"- und "Stop-" Codons für die Proteinsynthese sind fettgedruckt. 2) ST -cDNA -Sequenz aus menschlicher Plazenta (27) wie in EMBL Data Bank (Eingangs-Nr.X17247) veröffentlicht.

HepG2-ST-cDNA kann mittels der Primer SIA1 und SIA3 als ein 1,2 kb DNA-Fragments amplifiziert werden. Die PCR wird wie für GT-cDNA beschrieben unter leicht abgeänderten Zyklusbedingungen durchgeführt: 0,5 Minuten Denaturieren bei 95 °C, 1 Minute 15 Sekunden Anlagem bei 56°C, und 1 Minute 30 Sekunden Verlängerung bei 72°C, über insgesamt 25 bis 35 Zyklen. Im letzten Zyklus dauert die Primer-Verlängerung bei 72°C 5 Minuten..

Nach der PCR-Amplifizierung wird das 1,2 kb Fragment mit den Restriktionsenzymen BamHI und PstI verdaut, der Verdau wird auf einem 1,2%-igen Agarosegel analysiert, aus dem Gel eluiert und in den Vektor pUC18 subkloniert. Der erhaltenen Subklon wird als pSIA2 bezeichnet.

Beispiel 11: Konstruktion der konstitutiven ST-Expressionskassette Für konstitutive heterologe Expression wird ST-cDNA mit dem konstitutiven PH05- (-173)-Promoterfragment und den PH05-Terminatorsequenzen ligiert.

Plasmid pSIA2 wird erst durch Verdau mit dem Restriktionsenzym BamHI linearisiert und anschließend mit EcoRI teilverdaut. Da ST-cDNA ebenfalls eine interne Restriktionsstelle für das Enzym EcoRI enthält (bei bp 144), wird ein 1,2 kb Fragment mit der kompleiten ST-cDNA (SEQ. ID-Nr. 3) durch Teilverdau mit EcoRI hergestellt, wobei 1 μ» DNA und 0,25 U EcoRI verwendet werden (1 h, 37°C). Nach Gelelektrophorese wird das 1,2 kb EcoRI-BamHI-Fragment mit der kompletten ST-cDNA (SEQ ID-Nr. 3) isoliert. Auf diesem DNA-Fragment befindet sich das "ATG"-Startcodon für die Translation von ST in der Nähe der EcoRI-Restriktionsstelle. Drei Adenosinphosphate (siehe PCR Primer SIA 1) stellen ein "A" in der bp-Position 12 zur Verfügung, welches sich in der Konsens-Sequenz um "ATG" aus hochexprimierten Genen in Hefe findet (Hamilton, R. et al. (1987) Nucleic Acids Res. 14,5125-5149). An das Stop-Codon "TAA" und an 5 bp der 3'-untranslatierten Genregion schließt sich die BamHI-Stelle an.

Das 1,2 kb EcoRI-BamHI-ST-cDNA-Fragment wird mit dem 0,45 kb Sall-EcoRI-Fragment mit dem konstitutiven PH05-(-173)-Promoter (Beispiel 2.2(b)) und mit einem 3,5 kb BamHI-Sall-Vektorteil fiir die Amplifizierung in E. coli, der die PH05-Terminatorsequenz enthält (vgl. Beispiel 2.1, Fragment (b)) ligierl. Ligation und Transformation von E. coli-Stamm DH5a werden, wie in Beispiel 2.1 näher angegeben, durchgefiihrt. Ein Klon, der das erwartete Restriktionsmuster aufweist, wird als pST2 bezeichnet.

Vektor pST2 enthält die Expressionskassette fiir HepG2-ST unter der Kontrolle des konstitutiven PH05-(- 173)-Promoters in der Form eines 2,0 kb Sall-Hindlll-Fragments, das als DNA-Fragment (1C) bezeichnet wird.

Beispiel 12: Expression von ST in Hefe

Vektor pDP34 (vgl. EP 340 170) wird mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Der linearisierte Vektor wird mit GENECLEAN isoliert und die überstehenden Enden werden mittels Klenow-Polymerasebehandlung wie im Maniatis-Handbuch (siehe oben) beschrieben aufgefüllt. Die Reaktion wird nach 30 Minuten durch 20-miniitiges Erhitzen auf 65°C in der Gegenwart von 10 mM EDTA abgestoppt. Nach Ethanolfällung wird das Plasmid mit Sail verdaut und einer Gelelektrophorese auf einem 0,8%-igen Agarosegel unterworfen. Der (BamHI)-stumpfendige, mit Sail geschnittene Vektor pDP34 wird mit dem GENECLEAN-Kit in der Form eines 11,8 kb DNA-Fragments isoliert.

Plasmid pST2 wird mit dem Restriktionsenzym Hindin verdaut und analog zur Preparation des Vektors mittels Klenow-Polymerasebehandlung an der Hindll-Stelle aufgefüllt, und zwar analog zur Prâparation des Vektors. Das Produkt wird mit Sail verdaut, wobei ein 2,0 kb (HindIII)-sturapfendiges Sail-Fragment mit der konstitutiven ST-Expressionskassette entsteht (2C).

Die Ligation von 80 ng des pDP34-Vektors mit 40 ng Fragment 2C, und die Transformation kompetenter Zeilen von E. coli-Stamm DH5a wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgefiihrt. Ein Klon, der das erwartete Restriktionsmuster aufweist, wird ausgewählt und als pDPST5 bezeichnet.

Zur Transformation von Hefe wird mit CsCl gereinigte DNA des Expressionsvektors pDPST5 nach der im Maniatis-Handbuch (siehe oben) angegebenen Standardmethode hergestellt. Die S. cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 werden jeweils mit 5 pg Plasmid-DNA nach der Lithiumacetat-Transformationsmethode transformiert (Ito, H. et al, siehe oben). Ura+-Transformanten werden selektiert und einem Screening auf ST-Aktivität unterworfen. Jeweils eine positive Transformante wird ausgewählt und als Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPST5 und Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPST5 bezeichnet.

Beispiel 13: Enzymaktivität vollstândiger in Hefe exprimierter ST 13.1 Herstellung von Zellextrakten

Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPST5-Zellen werden unter Uracil-Selektion auf mit Histidin und Leucin angereicherten Minimal-Hefemedien gezüchtet. Exponentiell wachsende Zeilen (bei einer OD578 von 0,5) oder stationâre Zeilen werden durch Zentrifugieren geemtet, einmal mit 50 mM Imidazolpuffer pH 7,0 (Puffer 1) gewaschen, und bei einer Konzentration entsprechend 0,1-0,2 OD578 wieder in Puffer 1 suspendiert. Die Zeilen werden mechanisch durch kräftiges 4-minütiges Schütteln mit Glasperlen (0,45-0,5 mm Durchmesser) auf einem Vortex-Mixer aufgebrochen, wobei zwischendurch gekühlt wird.

Die ST-Aktivität in den Rohextrakten kann mit dem unten beschriebenen Test gemessen werden. 13.2 Test auf ST-Aktivität

Die ST-Aktivität kann dadurch bestimmt werden, daß die Menge an radioaktiv markierter Sialinsäure, die von der CMP-Sialinsäure auf einen Glycoproteinakzeptor ilbertragen wird, gemessen wird. Nach Beendigung der Reaktion durch Säurefällung wird der Niederschlag iiber Glasfaserfilter (Whatman GFA) filtriert, gründlich mit eiskaltem Ethanol gewaschen und durch Flüssigszintillationszählung (Hesford et al. (1984), Glycoconjugate J. 1, 141-153) auf Radioaklivität getestet. Die Zellextrakte werden 45 Minuten lang in einer Inkubationsmischung getestet, die 37 μΐ Zellextrakt, was ungefähr 0,5 mg Protein entspricht, und 3 μΐ Imidazol-Puffer 50 mMol/1, pH 7,0,50 nMol CMP-N-Acetyl-neuraminsäure (Sigma) mit einem Zusatz von CMP-3H-N-Acetylneuraminsäure (Amersham), um schließlich eine spezifische Aktivität von 7,3 Ci/mol zu erhalten, und 75 μ» Asialo-Fetuin (hergestellt durch 60-minütige Säurehydrolyse mit 0,1 M H2S04 bei 80 °C und anschließende Neutralisierung, Dialyse und Lyophilisierung) enthält. ST-Aktivität fmdet sich in den aus S. cerevisiae BT 150/pDPST5- und H449/pDPST5-Zellen hergestellten Rohextrakten.

Beispiel 14: Konstruktion einer Expressionskassette für lösliche ST (Lysgo-Cys^)

Die als ST(Lys39-Cys406) bezeichnete lösliche ST ist eine N-terminal verkürzte Variante und besteht aus 368 Aminosäuren (SEQ. ID-Nr.4). (a) HepG2-ST-cDNA-Teilsequenz

Plasmid pSIA2 wird mit EcoRI verdaut und ein 1,1 kb EcoRI-EcoRI-Fragment isoliert. (b) Vektor für die Amplifizierung in E. coli

Plasmid pUC18 (Pharmacia) wird an der multiplen Klonierungsstelle mit BamHI und EcoRI verdaut. Das Plasmid wird anschließend mit alkalischer Phosphatase, wie im Maniatis-Handbuch (siehe oben) beschrieben, behandelt, einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und vom Gel in der Form eines 2,7 kb DNA-Fragments isoliert. (c) Der konstitutive PH05-(-173)-Promoter und die SUC2-Signalsequenz

Der Vektor p31/PH05-(-173) RIT (Beispiel 2) wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut. Ein 0,25 kb BamHI-XhoI-Fragment mit dem konstitutiven PH05-(-173)-Promoter und der benachbarten Kodiersequenz für die Invertase-Signalsequenz (inv ss) wird isoliert. Das Fragment wird anschließend nochmals mit Hgal (BioLabs) geschnitten. Die Hgal-Erkennungssequenz fmdet sich auf dem DNA-Antisensestrang. Das Restriktionsenzym schneidet oberhalb der Erkennungssequenz auf solche Weise, daß das 5-überstehende Ende des Antisensestrangs mit dem Ende der Kodiersequenz der Invertase-Signalsequenz übereinstimmt. Das mit BamHI und Hgal geschnittenen 0,24 kb DNA-Fragment enthölt die an die Hefe-Invertase-Signalsequenz gebundene konstitutive PH05-(- 173)-Promotersequenz. (d) Adaptor

Fragment (a) ist an Fragment (c) über eine Adaptorsequenz gebunden, die aus äquimolaren Mengen der synthetischen Oligonucleotide 5' CTGCAAAATTGCAAACCAAGG 3' und 5'AA1TCCTTGGTTTGCAATTT 3' im Falie des Komplementärstrangs hergestellt wird. Die Oligonucleotide werden einander dadurch angelagert, daß sie zuerst auf 95°C erhitzt werden und dann langsam auf 20°C gekiihlt werden. Der angelagerte Adaptor wird im gefrorenen Zustand aufbewahrt.

(e) Konstruktion einer Plasmid psST Für die Ligation werden der linearisierte Vektor (b), das STcDNA-Fragment (a), Fragment (c) mit dem Promoter und der für das Signalpeptid kodierenden Sequenz, und Adaptor (d) in einem molaren Verhältnis von 1: 2: 2: 30-100 verwendeL Die Ligation erfolgt über 18 Stunden in 12 μΐ Ligasepuffer (66 mM Tris-HCl pH 7,5,1 mM Dithioerythritol, 5 mM MgCl2,1 mM ATP) bei 16°C. Mit der Ligationsmischung werden kompetente Zeilen des E. coli-Stamms DH5a wie oben beschrieben transformiert. Plasmid-Minipräparationen werden aus 24 unabhängigen Transformanten hergestellt. Ein einzelner Klon, der nach Charakterisierung mittels Restriktionsanalyse mit vier verschiedenen Enzymen (BamHI, PstI, EcoRI, Xhol, auch in Kombination) das erwartete Restriktionsmuster zeigt, wird als psST bezeichnet.

Die korrekte Sequenz an der Fusionsstelle der für das Invertase-Signalpeptid kodierenden Sequenz mit der für lösliche ST kodierenden cDNA(Lys39-Cys406) wird für Plasmid psST mittels des T7-Sequencing Kit (Pharmacia) und Primer 5'ACGAGGTTAATGGC 3', der bei Position -77 im konstitutiven PH05-(- 173)-Promoter beginnt, bestätigt. DNA-

Sequenz1^: 5' AAA ATA Tct gca aaa ttg caa acc aag gAA 3' 3' TTT TAT AGA GTG ttt aac gtt tgg ttc ctt 5'

Protein Lys Ile Ser Ala Lys Leu Gin Thr Lys Glu 16 19 39 inv ss ST Sequenz

Schnittstelle für Signal-Endopeptidase ^ Kleinbuchstaben bezeichnen die Adaptersequenz

Die Expressionskassette für lösliche ST mit dem konstitutiven PH05-(-173)-Promoter. der für Invertase-Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und der partiellen ST cDNA aus

Plasmid psST kann in der Form eines 1,35 kb Sail (BamHI) - EcoRI-Fragments herausgeschnitten werden. Der Expressionskassette fehlen noch immer die im anschließenden Klonierungsschritt anzufiigenden PH05-Terminatorsequenzen.

Beispiel 15: Konstruktion des Expressionsvektors pDPSTS

Zur Konstruktion des Expressionsvektors für lösliche STCLj^p-Cys^) werden die folgenden Fragmente zusammengefiigt: (a) Vektorteil

Plasmid pDP34 wird verdaut und wie in Beispiel 3 beschrieben vorbehandelt, was ein stumpfendiges Sall-Vektorfragment von 11,8 kb ergibt. (b) Expressionskassette

Plasmid psST wird erst durch Verdauung mit Sail (an der multiplen Klonierungsstelle) linearisiert und dann mit EcoRI teil verdaut. Ein 1,35 kb DNA-Fragment mit dem konstitutiven PH05-(-173)-Promoter, einer für das Hefe-Invertasesignalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und der partiellen ST-cDNA wird isoliert. (c) PH05-Terminatorsequenz

Die PH05-Terminatorsequenz wird aus Plasmid p31 isoliert, welches aus Plasmid p30 wie in EP 100561 beschrieben konstruiert wird. Nach Verdau mit dem Restriktionsenzym Hindlll werden die überstehenden Enden mittels Klenow-Polymerasebehandlung wie oben beschrieben aufgefüllt. Das Plasmid wird dann mit EcoRI verdaut, und ein stumpfendiges EcoRI-Fragment von 0,39 kb mit den PH05-Terminatorsequenzen wird isoliert.

Die Ligation der Fragmente (a), (b) und (c) und die Transformation kompetenter Zeilen des E. coli-Stamms DH5a werden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Plasmide werden aus den erhaltenen Transformanten isoliert und mittels Restriktionsanalyse charakterisiert. Das Plasmid eines Klons mit den richtigen Restriktionsfragmenten wird als pDPSTS bezeichnet.

Beispiel 16: Expression löslicher ST in Hefe

Analog Beispiel 4 werden S. cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 mittels mit CsCl gereinigter DNA des Expressionsvektors pDPSTS transformiert. Ura+-Transformanten werden isoliert und einem Screening auf ST-Aktivität unterworfen. Jeweils eine

Transformante wird ausgewählt und als Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPSTS und Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPSTS bezeichnet. Mit dem in Beispiel 13 beschriebenem Test findet sich ST-Aktivität in den Kulturbrühen beider Transformanten.

Beispiel 17: Konstruktion einer Expressionskassette für lösliche STfLySoy-Cys,^)

Die als ST(Lys27-Cys406) bezeichnete lösliche ST ist eine N-terminal verkürzte Variante, die die gesamte Stammregion und die katalytische Domäne umfaßt. Sie besteht aus 380 Aminosäuren, das sind die Aminosäuren 27 bis 406 der in SEQ ID-Nr. 3 angegebenen Aminosäuresequenz. (a) HepG2-ST-cDNA-Teilsequenz

Plasmid pSIA2 wird mit EcoRI verdaut und ein 1,1 kb EcoRI-EcoRI-Fragment isoliert. (b) Vektor für Amplifikation in U. coli

Plasmid pUC18 (Pharmacia) wird mit BamHI und EcoRI an der multiplen Klonierungsstelle verdaut. Das Plasmid wird anschließend wie im Maniatis-Handbuch beschrieben (siehe oben) mit alkalischer Phosphatase behandelt, einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen und aus dem Gel als 2,7 kb DNA-Fragment isoliert. (c) Der konstitutive PH05-(- 173)-Promoter und die SUC2-Signalsequenz

Der Vektor p31/PH05(-173) RIT (Beispiel 2) wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xhol verdaut. Ein 0,25 kb BamHI-XhoI-Fragment mit dem konstitutiven PH05-(-173)-Promoter und der benachbarten Kodiersequenz für die Invertase-Signalsequenz (inv ss) wird isoliert. Das Fragment wird anschließend nochmals mit Hgal (BioLabs) geschnitten. Die Hgal-Erkennungssequenz findet sich auf dem DNA-Antisensestrang. Das Restriktionsenzym schneidet "stromaufwärts" der Erkennungssequenz auf solche Weise, daß das 5-überstehende Ende des Antisensestrangs mit dem Ende der Kodiersequenz der Invertase-Signalsequenz übereinstimmt. Das mit BamHI und Hgal geschnittenen 0,24 kb DNA-Fragment enthält die an die Hefe-Invertase-Signalsequenz gebundene PH05-C- 173)-Promotersequenz. (d) Adaptor

Fragment (a) ist an Fragment (c) über eine Adaptorsequenz gebunden, die aus äquimolaren Mengen der synthetischen Oligonucleotide 5' CTGCAAAGGAAAA GAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGG 3', und 5 ' AATTCCTTGTTGC A ΑΊΤΤΑ A AGG A ATC ATAGTA ACTCCCTTTCTTCTTTTCCT T 3' im Falie des Komplementärstrangs hergestellt wird. Die Oligonucleotide werden einander dadurch angelagert, daß sie zuerst auf 95°C erhitzt werden und dann langsam auf 20°C gekühlt werden. Der angelagerte Adaptor wird im gefrorenen Zustand aufbewahrt. (e) Konstruktion des Plasmids psSTl Für die Ligation werden der linearisierte Vektor (b), das STcDNA-Fragment (a), Fragment (c) mit dem Promoter und der für das Signalpeptid kodierenden Sequenz, und Adaptor (d) in einem molaren Verhältnis von 1: 2: 2: 30-100 verwendet. Die Ligation erfolgt über 18 Stunden in 12 μΐ Ligasepuffer (66 mM Tris-HCl pH 7,5,1 mM Dithioerythritol, 5 mM MgCl2,1 mM ATP) bei 16°C. Mit der Ligationsmischung werden kompetente Zeilen des U. coli-Stamms DH5a wie oben beschrieben transformiert. Plasmid-Minipräparationen werden aus 24 unabhängigen Transformanten hergestellt. Ein einzelner Klon, der nach Charakterisierung mittels Restriktionsanalyse mit vier verschiedenen Enzymen (BamHI, PstI, EcoRI, Xhol, auch in Kombination) das erwartete Restriktionsmuster zeigt, wird als psSTl bezeichnet.

Die korrekte Sequenz an der Fusionsstelle der für das Invertase-Signalpeptid kodierenden Sequenz mit der für lösliche ST kodierenden cDNA(Lys27-Lys406) wird für Plasmid psSTl mittels des T7-Sequencing Kit (Pharmacia) und Primer 5'AGTCGAGTAGTATGGC 3', der bei Position -77 im konstitutiven PH05-(-173)-Promoter beginnt, bestätigt. DNA-

Sequenz1^: 5' AAA ATA Tct gca aag gaa aag aag aaa ggg 3' 3' TTT TAT AGA GTG ttc ctt ttc ttc ttt ccc 5'

Protein Lys Ile Ser Ala Lys Glu Lys Lys Lys Gly 16 19 27 inv ss ST Sequenz

Schnittstelle für Signal-Endopeptidase ^ Kleinbuchstaben bezeichnen die Adaptorsequenz

Die Expressionskassette für lösliche ST(Lys27-Cys406) mit dem konstitutiven PH05-(- 173)-Promoter, der für Invertase-Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und der partiellen ST cDNA aus Plasmid psSTl können in der Form eines 1,35 kb Sali (BamHI) -EcoRI-Fragments herausgeschnitten werden. Der Expressionskassette fehlen noch immer die im anschließenden Klonierungsschritt anzufügenden PH05-Terminatorsequenzen.

Beispiel 18: Konstruktion des Expressionsvektors pDPSTSl

Zur Konstruktion des Expressionsvektors für lösliche ST (Lys27-Cys406) werden die folgenden Fragmente zusammengefügt: (a) Vektorteil

Plasmid pDP34 wird verdaut und wie in Beispiel 3 beschrieben vorbehandelt, was ein stumpfendiges Sall-Vektorfragment von 11,8 kb ergibt. (b) Expressionskassette

Plasmid psSTl wird erst durch Verdau mit Sali (an der multiplen Klonierungsstelle) linearisiert und dann mit EcoRI teilverdaut. Ein 1,35 kb DNA-Fragment mit dem konstitutiven PH05-(-173)-Promoter, einer für das Hefe-Invertasesignalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und der partiellen ST-cDNA wird isoliert. (c) PH05-Terminatorsequenz

Die PH05-Terminatorsequenz wird aus Plasmid p31 isoliert, welches ausgehend von Plasmid p30 wie in EP 100561 beschrieben konstruiert wird. Nach Verdau mit dem Restriktionsenzym Hindïïl werden die überstehenden Enden mittels Klenow-Polymerasebehandlung wie oben beschrieben aufgefüllt. Das Plasmid wird dann mit EcoRI verdaut, und ein stumpfendiges EcoRI-Fragment von 0,39 kb mit den PH05-Terminatorsequenzen wird isoliert.

Die Ligation der Fragmente (a), (b) und (c) und die Transformation kompetenter Zeilen von U. coli-Stamm DH5a werden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Aus den erhaltenen Transformanten werden Plasmide isoliert und mittels Restriktionsanalyse charakterisiert. Das Plasmid eines Klons mit den richtigen Restriktionsfragmenten wird als pDPSTSl bezeichnet.

Beispiel 19: Expression löslicher ST(Lvs27-Cvs/106) in Hefe Analog Beispiel 4 werden S. cerevisiae-Stämme BT 150 und H 449 mittels mit CsCl gereinigter DNA des Expressionsvektors pDPSTSl transformiert. Ura+-Transformanten werden isoliert und einem Screening auf ST-Aktivität unterworfen. Jeweils eine

Transformante wird ausgewählt und als Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPSTSl und Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPSTSl bezeichnet. Mit dem in Beispiel 13 beschriebenem Test findet sich ST-Aktivität in den Kulturbrühen beider Transformanten.

Beispiel 20: Klonieren der FTcDNA aus der menschlichen HL 60-Zellinie Basierend auf der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Goelz, S.E. et al. (1990) Cell 63, 1349-1356) für ELFT (ELAM-1 -Liganden-Fucosyltransferase), die für a(l-3)-Fucosyltransferase kodiert, werden die folgenden Oligonucleotid-Primer entwickelt, um ein DNA-Fragment, das das offene Leseraster der ELFT-cDNA enthält, mittels PCR-Technik zu amplifizieren: 5'-CAGCGCTGCCTGTTCGCGCCAT-3' (ELFT-1B) und 5'-GG AG ATGC AC AGTAG AGG ATCA-3 ' (ELFT-2B). ELFT-1B fungiert als Primer bei den Basenpaaren 38-59 der veröffentlichten Sequenz, und ELFT-2B bei bp 1347-1326 im Antisensestrang. Mit diesen Primern wird ein 1,3 kb Fragment unter Verwendung des Perkin-Elmer Cetus Taq-Polymerase-Kits amplifiziert. Das Fragment wird aus frischer HL60-cDNA in der Gegenwart von 5% DMSO und 2 mM MgCl2 amplifiziert, wobei der Zyklus folgendermaßen ist: 95°C 5 min 25x (1 min 95°C, 1 min 60°C, 1,5 min 72°C) lOx (1 min 95°C, 1 min 60°C, 1,5 min + 15 sec/Zyklus 72°C).

In der Agarose-Gelelektrophorese zeigt sich eine deutliche 1,3 kb Bande, welche bei Verdau mit Smal oder Apal das von der publizierten Sequenz vorhergesagte Muster aufweist. Die 1,3 kb Bande wird mittels eines Gene-clean Kits (Bio 101) gereinigt und in den Vektor pCRIOOO (Invitrogen) subkloniert. Ein Einzelklon mit dem richtigen 1,3 kb Insert wird ausgewählt und als BRB.ELFT/pCR1000-13 bezeichnet. Die FTcDNA wird in den Vektor so eingefügt, daß sie bezüglich des T7-Promoters gegensinnig orientiert ist. Das offene Leseraster der FTcDNA wird vollständig sequenziert und ist mit der veröffentlichten Sequenz identisch (SEQ ID-Nr.5)

Beispiel 21: Konstruktion von Plasmiden für induzierbare und konstitutive Expression löslicher FTfArg^-Arg^) in Hefe Lösliche FT(Arg62-Arg405) wird von der FT-cDNA, die bei Nucleotidposition 241 (Nrul -Restriktionsstelle) beginnt, exprimiert, wobei die für den cytoplasmatischen Schwanz und die membranumfassende Domäne kodierende Region fehlt. (siehe Sequenz ID-Nr. 5).

Plasmid BRB.ELFT/pCR1000-13 wird mit Hindlïï verdaut, welches in der multiplen

Klonierungsregion 3' des FT-cDNA-Inserts schneidet. Die kohäsiven Enden werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase in stumpfe Enden umgewandelt. Xhol-Linker (5' CCTCGAGG 3', Biolabs) werden mit Kinase behandelt, angelagert, und mit den stumpfen Enden des Plasmids ligiert, wobei ein 100-facher molarer Überschuß an Linkem verwendet wird. Überschüssige Linker werden durch Isopropanol-Fällung der DNA entfemt, und diese wird weiter mit Xhol und Nrul verdaut (Schnitt an Nucleotidposition 240 der FT-cDNA nach Sequenz ID-Nr. 5). Das 1,1 kb Nrul-Xhol-Fragment (a) enthält die FT-cDNA Sequenz ohne die für den cytoplasmatischen Schwanz und die membranumfassende Domäne kodierende Region bis zu Aminosäure 61.

Die Plasmide p31 RIT12 und p31/PH05(-173)RIT (siehe Beispiel 2) werden jeweils mit Sali und Xhol verdaut. Die 0,9 kb bzw. 0,5 kb Fragmente werden isoliert und mit Hgal geschnitten. Die entstehenden kohäsiven Enden werden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt. Die so hergestellten stumpfen Enden stimmen mit dem 3'-Ende der kodierenden Sequenz für die Hefe-Invertase-Signalsequenz überein. Anschließendes Schneiden mit BamHI ergibt ein BamHI-"blunt end" Fragment (b) mit 596 bp, welches den induzierbaren PH05-Promoter und die Invertase-Signalsequenz mit ihrem eigenen ATG Oder ein BamHI-"blunt end" Fragment (c) mit 234 bp mit dem kurzen konstitutiven PH05(-173)-Promoter und der Invertase-Signalsequenz enthält.

Plasmid p31RIT12 wird mit der Restriktionsendonuclease Sali linearisiert. Teilverdau mit Hindlïï in der Gegenwart von Ethidiumbromid ergibt ein 1 kb SalI-HindlII-Fragment, das die 276 bp SalI-BamHI-pBR322-Sequenz, den 534 bp Promoter der sauren Phosphatase von Hefe PH05, die Hefe-Invertase-Signalsequenz (die für 19 Aminosäuren kodiert) und den PH05-Transkriptionsterminator enthält. Das 1 kb Sall-HindïII-Fragment von p31RIT12 wird in den Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor pJDB207 (Beggs, J.D. in: Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, Seiten 383-389), kloniert, der zuvor mit Sail und Hindlïï geschnitten wurde. Das entstandene Plasmid mit dem 1 kb Insert wird als pJDB207/PH05-RIT12 bezeichnet.

Plasmid pJDB207/PH05-RIT12 wird mit BamHI und Xhol verdaut, und das große 6,8 kb BamHI-XhoI-Fragment (d) wird isoliert. Dieses Fragment enthält alle Sequenzen des pJDB207-Vektors und den PH05-Transkriptionsterminator.

Das BamHI-"blunt end" Fragment (b) mit 596 bp, das 1,1 kb Nrul-Xhol-Fragment (a) und das 6,8 kb XhoI-BamHI-Vektorfragment (d) werden unter Standardbedingungen für die Ligation stumpier Enden ligiert. Kompetente E. coli-HB 101 -Zeilen werden mit aliquoten Teilen der Ligationsmischung transformiert. Plasmid-DNA aus ampicillinresistenten Koloniën wird durch Restriktionsverdau analysiert. Ein Einzelklon mit dem richtigen Expressionsplasmid wird als pJDB207/PH05-I-FT bezeichnet.

Die Ligation der DNA-Fragmente (c), (a) und (d) ergibt das Expressionsplasmid pJDB207/PH05(-173)-I-FT. Die Expressionskassetten dieser Plasmide enthalten die Kodiersequenz der Invertase-Signalsequenz, die im Leserahmen mit der der löslichen a(l-3)Fucosyltransferase fusioniert ist, welche unter der Kontrolle des induzierbaren PH05- beziehungsweise konstitutiven PH05(-173)-Promoters exprimiert wird. Die Expressionskassetten werden in den Hefe-U. coli-Shuttlevektor pJDB207 zwischen die BamHI- und HindlII-Restriktionsstellen kloniert.

Die Nucleotidsequenz an der Fusionsstelle zwischen Invertase-Signalsequenz und der für lösliche FT kodierenden cDNA wird durch DNA-Sequenzierung an einer Doppelstrang-Plasmid-DNA bestätigt, wobei der Primer 5' AGTCGAGGTTAGTATGGC 3' verwendet wird, der von Position -77 bis -60 die Nucleotidsequenz des PH05- und des PH05(-173)-Promoters aufweist. Der richtige Anschluß sieht folgendermaßen aus: DNA-

Sequenz: 5' AAA ATA TCT GCA CGA CCG GTG 3' 3' TTT TAT AGA GTG GCT GGC CAC 5'

Protein Lys Ile Ser Ala Arg Pro Val 16 19 62 inv ss FT Sequenz

Schnittstelle für Signal-Endopeptidase

Beispiel 22: Konstruktion von Plasmiden für die induzierbare und konstitutive Expression von membrangebundener FT in Hefe

Diese Konstrukte verwenden die Kodiersequenz der FT-cDNA mit ihrem eigenen ATG. Die Nucleotidsequenz unmittelbar stromaufwärts des ATG ist jedoch wegen ihres hohen G-C-Gehalts relativ ungünstig für Expression in Hefe. Diese Region wurde durch eine A-T-reiche Sequenz mittels PCR-Methoden ersetzt. Zugleich wird eine EcoRI-Restriktionsstelle an den neuen Nucleotidpositionen -4 bis -9 eingeführt.

Tabelle 6: PCR-Primer

Primer Sequenz (5' bis 3')^ entspricht FT cDNANukleotid FT1 cqaqaattcataATGGGGGCACCGTGGGGC 58-75 FT2 ccqctcqaqGAGCGCGGCTTCACCGCTCG 1285-1266 1) Großbucbstaben bedeuten Nucleotide aus der FT, Kleinbuchstaben sind zusätzliche neue Sequenzen, Restriktionsstellen sind unterstrichen, und "Start"- und "Stop"-Codons sind fettgedruckt.

Mittels PCR-Standardbedingungen wird die FT-cDNA mit den Primern FT1 und FT2 (siehe Tabelle 6) in 30 Zyklen von DNA-Synthese (Taq-DNA-Polymerase, Perkin-Elmer, 5 U/μΙ, eine Minute bei 72°C), Denaturierung (10 Sekunden bei 93°C) und Anlagern (40 Sekunden bei 60°C) amplifiziert. Das entstandene 1,25 kb DNA-Fragment wird durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt, und dann mit EcoRI, Xhol und Nrul verdaut. Das 191 bp EcoRI-NruI-Fragment (e) wird auf einem präparativem 4%-igem Nusieve 3:1 Agarosegel (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) in Tris-Boratpuffer pH 8,3 isoliert, aus dem Gel eluiert und mit Ethanol gefällt. Fragment (e) enthält den 5'-Teil des fiir die Aminosäuren 1 bis 61 kodierenden FT-Gens. Die DNA verfiigt über eine 5'-Verlängerung mit einer EcoRI-Schnittstelle wie im PCR-Primer FT1.

Die Plasmide p31RIT12 und p31/PH05(-173)RIT werden jeweils mit EcoRI und Xhol verdaut. Die großen Vektorfragmente (f bzw. g) werden auf einem präparativen 0,8 %-tigen Agarosegel isoliert, eluiert und gereinigt. Das 4,1 kb XhoI-EcoRI-Fragment (f) enthält den auf pBR322 basierenden Vektor, den 534 bp PH05-Promoter (3' EcoRI-Stelle) und den 131 bp PH05-Transkriptionsterminator (5' Xhol-Stelle). Das 3,7 kb XhoI-EcoRI-Fragment (g) unterscheidet sich lediglich durch den kurzen konstitutiven 172 bp PH05(-173)-Promoter (3' EcoRI-Stelle) anstelle des vollständigen PH05-Promoters.

Das 191 bp EcoRI-NruI-Fragment (e), das 1,1 kb Nrul-Xhol-Fragment (a) und das 4,1 kb

XhoI-EcoRI-Fragment (f) werden ligiert. Kompetente E. coli-HB 101-Zeilen werden mit 1 μΐ Aliquot der Ligationsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA ampicillinresistenter Koloniën wird analysiert. Plasmid-DNA eines Einzelklons wird als p31R/PH05-ssFT bezeichnet

Die Ligation der DNA-Fragmente (.e), (a) und (g) ergibt Plasmid p31R/PH05(-173)-ssFT. Diese Plasmide enthalten die kodierende Sequenz der membrangebundenen FT unter der Kontrolle des induzierbaren PH05- bzw. konstitutiven PH05(- 173)-Promoters.

Beispiel 23: Klonierung der FT-Expressionskassette in pDP34:

Die Plasmide p31R/PH05-ssFT und p31R/PH05(-173)-ssFT werden mit Hindlïï verdaut, die am 3' des PH05-Transkriptionsterminators schneidet. Nach einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase wird die DNA mit Sali verdaut. Die 2,3 kb und 1,9 kb Sall-"bluntend" Fragmente werden jéweils isoliert.

Die Plasmide pJDB207/PH05-I-FT und pJDB207/PH05(-173)-I-FT werden mit Hindin in der Gegenwart von 0,1 mg/ml Ethidiumbromid (urn ein Schneiden an einer zusätzlichen Hindlïï-Stelle in der Invertase-Signalsequenz zu vermeiden) teilverdaut und anschließend mit Klenow-DNA-Polymerase und Sali wie oben behandelt. Ein 2,1 kb bzw. 1,8 kb Fragment wird isoliert.

Jedes der 4 DNA-Fragmente wird mit dem stumpfendigen 11,8 kb Sall-Vektorfragment von pDP34 ligiert (siehe Beispiel 3). Nach Transformation kompetenter E coli-HB101-Zellen und Analyse der Plasmid-DNA einzelner Transformanten werden 4 richtige Expressionsplasmide als pDP34/PH05-I-FT; pDP34/PH05(-173)-I-FT; pDP34R/PH05-ssFT und pDP34R/PH05(-173)-ssFT bezeichnet.

Die S. cerevisiae-Stämme BT150 und H449 werden mit jeweils 5 pg der 4 Expressionsplasmide (oben) analog Beispiel 4 transformiert. Einzelne transformierte Hefezellkolonien werden selektiert und folgendermaßen bezeichnet:

Saccharomyces cerevisiae " " BT150/pDP34/PH05-I-FT; " " BT150/pDP34/PH05(-173)-I-FT; " " BT150/pDP34R/PH05-ssFT; " " BT150/pDP34R/PH05(-173)-ssFT; " " H449/pDP34/PH05-I-FT ; " " H449/pDP34/PH05(-173)-I-FT; " " H449/pDP34R/PH05-ssFT;

" " H449/pDP34R/PH05(- 173)-ssFT

Die Fermentation und Herstellung von Zellextrakten wird gemäß Beispiel 5 durchgeführt. Mit einem Test analog dem von Goetz et al. (oben) beschriebenen wird FT-Aktivität in den Rohextrakten aus BT150/pDP34R/PH05-ssFT, BT150/pDP34R/PH05(-173)-ssFT, H449/pDP34R/PH05-ssFT und H449/pDP34R/PH05(-173)-ssFT und in den Kulturbrühen von H449/pDP34/PH05-I-FT, H449/pDP34/PH05(-173)-I-FT, BT150/pDP34/PH05-I-FT und BT150/pDP34/PH05(-173)-I-FT gefunden.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismenstämme wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 16, D-3300 Braunschweig, hinterlegt (angegeben sind die Hinterlegungsdaten und Eingangsnummern):

Escherichia coli JM109/pDP34:14, März 1988; DSM 4473 Escherichia coli HB101/p30:23. Oktober 1987; DSM 4297 Escherichia coli HB101/p31R: 19. Dezember 1988; DSM 5116 Saccharomyces cerevisiae H 449:18. Februar 1988; DSM 4413 Saccharomvces cerevisiae BT 150: 23. Mai 1991; DSM 6530 SEOUENZPROTQKOLL SEP ID-Nr, 1 SEQUENZTYP: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 1265 bp . STRÄNGIGKEIT: doppelt TOPOLOGIE: linear MOLEKÜLTYP: rekombinant UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Plasmid p4AD113 aus E. coli DH5oc/p4AD113 MERKMALE: von 6 bis 1200 bp Für HeLa-Zellen- Galactosyl transférase kodierende cDNA-Sequenz von 1 bis 6 bp EcoRI-Stelle von 497 bis 504 bp Notl-Stelle von 1227 bis 1232 bp EcoRI-Stelle von 1236 bis 1241 bp EcoRV-Stelle von 1243 bis 1248 bp Bglïï-Stelle EIGENSCHAFTEN:

EcoRI-HindlE-Fragment aus Plasmid p4ADl 13 mit für vollständige Galactosyltransférase kodierender HeLa-Zellen-cDNA (EC2.4.1.22) GAATTC ATG AGG CTT CGG GAG CCG CTC CTG AGO GGC AGC 39

Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser 5 10 GCC GCG ATG CCA GGC GCG TCC CTA CAG CGG GCC TGC CGC 78

Ala Ala Met Pro Gly Ala Ser Leu Gin Arg Ala Cys Arg 15 20 CTG CTC GTG GCC GTC TGC GCT CTG CAC CTT GGC GTC ACC 117

Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr 25 30 35 CTC GTT TAC TAC CTG GCT GGC CGC GAC CTG AGC CGC CTG 156

Leu Val iyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu 40 45 50 CCC CAA CTG GTC GGA GTC TCC ACA CCG CTG CAG GGC GGC 195

Pro Gin Leu Val Gly Val -Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly 55 60 TCG AAC AGT GCC GCC GCC ATC GGG CAG TCC TCC GGG GAG 234

Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gin Ser Ser Gly Glu 65 70 75 CTC CGG ACC GGA GGG GCC CGG CCG CCG CCT CCT CTA GGC 273

Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly 80 ' 85 GCC TCC TCC CAG CCG CGC CCG GGT GGC GAC TCC AGC CCA 312

Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 90 95 100 GTC GTG GAT TCT GGC CCT GGC CCC GCT AGC AAC TTG ACC 351

Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr 105 110 115 TCG GTC CCA GTG CCC CAC ACC ACC GCA CTG TCG CTG CCC 390

Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 120 125 GCC TGC CCT GAG GAG TCC CCG CTG CTT GTG GGC CCC ATG 429

Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met 120 135 140 CTG ATT GAG TTT AAC ATG CCT GTG GAC CTG GAG CTC GTG 468

Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val 145 150 GCA AAG CAG AAC CCA AAT GTG AAG ATG GGC GGC CGC TAT 507

Ala Lys Gin Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr 155 160 165 GCC CCC AGG GAC TGC GTC TCT CCT CAC AAG GTG GCC ATC 546

Ala Pro Arg Asp Cys Val -Ser Pro His Lys Val Ala lie 170 175 180 ATC ATT CCA TTC CGC AAC CGG CAG GAG CAC CTC AAG TAC 585 lie lie Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu Lys Tyr 185 190 TGG CTA TAT TAT TTG CAC CCA GTC CTG CAG CGC CAG CAG 624

Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin 195 200 205 CTG GAC TAT GGC ATC TAT GTT ATC AAC CAG GCG GGA GAC 663

Leu Asp iyr Gly lie Tyr Val lie Asn Gin Ala Gly Asp 210 215 ACT ATA TTC AAT CGT GCT AAG CTC CTC AAT GTT GGC TTT 702

Thr lie Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe 220 225 230 CAA GAA GCC TTG AAG GAC TAT GAC TAC ACC TGC TTT GTG 741

Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val 235 240 245 TTT AGT GAC GTG GAC CTC ATT CCA ATG AAT GAC CAT AAT 780

Phe Ser Asp Val Asp Leu lie Pro Met Asn Asp His Asn 250 255 GCG TAC AGG TGT TTT TCA CAG CCA CGG CAC ATT TCC GTT 819

Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His lie Ser Val 260 265 270 GCA ATG GAT AAG TTT GGA TTC AGC CTA CCT TAT GTT CAG 858

Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin 275 280 TAT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA AGT AAA CAA CAG TTT 897

Tyr Phe Gly Gly Val Ser -Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 285 290 295 CTA ACC ATC AAT GGA TTT CCT AAT AAT TAT TGG GGC TGG 93 6

Leu Thr lie Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 300 305 310 GGA GGA GAA GAT GAT GAC ATT TTT AAC AGA TTA GTT TTT 975

Gly Gly Glu Asp Asp Asp lie Phe Asn Arg Leu Val Phe 315 ' 320 AGA GGC ATG TCT ATA TCT CGC CCA AAT GCT GTG GTC GGG 1014

Arg Gly Met Ser lie Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 325 330 335 AGG TGT CGC ATG ATC CGC CAC TCA AGA GAC AAG AAA AAT 1053

Arg Cys Arg Met lie Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn 340 345 GAA CCC AAT CCT CAG AGG TTT GAC CGA ATT GCA CAC ACA 1092

Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg lie Ala His Thr 350 355 360 AAG GAG ACA ATG CTC TCT GAT GGT TTG AAC TCA CTC ACC 1131

Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 365 370 375 TAC CAG GTG CTG GAT GTA CAG AGA TAC CCA TTG TAT ACC 1170

Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 380 385 CAA ATC ACA GTG GAC ATC GGG ACA CCG AGC TAGGACTTTT 1210

Gin Ile Thr Val Asp lie Gly Thr Pro Ser 390 395 GGTACAGGTA AAGACTGAAT TCATCGATAT CTAGATCTCG 1250 AGCTCGCGAA AGCTT . 1265 SEP ID-Nr. 2 SEQUENZTYP: Protein SEQUENZLÄNGE: 357 Aminosäuren MOLEKÜLTYP: C-terminales Fragment vollständiger HeLa-Zellen-Galactosyltransferase · EIGENSCHAFTEN: Lösliche Galactosyltransférase (EC 2.4.1.22) aus HeLa-Zellen

Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu 5

Pro Gin Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly 10 15 ' 20

Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gin Ser Ser Gly Glu 25 30 35

Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly 40 45

Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 50 55 60

Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr 65 70

Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 75 80 85

Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met 90 95 100

Leu lie Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val 105 110

Ala Lys Gin Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr 115 120 125

Ala Pro Arg Asp Cys Val.Ser Pro His Lys Val Ala Ile 130 - 135

Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu Lys Tyr 140 145 150

Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin 155 160 165

Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gin Ala Gly Asp 170 ' 175

Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe 180 185 190

Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val 195 200

Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 205 210 215

Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val 220 225 230

Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin 235 240

Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 245 250 255

Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 260 265

Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe 270 275 280

Arg Gly Met Ser lie Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 285 · 290 295

Arg Cys Arg Met lie Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn 300 305

Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg lie Ala His Thr 310 315 320

Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 325 ' 330 iyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 335 340 345

Gin lie Thr Val Asp lie Gly Thr Pro Ser 350 355 SEP ID-Nr. 3 SEQUENZTYP: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 1246 bp STRÄNGIGKEIT: doppelt TOPOLOGIE: linear MOLEKÜLTYP: rekombinant UNMUTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT : Plasmid pSIA2 aus E. coli DH5oc/pSIA2 MERKMALE: von 15 bis 1232 bp Fur HepG2-Zellen-Sialyltransfera$e kodierende cDNA-Sequenz von 1 bis 6 bp Pstl-Stelle von 6 bis 11 bp EcoRI-Stelle von 144 bis 149 bp EcoRI-Stelle von 1241 bis 1246 bp BamHI-Stelle EIGENSCHAFTEN:

Pstl-BamHI-Fragment aus Plasmid pSIA2 mit fiir vollständige Sialyltransferase kodierender HepG2-cDNA (EC 2.4.99.1) CTGCAGAATT CAAA ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA 38

Met lie His Thr Asn Leu Lys Lys 5 AAG TTC AGC TGC TGC GTC CTG GTC TTT CTT CTG TTT GCA 77

Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val Phe Leu Leu Phe Ala 10 15 20 GTC ATC TGT GTG TGG AAG GAA AAG AAG AAA GGG AGT TAC 116

Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly Ser Tyr 25 30 TAT GAT TCC TTT AAA TTG CAA ACC AAG GAA TTC CAG GTG 155

Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Val 35 40 45 TTA AAG AGT CTG GGG AAA TTG GCC ATG GGG TCT GAT TCC 194

Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser 50 55 60 CAG TCT GTA TCC TCA AGC -AGC ACC CAG GAC CCC CAC AGG 233

Gin Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg 65 70 GGC CGC CAG ACC CTC GGC AGT CTC AGA GGC CTA GCC AAG 272

Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys 75 80 85 GCC AAA CCA GAG GCC TCC TTC CAG GTG TGG AAC AAG GAC 311

Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Val Trp Asn Lys Asp 90 95 AGC TCT TCC AAA AAC CTT ATC CCT AGG CTG CAA AAG ATC 350

Ser Ser Ser Lys Asn Leu lie Pro Arg Leu Gin Lys Ile 100 105 110 TGG AAG AAT TAC CTA AGC ATG AAC AAG TAC AAA GTG TCC 389

Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser 115 120 125 TAC AAG GGG CC A GGA CC A GGC ATC AAG TTC AGT GCA GAG 428

Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu 130 135 GCC CTG CGC TGC CAC CTC CGG GAC CAT GTG AAT GTA TCC 467

Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser 140 145 150 ATG GTA GAG GTC ACA GAT TTT CCC TTC AAT ACC TCT GAA 506

Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 155 160 TGG GAG GGT TAT CTG CCC AAG GAG AGC ATT AGG ACC AAG 545

Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 165 170 175 GCT GGG CCT TGG GGC AGG -TGT GCT GTT GTG TCG TCA GCG 584

Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 180 185 190 GGA TCT CTG AAG TCC TCC CAA CTA GGC AGA GAA ATC GAT 623

Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp 195 200 GAT CAT GAC GCA GTC CTG AGG TTT AAT GGG GCA CCC ACA 662

Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr 205 210 215 GCC AAC TTC CAA CAA GAT GTG GGC ACA AAA ACT ACC ATT 701

Ala Asn Phe Gin Gin Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 220 225 CGC CTG ATG AAC TCT CAG TTG GTT ACC ACA GAG AAG CGC 740

Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg 230 235 240 TTC CTC AAA GAC AGT TTG TAC AAT GAA GGA ATC CTA ATT 779

Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 245 250 255 GTA TGG GAC CCA TCT GTA TAC CAC TCA GAT ATC CCA AAG 818

Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp lie Pro Lys 260 265 TGG TAC CAG AAT CCG GAT TAT AAT TTC TTT AAC AAC TAC 857

Trp Tyr Gin Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr 270 275 280 AAG ACT TAT CGT AAG CTG CAC CCC AAT CAG CCC TTT TAC 896 Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gin Pro Phe Tyr 285 290 ATC CTC AAG CCC CAG ATG -CCT TGG GAG CTA TGG GAC ATT 935 Ile Leu Lys Pro Gin Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp lie 295 300 305 CTT CAA GAA ATC TCC CCA GAA GAG ATT CAG CCA AAC CCC 974 Leu Gin Glu lie Ser Pro Glu Glu lie Gin Pro Asn Pro 310 315 320 CCA TCC TCT GGG ATG CTT GGT ATC ATC ATC ATG ATG ACG 1013 Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly lie lie lie Met Met Thr 325 330 CTG TGT GAC CAG GTG GAT ATT TAT GAG TTC CTC CCA TCC 1052 Leu Cys Asp Gin Val Asp lie Tyr Glu Phe Leu Pro Ser 335 340 345 AAG CGC AAG ACT GAC GTG TGC TAC TAC TAC CAG AAG TTC 1091 Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe 350 355 TTC GAT AGT GCC TGC ACG ATG GGT GCC TAC CAC CCG CTG 1130 Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr His Pro Leu 360 365 370 CTC TAT GAG AAG AAT TTG GTG AAG CAT CTC AAC CAG GGC 1169 Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gin Gly 375 380 385 ACA GAT GAG GAC ATC TAC CTG CTT GGA AAA GCC ACA CTG 1208 Thr Asp Glu Asp lie Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 390 395 CCT GGC TTC CGG ACC ATT CAC TGC TAAGCACAGG ATCC 1246

Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 400 405 SEP ID-NR. 4 SEQUENZTYP: Protein SEQUENZLÄNGE: 368 Aminosäuren MOLEKÜLTYP: C-terminales Fragment von vollständiger Sialyltransferase EIGENSCHAFTEN: Lösliche Sialyltransferase (EC 2.4.99.1) aus menschlichen HepG2-Zellen

Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Val 5

Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser 10 15 20

Gin Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg 25 30 35

Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys 40 45

Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Val Trp Asn Lys Asp 50 55 60

Ser Ser Ser Lys Asn Leu lie Pro Arg Leu Gin Lys lie 65 70

Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser 75 80 85 lyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly lie Lys Phe Ser Ala Glu 90 95 100

Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser 105 110

Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 115 120 125

Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 130 135

Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 140 145 150

Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp 155 160 165

Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr 170 175

Ala Asn Phe Gin Gin Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 180 185 190

Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg 195 200

Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 205 210 215

Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys 220 225 230

Trp Tyr Gin Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr 235 240

Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gin Pro Phe Tyr 245 250 255

Ile Leu Lys Pro Gin Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile 260 265

Leu Gin Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gin Pro Asn Pro 270 275 - 280

Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr 285 290 295

Leu Cys Asp Gin Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser 300 305

Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe 310 315 320

Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr Hi s Pro Leu 325 330

Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gin Gly 335 340 345

Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 350 355 360

Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 365 SEP ID-NR. 5 SEQUENZTYP: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 1400 bp STRÄNGIGKEIT: doppelt TOPOLOGIE: linear MOLEKÜLTYP: rekombinant UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: BRB.ELFT/pCR1000-13 MERKMALE:

Von 58 bis 1272 bp fiir menschliche a(l-3) Fucosyltransferase kodierende cDNA-Sequenz von 238 bis 243 bp Nrul-Stelle

EIGENSCHAFTEN: Für vollständige α(1-3) Fucosyltransferase kodierende cDNA CGCTCCTCCA CGCCTGCGGA CGCGTGGCGA GCGGAGGCAG CGCTGCCTGT 50 TCGCGCC ATG GGG GCA CCG TGG GGC TCG CCG ACG GCG GCG 90

Met Gly Ala Pro Trp Gly Ser Pro Thr Ala Ala 5 10 GCG GGC GGG CGG CGC GGG TGG CGC CGA GGC CGG GGG CTG 129

Ala Gly Gly Arg Arg Gly Trp Arg Arg Gly Arg Gly Leu 15 20 CCA TGG ACC GTC TGT GTG CTG GCG GCC GCC GGC TTG ACG 168

Pro Trp Thr Val Cys Val Leu Ala Ala Ala Gly Leu Thr 25 30 35 TGT ACG GCG CTG ATC ACC TAC GCT TGC TGG GGG CAG CTG 207

Cys Thr Ala Leu lie Thr Tyr Ala Cys Trp Gly Gin Leu 40 45 50 CCG CCG CTG CCC TGG GCG TCG CCA ACC CCG TCG CGA CCG 246

Pro Pro Leu Pro Trp Ala Ser Pro Thr Pro Ser Arg Pro 55 60 GTG GGC GTG CTG CTG TGG TGG GAG CCC TTC GGG GGG CGC 285

Val Gly Val Leu Leu Trp Trp Glu Pro Phe Gly Gly Arg 65 70 75 GAT AGC GCC CCG AGG CCG CCC CCT GAC TGC CGG CTG CGC 324

Asp Ser Ala Pro Arg Pro Pro Pro Asp Cys Arg Leu Arg 80 85 TTC AAC ATC AGC GGC TGC CGC CTG CTC ACC GAC CGC GCG 363

Phe Asn lie Ser Gly Cys Arg Leu Leu Thr Asp Arg Ala 90 95 100 TCC TAC GGA GAG GCT CAG GCC GTG CTT TTC CAC CAC CGC 402

Ser Tyr Gly Glu Ala Gin Ala Val Leu Phe His His Arg 105 110 115 GAC CTC GTG AAG GGG CCC CCC GAC TGG CCC CCG CCC TGG 441

Asp Leu Val Lys Gly Pro Pro Asp Trp Pro Pro Pro Trp 120 125 GGC ATC CAG GCG CAC ACT GCC GAG GAG GTG GAT CTG CGC 480

Gly lie Gin Ala His Thr Ala Glu Glu Val Asp Leu Arg 130 135 140 GTG TTG GAC TAC GAG GAG GCA GCG GCG GCG GCA GAA GCC 519

Val Leu Asp Tyr Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala 145 150 CTG GCG ACC TCC AGC CCC AGG CCC CCG GGC CAG CGC TGG 558

Leu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Pro Gly Gin Arg Trp 155 160 165 GTT TGG ATG AAC TTC GAG TCG CCC TCG CAC TCC CCG GGG 597

Val Trp Met Asn Phe Glu Ser Pro Ser His Ser Pro Gly 170 175 180 CTG CGA AGC CTG GCA AGT AAC CTC TTC AAC TGG AC G CTC 636

Leu Arg Ser Leu Ala Ser Asn Leu Phe Asn Trp Thr Leu 185 190 TCC TAC CGG GCG GAC TCG GAC GTC TTT GTG CCT TAT GGC 675

Ser Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Val Phe Val Pro Tyr Gly 195 200 205 TAC CTC TAC CCC AGA AGC CAC CCC GGC GAC CCG CCC TC A 714

Tyr Leu Tyr Pro Arg Ser His Pro Gly Asp Pro Pro Ser 210 215 GGC CTG GCC CCG CCA CTG TCC AGG AAA CAG GGG CTG GTG 753

Gly Leu Ala Pro Pro Leu Ser Arg Lys Gin Gly Leu Val 220 225 230 GCA TGG GTG GTG AGC CAC TGG GAC GAG CGC CAG GCC CGG 792

Ala Trp Val Val Ser His Trp Asp Glu Arg Gin Ala Arg 235 240 245 GTC CGC TAC TAC CAC CAA CTG AGC CAA CAT GTG ACC GTG 831

Val Arg Tyr Tyr His Gin Leu Ser Gin His Val Thr Val 250 255 GAC GTG TTC GGC CGG GGC GGG CCG GGG CAG CCG GTG CCC 870

Asp Val Phe Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gin Pro Val Pro 260 265 270 G AA ATT GGG CTC CTG CAC ACA GTG GCC CGC TAC AAG TTC 909

Glu Ile Gly Leu Leu His Thr Val Ala Arg Tyr Lys Phe 275 280 TAC CTG GCT TTC GAG AAC TCG CAG CAC CTG GAT TAT ATC 948

Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Gin His Leu Asp Tyr Ile 285 290 295 ACC GAG AAG CTC TGG CGC AAC GCG TTG CTC GCT GGG GCG 987

Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Leu Ala Gly Ala 300 305 310 GTG CCG GTG GTG CTG GGC CCA GAC CGT GCC AAC TAC GAG 1026

Val Pro Val Val Leu Gly Pro Asp Arg Ala Asn Tyr Glu 315 320 CGC TTT GTG CCC CGC GGC GCC TTC ATC CAC GTG GAC GAC 1065

Arg Phe Val Pro Arg Gly Ala Phe lie His Val Asp Asp 325 330 335 TTC CCA AGT GCC TCC TCC CTG GCC TCG TAC CTG CTT TTC 1104

Phe Pro Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Tyr Leu Leu Phe 340 345 CTC GAC CGC AAC CCC GCG GTC TAT CGC CGC TAC TTC CAC 1143

Leu Asp Arg Asn Pro Ala Val Tyr Arg Arg Tyr Phe His 350 355 360 TGG CGC CGG AGC TAC GCT GTC CAC ATC ACC TCC TTC TGG 1182

Trp Arg Arg Ser iyr Ala Val His Ile Thr Ser Phe Trp 365 370 375 GAC GAG CCT TGG TGC CGG GTG TGC CAG GCT GTA CAG AGG 1221

Asp Glu Pro Trp Cys Arg Val Cys Gin Ala Val Gin Arg 380 385 GCT GGG GAC CGG CCC AAG AGC ATA CGG AAC TTG GCC AGC 1260

Ala Gly Asp Arg Pro Lys Ser Ile Arg Asn Leu Ala Ser 390 395 400 TGG TTC GAG CGG TGAAGCCGCG CTCCCCTGGA AGCGACCCAG 1302

Trp Phe Glu Arg 405 GGGAGGCCAA GTTGTCAGCT TTTTGATCCT CTACTGTGCA TCTCCTTGAC 1352

Claims (19)

Patentansprüche:

1. Verfahren für die Herstellung einer membrangebundenen Säugetierglycosyltransferase aus der Gruppe bestehend aus einer Galactosyltransférase, einer Sialyltransferase und einer Fucosyltransferase, beziehungsweise einer deren Varianten, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hefestamm kultiviert wird, der mit einem Hybridvektor, der eine Expressionskassette umfassend einen Promoter und eine für die genannte Glycosyltransferase oder ihre Variante kodierende DNA-Sequenz enthält, wobei diese DNA von besagtem Promoter kontrolliert wird, transformiert wurde, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyltransferase menschlichen Ursprungs ist.

3. Verfahren für die Herstellung einer Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Variante durch das Fehlen des cytoplasmatischen Schwanzes, des Signalankers und, gegebenenfalls, eines kleineren Teils der Stammregion von der entsprechenden Form mit der vollen Lange unterscheidet.

4. Verfahren für die Herstellung einer Variante nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hefestamm kultiviert wird, der eine Expressionskassette umfassend einen Promoter, der funktionell mit einer ersten, ein Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, die im richtigen Leseraster mit einer zweiten, für die genannte Variante kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, die vom genannten Promoter kontrolliert wird, enthält, und die enzymatische Aktivität gewonnen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das die Glycosyltransferase eine Galactosyltransférase ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Galactosyltransférase UDP-Galactose: ß-Galactosid-oc(l-3) galactosyltransférase (EC 2.4.1.151) Oder UDP-Galactose: ß-N-Acetylglucosamin-ß(l-4) galactosyltransférase (EC 2.4.1.22) ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Galactosyltransférase die in SEQ ID-Nr. 1 abgebildete Aminosäuresequenz hat.

8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Galactosyltransférase die in SEQ ID-Nr. 2 abgebildete Aminosäuresequenz hat.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyltransferase eine Sialyltransferase ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sialyltransferase CMP-NeuAc-ß-Galactosid-a(2-6)sialyltransferase (EC 2.4.99.1) ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sialyltransferase die in SEQ ID-Nr. 3 abgebildete Aminosäuresequenz hat.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sialyltransferase als ST(Lys27-Cys406) bezeichnet wird und aus den Aminosäuren 27 bis 406 der in SEQ ID-Nr. 3 aufgelisteten Aminosäuresequenz besteht.

13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sialyltransferase die in SEQ ID-Nr. 4 abgebildete Aminosäuresequenz hat.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyltransferase eine Fucosyltransferase ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fucosyltransferase GDP-Fucose: ß-Galactosid-a(l-2) fucosyltransferase (EC 2.4.1.69) und GDP-Fucose: N-Actylglucosamin-a( 1-3/4) fucosyltransferase (EC 2.4.1.65) ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fucosyltransferase die unter SEQ ID-Nr. 5 abgebildete Aminosäuresequenz hat.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fucosyltransferase als FT(Arg62-Arg405) bezeichnet wird und aus den Aminosäuren 62 bis 405 der unter SEQ ID-Nr. 5 abgebildeten Aminosäuresequenz besteht.

18. Ein Hefe-Hybridvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Expressionskassette umfassend einen Hefepromoter und eine für eine merabrangebundene Säugetierglycosyltransferase aus der Grappe bestehend aus einer Galactosyltransférase, einer Sialyltransferase und einer Fucosyliransferase, beziehungsweise eine deren Varianten kodierende DNA-Sequenz, enthält, wobei diese DNA-Sequenz vom genannten Promoter kontrolliert wird.

19. Ein miteinem Hybridvektor nach Anspruch 18 transformierter Hefestamm.