BE1005579A5 - Procede pour la production de glycosyltransferases, vecteur hybride et souches de levures utilises a cette fin. - Google Patents

Abstract

L'invention décrit un procédé pour la production d'une glycosyltransférase mammalienne liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase ou une variante de celles-ci, respectivement, comprenant la culture d'une souche de levure qui a été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur et une séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, lequel ADN est contrôlé par ledit promoteur, et la récupération de l'activité enzymatique.

Description

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  Procédé pour la production de glycosyltransférases, vecteur hybride et souches de levures utilisés à cette fin 
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 L'invention concerne le domaine de la technologie de l'ADN recombinant et fournit un procédé amélioré pour la production de glycosyltransférases au moyen de souches de levures transformées. 



  Les glycosyltransférases catalysent le transfert de fragments glucidiques d'un substrat donneur activé, habituellement un sucre nucléotidique, à un sucre accepteur spécifique, pour former une liaison glycosidique. En fonction du type de sucre transféré, ces enzymes sont groupées en familles, par exemple les galactosyltransférases, sialyltransférases et fucosyltransférases. Etant des protéines membranaires résidentes principalement localisées dans l'appareil de Golgi, les glycosyltransférases ont en commun une structure de domaines constituée d'une courte queue cytoplasmique amino-terminale, d'un domaine d'ancrage-signal, et d'une région de tige étendue qui est suivie d'un grand domaine catalytique carboxy-terminal.

   Le domaine d'ancragesignal joue le rôle à la fois de peptide signal indissociable et de domaine de recouvrement de la membrane, et oriente le domaine catalytique de la glycosyltransférase dans la lumière de l'appareil de Golgi. La région de l'espaceur ou de la tige au voisinage de la lumière est supposée servir d'amarre flexible, ce qui permet au domaine catalytique de glycosyler des groupes glucidiques de protéines solubles, et liées à la membrane, de la chaîne sécrétoire, 

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 se dirigeant vers l'appareil de Golgi. En outre, on a découvert que la région de la tige fonctionnait comme signal de rétention pour maintenir l'enzyme liée à la membrane de l'appareil de Golgi (demande PCT nO 91/06635).

   On suppose que ces glycosyltransférases solubles proviennent d'une libération protéolytique, par des protéases endogènes, à partir des formes correspondantes des enzymes liées à la membrane, probablement par coupure entre le domaine catalytique et le domaine trans-membranaire. 



   La synthèse enzymatique de structures glucidiques offre l'avantage d'une grande stéréosélectivité et d'une grande régiosélectivité, ce qui fait des glycosyltransférases un outil précieux pour la modification et la synthèse de glycoprotéines, glycolipides et oligosaccharides. Contrairement aux méthodes chimiques, l'introduction de groupes protecteurs ; qui prend beaucoup de temps, est alors superflue.'
Etant donné que les glycosyltransférases ne sont présentes dans la nature qu'en très faibles quantités, l'isolement à partir de sources naturelles et. la purification subséquente sont difficiles. En conséquence, on a étudié la production mettant à profit la technologie de l'ADN recombinant.

   Par exemple, des galactosyltransférases ont été exprimées dans E. coli (PCT 90/07000) et des cellules   d ! ovaire   de hamster   d'Asie   (CHO) [D. F. Smith et coll. (1990) J.   Biol.   Chem., 265, 6225-6234], des sialyltransférases ont été exprimées dans des cellules CHO [E. U. Lee (1990) Diss. 



    Abstr. Int.   B 50, 3453-3454] et des cellules COS-1 [J. C. Paulsen et coll. (1988) J. Cell. Biol. 107, 10A], et des fucosyltransférases ont été produites dans des cellules COS-1 [S. E. Goelz et coll. (1990) Cell., 63, 1349-1356 ; R. D. Larsen et coll. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6674-6678] et des cellules CHO [B. Potvin (1990) J. Biol. 



    Chem.,   265, 1615-1622]. Compte tenu des faits que l'expression hétérologue chez les procaryotes a l'inconvénient de 

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 fournir des produits non glycosylés, les glycosyltransférases étant cependant des glycoprotéines, et que la production de glycosyltranférases au moyen d'hôtes mammaliens est très coûteuse et très compliquée, en raison de la présence de nombreuses glycosyltransférases endogènes contaminant le produit recherché, il est nécessaire de pouvoir disposer de procédés améliorés, permettant la production économique de glycosyltranférases à grande échelle. 



   Un objet de la présente invention est de fournir un tel procédé. 



   La présente invention fournit un procédé pour la production de glycosyltransférases biologiquement actives, par la technologie de l'ADN recombinant, à l'aide d'un système d'expression comprenant un vecteur de type levure. 



   Plus précisément, la présente invention fournit un procédé pour la production d'une glycosyltransférase liée à la membrane, choisie parmi une   galadtosyltrànsférase,   une sialyltransférase et une fucosyltransférase, ou une variante de celles-ci, respectivement, ledit procédé comprenant la culture d'une souche de levure ayant été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur et une séquence   d'ADN   codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, lequel ADN est contrôlé par ledit promoteur, et la récupération de l'activité enzymatique. 



   Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un procédé pour la production d'une glycosyltransférase liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase, ou une variante de celles-ci, respectivement, ledit procédé comprenant la culture d'une souche de levure ayant été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur, une séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, 

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 et une séquence   d'ADN   contenant des signaux de terminaison de transcription de levure, et la récupération de l'activité enzymatique. 



   Dans un second mode de réalisation, l'invention concerne un procédé pour la production d'une glycosyltransférase liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase ou une variante de celles-ci, respectivement, ledit procédé comprenant la culture d'une souche de levure ayant été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur fonctionnellement lié à une première séquence d'ADN codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure, et la récupération de l'activité enzymatique. 



   Tel qu'utilisé précédemment ou ci-après, le terme "glycosyltransférase"est destiné à englober la famille des galactosyltransférases, la famille des sialyltransférases et la famille des fucosyltransférases. Lesdites glycosyltransférases sont des enzymes existant dans la nature, d'origine mammalienne, par exemple bovine, murine ou humaine. On préfère des glycosyltransférases humaines complètes, existant dans la nature, y compris les enzymes désignées ci-après par leurs numéros EC. 



   Les   galactosyltransférases   liées à la membrane et leurs variantes, qui peuvent être obtenues selon le procédé de l'invention, catalysent le transfert d'un résidu galactose, d'un donneur activé, habituellement un donneur activé nucléotidique tel que l'uridine diphosphate-galactose (UDP-Gal), à un groupe glucidique. 
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  Comme exemples de galactosyltransférases liées à la membrane, on peut citer l'UDP-galactose : ss-galactoside a (1-3) -galactosyltransférase (EC 2. 4. 1. 151) qui utilise le 

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 galactose en tant que substrat accepteur, en formant une liaison a   (1-3),   et   l'UDP-galactose   :   ss-N-acétylglucosamine   ss   (1-4) -galactosyltransférase   (EC 2.4. 1.22) qui transfère le galactose à la   N-acétylglucosamine     (GlcNAc)   en formant une liaison ss (1-4), y compris leurs variantes, respectivement. 



  En présence d'a-lactalbumine, ladite ss   (1-4) -galactosyl-   transférase accepte également le glucose en tant que substrat accepteur, pour catalyser ainsi la synthèse du lactose. 



   La galactosyltransférase liée à la membrane qui est particulièrement préférée est l'enzyme ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ nO 1. 



   Les sialyltransférases liées à la membrane et leurs variantes, pouvant être obtenues selon le procédé de l'invention, catalysent le transfert d'acides sialiques [par 
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 exemple l'acide N-acétylneuraminique- (NeuAc)], d'un donneur \. activé, habituellement un acide cytidin monophosphatesialique (CMP-SA), à un fragment accepteur glucidique. Un exemple d'une sialyltransférase liée à la membrane, pouvant être obtenue selon le procédé de l'invention, est la CMP-NeuAc : ss-galactoside a (2-6) -sialyltransférase (EC 2.4. 99.1) qui constitue la séquence NeuAc-a (2-6) Gal- ss   (1-4)   GlcNAc commune à de nombreux groupes glucidiques liés à l'azote. 



   La sialyltransférase lié à la membrane qui est particulièrement préférée est l'enzyme ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ nO 3. 



   Les fucosyltransférases liées à la membrane et leurs variantes, pouvant être obtenues selon le procédé de l'invention, catalysent le transfert d'un résidu fucose, d'un donneur activé, habituellement un donneur activé nucléotidique, tel que le guanosine diphosphate-fucose (GDP-Fuc), à un groupe glucidique. Comme exemples de telles glucosyltransférases, on peut citer la GDP-fucose :   ss-galactoside     a   (1-2) -fucosyltransférase (EC 2. 4. 1.69) et la 

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   GDP-fucose   :   N-acétylglucosamine   a   (l-3/4} -fucosyltransférase   (EC 2.4. 1.65). 



   La fucosyltransférase liée à la membrane qui est particulièrement préférée est l'enzyme ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ no 5. 



   Tel qu'on l'utilise ici, le   terme"variantes"est   destiné à englober à la fois les variantes liées à la membrane et les variantes solubles des glycosyltransférases liées à la membrane d'origine mammalienne, existant dans la nature, à condition que ces variantes aient une activité enzymatique. On préfère les variantes d'origine humaine. 



   Par exemple, le terme"variantes"est destiné à inclure des variantes liées à la membrane, existant dans la nature, de glycosyltransférases liées à la membrane, rencontrées au sein d'une espèce particulière, par exemple une 
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 variante d'une galactosyltransférase-qui diffère de l'enzyme 1. ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ n  1, par le fait qu'elle est dépourvue de sérine à la position 11 et comporte les aminoacides valine et tyrosine au lieu d'alanine et leucine aux positions 31 et 32, respectivement. Une telle variante peut être codée par un gène apparenté de la même famille génique ou par une variante allèle d'un gène particulier.

   Le terme"variantes" englobe également des glycosyltransférases produites à partir d'un ADN qui a été soumis à une mutagénèse in vitro, à condition que la protéine codée par ledit ADN ait l'activité enzymatique de la glycosyltransférase native. De telles modifications peuvent consister en une addition, un remplacement et/ou une délétion d'aminoacides, le dernier cas conduisant à des variantes raccourcies. 



   Les variantes préférées selon le procédé de l'invention sont des variantes raccourcies, en particulier des variantes solubles,   c'est-à-dire   des variantes qui ne sont pas liées à la membrane. Les variantes raccourcies comprennent par exemple des formes solubles de glycosyl- 

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 transférases liées à la membrane et leurs variantes liées à la membrane, par exemple les variantes mentionnées cidessus, qui peuvent être sécrétées par une souche de levure transformée, utilisée dans le procédé selon l'invention. 



  Selon la présente invention, ces enzymes solubles sont les variantes tronquées préférées. 



   L'invention concerne également un procédé pour la production d'une variante soluble d'une glycosyltransférase liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase, ledit procédé comprenant la culture d'une souche de levure ayant été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur fonctionnellement lié à une première séquence d'ADN codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour ladite variante, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure, et l'isolement de ladite variante. 



   Par définition, la forme soluble d'une glycosyltransférase est une variante raccourcie qui diffère de la forme complète correspondante,   c'est-à-dire   la forme liée à la membrane, à l'état naturel localisée dans le réticulum endoplasmique du complexe de Golgi, par l'absence de la queue cytoplasmique, du domaine d'ancrage-signal et éventuellement d'une partie de la région de la tige. Telle qu'on l'utilise ici,   l'expression"partie   de la tige"est définie comme étant une partie mineure du côté N-terminal de la région de la tige, composée de jusqu'à 12 aminoacides. En d'autres termes, les variantes solubles préparées selon le procédé de la présente invention consistent essentiellement en la région de la tige dans son ensemble et le domaine catalytique. 



   Les variantes solubles sont des enzymes à activité enzymatique, qui diffèrent des formes complètes correspondantes par l'absence d'un peptide NH2-terminal constitué de 

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 26 à 67, en particulier de 26 à 61 résidus aminoacides, étant entendu que les formes dépourvues d'une partie de la région de la tige ne sont dépourvues que de la partie mineure de celle-ci, définie plus haut. On préfère des variantes solubles qui peuvent être obtenues à partir des glycosyltransférases liées à la membrane, identifiées précédemment par leur numéros EC, ainsi que des variantes solubles pouvant être obtenues à partir de la fucosyltransférase liée à la membrane, ayant la séquence représentée dans l'appendice ID SEQ nO 5. 



   Les variantes solubles préférées de galactosyltransférases se distinguent des formes complètes correspondantes par le fait qu'elles sont dépourvues d'un peptide
NH2-terminal constitué de 37 à 55, en particulier de 41 à 44 aminoacides. La variante soluble particulièrement préférée obtenue selon le procédé de l'invention est l'enzyme ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ nO   2.   



   Les variantes solubles préférées de sialyltransférases sont privées d'un peptide NH2-terminal constitué de 26 à 38 aminoacides, par comparaison avec la forme complète. La variante soluble particulièrement préférée selon le procédé de l'invention est l'enzyme comportant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ nO 4. De même, on préfère la variante soluble désignée par ST    (Lys27-Cys406) constituée   des aminoacides 27 à 406 de la séquence d'aminoacides donnée dans l'appendice ID SEQ nO 3. 



   Les variantes solubles préférées de fucosyltransférases diffèrent des enzymes complètes correspondantes par le fait qu'elles sont dépourvues d'un peptide NH2terminal constitué de 56 à 67, en particulier de 56 à 61 aminoacides. On préfère en particulier la variante soluble désignée par FT   (Arg62-Arg405)'     composée   des aminoacides 62 à 405 de la séquence d'aminoacides donnée dans 

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 l'appendice ID SEQ nO 5. 



   Les souches hôtes de levures et les composants des vecteurs hybrides sont tels que spécifié ci-après. 



   Les souches de levures transformées sont cultivées au moyen de méthodes connues dans la technique. 



   Ainsi, les souches de levures transformées selon l'invention sont cultivées dans un milieu liquide contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux. 



   Diverses sources de carbone peuvent être utilisées. 



  Comme exemples de sources de carbone préférées, on peut citer des glucides assimilables, tels que le glucose, le maltose, le mannitol, le fructose ou le lactose, ou un   acé-   tate tel que l'acétate de sodium, qui peuvent être utilisés seuls ou en mélanges appropriés. Les sources d'azote appropriées comprennent, par exemple, des aminoacides, tels que l'hydrolysat acide de caséine, des peptides et des protéines et leurs produits de dégradation,   telsque   la tryptone, la peptone ou des extraits de viande, en outre, l'extrait de levure, l'extrait de malt, la liqueur de trempage du maïs, ainsi que des sels d'ammonium, tels que le chlorure, sulfate ou nitrate d'ammonium, qui peuvent être utilisés seuls ou en mélanges appropriés.

   Les sels minéraux qui peuvent être utilisés comprennent, par exemple, des sulfates, chlorures, phosphates et carbonates de sodium, potassium, magnésium et calcium. En outre, le milieu nutritif peut également contenir des stimulateurs de croissance. Les substances qui stimulent la croissance comprennent, par exemple, des oligo- éléments, tels que le fer, le zinc, le manganèse et similaires, ou des aminoacides individuels. 



   En raison de l'incompatibilité entre l'ADN 2   jn   endogène et les vecteurs hybrides portant son réplicon, les cellules de levures transformées par de tels vecteurs hybrides ont tendance à perdre ce dernier. De telles cellules de levures doivent être cultivées dans des conditions 

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 sélectives,   c'est-à-dire   des conditions qui exigent pour la croissance l'expression d'un gène codé par un plasmide. Les marqueurs les plus sélectifs actuellement utilisés et présents dans les vecteurs hybrides selon l'invention (voir plus loin) sont des gènes codant pour des enzymes de la biosynthèse de purines ou d'aminoacides. Cela rend nécessaire l'utilisation de milieux minimaux synthétiques déficients en l'aminoacide ou la base purique correspondants. 



  Toutefois, on peut également utiliser des gènes conférant la résistance à un biocide approprié (par exemple un gène conférant la résistance à   l'amino-glycoside   G418). Des cellules transformées par des vecteurs contenant des gènes de résistance à des antibiotiques sont cultivées en milieux complexes contenant l'antibiotique correspondant, ce qui permet d'atteindre de plus grandes vitesses de croissance et de plus fortes densités cellulaires. 



   Des vecteurs hybrides comprenant l'ADN 2   g   complet (comprenant une origine fonctionnelle de réplication) sont maintenus de façon stable dans des souches de Saccharomyces cerevisiae qui sont dépourvues de plasmides   2.     jn   endogènes (souches dites   cir ),   de sorte que la culture peut être effectuée dans des conditions de croissance non sélectives,   c'est-à-dire   dans un milieu complexe. 



   Les cellules de levures contenant des plasmides hybrides avec un promoteur constitutif expriment l'ADN codant pour une glycosyltransférase, ou une variante de celle-ci, contrôlée par ledit promoteur, sans induction. 



  Toutefois, si ledit ADN est sous le contrôle d'un promoteur régulé, il faut adapter la composition du lieu de croissance de manière à obtenir des taux maximaux de transcrits   d'ARNm,   par exemple lorsqu'on utilise le promoteur   PH05,   le milieu de croissance doit contenir une faible concentration de phosphate minéral, pour la dérépression de ce promoteur. 



   La culture est effectuée au moyen de techniques classiques. Les conditions de culture, telles que la tempéra- 

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 ture, le pH du milieu et la durée de fermentation, sont choisies de manière que des concentrations maximales de la protéine hétérologue soient produites. Une souche de levure choisie est de préférence cultivée dans des conditions aérobies, en culture submergée avec secouement ou agitation, à une température d'environ 25 à   35 C,   de préférence aux environs de   28 C,   à un pH de 4 à 7, par exemple à environ pH 5, et pendant au moins 1 à 3 jours, de préférence aussi longtemps que sont obtenus des rendements satisfaisants en protéine. 



   Après expression dans la levure, la glycosyltransférase, ou sa variante, est soit accumulée dans les cellules, soit sécrétée dans le milieu de culture, et on l'isole par des moyens classiques. 



   Par exemple, la première étape consiste habituellement en la séparation des cellules   d ! avec   le bouillon de culture par centrifugation. Dans le cas où la glycosyltransférase ou sa variante s'est accumulée dans les cellules, la protéine doit être libérée de l'intérieur de la cellule par lyse des cellules. Les cellules de levures peuvent être   lysées   de différentes façons bien connues dans la technique, par exemple par application de forces mécaniques, telles que secouement avec des billes de verre, par vibration ultrasonique, choc osmotique et/ou par digestion enzymatique de la paroi cellulaire.

   Dans le cas où la glycosyltransférase ou sa variante à isoler est associée ou liée à une fraction membranaire, on peut atteindre une concentration plus poussée, par exemple, par centrifugation différentielle de l'extrait cellulaire, et, éventuellement, traitement subséquent de la fraction particulière par un détergent, tel que le Triton.

   Des procédés appropriés à la purification de la glycosyltransférase brute ou de sa variante comprennent des techniques chromatographiques classiques, telles que la chromatographie d'affinité, par exemple avec un support approprié, des anticorps ou la 

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 concanavaline A, la chromatographie d'échange d'ions, la filtration sur gel, la chromatographie de partage, la HPLC,   l'électrophorèse,   des étapes de précipitation telles que la précipitation au sulfate d'ammonium et d'autres processus, en particulier ceux connus d'après la littérature. 



   Dans le cas où la glycosyltransférase, ou sa variante, est sécrétée par la cellule de levure dans l'espace périplasmique, on peut utiliser un protocole d'isolement simplifié : la protéine est recueillie sans lyse cellulaire, par élimination enzymatique de la paroi cellulaire ou par des agents chimiques, par rexemple des réactifs de type thiol ou   l'EDTA,   qui donnent naissance à des endommagements de la paroi cellulaire permettant la libération de la glycosyltransférase produite. Dans la cas où la glycosyltransférase ou sa variante est sécrétée dans le bouillon de culture, elle peut être recueillie directement à partir de celui-ci et purifiée au moyen des méthodes spécifiées plus haut. 



   Afin de déceler l'activité de la glycosyltransférase, on peut utiliser des essais connus dans la littérature. Par exemple, l'activité de la galactosyltransférase peut être mesurée par détermination de la quantité de galactose radiomarqué, incorporé dans une molécule d'accepteur approprié, tel qu'une glycoprotéine ou un reste glucidique libre. De même, l'activité de la sialyltransférase peut être dosée, par exemple, par l'incorporation d'acide sialique dans des substrats appropriés, et l'activité de la fucosyltransférase peut être dosée par le transfert de fucose à un accepteur approprié. 



   Les cellules hôtes de levures transformées selon l'invention peuvent être obtenues par des techniques d'ADN recombinant, comprenant les-étapes suivantes : - construction d'un vecteur hybride comprenant un promoteur de levure et une séquence d'ADN codant pour une glycosyl- transférase liée à la membrane, ou une variante de celle- 

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 ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promo- teur, - transformation d'une souche hôte de levure à l'aide dudit vecteur hybride et - sélection de cellules de levures transformées pour les séparer des cellules de levures non transformées. 



  Vecteurs d'expression
Le vecteur hybride de levure selon l'invention comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure et une séquence   d'ADN   codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur. 



   Dans un premier mode de réalisation, le vecteur hybride de levure selon l'invention comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure, une séquence 
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 d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la mem- \ brane, ou une variante de celle-ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. 



   Dans un second mode de réalisation, le vecteur hybride de levure selon l'invention comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure fonctionnellement lié à une première séquence   d'ADN   codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence   d'ADN   codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. 



   Le promoteur de levure est un promoteur régulé ou constitutif, provenant de préférence d'un gène de levure fortement exprime, en particulier d'un gène de Saccharomyces cerevisiae. Ainsi, il est possible d'utiliser le promoteur du gène   TRPI,   du gène ADHI ou   ADHII,   du gène de la phosphatase acide (PH05), un promoteur des gènes de phéromone d'ap- 

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 parement de levure, codant pour le facteur a ou a, ou un promoteur provenant d'un gène codant pour une enzyme glycolytique, tel que le promoteur des gènes de   l'énolase,   de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAP), de la 3-phosphoglycérate kinase (PGK), de   l'hexokinase,   de la pyruvate décarboxylase, de la phosphofructokinase, de la glucose-6-phosphate isomérase,

   de la 3-phosphoglycérate mutase, de la pyruvate kinase, de la triosephosphate isomérase, de la phosphoglucose isomérase ou de la glucokinase. On peut en outre utiliser des promoteurs hybrides comprenant des séquences d'activation en amont (UAS = upstream activation sequences) d'un gène de levure et des éléments de promoteur en aval, comprenant une boîte TATA fonctionnelle d'un autre gène de levure, par exemple un promoteur hybride comprenant le ou les UAS du gène   PH05   de levure et des éléments de promoteur en aval comprenant une boîte TATA fonctionnelle du gène GAP de levure (promoteur hybride PH05-GAP).

   Un promoteur   préféré   est le promoteur du gène GAP, en particulier des fragments fonctionnels de celui-ci, partant des nucléotides situés entre les positions -550 et-180, en particulier du   nucléotide-540,-263   ou - 198, et se terminant au niveau du nucléotide-5 du gène GAP. Un autre promoteur préféré du type régulé est le promo- 
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 teur de PH05. En tant que promoteur constitutif, on préfère un promoteur raccourci de PH05 de la phosphatase acide, dépourvu des éléments régulateurs amont (UAS) comme par exemple l'élément promoteur PH05 (-173) commençant au niveau du nucléotide-173 et se terminant au niveau du nucléotide - 9 du gène PH05. 



   La séquence d'ADN codant pour un peptide signal ("séquence signal") provient de préférence d'un gène de levure codant pour un polypeptide qui est normalement sécrété. On peut également choisir d'autres séquences signal de protéines hétérologues qui sont normalement sécrétées. 



  Des séquences signal de levure sont, par exemple, les 

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 séquences signal et prépro des gènes de l'invertase, du facteur a, de la phéromone peptidase (KEX1), de la"toxine tueuse"et de la phosphatase acide répressible (PH05) de levure et la séquence signal de glucoamylase provenant de Aspergillus avamori. Une autre possibilité consiste à construire des séquences signal fusionnées, par ligature d'une partie de la séquence signal (si elle est présente) du gène qui, à   l'état   naturel, est lié au promoteur utilisé (par exemple PH05), avec une partie de la séquence signal d'une autre protéine hétérologue. On préfère les combinaisons qui permettent une coupure précise entre la séquence signal et la séquence d'aminoacides de la glycosyltransférase.

   Des séquences supplémentaires, telles que les séquences pro ou espaceur, qui peuvent ou non porter des signaux de maturation spécifiques, peuvent également être incluses dans les constructions, pour faciliter une maturation exacte de molécules de précurseur. Ou bien, on peut produire des protéines fusionnées contenant des signaux de maturation internes qui permettent une maturation adéquate in vivo ou in vitro. Par exemple, les signaux de maturation contiennent Lys-Arg, qui est reconnu par une endopeptidase de levure localisée dans les membranes de l'appareil de Golgi. La séquence signal préférée selon la présente invention est celle du gène de l'invertase de levure. 



   Si une glycosyltransférase complète, ou une variante de celle-ci liée à la membrane, est exprimée dans une levure, le vecteur hybride de levure préféré comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure, une séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. Si l'ADN code pour une enzyme liée à la membrane, une séquence signal supplémentaire n'est pas nécessaire. 

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   Lorsqu'une variante soluble d'une glycosyltransférase liée à la membrane est exprimée dans une levure, le vecteur hybride de levure préféré comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure fonctionnellement lié à une première séquence d'ADN codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour ladite variante, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. 



   De l'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, peut être préparé par des méthodes connues dans la technique et comprend de l'ADN génomique, par exemple isolé à partir d'une banque d'ADN génomiques mammaliens, provenant par exemple de cellules bovines, humaines, de rat ou de souris. si nécessaire, les introns existant dans l'ADN génomique codant pour l'enzyme sont supprimés. En outre, de   l'ADN   codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de 
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 celle-ci, comprend de l'ADNc qui peut être isolé à partir d'une banque d'ADNc mammaliens ou produit à partir de l'ARNm correspondant. La banque d'ADNc peut provenir de cellules de différents tissus, par exemple des cellules placentaires ou des cellules hépatiques.

   La préparation d'ADNc par la voie de l'ARNm est réalisée au moyen de méthodes classiques, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR = polymerase chain reaction). 



   Par exemple, en suivant des méthodes classiques connues dans la technique, on effectue l'isolement d'ARNpoly (A) + à partir de cellules mammaliennes, par exemple de cellules HeLa, et la synthèse subséquente du premier brin d'ADNc. A partir de cette matrice d'ADN synthétisée, on peut utiliser la PCR pour amplifier la séquence cible, à savoir l'ADN codant pour la glycosyltransférase ou un fragment de celui-ci, tandis que l'amplification des séquences non cibles, numériquement dominantes, est réduite au minimum. A 

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 cette fin, il faut connaître la séquence d'un petit groupe de nucléotides de chaque côté de la séquence cible.

   Ces séquences adjacentes sont utilisées pour construire deux oligonucléotides amorces monocaténaires synthétiques, dont la séquence est choisie de manière que chacun ait une complémentarité de paires de bases avec sa séquence adjacente respective. La PCR débute par dénaturation du brin hybride d'ADN-ARNm, suivie de la soudure des amorces aux séquences encadrant la cible. L'addition d'une ADN polymérase et de désoxynucléotide triphosphates provoque la formation de deux fragments d'ADN bicaténaires, commençant chacun au niveau de l'amorce et s'étendant le long de la séquence cible, copiant ainsi cette dernière. Chacun des produits nouvellement synthétisés peut servir de matrices pour hybridation d'amorces et d'extensions (cycle suivant), conduisant ainsi à un accroissement exponentiel de fragments bicaténaires de bonne longueur. 



   En outre, on peut synthétiser chimiquement ou enzymatiquement de l'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci. Une variante d'une glycosyltransférase liée à la membrane, ayant une activité enzymatique et comportant une séquence d'aminoacides dans laquelle un ou plusieurs aminoacides sont supprimés (fragments   d'ADN)   et/ou remplacés par un ou plusieurs autres aminoacides, est codée par un ADN mutant. De plus, un ADN mutant peut comprendre un mutant silencieux dans lequel un ou plusieurs nucléotides sont remplacés par d'autres nucléotides, les nouveaux codons codant pour le (s) même (s) aminoacide (s). Une telle séquence mutante est également une séquence d'ADN dégénérée.

   Des séquences d'ADN dégénérées sont dégénérées, dans le sens du code génétique, du fait qu'un nombre illimité de nucléotides sont remplacés par d'autres nucléotides sans que cela entraîne une modification de la séquence d'aminoacides initialement codée. De telles séquences d'ADN dégénérées peuvent être utiles, en raison de 

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 leurs sites de restriction différents et/ou de leur fréquence différente de codons particuliers qui sont préférés par   l'hôte   spécifique, pour l'obtention d'une expression optimale d'une glycosyltransférase ou d'une variante de celle-ci. De telles séquences d'ADN ont de préférence   l'em-   ploi de codons préférés par la levure. 



   Un ADN mutant peut également être obtenu par mutation in vitro d'un ADNc ou d'un ADN génomique existant dans la nature, selon des méthodes connues dans la technique. Par exemple,   lADN   partiel codant pour une forme soluble d'une glycosyltransférase peut être excisé de l'ADN complet codant pour la glycosyltransférase correspondante, liée à la membrane, au moyen d'enzymes de restriction. La disponibilité d'un site de restriction approprié est avantageuse à cette fin. 



   Une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure est de préférence la, séquence adjacente en 3'd'un gène de levure qui contient des signaux adéquats pour la terminaison de la transcription et la polyadénylation. Des séquences adjacentes en   3'qui   sont appropriées sont par exemple celles du gène de levure lié à l'état naturel au promoteur utilisé. La séquence adjacente préférée est celle du gène PH05 de levure. 



   Le promoteur de levure, la séquence d'ADN facultative codant pour le peptide signal, la séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, et la séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure, sont fonctionnellement liés en un arrangement en tandem,   c'est-à-dire   qu'ils sont juxtaposés de manière que leurs fonctions normales soient maintenues.

   L'arrangement est tel que le promoteur effectue une expression adéquate de la séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci (éventuellement précédée d'une séquence signal), les signaux de terminaison de transcrip- 

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 tion effectuent une terminaison adéquate de transcription et de polyadénylation, et la séquence signal facultative est liée dans le cadre de lecture adéquat à la séquence d'ADN mentionnée plus haut, de manière que le dernier codon de la séquence signal soit directement lié au premier codon de ladite séquence   d'ADN,   et que la sécrétion de la protéine se produise.

   Si le promoteur et la séquence signal proviennent de gènes distincts, le promoteur est de préférence lié à la séquence signal au niveau d'un site localisé entre le point de départ majeur de l'ARNm et l'ATG du gène soudé à l'état naturel au promoteur. La séquence signal devrait avoir son propre ATG pour l'initiation de la traduction. La jonction de ces séquences peut être effectuée au moyen de segments de liaison   oligodésoxynucléotidiques   portant la séquence de reconnaissance d'une endonucléase. 



   Les vecteurs appropriés pour la réplication et   l'ex-   pression dans une levure contiennent une origine de réplication de levure. Des vecteurs hybrides qui contiennent une origine de réplication de levure, par exemple le segment chromosomique à réplication autonome (ars), sont conservés extrachromosomiquement dans la cellule de levure après transformation, et sont répliqués de façon autonome au cours de la mitose. On peut également utiliser des vecteurs 
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 hybrides qui contiennent des séquences homologues à l'ADN plasmidique 2 g de levure. De tels vecteurs hybrides sont intégrés par recombinaison dans des plasmides 2 déjà pré- sents à l'intérieur de la cellule, ou se répliquent de façon autonome. 



   De préférence, les vecteurs hybrides selon l'invention comprennent un ou plusieurs, en particulier un ou deux marqueurs génétiques sélectifs pour levure et un tel marqueur est une origine de réplication pour un hôte bactérien, notamment Escherichia coli. 



   En ce qui concerne les marqueurs génétiques sélectifs pour levure, on peut utiliser tout gène marqueur qui faci- 

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 lite la sélection de transformants en raison de l'expression phénotypique du gène marqueur. Des marqueurs appropriés pour levure sont, par exemple, ceux exprimant une résistance à un antibiotique, ou, dans le cas de mutants auxotrophes de levure, des gènes qui complètent des lésions de l'hôte. Les gènes correspondants confèrent, par exemple, une résistance aux antibiotiques G418, hygromycine ou bléomycine, ou réalisent la prototrophie dans un mutant auxotrophe de levure, par exemple le gène URA3,   LEU2, LYS2   ou   TRP1.   



   Etant donné que l'amplification des vecteurs hybrides est commodément effectuée dans E. coli, un marqueur génétique de E. coli et une origine de réplication de E. coli 
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 sont avantageusement inclus. On peut les obtenir à partir de plasmides de E. coli, tels que pBR322, ou d'un plasmide pUC, par exemple pUC18 ou pUC19, qui contiennent l'un et l'autre l'origine de réplication de E. coli et un marqueur génétique de E. coli conférant la résistance à des antibiotiques tels que l'ampicilline. 



   Les vecteurs hybrides selon l'invention sont construits par des méthodes connues dans la technique, par exemple par assemblage de la cassette d'expression constituée d'un promoteur de levure et une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase, ou une variante de celle-ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, ou des divers constituants de la cassette d'expression, et des fragments   d'ADN   contenant des marqueurs génétiques sélectifs pour la levure et pour un hôte bactérien, et des origines de réplication pour la levure et pour un hôte bactérien, dans l'ordre préétabli. 



   Les vecteurs hybrides de l'invention sont utilisés pour la transformation des souches de levures décrites cidessous. 



  Souches de levures et transformation de celles-ci
Des organismes hôtes de type levure appropriés sont des souches appartenant au genre Saccharomyces, en particu- 

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 lier des souches de Saccharomyces cerevisiae. Lesdites souches de levures comprennent des souches qui ont été éventuellement privées de plasmides 2   g   endogènes et/ou qui éventuellement sont dépourvues d'activité (s) de peptidase de levure, par exemple d'activité peptidase   ysc < x, yscA, yscB,     yscY   et/ou yscS. 



   L'invention concerne en outre une souche de levure qui a été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur et une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, lequel ADN est contrôlé par ledit promoteur. 



   Dans un premier mode de réalisation, la souche de levure selon l'invention a été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure, une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane ou une variante de celle-ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. 



   Dans un second mode de réalisation, la souche de levure selon l'invention a été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression constituée d'un promoteur de levure fonctionnellement lié à une première séquence   d'ADN,   codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. 



   Les souches de levures de l'invention sont utilisées pour la production d'une glycosyltransférase liée à la membrane, ou d'une variante de celle-ci. 



   La transformation de la levure par les vecteurs hybrides selon l'invention est réalisée par des méthodes connues dans la technique, par exemple selon les méthodes 

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 décrites par Hinnen et coll. [Proc. Natl. Acad. Soi. USA (1978), 75, 1929] et Ito et coll. [J. Bact. (1983), 153, 163-168]. 



   Les glycosyltransférases liées à la membranes, et leurs variantes, produites par le procédé selon l'invention, peuvent être utilisées d'une façon connue en soi, par exemple pour la synthèse et/ou la modification de glycoprotéines, oligosaccharides et glycolipides (US-A-4 925 796 ;   EP-A-414 171).   



   L'invention concerne en particulier le procédé pour la production de glycosyltransférases liées à la membrane, et de leurs variantes, les vecteurs hybrides, les souches de levures transformées et les glycosyltransférases pouvant être obtenues selon le procédé de l'invention, comme décrit dans les exemples. 



   La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. Dans les exemples, on utilise les abréviations suivantes   :   GT = galactosyltransférase (EC 2.4. 1.22) ;   PCR =   amplification en chaîne par polymérase ; ST = sialyltransférase (EC 2.4. 99.1) ; FT = fucosyltransférase. 



  Exemple l-Clonage de l'ADNc codant pour la galactosyl- transférase (GT) provenant de cellules HeLa
On isole par la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) de l'ADNc GT à partir de cellules HeLa [G. Watzele et E. G. Berger (1990), Nucleic Acids   Res.,   18, 7174] : 1.   1- Préaration d'ARNpoly (A) + à partir   de cellules HeLa
Pour la préparation d'ARN, on cultive des cellules HeLa en culture monocouche sur 5 plaques (23 x 23 cm). 



  L'isolement rapide et efficace d'ARN à partir de cellules cultivées est effectué par extraction à l'aide de guanidineHC1, comme décrit par R. J. Mac Donald et coll. [Meth. 



  Enzymol. (1987), 152, 226-227]. En général, les rendements 

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 vont d'environ 0,6 à 1 mg d'ARN total par plaque de cellules confluentes. On effectue l'enrichissement de   l'ARNpoly     (A) par   chromatographie d'affinité sur oligo (dT)-cellulose, selon la méthode décrite dans le manuel de Maniatis [J. Sambrook, E. F. Fritsch et T. Maniatis (1989), Molecular Cloning : A laboratory Manual (2e edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA], en injectant 4 mg d'ARN total dans une colonne de 400   ni.   On recueille 3 % de l'ARN introduit, sous forme   d'ARNpoly   (A) enrichi, qui est conservé jusqu'à l'emploi en parties aliquotes précipitées avec 3 volumes d'éthanol   à -700C.   



  1.   2- synthèse d'ADNc   premier brin pour PCR
L'ARNpoly (A)+ (ARNm) est inversé-transcrit en ADN à l'aide de la transcriptase inverse H--RNase du virus de la leucémie murine de Moloney (TI H- de VLM-M) (BRL). Dans la préparation du mélange réactionnel de 20 gl, on suit le protocole fourni par BRL, avec de légères variations : on chauffe pendant 10 minutes à   700C   1   ngd'ARNpoly (A) +   de 
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 cellules HeLa et 500 ng d'oligo (dT) 12-18 (Pharmacia) dans - i-JLo 11, 5   gl   d'eau stérile et on refroidit ensuite. rapidement le mélange sur de la glace.

   On ajoute ensuite 4 gl de tampon de réaction fourni par BRL [tris-HCl 250 mM (pH 8,3), KCl 
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 375 mM, MgCl2 15 mM], 2 jul de dithiothréitol 0, 1 M, 1 ni de dNTP mélangés (10 mM chaque de dATP, dCTP, dGTP, TTP, Pharmacia), 0, 5 ni (17, 5 U) de RNAguard (inhibiteur de RNase de Pharmacia) et 1 gl (200 U) de TI H- de VLM-M. On effectue la réaction à 420C et on la fait cesser au bout de 1 heure en chauffant le tube pendant 10 minutes à 95 C. 



   Afin de contrôler l'efficacité de la réaction, on met à incuber une partie aliquote (5 gl) du mélange en présence 
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 32 de 2 Ci d/o-P-dCTP. En mesurant le dCTP incorporé, on calcule la quantité d'ADNc synthétisé. Le rendement de la synthèse du premier brin est habituellement compris entre 5 et 15 %. 

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  1. 3-Amplification en chaîne par   polymerase (PCR)  
Les amorces   oligodésoxynucléotidiques   utilisées pour la PCR sont synthétisées in vitro par la méthode au phosphoramidite   [M.   H. Caruthers dans Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (Synthèse chimique et enzymatique de fragments de gène), H. G. Gassen et A. Lang éditeurs, Verlag Chemie, Weinheim, RFA] sur un synthétiseur Applied Biosystems modèle 380B. Elle sont énumérées dans le tableau 1. 



   Tableau 1
Amorces pour PCR
Corres- pondant à pb dans
Amorce Séquences (5'à 3') l'ADNc de GT2) Plup   (KpnI)     cgctACCCTTCTTAAAGCGGCGÇCGGGAAGATG (-26)-3   PI (EcoRI) gccgaattcATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAGCG 1- 28 P3 (SacI) CTGGAGCTCGTGGCAAAGCAGAACCC 448-473 
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 P2d (EcoRI) xccsaaTTCAGTCTCTTATCCGTGTACCAAAACGCCTA 1222-1192 P4 (HindII cccaagctTGGAATGATGATGGCCACCTTGTGAGG 546-520 Les lettres majuscules représentent des séquences prove- nant de la GT, les lettres minuscules représentent des séquences supplémentaires, les sites pour enzymes de restriction sont soulignés. Les codons   pour"le départ"     et "l'arrêt" de   la traduction de l'ARN apparaissent en gras. 



  2) Séquence d'ADNc de GT provenant du placenta humain, telle que publiée dans GenBank   (n    de dépôt M22921). 



   Les conditions normales de PCR pour un mélange d'incubation de 30   Ml   sont les suivantes : 1   ni   du mélange réactionnel de transcriptase inverse (voir exemple 1.2), contenant environ 5 ng d'ADNc premier brin, 15 pmoles chaque des amorces concernées, 200   gnoles   chaque des quatre désoxy- 

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 nucléoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et TTP) dans du tampon PCR [tris-HCl 10 mM (pH 8,3) (à   23 C),   KCl 50 mM,   MgCl2 1,   5 mM, 0,001 % de gélatine] et 0,5 U de polymérase AmpliTaq Polymerase (Perkin Elmer).

   On effectue l'amplification dans l'appareil Thermocycler 60 (Biomed) en utilisant les conditions suivantes : 0,5 minute de dénaturation à   95 C,   1 minute d'hybridation à   560C   et 1 minute 15 secondes d'extension à   72OC,   pour un total de 20-25 cycles. Dans le dernier cycle, l'extension d'amorce à   720C   est effectuée pendant 5 minutes. 



   Pour le séquençage et le sous-clonage, l'ADNc de GT de HeLa est amplifié en deux segments se chevauchant, au moyen de différentes combinaisons d'amorces : (1) Fragment P1-P4 : on utilise les amorces PI et P4 pour amplifier un fragment d'ADN de 0,55 kb couvrant les positions de nucléotides 7-556 dans l'ADNc de GT de HeLa (ID SEQ nO 1). 



  (2) Fragment P3-P2d : on utilise les amorces P3 et P2d pour amplifier un fragment de 0,77 kb couvrant les positions de nucléotides 457-1 232 (ID SEQ nO 1). 



   Afin d'éviter des erreurs au cours de l'amplification, on effectue quatre PCR indépendantes pour chaque fragment. On utilise également l'amorce   Plup     (KpnI)   en association avec l'amorce P4, pour déterminer la séquence d'ADN suivie du codon d'initiation. 



   Après l'amplification en chaîne par polymérase, le fragment P1-P4 est digéré à l'aide des enzymes de restriction EcoRI et HindIII, analysé sur un gel d'agarose à 1, 2 %, élue du gel par GENECLEAN (BIO 101) et sous-clone dans le vecteur pUC18 (Pharmacia) ayant été digéré à l'aide des mêmes enzymes. Le fragment P3-P2d est digéré à l'aide de SacI et EcoRI, analysé sur un gel à 1,2 %, élue et sous-   cloné   dans pUC18 qui a été digéré par SacI et EcoRI. Les sous-clones résultants sont   pUC18/P1-P4   et pUC18/P3-P2d, respectivement. Pour le sous-clonage, la ligature et la 

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 transformation de la souche DH5a de E. coli, on suit les modes opératoires classiques tels que décrits dans l'exemple 2.

   On utilise des minipréparations des plasmides   pUC18/P1-P4   et pUC18/P3-P2d pour le séquençage didésoxy d'ADN bicaténaire dénaturé, à l'aide du nécessaire de séquençage à la polymérase de T7 (Pharmacia). Des amorces de séquençage de M13/pUC et des amorces de séquençage inverse (Pharmacia) sont appliquées au séquençage de fragments chevauchants produits à partir des deux brins d'ADN, par digestion par diverses enzymes de restriction. Un nouveau sousclonage de fragments de restriction du gène GT est nécessaire pour le séquençage poussé de fragments chevauchants des deux brins. La séquence de fragments amplifiée par plusieurs PCR indépendantes montre que l'erreur d'amplification est inférieure à 1 pour 3 000 nucléotides.

   La séquence nucléotidique complète de l'ADNc de   GT   de cellules HeLa qui est donnée dans ID SEQ nO 1 est homologue à 99,2 % à celle du placenta humain   (nO   de dépôt Genbank M22921). On constate trois différences : (a) trois paires de bases supplémentaires aux positions des nucléotides 37-39 (ID SEQn  1) ayant pour résultat un aminoacide supplémentaire (Ser) dans la partie N-terminale de la protéine ; (b) les bases 98 à 101 sont   "CTCT"au   lieu   de"TCTG"dans   la séquence du placenta humain, ce qui conduit à deux remplacements d'aminoacides conservateurs (AlaLeu au lieu de ValTyr) aux positions d'aminoacides 31 et 32 dans le domaine de recouvrement de membrane de GT ;

   (c) de"A", le nucléotide à la position 1 047 est changé en"G", sans entraîner un changement de la séquence d'aminoacides. 



   Les deux fragments d'ADN chevauchants P1-P4 et P3-P2d codant pour   l'ADNc   de GT de HeLa sont assemblés par le site de restriction NotI à la position de nucléotide 498, qui est présent dans les deux fragments. 

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     L'ADNc   complet de GT de cellules HeLa (ID SEQ nO 1) est   cloné   sous forme d'un fragment de restriction EcoRI- EcoRI de 1,2 kb dans le plasmide pIC-7, un dérivé de pUC8 à sites de restriction supplémentaires dans le site de clonage multiple   [J.   L. Marsh, M. Erfle et E. J. Wykes (1984), Gene, 32, 481-485], ce qui donne le vecteur p4AD113. Afin de créer la cassette d'expression GT, on supprime comme suit le site de restriction EcoRI (pb 1 227) à l'extrémité   3'de   la séquence d'ADNc : le vecteur p4AD113 est d'abord linéarisé par digestion par EcoRV, et ensuite traité par de la phos- phatase alcaline. On fait en outre digérer partiellement pendant 1 heure à   37 C,   avec 0,25 U de EcoRI, 1 gg de l'ADN plasmidique linéarisé.

   Après électrophorèse en gel d'aga- rose, un fragment correspondant à la taille du plasmide linéarisé (3,95 kb) est isolé du gel au moyen de GENECLEAN (Bio 101). L'extrémité EcoRI saillante est complétée à l'aide du fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit \ dans le manuel de Maniatis (voir plus haut). Après phénol- sation et précipitation à l'éthanol, le plasmide est religa- turé et utilisé pour transformer E. coli DH5a (Gibco/BRL). 



  On effectue des minipréparations de plasmides à partir de six transformants. Les plasmides obtenus sont contrôlés par analyse de restriction, en ce qui concerne l'absence des sites de restriction EcoRI et EcoRV à   l'extrémité     3'de   l'ADNc de GT de cellules HeLa. On choisit pour l'expérimen- tation suivante le plasmide désigné par p4AE113, car sa séquence d'ADN est identique à celle du plasmide p4AD113, mis à part que les pb 1 232-1 238 avec les sites de res- triction EcoRI-EcoRV sont supprimés. 



  Exemple 2-Construction de cassettes d'espression pour GT complète 
Pour l'expression hétérologue dans Saccharomyces cerevisiae, on soude la séquence complète d'ADNc de GT de cellules HeLa (ID SEQ nO 1) à des signaux de régulation de transcription de levure, pour un départ et une terminaison 

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 efficaces de transcription. Les séquences promotrice et terminatrice partent du gène de la phosphatase acide de levure   (PH05)   (EP-100 561). Le promoteur PH05 complet est régulé par l'apport de phosphate inorganique dans le milieu de culture. De fortes concentrations de Pi conduisent à une répression du promoteur, tandis qu'une faible concentration de Pi agit par induction.

   On peut également utiliser un court fragment promoteur PH05 de 173 pb qui est dépourvu de tous éléments régulateurs et par conséquent se comporte comme un promoteur constitutif. 



  2. 1- Construction d'une cassette d'expression inductible par le phosphate
La séquence   d'ADNc   de GT est associée au promoteur   PH05 de   levure et aux séquences terminatrices de transcription, comme suit : (a) séquence complète   d'ADNC   de GT de cellules HeLa :
On fait digérer par les enzymes de restriction EcoRI et BglII le vecteur p4AE113 comportant la séquence complète   d'ADNc   de GT. Les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1 %. On isole du gel, par adsorption sur glasmilk, en utilisant le nécessaire GENECLEAN (Bio 101), un fragment d'ADN de 1,2 kb contenant la séquence complète d'ADNc codant pour la GT de cellules HeLa.

   Sur ce fragment, le codon   d'initiation"ATG"pour   la synthèse protéique de la GT est localisé directement en arrière du site de restriction pour EcoRI, tandis que le 
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 codon d'arrêt "TAG" est suivi de 32 pb apportées par la région non traduite en 3'de la GT de cellules HeLa, et le site de clonage multiple du vecteur, comportant le site de restriction BglII. 



  (b) Vecteur pour l'amplification dans E. coli :
Le vecteur pour l'amplification, le plasmide p31R (voir EP-100 561), un dérivé de pBR322, est digéré à l'aide des enzymes de restriction BamHI et SalI. Les fragments de restriction sont séparés sur un gel d'agarose à 1 %, et un 

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 fragment vecteur de 3,5 kb est isolé du gel comme décrit précédemment. Ce fragment   d'ADN   contient le grand fragment vecteur SalI-HindIII du dérivé de pBR322, ainsi qu'une séquence terminatrice de transcription de   PH05   de 337 pb, au lieu de la séquence HindIII-BamHI de pBR322. 



  (c) Séquence du promoteur PH05 inductible :
Le fragment promoteur PH05 contenant les éléments régulateurs (UASp) pour l'induction par un phosphate est isolé du plasmide p31R (voir EP-100 561) par digestion à l'aide des enzymes de restriction SalI et EcoRI. Le fragment   d'ADN   SalI-EcoRI de 0,8 kb comprend la séquence SalI-BamHI de pBR322 de 276 pb et le fragment promoteur   PH05   BamHIEcoRI de 534 pb, avec le segment de liaison EcoRI (5'-GAATTC-3') introduit à la position-8 de la séquence du promoteur   PHOS.   



  (d) Construction du plasmide   pGTA1132  
Les trois fragments d'ADN   (ar à   (c) sont ligaturés dans 12   jul   d'un mélange de ligature : on ligature 100 ng de fragment d'ADN (a) et 30 ng chaque de fragments (b) et (c), pendant 18 heures à 15 C, en utilisant 0,3 U d'ADN ligase de T4 (Boehringer) dans le tampon pour ligase fourni [tris-HCl 66 mM (pH 7,5), dithioérythritol 1 mM,    MgCl2     5   mM, ATP 1 mM). On utilise la moitié du mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E. coli souche   DH5a   (Gibco/BRL). Pour la préparation de cellules compétentes et pour la transformation, on suit le protocole classique tel que donné dans le manuel de Maniatis (voir plus haut).

   On étale les cellules sur du milieu LB sélectif, additionné de 75   g/ml   d'ampicilline, et on les met à incuber à   37 C.   On obtient environ 120 transformants. On effectue des minipréparations de plasmide à partir de six transformants indépendants, en utilisant le protocole de lyse alcaline modifié de H. C. Birnboim et J. Doly, tel que décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut). Les plasmides isolés sont caractérisés par analyse de restriction à l'aide de quatre 

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 enzymes différentes (EcoRI, PstI, HindIII et SalI, également en association). Les six plasmides présentent tous les fragments de restriction attendus. On choisit l'un des clones et on le désigne par pGTA1132.

   Le plasmide pGTA1132 contient la cassette d'expression comportant l'ADNc complet de GT de cellules HeLa sous contrôle du promoteur PH05 régulé par le phosphate, et la séquence terminatrice de transcription de PH05. Cette cassette d'expression peut être excisée de pGTA1132, sous forme d'un fragment SalI-HindIII de 2,35 kb, dénommé"fragmentd'ADN(1A)". 



  2. 2- Construction d'une cassette d'expression constitutive
Pour la construction d'une cassette d'expression comportant un promoteur constitutif non régulé, on utilise un fragment promoteur   PH05   tronqué en 5', dépourvu d'éléments régulateurs par phosphate, qui est isolé à partir du plasmide   P31jPH05   (-173) RIT. 



  (a) Construction du plasmide   p31/PH05   (-173) RIT
Le plasmide p31RIT12 (EP-288 435) comprend le promoteur PH05 complet régulé [avec un site EcoRI introduit à la position de nucléotide-8 sur un fragment BamHI-EcoRI de 534 pb, suivi de la séquence codante pour la séquence signal de l'invertase de   levure (EcoRI-XhoI   de 72 pb) et du signal de terminaison de transcription de   PHO   (XhoI-HindIII de 135 pb) clone dans un arrangement en tandem entre BamHI et HindIII sur le vecteur dérivé de pBR322]. 



     L'élément   promoteur   PH0. 5 (-173)   constitutif, provenant du plasmide pJDB207/PH05   (-173)-YHIR   (EP-340 170) comprend la séquence nucléotidique du promoteur   PH05   de levure, de la position de   nucléotide-9 à-173   (site de restriction BstEII) mais ne comporte pas de séquences régulatrices en amont (UASp). Le promoteur PH05 (-173) se comporte par conséquent comme un promoteur constitutif. Cet exemple décrit le remplacement du promoteur PH05 régulé dans le plasmide p31RIT12 par le court élément promoteur PH05 (-173) constitutif, dans le but d'obtenir le plasmide   p31jPHOS     (-173)   RIT. 

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   On fait digérer par les endonucléases de restriction SalI et EcoRI les plasmides p31RIT12 (EP-288 435) et   pJDB207/PH05     (-173)-YHIR   (EP-340 170). Les fragments SalIEcoRI respectifs, de 3,6 kb et 0,4 kb, sont isolés sur un gel d'agarose à 0,8 %, élues du gel, précipités à   ltéthanol   et remis en suspension dans H20 à une concentration de 0,1 pmole/gl. On ligature les deux fragments d'ADN et on 
 EMI31.1 
 mélange des parties aliquotes de 1 gl du mélange de ligature, pour transformer des cellules compétentes de E. coli HB101 (ATCC). Des colonies résistantes à l'ampicilline sont cultivées individuellement dans du milieu LB additionné d'ampicilline (100 gg/ml). On isole l'ADN plasmidique selon la méthode de D. S. Holmes et coll. [Anal. Biochem.

   (1981), 144, 193] et on l'analyse par digestions de restriction à   l'aide   de SalI et EcoRI. Le plasmide d'un clone comportant les fragments de restriction corrects est désigné par   p31/PH05   (-173) RIT. 



  (b) Construction du plasmide   pGTBl135)  
On fait digérer par les enzymes de restriction EcoRI et SalI le plasmide p31/PH05 (-173) RIT. Après séparation sur un gel d'agarose à 1 %, un fragment SalI-EcoRI de 0,45 kb est isolé du gel à l'aide de GENECLEAN (Bio 101). Ce fragment contient la séquence SalI-BamHI de 276 pb de pBR322 et le fragment promoteur   PH05   constitutif BamHI (BstEII)-EcoRI de 173 pb. On soude le fragment SalI-EcoRI de 0,45 kb à l'ADNc de GT EcoRI-BglII de 1,2 kb [fragment (a)] et à la partie de vecteur BamHI-SalI de 3,5 kb pour amplification dans E. coli avec le terminateur de   PH05   fragment (b)] décrit dans l'exemple 2. 1. On effectue la ligature et la transformation de E. coli souche DH5a, comme décrit plus haut, pour obtenir 58 transformants.

   Des plasmides sont isolés par des minipréparations à partir de six colonies indépendantes, et caractérisés par analyse de restriction. 



  Les six plasmides présentent tous les fragments attendus. Un clone correct est désigné par pGTB1135 et utilisé pour 

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 d'autres essais de clonage, pour donner la cassette d'expression codant pour la GT de cellules HeLa, sous contrôle du fragment promoteur   PH05   (-173) constitutif. Cette cassette d'expression peut être excisée du vecteur pGTB1135, sous forme d'un fragment SalI-HindIII de 2 kb dénommé fragment d'ADN   (lB).   



  Exemple 3-Construction des vecteurs d'expression pDPGTA8 et pDPGTB5
Le vecteur de levure utilisé pour l'expression hétérologue est le vecteur épisomique pDP34 (11,8 kb), qui est un vecteur navette levure-E. coli comportant le marqueur de résistance à l'ampicilline pour E. coli et les marqueurs sélectifs de levure URA3 et dLEU2. On fait digérer par l'enzyme de restriction BamHI le vecteur pDP34 (voir EP-340 170). On isole à l'aide de GENECLEAN le vecteur linéarisé, et on complète les extrémités saillantes par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut). On met fin à la réaction au bout de 30 minutes, par chauffage à   650C   pendant 20 minutes en présence de 10 mM d'EDTA.

   Après précipitation à   l'éthanol,   on fait digérer le plasmide par SalI et on le soumet à une électrophorèse en gel sur un gel d'agarose à 0, 8 %. Le vecteur pDP34 coupé par SalI, à extrémités franches (BamHI) est isolé du gel, à l'aide du nécessaire GENECLEAN, sous forme d'un fragment   d'ADN   de 11,8 kb. 



   Par analogie avec la préparation de vecteurs, on fait digérer les plasmides pGTA1132 et pGTB1135 chacun par HindIII. Les extrémités saillantes des plasmides linéarisés sont complétées par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, et on les soumet ensuite à une digestion par SalI, pour obtenir (2A) un fragment SalI-extrémité franche (HindIII) de 2,35 kb, comportant la cassette d'expression régulée par le phosphate, ou 

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 (2B) un fragment SalI-extrémité franche (HindIII) de 2,0 kb, comportant la cassette d'expression constitutive. 



   On effectue la ligature de la partie de vecteur pDB34 SalI-extrémité franche avec le fragment 2A ou le fragment 2B, et la transformation de cellules compétentes de E. coli souche   DH5,   comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant 80 ng de la partie de vecteur et 40 ng de fragment 2A ou 2B, respectivement. On obtient respectivement 58 et 24 transformants. A partir de chaque transformation, six plasmides sont préparés et caractérisés par analyse de restriction. 



  Pour la construction avec la cassette d'expression régulée (fragment 2A), deux plasmides présentent le profil de restriction attendu. L'un des clones est choisi et désigné par pDPGTA8. Pour la construction avec la cassette d'expression constitutive (fragment 2B), un plasmide présente le profil de restriction attendu, et    est désigné   par pDPGTB5. 



  Exemple 4-Transformation de la souche BT150 de
S.   cerevisiae Il  
On prépare de l'ADN purifié au CsCl des vecteurs d'expression pDPGTA8 et pDPGTB5, en suivant le protocole de R. Treisman dans le manuel de Maniatis (voir plus haut). Les souches de S. cerevisiae protéase-déficientes BT150   (MATa,   his4, leu2, ura3, pral, prbl, prcl, cpsl) et H449   (MATa,   prbl,   cpsi,   ura3A5, leu2-3,2-112, cir ) sont transformées chacune avec 5   jug   de chacun des plasmides pDPGTA8, pDPGTB5 et pDP34 (régulation sans cassette d'expression) selon la méthode de transformation à l'acétate de lithium (H. Ito et coll., voir plus haut). Des   transformants Ura sont isoles   et criblés en ce qui concerne l'activité GT (voir plus loin).

   Des cellules de levures transformées individuelles sont sélectionnées et dénommées comme suit : Saccharomyces cerevisiae BT150/pDPGTA8 Saccharomyces cerevisiae   BT150/pDPGTB5   Saccharomyces cerevisiae BT150/pDP34 Saccharomyces cerevisiae H449/pDPGTA8 

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 Saccharomyces cerevisiae H449/pDPGTB5 Saccharomyces cerevisiae H449/pDP34. 



  Exemple 5-Activité enzymatique de GT complète exprimée dans une levure 5. 1- Préparation d'extraits cellulaires
Des cellules de souches transformées de Saccharomyces cerevisiae BT150 et H449 sont cultivées chacune sous sélection à l'uracile, dans des milieux minimaux pour levure (Difco) additionnés d'histidine et de leucine. La vitesse de croissance des cellules ntest pas affectée par l'introduction de l'un quelconque des vecteurs d'expression. Des cel- 
 EMI34.1 
 lules en croissance exponentielle (à DO--= 0, 5) ou des 0/e cellules stationnaires sont recueillies par centrifugation, lavées une fois avec du tampon tris-HCl 50 mM (pH 7,4) (tampon 1), puis remises en suspension dans du tampon 1, à une 
 EMI34.2 
 concentration correspondant à 0, 1-0, 2 DO---.

   On effectue une 3/0 lyse mécanique des cellules par secouement énergique sur un agitateur à vortex, avec des billes de'verre (0,45-0, 5 mm de diamètre) pendant 4 minutes, avec refroidissement intermittent. Les extraits bruts sont utilisés directement pour la détermination de l'activité enzymatique. 



   Le fractionnement des composants cellulaires est réalisé par centrifugation différentielle de l'extrait. En premier lieu, on centrifuge l'extrait à 450 g pendant 5 minutes ; en second lieu, on centrifuge le surnageant obtenu à 20 000 g pendant 45 minutes. 



   On recueille le surnageant et on remet les culots en suspension dans du tampon 1. 



   Pour l'induction par le phosphate de l'expression de la GT sous le contrôle du promoteur PH05 inductible, on transfère en masse les cellules de transformants BT150/pDPGTA8 et H449/pDPGTA8, respectivement, dans un milieu minimal à faible teneur en phosphate [B. Meyhack et coll., Embo J. (1982) 1, 675-680]. Les extraits cellulaires sont préparés comme décrit plus haut. 

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  5.   2- Dosage   de protéine
La concentration de protéine est déterminée au moyen 
 EMI35.1 
 du nécessaire de dosage de protéine BCA (Pierce). 



  5. 3- Dosage de l'activité de la GT On peut mesurer l'activité de la GT à l'aide de méthodes radiochimiques, en utilisant en tant que substrats accepteurs soit de l'ovalbumine, une glycoprotéine qui 
 EMI35.2 
 expose seulement GlcNAc en tant que site accepteur, soit du GlcNAc libre. Les extraits cellulaires (nombre de cellules correspondant à DO---= 1-2) sont dosés pendant 45 ou 3/o 60 minutes à   37 C,   dans 100   gl   de milieu d'incubation contenant 100 mM de tris-HCl (pH 7,4), 50 nCi   d'UDP¯14C-Gal   (325   mCi/mmole),   80 nmoles d'UDP-Gal, 1 gmole de   MnCI2'1 %   de Triton X-100 et 1 mg d'ovalbumine ou 2   gnoles   de   GlcNAc   en tant qu'accepteur.

   Dans le cas où l'on utilise un substrat accepteur de type glycoprotêine, on met fin à la 
 EMI35.3 
 réaction par précipitation à l'acide de la protéine et on détermine la quantité de C-galactose incorporée dans l'ovalbumine par comptage de scintillations en milieu liquide [E. G. Berger et coll. (1978) Eur. J.   Biochem.,   90, 213-222]. Lorsqu'on utilise du   GlcNAc   en tant que substrat accepteur, on met fin à la réaction par addition de 0,4 ml 
 EMI35.4 
 14 d'eau glacée et on sépare l'UDP-C-galactose inutilisée des produits 14C sur une colonne à anions échangés (AGX1-8, BioRad) comme décrit [A. S. Masibay et P. K. Qasaba (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5733-5737].

   On effectue les dosages avec ou sans molécules acceptrices, pour déterminer le degré d'hydrolyse   d'UDP-Gal   par les nucléotides pyrophosphatases. Les résultats sont donnés dans le tableau 2. 

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   Tableau 2 Activité de la GT dans la souche de S. cerevisiae BT150 transformée par différents plasmides 
 EMI36.1 
 
<tb> 
<tb> Activité <SEP> spécifique <SEP> de
<tb> la <SEP> GT <SEP> (mU/mg <SEP> de <SEP> protéine)
<tb> Haute <SEP> teneur <SEP> Faible <SEP> teneur
<tb> Plasmide <SEP> Promoteur <SEP> PHQ-5en <SEP> P. <SEP> en <SEP> P
<tb> @i
<tb> pDP34- < 0, <SEP> 01 <SEP> n. <SEP> d. <SEP> 1)
<tb> pDPGTA8 <SEP> régulé <SEP> par <SEP> phosphate <SEP> 0,1 <SEP> 0,6-1
<tb> pDPGTB5 <SEP> constitutif <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> n. <SEP> d. <SEP> 1)
<tb> 
 Non déterminé. 



   L'activité GT de cultures que l'on a fait passer à des conditions inductibles (milieu minimal à faible teneur en Pi) est approximativement la même que l'activité de cul- 
 EMI36.2 
 tures en milieux minimaux exprimant-la GT de façon constitu- ,. tive (tableau 2). Comme on s'y attendait, on ne trouve aucune activité enzymatique dans les cellules transformées par le vecteur seul. 



   Au cours du fractionnement, la majeure partie de l'activité GT (70-90 %, voir tableau 3) et la plus forte activité spécifique se trouvent toujours dans le culot obtenu par centrifugation à grande vitesse (20 000 g). L'activité de l'enzyme peut être accrue par l'addition de   1-2 %   de Triton X-100 au mélange de dosage enzymatique. Ces deux faits suggèrent que la GT recombinante est liée à la membrane dans les cellules de levures, comme elle l'est dans les cellules HeLa. 

 <Desc/Clms Page number 37> 

 



   Tableau 3
Distribution de l'activité de la GT au cours du fractionnement de cellules BT150/pDPGT5 
 EMI37.1 
 
<tb> 
<tb> Activité <SEP> GT
<tb> cpm <SEP> d'UDP-C-Gal
<tb> Fraction <SEP> incorporé <SEP> dans <SEP> GlcNAc <SEP> %
<tb> Extrait <SEP> brut <SEP> 19 <SEP> 400
<tb> Culot <SEP> (400 <SEP> g) <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> 4,6
<tb> Culot <SEP> (20 <SEP> 000 <SEP> g) <SEP> 15 <SEP> 800 <SEP> 72,5
<tb> Surnageant <SEP> (20 <SEP> 000 <SEP> g) <SEP> 5 <SEP> 00022, <SEP> 9
<tb> total <SEP> :

   <SEP> 21 <SEP> 800 <SEP> 100
<tb> 
 Exemple 6-Purification de la GT recombinante
Afin de libérer l'enzyme liée à la membrane, la fraction de culot, obtenue par centrifugation à 20 000 g, de cellules BT150/pDPGTB5 est traitée par 1 % (p/v) de 
 EMI37.2 
 Triton X-100 pendant 10 minutes à la température ambiante, et équilibrée avec 50 mM de tris-HCl (pH 7, 4), 25 mM de MgCI2'0, 5 mM d'UMP et 1 % (p/v) de Triton X-100. On filtre (0,2   jum)   le surnageant obtenu après centrifugation, puis on le fait passer dans une colonne de   GlcNAc-p-aminophényl-   Sepharose [E. G. Berger et coll. (1976), Experientia, 32, 690-691], avec un volume de lit de 5 ml, à un débit de 0,2 ml/min, à   4 C.   L'enzyme est éluée avec 50 mM de tris-HCl (pH 7,4), 5 mM de   GlcNAc,   25 mM d'EDTA et 1 % de Triton X-100.

   Un seul pic d'activité enzymatique est élué dans 5 fractions (taille : 1 ml). Ces fractions sont réunies et dialysées contre 2   x 1 1   de tris-HCl 50 mM (pH 7,4), 0,1 % de Triton X-100. La GT purifiée est enzymatiquement active. 



  Exemple   7 - Construction d'une   cassette d'expression codant pour la GT soluble
La galactosyltransférase exprimée dans une levure peut être sécrétée dans le milieu de culture si un promoteur de levure est fonctionnellement lié à une première séquence 

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 d'ADN codant pour la séquence signal du gène d'invertase de levure SUC2 liée, dans le cadre de lecture adéquat, à un ADNc codant pour la GT soluble. 



  (a) Séquence partielle   d'ADNc   de GT de cellules HeLa
L'ADNc de GT est excisé du plasmide p4AD113 (exemple 1) par digestion par EcoRI. on isole le fragment de 1,2 kb, contenant l'ADNc complet de GT, puis on le fait digérer partiellement par MvnI (Boehringer) en coupant la séquence de la GT aux positions 43,55, 140 et 288 de la séquence de nucléotides représentée dans l'ID SEQ nO 1. Lors de la digestion de 0,2 gg du fragment EcoRI-EcoRi par 0,75 U de MvnI pendant 1 heure, l'ADNc de GT n'est coupé qu'une fois à la position de nucléotide 134, pour donner un fragment MvnI-EcoRI de 1,1 kb (b) Vecteur pour amplification dans E. coli
On fait digérer le plasmide   pUC18   (Pharmacia) par BamHI et EcoRI dans le site de clonàge multiple.

   On traite ensuite le plasmide par de la phosphatase alcaline, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut), on le soumet à une électrophorèse en gel   d'agarose,. puis   on l'isole du gel, sous forme d'un fragment d'ADN de 2,7 kb. 



  (c) Promoteur   PH05   (-173) constitutif et séquence signal SUC2
On fait digérer par les enzymes de restriction BamHI et   XhoI   le vecteur   p31/PHOS   (-173) RIT (exemple 2). On isole un fragment BamHI-XhoI de 0,25 kb, comportant le promoteur   PH05   (-173) constitutif et la séquence codante adjacente pour la séquence signal de l'invertase (ss inv). On recoupe ensuite le fragment à l'aide de HgaI (BioLabs). La séquence de reconnaissance HgaI est sur le brin d'ADN antisens. L'enzyme de restriction coupe-en amont de la séquence de reconnaissance, de telle façon que l'extrémité en gradin du brin antisens coïncide avec l'extrémité de la séquence codante de la séquence signal de l'invertase.

   Le fragment d'ADN coupé par BamHI et HgaI, de 0,24 kb, contient la séquence promotrice   PHOJ   (-173) constitutive liée à la séquence signal de 

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 l'invertase de levure. 



  (d) Segment de raccord
Le fragment (a) est lié au fragment (c) au moyen d'une séquence de raccord qui est préparée à partir de quantités équimolaires des oligonucléotides synthétiques (Microsynth) 5'CTGCACTGGCTGGCCG3'et 5'CGGCCAGCCAG3'pour le brin complémentaire. Les oligonucléotides sont hybridés l'un à l'autre tout d'abord par chauffage à   950C   et ensuite lent refroidissement jusqu'à   20 C.   Le segment de raccord hybridé est conservé à l'état congelé. 



  (e) Construction du plasmide psGT
Pour la ligature, le vecteur (b) linéarisé, le fragment (a) d'ADNc de GT, le fragment (c) contenant le promoteur et la séquence codant pour le peptide signal, et le segment de raccord (d) sont utilisés en un rapport molaire de 1 : 2 : 2 : 30-100. La ligature est effectuée dans 12   gl   de tampon de ligase [tris-HCl 66 mM (pH 7,5), dithioérythritol 1   mM,      MgCl2   5 mM, ATP 1 mM) pendant   heures   à   16 C.   On utilise le mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E. coli souche   DH5,   comme décrit plus haut. On effectue des minipréparations de plasmide à partir de 24 transformants indépendants.

   Les plasmides isolés sont caractérisés par analyse de restriction, à l'aide de quatre enzymes différentes (BamHI, PstI, EcoRI, XhoI, également en association). Un clone unique ayant le profil de restriction attendu est désigné par psGT. 



   La séquence correcte au niveau du site de fusion de la séquence codant pour le peptide signal de l'invertase, avec l'ADNc codant pour la GT soluble, est confirmée pour le plasmide psGT, au moyen du nécessaire de séquençage T7 (Pharmacia) et de l'amorce   5'-AGTCGAGGTTAGTATGGC-3'commen-   çant à la position-77 dans le promoteur PH05 (-173) constitutif. 

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 EMI40.1 
 



  Séquence Mvnl pour ADN : 5'AAA ATA Tct gca ctg gct ggc cgC GAC CTG AGC 3' 3'TTT TAT AGA CGT gac cga ccg gcG CAG GAC TCG 5'   protéine : Lys rle   Ser Ala Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser
16 19 42 ss inv séquence de la GT site de coupure pour l'endopeptidase signal Les lettres minuscules représentent la séquence de rac- cord. 



   La cassette d'expression pour la GT sécrétée, contenant le promoteur PHO5 (-173) constitutif, la séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase et l'ADNc partiel de GT provenant du plasmide psGT, peut être excisée sous forme d'un fragment SalI (BamHI)-EcoRI de 1,35 kb. La cassette d'expression est encore dépourvue des séquences terminatrices de PH05, à ajouter dans l'étape suivante de clonage. 



  Exemple 8-Construction du vecteur d'expression pDPGTS
Pour la construction du vecteur d'expression pour la GT Soluble, on combine les fragments suivants : (a) Partie de vecteur
Le plasmide pDP34 est digéré et prétraité comme décrit dans l'exemple 3, ce qui donne un fragment de vecteur SalI-extrémité franche de 11,8 kb. 



  (b) Cassette d'expression
On linéarise d'abord le plasmide psGT par digestion par SalI (dans le site de clonage multiple) et on le fait ensuite digérer partiellement par EcoRI. On isole un fragment d'ADN de 1,35 kb, contenant le promoteur   PH05   (-173) constitutif, une séquence dtADN codant pour le peptide signal de l'invertase de levure, et l'ADNc partiel de GT. 

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  (c) Séquence terminatrice de PHOS
On isole la séquence terminatrice de PH05 à partir du plasmide p31 qui est construit à partir du plasmide p30, comme décrit dans EP-100 561. Après digestion par l'enzyme de restriction HindIII, les extrémités saillantes sont complétées par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit plus haut. On fait ensuite digérer le plasmide par EcoRI et on isole un fragment EcoRI-extrémité franche de 0,39 kb, comportant les séquences terminatrices de PHOS. 



   On effectue comme décrit dans l'exemple 2 la ligature des fragments (a), (b) et (c) et la transformation de cellules compétentes de E. coli souche DH5a. A partir des transformants obtenus, on isole des plasmides et on les caractérise par analyse de restriction. Le plasmide d'un clone comportant les fragments de restriction corrects est désigné par    pDPGTS.   



  Exemple 9-Expression de la GT solublè dans une levure
Par analogie avec l'exemple 4, on utilise de   l'ADN,   purifié au CsCl, du vecteur d'expression pDPGTS, pour transformer des souches BT150 et H449 de S. cerevisiae. On isole des transformants Ura+ et on les crible en ce qui concerne l'activité GT. Dans chaque cas, un transformant est sélectionné et dénommé Saccharomyces cerevisiae   BT150/pDPGTS   et Saccharomyces cerevisiae H449/pDPGTS, respectivement. En utilisant l'essai décrit dans l'exemple 5, on constate la présence d'activité GT dans les bouillons de culture des deux transformants. 



  Exemple   10 - clonage   de l'ADNc de la sialyltransférase (ST) à partir de cellules HepG2 humaines
On isole de   l'ADNc   ST à partir de cellules HepG2 par CPR, par analogie avec   l'ADNc   de GT. La préparation   d'ARNpoly   (A) + et la synthèse   d'ADNc   premier brin sont effectuées comme décrit dans l'exemple 1. Pour la PCR, on utilise les amorces (Microsynth) énumérées dans le tableau 5. 

 <Desc/Clms Page number 42> 

 



   Tableau 5
Amorces pour PCR
Correspondant à pb dans Amorce Séquence   (5'à 3') 1) l'ADNc   de ST2) 
 EMI42.1 
 
<tb> 
<tb> PstI/EcoRI
<tb> SIAI <SEP> cgctgcagaattcaaaATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGT <SEP> 1 <SEP> - <SEP> 28
<tb> BamHI
<tb> SIA3 <SEP> cscgaatCCTGTGCTTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGCC <SEP> 1228-1198
<tb> 
 Les lettres majuscules représentent des séquences prove- nant de la ST, les lettres minuscules représentent des séquences supplémentaires comportant des sites pour enzymes de restriction (soulignées). Les codons codant   pour"le départ"et"l'arrêt"de la synthèse   de protéine sont indiqués en gras. 



    2) Séquence d'ADNe   de ST provenant du placenta humain (27) telle que publiée dans EMBL Data Bank   (n    de dépôt X17247). 



   On peut amplifier l'ADNc de ST provenant de HepG2, sous forme d'un fragment d'ADN de 1,2 kb, en utilisant les amorces SIA1 et SIA3. La PCR est effectuée comme décrit pour l'ADNc de GT, dans des conditions de cycle légèrement modifiées : 0,5 minute de dénaturation à 95 C, 1 minute 15 secondes d'hybridation à 560C et 1 minute 30 secondes d'extension à   72OC,   pour un total de 25-35 cycles. Dans le dernier cycle, l'extension d'amorce à   720C   est effectuée pendant 5 minutes. 



   Après PCR, le fragment de 1,2 kb est digéré par les enzymes de restriction BamHI et PstI, analysé sur un gel d'agarose à 1,2 %, élue du gel et   sous-cloné   dans le vecteur pUC18. Le sous-clone résultant est dénommé pSIA2. 

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  Exemple   11 - Construction   de la cassette d'expression de ST constitutive
Pour l'expression hétérologue constitutive, on ligature l'ADNc de ST au fragment promoteur PH05 (-173) constitutif et aux séquences terminatrices de PH05. 



   Le plasmide pSIA2 est d'abord linéarisé par digestion par l'enzyme de restriction BamHI, et ensuite digéré partiellement par EcoRI. Etant donné que l'ADNc de ST contient également un site de restriction interne pour l'enzyme EcoRI (à 144 pb), un fragment de 1,2 kb comportant l'ADNc complet de ST (ID SEQ n  3) est créé par digestion partielle par EcoRI, à l'aide de 1 mg d'ADN et de 0,25 U de EcoRI (1 heure,   37 C).   Après électrophorèse en gel, on isole le fragment EcoRI-BamHI de 1,2 kb, comprenant l'ADNc complet de ST (ID SEQ nO 3). Sur ce fragment d'ADN, le codon d'initia-   tion"ATG"pour   la traduction de la ST est localisé au voisinage du site de restriction EcoRI.

   Trois adénosine phosphates (voir amorce SIA1 pour PCR} fournissent un"A"à la pb position 12, qui se trouve dans la séquence consensus entourant   l'"ATG"provenant   de gènes fortement exprimés dans la levure   [R.   Hamilton et coll. (1987) Nucleic Acids Res., 14,   5125-5149].   Le codon d'arrêt"TAA"et 5 pb de la région non traduite en   3'du gène   sont suivis du site BamHI. 



   On ligature le fragment d'ADNc de ST EcoRI-BamHI de 1,2 kb au fragment SalI-EcoRI de 0,45 kb, contenant le promoteur PH05 (-173) constitutif exemple 2. 2 (b)] et une partie de vecteur BamHI-SalI de 3,5 kb, pour amplification dans E. coli contenant la séquence terminatrice de PH05 [voir exemple 2.1, fragment (b)]. La ligature et la transformation de E. coli souche   DH5     sont effectuées comme décrit dans l'exemple 2.1. Un clone présentant le profil de restriction attendu est désigné par pST2. 



   Le vecteur pST2 comprend la cassette d'expression codant pour la ST de HepG2, sous contrôle du promoteur PH05 (-173) constitutif, sous forme d'un fragment SalI- 

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 EMI44.1 
 HindIII de 2, 0 kb, dénommé "fragment d'ADN (lC) ". 



  Exemple 12-Expression de la ST dans une levure On fait digérer par l'enzyme de restriction BamHI le vecteur pDP34 (voir EP-340 170). On isole à l'aide de GENECLEAN le vecteur linéarisé et on complète les extrémités saillantes par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut). Au bout de 30 minutes, on met fin à la réaction par chauffage à   650C   pendant 20 minutes en présence de 10 mM   d'EDTA.   Après précipitation à l'éthanol, on fait digérer le plasmide par SalI et on le soumet à une électrophorèse en gel sur un gel d'agarose à 0,8 %. Le vecteur pDP34 coupé par SalI-extrémité franche (BamHI) est isolé à l'aide du nécessaire GENECLEAN, sous forme d'un fragment d'ADN de 11,8 kb. 



   On fait digérer le plasmide pST2 par l'enzyme de restriction HindIII, et, par analogie avec la préparation de la partie de vecteur, on la complète au niveau du site HindIII par traitement par le fragment de Klenow de la poly-   mérase.   On soumet le produit à une digestion par Sali, pour obtenir un fragment SalI-extrémité franche (HindIII) de 2, 0 kb, comprenant la cassette d'expression de ST constitutive (2C). 



   On effectue comme décrit dans l'exemple 2 la ligature de 80 ng du vecteur pDP34 avec 40 ng de fragment 2C, et la transformation de cellules compétentes de la souche DH5a de E. coli. Un clone présentant le profil de restriction attendu est choisi et désigné par pDPST5. 



   Pour la transformation d'une levure, on prépare de l'ADN, purifié par CsCl, du vecteur d'expression pDPST5, en suivant le mode opératoire classique donné dans le manuel de Maniatis (voir plus haut). Les souches BT150 et H449 de S. cerevisiae sont transformées chacune à l'aide de 5   g   d'ADN plasmidique, selon la méthode de transformation à l'acétate de lithium (H. Ito et coll., voir plus haut). Des transformants Ura+ sont sélectionnés et criblés en ce qui 

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 concerne l'activité ST. Un transformant positif est sélectionné dans chaque cas, et on les désigne par, respectivement, Saccharomyces cerevisiae BT150/pDPST5 et Saccharomyces cerevisiae H449/pDPSTS. 



  Exemple 13-Activité enzymatique de la ST complète exprimée dans la levure 13. 1-Préparation d'extraits cellulaires
On cultive des cellules de Saccharomyces cerevisiae BT150/pDPST5 dans des conditions de sélection par l'uracile, en milieux minimaux pour levure, additionnés d'histidine et de leucine. Des cellules en croissance exponentielle (à une    DO578 de   0,5) ou des cellules stationnaires sont recueillies par centrifugation, lavées une fois avec du tampon imidazole 50 mM (pH 7,0) (tampon 1) puis remises en suspension dans du tampon 1, à une concentration correspondant à une   DO---de   0, 1-0,2. La lyse mécanique des cellules est effectuée par secouement énergique sur un mélangeur à vortex, avec des billes de verre (0,45 et 0,5 mm de diamètre) pendant 4 minutes, avec refroidissement intermittent. 



   On peut mesurer l'activité ST dans les extraits bruts, en utilisant le dosage décrit ci-dessous. 



  13.   2- Dosage   de l'activité ST
On peut déterminer l'activité ST en mesurant la quantité d'acide sialique radiomarqué qui est transférée de l'acide CMP-sialique à un accepteur glycoprotéique. Après avoir mis fin à la réaction par précipitation à l'acide, on sépare le précipité par filtration au moyen de filtres à la fibre de verre (Whatman GFA), on le lave complètement avec de l'éthanol glacé, puis on détermine sa radioactivité par comptage de scintillations en milieu liquide [Hesford et coll.

   (1984), Glycoconjugate   J.,   1,   141-153].   On dose les extraits cellulaires pendant 45 minutes dans un mélange d'incubation contenant 37 gl d'extraits cellulaires correspondant à environ 0,5 mg de protéine ; 3   ni   de tampon imidazole 50 mM (pH 7,0) ; 50 nM de CMP-acide   N-acétylneuraminique   

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 (Sigma) auquel est ajouté du   CMP-H-acide   N-acétylneuraminique (Amersham) pour donner une activité spécifique finale de 7,3 Ci/mole, et 75 Mg d'asialofétuine (préparée par hydrolyse acide à l'aide de 0,1 M de   H2S04   à   80 C   pendant 60 minutes, suivie de neutralisation, dialyse et lyophilisation). 



   L'activité ST se rencontre dans les extraits bruts préparés à partir de cellules de S. cerevisiae BT150/pDPST5 et H449/pDPST5. 



  Exemple 14-Construction d'une cassette d'expression pour 
 EMI46.1 
 la ST {Lys39-cys406) soluble 39 406 La ST soluble, dénommée ST (Lys39-Cys406) est une variante tronquée à l'extrémité N-terminale qui consiste en 368 aminoacides (ID SEQ nO 4). 
 EMI46.2 
 



  (a) enant de Hep¯ (a) Séquence partielle d'ADNc de ST provenant de HepG2 
On fait digérer le plasmide pSIA2 par EcoRI et on isole un fragment EcoRI-EcoRI de 1, i kb. 



  (b) Vecteur pour amplification dans E. coli
On fait digérer par BamHI et EcoRI le plasmide   pUCIS   (Pharmacia) dans le site de clonage multiple. On traite ensuite le plasmide par de la phosphatase alcaline, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut), on le soumet à une électrophorèse en gel d'agarose, puis on l'isole du gel, sous forme d'un fragment d'ADN de 2,7 kb. 



  (c) Promoteur    PH05 (-173) constitutif et séquence signal SUC2  
On fait digérer par les enzymes de restriction BamHI et   Xhol   le vecteur   p31/PH05   (-173) RIT.. On isole un fragment BamHI-XhoI de 0,25 kb comportant le promoteur PH05 (-173) constitutif et la séquence codante adjacente, codant pour la séquence signal de l'invertase (ss inv). Le fragment est ensuite recoupé par   Hgal   (Biolabs). La séquence de reconnaissance HgaI se trouve sur le brin d'ADN antisens. L'enzyme de restriction coupe en amont de la séquence de reconnaissance, de telle manière que l'extrémité en gradin 5 du brin antisens coïncide avec l'extrémité de la séquence 

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 codante de la séquence signal de l'invertase.

   Le fragment d'ADN coupé par BamHI et HgaI, de 0,24 kb, contient la séquence du promoteur PH05 (-173) constitutif liée à la séquence signal de l'invertase de levure. 



  (d) Segment de raccord
On soude le fragment (a) au fragment (c) au moyen d'une séquence de raccord qui est préparée à partir de quantités équimolaires des oligonucléotides synthétiques 5'-CTGCAAAATTGCAAACCAAGG-3'et 5'-AATTCCTTGGTTTGCAATTT-3'pour le brin complémentaire. Les oliginucléotides sont hybridés l'un à l'autre d'abord par chauffage à 950C et ensuite lent refroidissement jusqutà   200C.   Le segment de raccord hybridé est conservé à l'état congelé. 



  (e) Construction du plasmide psST
Pour la ligature, on utilise le vecteur (b) linéarisé, le fragment   d'ADNc   de la ST (a), le fragment (c) contenant le promoteur et la séquence'codant pour le peptide signal, et le segment de raccord (d),'en un rapport molaire de 1 : 2 : 2 : 30-100. La ligature est effectuée pendant 18 heures à   160C   dans 12   gl   de tampon de ligase   tirais-cl   66 mM 
 EMI47.1 
 {pH 7, 5), dithioérythritol 1 mM, MgC12 5 mM, ATP 1 mM]. On utilise le mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E. coli souche DH5a, comme décrit plus haut. On effectue des minipréparations de plasmide à partir de 24 transformants indépendants.

   Un clone unique, présentant le profil de restriction attendu, après caractérisation par analyse de restriction à l'aide de quatre enzymes différentes (BamHI, PstI, EcoRI, XhoI, également en association) est dénommé psST. 



   La séquence correcte au niveau du site de fusion de 
 EMI47.2 
 la séquence codant pour le peptide signal de l'invertase, avec l'ADNc codant pour la ST (Lys39-Cys406) soluble est confirmée pour le plasmide psST au moyen du nécessaire de   séquençage   T7 (Pharmacia) et de l'amorce   5'-ACGAGGTTAATGGC-3'   partant de la position-77 dans le promoteur   PH05   (-173) 

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 constitutif. 



  Séquence pour ADN1) : 4' AAA ATA Tct gca aaa ttg caa acc aag gAA 3'   3'TTT   TAT AGA GTG ttt aac gtt tgg ttc ctt 5'   Protéine : Lys Ile Ser Ala | Tys Leu Gln Thr Lys Glu 16 19 39   ss inv séquence de la ST site de coupure pour endopeptidase signal   1) Les   lettres minuscules représentent la séquence de rac- cord. 



   La cassette d'expression pour la ST sécrétée,. contenant le promoteur PHO5 (-173) constitutif, la séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase et   l'ADNc   de ST partiel provenant du plasmide psST, peut être excisée sous forme d'un fragment SAlI (BamHI)-EcoRI de 1,35 kb. La cassette d'expression est encore dépourvue des séquences terminatrices de   PH03,   à ajouter dans l'étape suivante de clonage. 



  Exemple 15-Construction du vecteur d'expression pDPSTS
Pour la construction du vecteur d'expression pour la ST   (Ly-g-Cys. g)   soluble, on combine les fragment suivants : (a) Partie de vecteur
Le plasmide pD34 est digéré et prétraité comme décrit dans l'exemple 3, ce qui donne un fragment vecteur SalIextrémité franche de 11,8 kb. 



  (b) Cassette d'expression
Le plasmide psST est d'abord linéarisé par digestion par SalI (dans le site de clonage multiple) et ensuite partiellement digéré par EcoRI. On isole un fragment d'ADN de 1,35 kb, contenant le promoteur PH05 (-173) constitutif, une séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase de levure, et l'ADNc partiel de la ST. 

 <Desc/Clms Page number 49> 

 



  (c) Séquence terminatrice de PH05
On isole la séquence terminatrice de   PH05 à   partir du plasmide p31 qui est construit à partir du plasmide p30, comme décrit dans EP-100 561. Après digestion par l'enzyme de restriction HindIII, on complète les extrémités saillantes par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit plus haut. On fait ensuite digérer le plasmide par EcoRI et on isole un fragment EcoRI-extrémité franche de 0, 39 kb comportant les séquences terminatrices de PHO5. 



   On effectue comme décrit dans l'exemple 2 la ligature des fragments (a), (b) et (c) et la transformation de cellules compétentes de E. coli   souche DH5a.   A partir des transformants obtenus, on isole des plasmides et on les caractérise par analyse de restriction. Le plasmide d'un clone comportant les fragments de restriction corrects est dénommé pDPSTS. \ Exemple 16-Expression de la ST soluble dans une levure
Par analogie avec l'exemple 4, on utilise de   l'ADN,   purifié par CsCI, du vecteur d'expression pDPSTS, pour transformer les souches BT150 et H449 de S. cerevisiae. On isole des transformants   Ura+   et les crible en ce qui concerne l'activité ST. On sélectionne un transformant dans chaque cas, et ces transformants sont dénommés Saccharomyces cerevisiae BT150/pDPSTS et Saccharomyces cerevisiae H449/pDPSTS.

   En utilisant l'essai décrit dans l'exemple 13, on constate la présence d'acticvité ST dans les bouillons de culture des deux transformants. 



  Exemple   17 - Construction d'une   cassette d'expression pour la ST   (Lysy-Cys ) soluble  
La ST soluble, dénommée ST   (Lys27-Cys406)   est une variante tronquée à   l'extrémité   N-terminale qui contient le domaine catalytique et toute la région de la tige, et consiste en 380 aminoacides, à savoir les aminoacides 27 à 406 de la séquence d'aminoacides donnée dans l'ID SEQ nO 3. 

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  (a) Séquence d'ADNc partielle de la ST de HepG2
On fait digérer le plasmide pSIA2 par EcoRI et on isole un fragment EcORI-EcoRI de 1,1 kb   (b) Vecteur pour amplification dans E. coH  
On fait digérer par BamHI et EcoRI le plasmide pUC18 (Pharmacia) dans le site de clonage multiple. Le plasmide est ensuite traité par de la phosphatase alcaline, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut), sousmis à une électrophorèse en gel d'agarose, puis isolé du gel sous forme d'un fragment d'ADN de 2,7 kb. 



  (c) Promoteur PHO5(-173) constitutif et séquence signal SUC2
On fait digérer par les enzymes de restriction BamHI et   XhoI   le vecteur   p31/PH05   (-173) RIT (exemple 2). On. isole un fragment BamHI-XhoI de 0,25 kb, comportant le promoteur   PH05   (-173) constitutif et la séquence codante adjacente pour la séquence signal de l'invertase (ss inv). Le fragment est ensuite recoupé par HgaI (BioLabs). La séquence de reconnaissance HgaI se trouve sur le brin d'ADN antisens. L'enzyme de restriction coupe en amont de la séquence de reconnaissance, de telle manière que   l'extrémité   5 en gradin du brin antisens coïncide avec l'extrémité de la séquence codante de la séquence signal de l'invertase.

   Le fragment coupé par BamHI et HgaI, de 0,24 kb, contient la séquence promotrice PH05 (-173) constitutive liée à la séquence signal de l'invertase de levure. 



  (d) Segment de raccord
Le fragment (a) est soudé au fragment (c) au moyen d'une séquence de raccord qui est préparée à partir de quantités équimolaires des oligonucléotides synthétiques   5'-CTGCAAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGG-3'   et 5'-AATTCCTTGTTGCAATTTAAAGGAATCATAGTAACTCCCTTTCTTCTTTTCCTT-3' pour le brin complémentaire. Les oligonucléotides sont hybridés l'un à l'autre d'abord par chauffage à   950C   et ensuite lent refroidissement jusqu'à   200C.   Le segment de 

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 raccord hybridé est conservé à l'état congelé. 



  (e) Construction du plasmide   psTI  
Pour la ligature, on utilise le vecteur (b) linéarisé, le fragment (a)   d'ADNc   de la ST, le fragment (c) contenant le promoteur et la séquence codant pour le peptide signal, et le segment de raccord (d), en un rapport molaire de 1 : 2 : 2 : 30-100. On effectue la ligature pendant 18 heures, à   16 C,   dans 12   ni   de tampon de ligase [tris-HCl 66 mM (pH 7,5), dithioérythritol 1 mM,    MgCl2     5   mM, ATP 1 mM. On utilise le mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E. coli souche   DH5a   comme décrit plus haut. 



  On effectue des minipréparations de plasmide à partir de 24 transformants indépendants. Un clone unique présentant le profil de restriction attendu, après caractérisation par analyse de restriction au moyen de quatre enzymes différentes (BamHI, PstI, EcoRI, XhoI, également en association) est dénommé   psSTl.'  
On confirme pour le plasmide psSTl la séquence correcte au niveau du site de fusion de la séquence codant pour le peptide signal de l'invertase, comportant   l'ADNc   
 EMI51.1 
 codant pour la ST (Lys27-cys406) soluble, en utilisant le 27 406 nécessaire de séquençage T7 (Pharmacia) et l'amorce   5'-AGTCGAGTAGTATGGC-3'commençant   à la position-77 dans le promoteur PH05 (-173) constitutif. 



  Séquence 
 EMI51.2 
 pour ADN 5'MA ATA Tet gea aag gaa aag aag aaa ggg 3 1 
3'TTT TAT AGA GTG ttc ctt   ttc ttc ttt cee 5'     Protéine : Lys Ile Ser Ala Lys Glu Lys Lys Lys Gly 16 19 27   ss inv séquence de la ST site de coupure pour endopeptidase signal
Les lettres minuscules représentent la séquence de rac- cord. 

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   La cassette d'expression pour la ST (Lys27-Cys406) sécrétée, contenant le promoteur   PH0. 5 (-l73)   constitutif, la séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase, et l'ADNc partielle de ST provenant du plasmide psST1, peut être excisée sous forme d'un fragment SalI (BamHI)-EcoRI de 1,35 kb. La cassette d'expression est encore dépourvue des séquences terminatrices de   PH05,   à ajouter dans l'étape suivante de clonage. 



  Exemple 18-Construction du vecteur d'expression pDPSTS1
Pour la construction du vecteur d'expression pour la ST   (Lys---Cys.--)   soluble, on combine les fragments suivants : (a) Fragment vecteur
Le plasmide pDP34 est digéré et prétraité comme décrit dans l'exemple 3, pour donner un fragment vecteur 
 EMI52.1 
 SalI-extrémité franche de 11, 8 kb. 



  (b) Cassetted/expression Le plasmide psST1 est d'abord linéarisé par digestion par SalI (dans le site de clonage multiple) et ensuite digestion partielle par EcoRI. On isole un fragment d'ADN de 1,35 kb contenant le promoteur   PH03   (-173) constitutif, une séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase de levure, et l'ADNc partiel de ST. 



  (c) Séquence   terminatrice dePHO  
La séquence terminatrice de PH05 est isolée à partir du plasmide p31, qui est construit à partir du plasmide p30, comme décrit dans EP-100 561. Après digestion par l'enzyme de restriction HindIII, on complète les extrémités saillantes par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit plus haut. On fait ensuite digérer le plasmide par EcoRI et on isole un fragment EcoRI-extrémité franche de 0,39 kb, comportant les séquences terminatrices de PHOS. 



   On effectue comme décrit dans l'exemple 2 la ligature des fragments (a), (b) et (c) et la transformation de cellules compétentes de E. coli souche DH5a. A partir des 

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 transformants obtenus, on isole des plasmides et on les caractérise par analyse de restriction. Le plasmide d'un clone comportant les fragments corrects de restriction est dénommé pDPSTS1. 
 EMI53.1 
 



  Exemple 19-Expression de la ST (Lys27-Cys406) soluble dans une levure
Par analogie avec l'exemple 4, on utilise   l'ADN,   purifié par CsCl, du vecteur d'expression pDPSTS1, pour transformer les souches BT50 et H449 de S. cerevisiae. Les transformants Ura sont isolés et criblés en ce qui concerne l'activité de la ST. On sélectionne un transformant dans chaque cas, et ceux-ci sont dénommés Saccharomyces cerevisiae BT150/pDPSTS1 et Saccharomyces cerevisiae H449/pDPSTS1. A l'aide de l'essai décrit dans l'exemple 13, on constate la présence de l'activité ST dans les bouillons de culture des deux transformants. 



  Exemple   20-Clonage   de l'ADNc de FT à partir de la lignée cellulaire HL60 humaine,
Sur la base de la séquence d'ADNc publiée [S. E. Goelz et coll. (1990) Cell, 63, 1349-1356] pour la ELFT (fucosyltransférase à ligand ELAM-1) codant pour lia   (1-3)   fucosyltransférase, on synthétise les amorces oligonucléotidiques suivantes pour amplifier par la méthode PCR un fragment d'ADN englobant le cadre de lecture ouvert de l'ADNc de ELFT :   5'-CAGCGCTGCCTGTTCGCGCCAT-3'   (ELFT-1B) et   5'-GGAGATGCACAGTAGAGGATCA-3'   (ELFT-2B). ELFT-1B amorce aux paires de bases 38-59 de la séquence publiée, et ELFT-2B amorce aux paires de bases 1 347-1 346 de l'antisens. On utilise les amorces pour amplifier un fragment de 1,3 kb, au moyen du nécessaire Taq polymérase Cetus Perkin-Elmer.

   Le fragment est amplifié à partir   d'ADNc   de HL60 neuf, en présence de 5 % de DMSO et 2 mM de   MgCl-, avec   le cycle suivant :   95 C,   5 minutes 25 x (1 minute à   95 C,   1 minute à   60 C,   1,5 minute à   72 C)   

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 10 x (1 minute à   95 C,   1 minute à 60 C, 1,5 minute +
15 s/cycle à   72 C).   



  L'électrophorèse en gel d'agarose révèle une bande principale de 1,3 kb qui, une fois digérée par SmaI ou ApaI, donne la structure prédite par la séquence publiée. La bande de 1,3 kb est purifiée au moyen d'un nécessaire GENECLEAN (Bio 101) et est sous-clonée dans le vecteur pCR1000 (Invitrogen). Un clone unique comportant le segment d'insertion correct de 1,3 kb est sélectionné et dénommé BRB.   ELFT/pCR1000-13.     L'ADNc   de FT est inséré dans le vecteur en orientation inversée par rapport au promoteur T7. Le cadre de lecture ouvert de l'ADNc de Ft a été complètement séquencé et est identique à la séquence publiée (ID SEQ nO 5). 



  Exemple 21-Construction de plasmides pour l'expression inductible et constitutive de la
FT   (Arg62-Arg405)   soluble dans une levure
La FT   (Arg--Arg.--)   soluble est exprimée à partir de l'ADNc de FT partant de la position de nucléotide 241 (site de restriction NruI) avec omission de la région N-terminale codant pour la queue cytoplasmique et le domaine de recouvrement de la membrane (voir ID SEQ n  5). 



   On fait digérer le plasmide BRB.   ELFT/pCR1OO-13   par HindIII, qui coupe dans la région   3'de   clonage multiple de   l'élément   d'insertion d'ADNc de FT. Les extrémités cohésives sont converties en extrémités franches dans une réaction avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase. Des segments de liaison   XhoI     (5'-CCTCGAGG-3',   BioLabs) sont soumis à la kinase, hybridés et ligaturés aux extrémités franches du plasmide, au moyen d'un excès de 100 M de segments de liaison. Les segments de liaison n'ayant pas réagi sont éliminés par précipitation à l'isopropanol de l'ADN, qui est encore digéré par   XhoI   et NruI (coupure à la position de nucléotide 240 de l'ADNc de FT, selon   l'ID   SEQ   n    5).

   Le fragment (a) NruI-XhoI de 1,1 kb contient la séquence d'ADNc de 

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 la FT dépourvue de la région codant pour la queue cytoplasmique et le domaine de recouvrement de la membrane, allant jusqu'à l'aminoacide 61. 



   On fait digérer chacun par SalI et   XhoI   les plasmides p31RIT12 et   p31/PH05 (-173}   RIT (voir exemple 2). Les fragments de 0,9 kb et 0,5 kb, respectivement, sont isolés et coupés par HgaI. Les extrémités cohésives résultantes sont complétées à l'aide du fragment de Klenow de   l'ADN   polymérase. Les extrémités franches créées coïncident avec l'extrémité   3'de   la séquence codante pour la séquence signal de l'invertase de levure.

   La coupure subséquente par BamHI libère un fragment (b) BamHI-extrémité franche de 596 pb, qui comprend le promoteur   PH03   inductible et la séquence signal de l'invertase, avec son propre codon ATG, ou un fragment (c) BamHI-extrémité franche de 234 pb, comperenant le court promoteur PH05 (-173) constitutif et la séquence signal de l'invertase. 



   Le plasmide   p31RIT12   est linéarisé à l'aide de l'endonucléase de restriction SalI. La digestion partielle par HindIII, en présence de bromure d'éthidium, donne un fragment SalI-HindIII de 1 kb comprenant la séquence SalI-BamHI de pBR322 de 276 pb, le promoteur de 534 pb de la phosphatase acide PH05 de la levure, la séquence signal de l'invertase de levure (codant pour 19 aminoacides) et le terminateur de transcription de PH05. Le fragment SalI-HindIII de 1 kb de p31RIT12 est clone dans le vecteur navette de   levure-E.   coli pJDB207 [J. D. Beggs dans : Molecular Genetics in yeast (Génétique moléculaire chez la levure), Alfred Benzon Symposium 16, Copenhague, 1981, p. 383-389], qui a été coupé par SalI et HindIII.

   Le plasmide résultant, contenant l'élément d'insertion de 1 kb, est dénommé   pJDB207/PHOS-RIT12.   



   On fait digérer le plasmide pJDB207/PH05-RIT12 par BamHI et   XhoI   et on isole le grand fragment (d) BamHI-XhoI de 6,8 kb. Ce fragment contient l'ensemble des séquences du 

 <Desc/Clms Page number 56> 

 vecteur pJDB207 et le terminateur de transcription de PHOS. 



   En utilisant des conditions courantes pour ligature d'extrémités franches, on ligature le fragment (b) BamHIextrémité franche de 596 pb, le fragment (a) NruI-XhoI de 1,1 kb et le fragment vecteur (d) XhoI-BamHI de 6, 8 kb. On utilise des parties aliquotes du mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E. coli HB101. On analyse par digestions de restriction l'ADN plasmidique provenant de colonies résistantes à l'ampicilline.

   Un clone unique comportant le plasmide d'expression correct est dénommé   pJDB207/PH05-I-FT.   La ligature des fragments d'ADN (c), (a) et (d) conduit au plasmide d'expression   pJDB207/PHOS (-173) -I-FT.   Les cassettes d'expression de ces plasmides comprennent la séquence codante de la séquence signal de l'invertase, soudée, en cadre de lecture, à celle de l'a   (1-3)   fucosyltransférase soluble qui est exprimée sous le contrôle du gène PH05 inductible-ou du promoteur PH05 (-173) constitutif, respectivement. Les cassettes d'expression sont clonées dans le vecteur navette de levureE. coli pJDB207, entre les sites de restriction BamHI et HindIII.

   La séquence de nucléotides au niveau du site de la fusion entre la séquence signal de l'invertase et l'ADNc codant pour la FT soluble, est confirmée par séquençage d'ADN sur l'ADN plasmidique bicaténaire, au moyen de l'amorce   5'-AGTCGAGGTTAGTATGGC-3'représentant   la séquence nucléotidique aux positions-77 à-60 du PH05, ainsi que du promoteur   PHOS   (-173).

   La jonction correcte est la suivante :   5'AAA ATA   TCT GCA CGA CCG GTG 3'   3'TTT   TAT AGA CGT GCT GGC CAC 5'
Lys Ile Ser Ala Arg Pro Val
19 62
FT ss inv site de coupure pour peptidase signal 

 <Desc/Clms Page number 57> 

 Exemple 22-Construction de plasmides pour l'expression inductible et constitutive de la FT liée à la membrane dans la levure
Ces constructions utilisent la séquence codante de l'ADNc de FT, avec son propre codon ATG. La séquence de nucléotides immédiatement en amont de l'ATG est toutefois plutôt défavorable pour l'expression dans la levure, en raison de sa forte teneur en   G-C.   En utilisant des méthodes PCR, on. a remplacé cette région par une séquence riche en A-T. En même temps, un site de restriction EcoRI est introduit au niveau des nouvelles positions de nucléotides-4 à - 9. 



   Tableau 6 
 EMI57.1 
 
<tb> 
<tb> Amorces <SEP> pour <SEP> PCR
<tb> Correspondant <SEP> à <SEP> pb
<tb> Amorce <SEP> Séquence <SEP> (5' <SEP> à <SEP> 3')1) <SEP> dans <SEP> l'ADNc <SEP> de <SEP> FT
<tb> FT1 <SEP> cgagaattcataATGGGGGCACCGTGGGGC <SEP> 58 <SEP> à <SEP> 75
<tb> FT2 <SEP> ccgctcqaqGAGCGCGGCTTCACCGCTCG <SEP> 1285 <SEP> à <SEP> 1266
<tb> 
 Les lettres majuscules représentent des nucléotides pro- venant de la FT, le lettres minuscules sont de nouvelles séquences supplémentaires ; les sites de restriction sont soulignés ; les codons   d'''initiation''et     d'''arrêt''sont   indiqués en gras. 



   On utilise des conditions normales de PCR pour amplifier l'ADNc de FT avec les amorces FT1 et FT2 (voir 
 EMI57.2 
 tableau 6) en 30 cycles de synthèse d'ADN (ADN polymérase Taq, Perkin-Elmer, 5 U/l, 1 minute à 72 C), de dénaturation (10 secondes à 93 C) et d'hybridation (40 secondes à   600C).   



  Le fragment d'ADN de 1,25 kb résultant est purifié par extraction au phénol et précipitation à l'éthanol, puis digéré par EcoRI, XhoI et NruI. Le fragment (e) EcoRI-NruI 

 <Desc/Clms Page number 58> 

 de 191 pb est isolé sur un gel d'agarose préparatif à 4 % Nusieve 3 : 1 (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) dans du tampon Tris-borate pH 8,3, élué du gel et précipité à   l'éthanol.   Le fragment (e) comprend la partie   5'du   gène de la FT codant pour les aminoacides 1 à 61. L'ADN a une extension en 5'avec le site EcoRI, comme dans l'amorce FT1 pour PCR. 



   On fait digérer chacun par EcoRI et   Xhol   les plasmides p31RIT12 et   p31/PH05   (-173) RIT. Les grands fragments vecteurs (f et g, respectivement) sont isolés sur un gel d'agarose préparatif à 0,8 %, élués et purifiés. Le fragment (f) XhoI-EcoRI de 4,1 kb comprend le vecteur dérivé de 
 EMI58.1 
 pBR322, le promoteur PH05 de 534 pb (site EcoRI en 3') et le terminateur de transcription de Phots de 131 pb (site XhoI en 5'). Le fragment (g) XhoI-EcoRI de 3, 7 kb ne diffère que par le court promoteur constitutif'PH05 (-173) de 172 pb (site EcoRI en 3') au lieu du promoteur PH05 complet. 



   On ligature le fragment (e) EcoRI-NruI de 191 pb, le fragment (a) NruI-XhoI de 1,1 kb et le fragment (f)   XhoI-   EcoRI de 4,1 kb. On utilise une partie aliquote de 1   Ul   du mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E. coli HB101. On analyse   lADN   plasmidique provenant de colonies résistantes à l'ampicilline. L'ADN plasmidique provenant d'un seul clone est dénommé p31R/PHO5-ssFT. 
 EMI58.2 
 



  La ligature des fragments d'ADN (e), (a) et (g) conduit au plasmide p31R/PHOS (-173) -ssFT. Ces plasmides com- prennent la séquence codante de la FT liée à la membrane, sous le contrôle du gène PH05 inductible ou du promoteur   PH05   (-173) constitutif, respectivement. 



  Exemple   23-Clonage   des cassettes d'expression de la FT dans pDP34 
 EMI58.3 
 Les plasmides p31R/PHOS-ssFT et p31R/PHOS (-173)-ssFT sont digérés par HindIII, qui coupe en 3'du terminateur de transcription de PH05. Après une réaction avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase, on fait digérer l'ADN par 

 <Desc/Clms Page number 59> 

 SalI. On isole les fragments SalI-extrémité franche de 2,3 kb et 1,9 kb, respectivement. 



   On fait digérer partiellement les plasmides pJDB207/PH05-I-FT et pJDB207/PH05 (-173)-I-Ft par HindIII en présence de 0,1 mg/ml de bromure d'éthidium (pour éviter la coupure en un site HindIII supplémentaire dans la séquence signal de l'invertase) et on les traite ensuite par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase et SalI, comme ci-dessus. 



  On isole les fragments de 2,1 kb et 1,8 kb, respectivement. 



   Les quatre fragments d'ADN sont ligaturés chacun au fragment vecteur SalI-extrémité franche de 11,8 kb de pDP34 (voir exemple 3). Après transformation de cellules compétentes de E. coli HB101 et analyse de l'ADN plasmidique de transformants individuels, quatre plasmides d'expression 
 EMI59.1 
 corrects sont dénommés pDP34/PHOS-I-FTi pDP34/PN0. 5 (-173)-I-FT ; pDP34R/PH05-ssFT et   pDP34R/PHOS (-173) -ssFT.   



   On transforme les souches BT150 et H449 de S. cerevisiae au moyen de 5   g   chaque des quatre plasmides d'expression (ci-dessus) selon l'exemple 4. Des colonies de levures transformées individuelles sont sélectionnées et reçoivent les dénominations suivantes : 
 EMI59.2 
 Saccharomyces cerevisiae BT150/pDP34/PHOS-I-FTi " "BT150/pDP34/PHOS (-173) -I-FTi ""BT150/pDP34R/PH03-ssFT ; BT150/pDP34R/PH05 (-173)-ssFT ; H449/pDP34/PH05-I-FT ; ""H449/pDP34/PHO5-(-173)-I-FT ;   H449/pDP34R/PH05-ssFT ; " " H449/pDP34R/PHO5(-173)-ssFT.   



   On effectue comme dans l'exemple 5 la fermentation et la préparation des extraits cellulaires. En utilisant un essai analogue à celui décrit par Goelz et coll. (voir plus haut), on constate la présence d'activité FT dans les extraits bruts préparés à partir des souches 

 <Desc/Clms Page number 60> 

 
 EMI60.1 
 BT150/pDP34R/PH05-ssFT, BT150/pDP34R/PH05 (-173) -ssFT, H449/pDP34R/PH05-SSFT et H449/pDP34R/PHOS (-173)-ssFT et dans le bouillon de culture des souches H449/pDP34/PH05-I-FT, H449/pDP34/PH05 (-173) -I-FT, BT150/pDP34/PH05-I-FT et BT150/pDP34/PH05 (-173)-I-FT. 



  Dépôts de micro-organismes 
Les souches suivantes de micro-organismes ont été déposées à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 16, D-3300 Braunschweig (dates de dépôt et numéros donnés ci-après) : Escherichia coli JM109/pDP34 : 14 mars 1988 ; DSM 4473   Escherichia   coli   HB101/p30   : 23 octobre 1987 ; DSM 4297 Escherichia coli HB101/p31R : 19 décembre 1988 ; DSM 5116 Saccharomyces cerevisiae H449 : 18 février 1988 ; DSM 4413 Saccharomyces cerevisiae BT150 : 23 mai 1991 ;

   DSM 6530. 

 <Desc/Clms Page number 61> 

 Annexes-Identification des séquences ID SEQ nO 1 
 EMI61.1 
 7 Type de séquence : nucléotide avec protéine correspondante Longueur de la séquence : 1 265 pb Nombre de brins : bicaténaire Topologie : linéaire Type de molécule : recombinante Source expérimentale directe : plasmide p4AD113 de E. coli
DH5a/p4AD113 Caractéristiques : de 6 à 1 200 pb Séquence   d'ADNc   codant pour la galactosyltransférase de cellules HeLa de 1 à 6 pb site EcoRI de 497 à 504 pb site NotI de 1 227 à 1 232 pb site EcoRI de 1 236 à 1 241 pb site EcoRV de 1 243 à 1 248 pb site   BglII,'   Propriétés : fragment EcoRI-HindIII provenant du plasmide p4AD113 comprenant l'ADNc de cellules HeLa codant pour la galactosyltransférase complète (EC 2.4. 1.22). 



  GAATTC ATG AGG CTT CGG GAG CCG CTC CTG AGC GGC AGC 39
Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser
5 10 GCC GCG ATG CCA GGC GCG TCC CTA CAG CGG GCC TGC CGC 78 Ala Ala Met Pro Gly Ala Ser Leu   Gln   Arg Ala Cys Arg
15 20 CTG CTC GTG GCC GTC TGC GCT CTG CAC CTT GGC GTC ACC 117 Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr 25 30 35 CTC GTT TAC TAC CTG GCT GGC CGC GAC CTG AGC CGC CTG 156 Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu
40 45 50 

 <Desc/Clms Page number 62> 

 CCC CAA CTG GTC GGA GTC TCC ACA CCG CTG CAG GGC GGC 195 Pro   Gln   Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly
55 60 TCG AAC AGT GCC GCC GCC ATC GGG CAG TCC TCC GGG GAG 234 Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu
65 70 75 CTC CGG ACC GGA GGG GCC CGG CCG CCG CCT CCT CTA GGC 273 Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly
80 85 GCC TCC TCC CAG CCG 

  CGC CCG GGT GGC GAC TCC AGC CCA 312 Ala Ser Ser Gln Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 
 EMI62.1 
 90 95 100 ! GTC GTG GAT TCT GGC CCT GGC CCC GCT AGC AAC TTG ACC 351 Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr
105 110 115 TCG GTC CCA GTG CCC CAC ACC ACC GCA CTG TCG CTG CCC 390 Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro
120 125 GCC TGC CCT GAG GAG TCC CCG CTG CTT GTG GGC CCC ATG 429 Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met
120 135 140 CTG ATT GAG TTT AAC ATG CCT GTG GAC CTG GAG CTC GTG 468 Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val
145 150 GCA AAG CAG AAC CCA AAT GTG AAG ATG GGC GGC CGC TAT 507 Ala Lys Gln Asn Pro Asn Val Lys   Mer Gly   Gly Arg Tyr 155 160 165 

 <Desc/Clms Page number 63> 

 GCC CCC AGG GAC TGC GTC TCT CCT CAC AAG GTG GCC ATC 546 Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His Lys Val Ala Ile
170 175 180 ATC ATT CCA TTC 

  CGC AAC CGG CAG GAG CAC CTC AAG TAC 585 Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys Tyr
185 190 TGG CTA TAT TAT TTG CAC CCA GTC CTG CAG CGC CAG CAG 624 Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu   Gln   Arg   Gln     Gln  
195 200 205 CTG GAC TAT GGC ATC TAT GTT ATC AAC CAG GCG GGA GAC 663 Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn   Gln   Ala Gly Asp
210 215 ACT ATA TTC AAT CGT GCT AAG CTC CTC AAT GTT GGC TTT 702 Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe 220 225 230 CAA GAA GCC TTG AAG GAC TAT GAC TAC ACC TGC TTT GTG   741     Gln   Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val
235 240 245 TTT AGT GAC GTG GAC CTC ATT CCA ATG AAT GAC CAT AAT 780 Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn
250 255 GCG TAC AGG TGT TTT TCA CAG CCA CGG CAC ATT TCC GTT 819 Ala Tyr Arg 

  Cys Phe Ser   Gln   Pro Arg His Ile Ser Val
260 265 270 
 EMI63.1 
 GCA ATG GAT AAG TTT GGA TTC AGC CTA CCT TAT GTT CAG 858 Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 

 <Desc/Clms Page number 64> 

 TAT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA AGT AAA CAA CAG TTT 897 Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 285 290 295 CTA ACC ATC AAT GGA TTT CCT AAT AAT TAT TGG GGC TGG 936 Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp
300 305 310 GGA GGA GAA GAT GAT GAC ATT TTT AAC AGA TTA GTT TTT 975 Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe
315 320 AGA GGC ATG TCT ATA TCT CGC CCA AAT GCT GTG GTC GGG 1014 Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly
325 330 335 AGG TGT CGC ATG ATC CGC CAC TCA AGA GAC AAG AAA AAT 1053 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn
340 345 GAA CCC AAT CCT CAG AGG TTT GAC CGA ATT GCA CAC ACA 1092 Glu Pro 

  Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr 350 355 360 AAG GAG ACA ATG CTC TCT GAT GGT TTG AAC TCA CTC ACC 1131 Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr
365 370 375 TAC CAG GTG CTG GAT GTA CAG AGA TAC CCA TTG TAT ACC 1170 Tyr   Gln   Val Leu Asp Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr
380 385 CAA ATC ACA GTG GAC ATC GGG ACA CCG AGC TAGGACTTTT 1210 Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser
390 395 

 <Desc/Clms Page number 65> 

 GGTACAGGTA AAGACTGAAT TCATCGATAT CTAGATCTCG 1250 AGCTCGCGAA AGCTT 1265 

 <Desc/Clms Page number 66> 

 ID SEQ nO 2 Type de séquence : protéine Longueur de la séquence : 357 aminoacides Type de molécule : fragment C-terminal de la galactosyl- transférase complète de cellules HeLa Propriétés :

  *  galactosyltransférase soluble (EC 2.4. 1.22) provenant de cellules HeLa
Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu
5 
Pro Gin Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly
10 15 20 
Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu
25 30 35 
Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly
40 45 
Ala Ser Ser Gln Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro
50 55 60 
Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr
65 70 
Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro
75 80 85 
Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met
90 95 100 
Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val
105 110 
Ala Lys   Gln   Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr
115 120 125 

 <Desc/Clms Page number 67> 

 Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His Lys Val Ala Ile
130 135 Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg   Gln   Glu His Leu Lys Tyr 140 145 150 Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro 

  Val Leu   Gln   Arg   Gln     Gln  
155 160 165 Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn   Gln   Ala Gly Asp
170 175 Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe
180 185 190 Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val
195 200 Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 205 210 215 Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val
220 225 230 Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln
235 240 Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe
245 250 255 Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp
260 265 Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe 270 275 280 

 <Desc/Clms Page number 68> 

 Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly
285 290 295 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn
300 305 Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His 

  Thr
310 315 320 Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr
325 330 Tyr Gln Val Leu Asp Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 335 340 345 Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser-
350 355 

 <Desc/Clms Page number 69> 

 ID SEQ nO 3 Type de séquence : nucléotide avec protéine correspondante Longueur de la séquence : 1 246 pb Nombre de brins : bicaténaire Topologie : linéaire Type de molécule : recombinante Source expérimentale directe : plasmide pSIA2 de E. coli   DH5cx/pSIA2   Caractéristiques : de 15 à 1 232 pb séquence d'ADNc codant pour la sialyl- transférase de cellules HepG2 de 1 à 6 pb site PstI de 6 à 11 pb site EcoRI de 144 à 149 pb site EcoRI de 1 241 à 1 246 pb site BamHI Propriétés :

   fragment PstI-BamHI provenant du plasmide pSIA2 comprenant   1'ADNc   de HepG2 codant pour la sialyltransférase complète (EC 2.4. 99.1) 
CTGCAGAATT CAAA ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA 38 
 EMI69.1 
 Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys 5 AAG TTC AGC TGC TGC GTC CTG GTC TTT CTT CTG TTT GCA 77 Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val Phe Leu Leu Phe Ala
10 15 20 GTC ATC TGT GTG TGG AAG GAA AAG AAG AAA GGG AGT TAC 116 Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly Ser Tyr
25 30 TAT GAT TCC TTT AAA TTG CAA ACC AAG GAA TTC CAG GTG 155 Tyr Asp Ser Phe Lys Leu   Gln   Thr Lys Glu Phe   Gln   Val
35 40 45 

 <Desc/Clms Page number 70> 

 TTA AAG AGT CTG GGG AAA TTG GCC ATG GGG TCT GAT TCC 194 Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser
50 55 60 CAG TCT GTA TCC TCA AGC AGC ACC CAG GAC CCC CAC AGG 233 Gln Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr 

    Gln   Asp Pro His Arg
65 70 GGC CGC CAG ACC CTC GGC AGT CTC AGA GGC CTA GCC AAG 272 Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys
75 80 85 GCC AAA CCA GAG GCC TCC TTC CAG GTG TGG AAC AAG GAC 311 Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp Asn Lys Asp
90 95 AGC TCT TCC AAA AAC CTT ATC CCT AGG CTG CAA AAG ATC 350 Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile 100 105 110 TGG AAG AAT TAC CTA AGC ATG AAC AAG TAC AAA GTG TCC 389 Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser
115.

   120 125 TAC AAG GGG CCA GGA CCA GGC ATC AAG TTC AGT GCA GAG 428 Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu
130 135 GCC CTG CGC TGC CAC CTC CGG GAC CAT GTG AAT GTA TCC 467 Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser
140 145 150 ATG GTA GAG GTC ACA GAT TTT CCC TTC AAT ACC TCT GAA 506 Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu
155 160 

 <Desc/Clms Page number 71> 

 TGG GAG GGT TAT CTG CCC AAG GAG AGC ATT AGG ACC AAG 545 Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 165 170 175 GCT GGG CCT TGG GGC AGG TGT GCT GTT GTG TCG TCA GCG 584 Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala
180 185 190 GGA TCT CTG AAG TCC TCC CAA CTA GGC AGA GAA ATC GAT 623 Gly Ser Leu Lys Ser Ser   Gln   Leu Gly Arg Glu Ile Asp
195 200 GAT CAT GAC GCA GTC CTG AGG TTT AAT GGG GCA CCC ACA 662 Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr
205 210 215 

  
 EMI71.1 
 GCC AAC TTC CAA CAA GAT GTG GGC ACA AAA ACT ACC ATT 701 Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 
220 225 CGC CTG ATG AAC TCT CAG TTG GTT ACC ACA GAG AAG CGC   740   Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg 230 235.240 TTC CTC AAA GAC AGT TTG TAC AAT GAA GGA ATC CTA ATT 779 Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile
245 250 255 GTA TGG GAC.

   CCA TCT GTA TAC CAC TCA GAT ATC CCA AAG 818 Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys
260 265 TGG TAC CAG AAT CCG GAT TAT AAT TTC TTT AAC AAC TAC   857   Trp Tyr Gln Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr
270 275 280 

 <Desc/Clms Page number 72> 

 AAG ACT TAT CGT AAG CTG CAC CCC AAT CAG CCC TTT TAC 896 Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gin Pro Phe Tyr
285 290 ATC CTC AAG CCC CAG ATG CCT TGG GAG CTA TGG GAC ATT 935 Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile 295 300 305 CTT CAA GAA ATC TCC CCA GAA GAG ATT CAG CCA AAC CCC 974 Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro
310 315 320 CCA TCC TCT GGG ATG CTT GGT ATC ATC ATC ATG ATG ACG 1013 Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr
325 330 CTG TGT GAC CAG GTG GAT ATT TAT GAG TTC CTC CCA TCC 1052 Leu Cys Asp   Gln   Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser
335 340 

  345 AAG CGC AAG ACT GAC GTG TGC TAC TAC TAC CAG AAG TTC 1091 Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr Tyr Tyr   Gln   Lys Phe   350.   355 TTC GAT AGT GCC TGC ACG ATG GGT GCC TAC CAC CCG CTG 1130 Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr His Pro Leu 360 365 370 CTC TAT GAG AAG AAT TTG GTG AAG CAT CTC AAC CAG GGC 1169 Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln Gly
375 380. 385 ACA GAT GAG GAC ATC TAC CTG CTT GGA AAA GCC ACA CTG 1208 Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
390 395 

 <Desc/Clms Page number 73> 

 CCT GGC TTC CGG ACC ATT CAC TGC TAAGCACAGG ATCC 1246 Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys
400 405 

 <Desc/Clms Page number 74> 

 ID SEQ nO 4 Type de séquence : protéine Longueur de la séquence : 368 aminoacides Type de molécule : fragment C-terminal de la sialyl- transférase complète Propriétés :

   sialyltransférase soluble (EC 2.4. 99.1) prove- nant de cellules HepG2 humaines 
Lys Leu   Gln   Thr Lys Glu Phe   Gln   Val
5 
Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser
10 15 20 
Gin Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg
25 30 35 
Gly Arg   Gln   Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys
40 45 
Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp Asn Lys Asp
50 55 60 
Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gin Lys Ile
65 70 
Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser
75 80 85 
Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu
90 95 100 
Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val Asn Val Ser
105 110 
Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu
115 120 125 

 <Desc/Clms Page number 75> 

 Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys
130 135 Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 140 145 

  150 Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp
155 160 165 Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr
170 175 Ala Asn Phe   Gln     Gln   Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile
180 185 190 Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg
195 200 Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 205 210 215 Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys
220 225 230 Trp Tyr Gln Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr
235 240 Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gin Pro Phe Tyr
245 250 255 Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile
260 265 Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile   Gln   Pro Asn Pro 270 275 280 

 <Desc/Clms Page number 76> 

 Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr
285 290 295 Leu Cys Asp Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser
300 305 Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr Tyr Tyr

    Gln   Lys Phe
310 315 320 Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr His Pro Leu
325 330 Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln Gly 335 340 345 Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
350 355 360 Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys
365 

 <Desc/Clms Page number 77> 

 ID SEQ no 5 Type de séquence : séquence nucléotidique avec protéine cor- respondante Longueur de la séquence : 1 400 pb Nombre de brins : bicaténaire Topologie : linéaire Source expérimentale directe : BRB.   ELFT/pCR1000-13   Caractéristiques : de 58 à 1 272 pb séquence d'ADNc codant pour   lla   (1-3)- fucosyltransférase humaine de 238 à 243 pb site NruI Propriétés :

   ADNc de cellules HL60 codant pour   lia (1-3)-   fucosyltransférase complète CGCTCCTCCA CGCCTGCGGA CGCGTGGCGA GCGGAGGCAG CGCTGCCTGT 50 TCGCGCC ATG GGG GCA CCG TGG GGC TCG CCG ACG GCG GCG 90
Met Gly Ala Pro Trp Gly Ser'Pro Thr Ala Ala
5 10 GCG GGC GGG CGG CGC GGG TGG CGC CGA GGC CGG GGG CTG 129 Ala Gly Gly Arg Arg Gly Trp Arg Arg Gly Arg Gly Leu
15 20 CCA TGG ACC GTC TGT GTG CTG GCG GCC GCC GGC TTG ACG 168 Pro Trp Thr Val Cys Val Leu Ala Ala Ala Gly Leu Thr
25 30 35 TGT ACG GCG CTG ATC ACC TAC GCT TGC TGG GGG CAG CTG 207 Cys Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Ala Cys Trp Gly Gln Leu
40 45 50 CCG CCG CTG CCC TGG GCG TCG CCA ACC CCG TCG CGA CCG 246 Pro Pro Leu Pro Trp Ala Ser Pro Thr Pro Ser Arg Pro
55 60 

 <Desc/Clms Page number 78> 

 GTG GGC GTG CTG CTG TGG TGG GAG CCC TTC GGG GGG CGC 285 Val Gly Val Leu Leu Trp Trp Glu Pro Phe Gly Gly Arg
65 70 75 GAT AGC GCC CCG AGG 

  CCG CCC CCT GAC TGC CGG CTG CGC 324 Asp Ser Ala Pro Arg Pro Pro Pro Asp Cys Arg Leu Arg
80 85 TTC AAC ATC AGC GGC TGC CGC CTG CTC ACC GAC CGC GCG 363 Phe Asn Ile Ser Gly Cys Arg Leu Leu Thr Asp Arg Ala
90 95 100 TCC TAC GGA GAG GCT CAG GCC GTG CTT TTC CAC CAC CGC 402 Ser Tyr Gly Glu Ala   Gln   Ala Val Leu Phe His His Arg
105 110 115 GAC CTC GTG AAG GGG CCC CCC GAC TGG CCC CCG CCC TGG 441 Asp Leu Val Lys Gly Pro Pro Asp Trp Pro Pro Pro Trp
120 125 GGC ATC CAG GCG CAC ACT GCC GAG GAG GTG GAT CTG CGC 480 Gly Ile   Gln   Ala His Thr Ala Glu Glu Val Asp Leu Arg
130 135 140 GTG TTG GAC TAC GAG GAG GCA GCG GCG GCG GCA GAA GCC 519 Val Leu Asp Tyr Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala
145 150 CTG GCG ACC TCC AGC CCC AGG CCC CCG GGC CAG CGC TGG 558 Leu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Pro Gly   Gln   Arg Trp 155 160 165 GTT TGG ATG AAC TTC GAG 

  TCG CCC TCG CAC TCC CCG GGG 597 Val Trp Met Asn Phe Glu Ser Pro Ser His Ser Pro Gly
170 175 180 

 <Desc/Clms Page number 79> 

 CTG CGA AGC CTG GCA AGT AAC CTC TTC AAC TGG ACG CTC 636 Leu Arg Ser Leu Ala Ser Asn Leu Phe Asn Trp Thr Leu
185 190 TCC TAC CGG GCG GAC TCG GAC GTC TTT GTG CCT TAT GGC 675 Ser Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Val Phe Val Pro Tyr Gly
195 200 205 TAC CTC TAC CCC AGA AGC CAC CCC GGC GAC CCG CCC TCA 714 Tyr Leu Tyr Pro Arg Ser His Pro Gly Asp Pro Pro Ser
210 215 GGC CTG GCC CCG CCA CTG TCC AGG AAA CAG GGG CTG GTG 753 Gly Leu Ala Pro Pro Leu Ser Arg Lys Gln Gly Leu Val 220 225 230 GCA TGG GTG GTG AGC CAC TGG GAC GAG CGC CAG GCC CGG   792   Ala Trp Val Val Ser His Trp Asp Glu Arg Gln Ala Arg
235 240.

   245 GTC CGC TAC TAC CAC CAA CTG AGC CAA CAT GTG ACC GTG 831 Val Arg Tyr Tyr His Gln Leu Ser Gln His Val Thr Val
250 255 GAC GTG TTC GGC CGG GGC GGG CCG GGG CAG CCG GTG CCC 870 Asp Val Phe Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gln Pro Val Pro
260 265 270 GAA ATT GGG CTC CTG CAC ACA GTG GCC CGC TAC AAG TTC 909 Glu Ile Gly Leu Leu His Thr Val Ala Arg Tyr Lys Phe
275 280 TAC CTG GCT TTC GAG AAC TCG CAG CAC CTG GAT TAT ATC 948 Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Gln His Leu Asp Tyr Ile 285 290 295 

 <Desc/Clms Page number 80> 

 ACC GAG AAG CTC TGG CGC AAC GCG TTG CTC GCT GGG GCG 987 Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Leu Ala Gly Ala
300 305 310 GTG CCG GTG GTG CTG GGC CCA GAC CGT GCC AAC TAC GAG 1026 Val Pro Val Val Leu Gly Pro Asp Arg Ala Asn Tyr Glu
315 320 CGC TTT GTG CCC CGC GGC GCC TTC ATC CAC GTG GAC GAC 1065 Arg Phe Val Pro Arg Gly Ala Phe Ile His Val Asp Asp
325 330 335 TTC CCA AGT GCC TCC TCC 

  CTG GCC TCG TAC CTG CTT TTC 1104 Phe Pro Ser Ala Ser Ser Leu Ala'Ser Tyr Leu Leu Phe
340 345 CTC GAC CGC AAC CCC GCG GTC TAT CGC CGC TAC TTC CAC 1143 Leu Asp Arg Asn Pro Ala Val Tyr Arg Arg Tyr Phe His 350 355 360 TGG CGC CGG AGC TAC GCT GTC CAC ATC ACC TCC TTC TGG 1182 Trp Arg Arg Ser Tyr Ala Val His Ile Thr Ser Phe Trp
365 370 375 GAC GAG CCT TGG TGC CGG GTG TGC CAG GCT GTA CAG AGG 1221 Asp Glu Pro Trp Cys Arg Val Cys Gln Ala Val   Gln   Arg
380 385 GCT GGG GAC CGG CCC AAG AGC ATA CGG AAC TTG GCC AGC 1260 Ala Gly Asp Arg Pro Lys Ser Ile Arg Asn Leu Ala Ser
390 395 400 TGG TTC GAG CGG TGAAGCCGCG CTCCCCTGGA AGCGACCCAG 1302 Trp Phe Glu Arg
405 

 <Desc/Clms Page number 81> 

   3GGAGGCCAA   GTTGTCAGCT TTTTGATCCT CTACTGTGCA TCTCCTTGAC 1352   TGCCGCATCA   TGGGAGTAAG TTCTTCAAAC ACCCATTTTT GCTCTATG 1400
Les souches mentionnées dans 

  la description ont été déposées au nom de CIBA-GEIGY AG auprès de
Deutsche Sammlung
Von Mikroorganismen
Mascheroder Weg 1 b
D 3300 Braunschweig
REFERENCE DATE DE DEPOT NO DE DEPOT   1 )   HB101/p30 23 octobre 1987 DSM 4297   2 )   H449 18 février 1988 DSM 4413   3 )   JM109/pDP34 14 mars 1988 DSM 4473   4 )   HB101/p31R 19 décembre   1988-DSM   5116
50) 5/BT 150 23 mai 1991 DSM 6530

Claims (19)

1. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production d'une glycosyltransférase mammalienne liée à la membrane choisie dans le groupe consistant en une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase, ou une variante de celles-ci, respectivement, comprenant la culture d'une souche de levure qui a été transformée avec un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur et une séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, lequel ADN est contrôlé par ledit promoteur, et la récupération de l'activité enzymatique libre de cellule.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycosyltransférase est d'origine humaine.
3. 3. Procédé pour la production d'une variante selon la revendication 1, caractérisé en ce que la variante diffère de la glycosyltransférase complète correspondante par l'absence de la queue cytoplasmique, du domaine d'ancrage-signal et, éventuellement, d'une partie mineure de la région de la tige.
4. 4. Procédé pour la production d'une variante selon la revendication 3, comprenant la culture d'une souche de levure comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur fonctionnellement lié à une EMI82.1 première séquence d'ADN codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour ladite variante, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, et la récupération de l'activité enzymatique.
5. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycosyltransférase est une galactosyltransférase.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la galactosyltransférase est choisie parmi l'UDP-galactose : ss-galactoside- <Desc/Clms Page number 83> a (l-3)-galactosyltransférase (EC 2.4. 1. 151) et l'UDP-galactose : ss-N- acétylglucosamine-ss (1-4)-galactosyltransférase (EC 2.4. 1.22).
7. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la galactosyltransférase comporte la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQn l.
8. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la galactosyltransférase comporte la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQ n 2.
9. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycosyltransférase est une sialyltransférase.
10. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sialyltransférase est la CJ\1P-NeuAc : P-galactoside-a (2-6)sialyltransférase (EC 2.4. 99.1).
11. 11. Procédé selon la revendication 9,'caractérisé en ce que la sialyltransférase comporte la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQ n 3.
12. 12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sialyltransférase est désignée par ST (Lys27-Cys406) et consiste en les aminoacides 27 à 406 de la séquence d'aminoacides énumérée dans l'ID SEQ no 3.
13. 13. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sialyltransférase comporte la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQ n 4.
14. 14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycosyltransférase est une fucosyltransférase.
15. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fucosyltransférase est choisie parmi la GDP-fucose : p-galactoside-a (1-2) - <Desc/Clms Page number 84> fucosyltransférase (EC 2.4. 1.69) et la GDP-fucose : N-acétylglucosaminea (1-3/4) -fucosyltransférase (EC 2. 4. 1. 65).
16. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fucosyltransférase comporte la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQ no 5.
17. 17. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fucosyltransférase est désignée par FT (Arg62-Arg405) et consiste en les aminoacides 62 à 405 de la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQn 5.
18. 18. Vecteur hybride de levure comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure et une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase mammalienne liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase, ou une variante de celles-ci, respectivement, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur.
19. 19. Souche de levure qui a été transformée par un vecteur hybride selon la revendication 18.