PT100545A - Processo melhorado para a producao de glicosiltransferases - Google Patents

Description

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0 invento está relacionado com o campo da tecnologia de DNA recombinante e proporciona um método melhorado para a produção de glicosiltransferases através da utilização de estirpes de levedura transformadas.

As glicosiltransferases transferem resíduos de açúcar de um substrato dador activado, geralmente um açúcar nucleótido, para um açúcar específico aceitador formando assim uma ligação glicosídica. Com base neste tipo de transferência de açúcares, estas enzimas são agrupadas em famílias, e.g. galactosiltransfe-rases, sialiltransferases e fucosiltransfepases. Sendo proteínas de membrana essencialmente localizadas no aparelho de Golgi, as glicosiltransferases partilham uma estrutura de domínio comum consistindo numa pequena cauda citoplasmãtica amino-terminal, um domínio sinal de ancoragem e uma região pedunculo prolongada que é seguida de um domínio catalítico grande no extremo carbonilo. O domínio sinal de ancoragem actua como peptídeo sinal não clivável e como região que atravessa a membrana e orienta o domínio catalítico da glicosiltransferase dentro do lumen do aparelho de Golgi. 0 pedunculo luminal ou região espaçadora é suposta servir como peia flexível, permitindo que o domínio catalítico glicosile grupos açúcar de proteínas ligadas a membranas e solúveis da via secretora que passam pelo aparelho de Golgi. Ainda, descobriu-se que a fracção do pedunculo funciona como sinal de retenção para manter a enzima ligada à membrana de Golgi (Pedido PCT N2 91/06635). As formas solúveis de glicosiltransferases são encontradas no leite, soro e outros fluídos do corpo. Estas glicosiltransferases solúveis são supostas resultarem da libertação proteolítica das formas correspondentes ligadas a membranas por proteases endógenas, presumivelmente por clivagem entre o domínio catalítico e o domínio transmembranar. A síntese enzimática das estruturas de açúcar tem a vantagem de uma alta selectividade espacial e regional, tornando as glicosiltransferases uma arma importante para a modificação ou síntese de glicoproteínas, glicolípidos e oligossacáridos. Ao contrário dos métodos químicos a introdução demorada dos grupos protectores é supérfula.

As glicosiltransferases ocorrem naturalmente em pequenas quantidades, sendo díficil o isolamento a partir de fontes naturais e subsequente purificação. Portanto, foi desenvolvida a produção usando tecnologia de DNA recombinante. Por exemplo, foram expressas galactosiltransferases em E. coli (PCT 90/07000) e células de ovário de hamster chinês (CHO) (Smith, D.F. et al., (1990) J. Biol. Chem. 265, 6225-34), sialiltransferases foram expressas em células CHO (Lee, E.U. (1990) Diss. Abstr. Int. B 50, 3453-4) e células COS-1 (Paulsen, J.C. et al. (1988) J. Cell. Biol. 107, 10A) e fucosiltransferases foram produzidas em células COS-l (Goelz, S.E. et al. (1990) Cell, 1349-1356; Larsen R.D. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 6674-6678) e células CHO (Potvin, B. (1990) J. Biol. Chem. 265, 1615-1622). Considerando os factos da expressão heteróloga em procariotas ter a desvantagem de proporcionar produtos não glicosilados, as glicosiltransferases, no entanto, sendo glicoproteínas e a produção de glicosiltransferases através dos hospedeiros mamíferos ser muito cara e também complicado devido à presença de muitas glicosiltransferases endógenas que contaminariam o produto pretendido, é necessário métodos melhores que tornem possível a produção económica de glicosiltransferases em larga escala.

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar tais métodos. 4

0 presente invento proporciona um processo para a produção de glicosiltransferases biologicamente activa através da tecnologia de DNA recombinante usando um sistema de expressão com vector de levedura.

Mais especificamente, o presente invento proporciona um processo para a produção de uma glicosiltransferase ligada à membrana seleccionada do grupo constituído por uma galactosil-transferase, uma sialiltransferase e uma fucosiltransferase ou respectivas variantes, o referido processo caracterizando-se pela cultura de uma estirpe de levedura que foi transformada com um vector híbrido compreendendo uma cassete de expressão contendo um promotor e uma sequência de DNA codificadora da referida glicosiltransferase ou sua variante, DNA esse que é controlado pelo referido promotor, e recuperação da actividade enzimática.

Numa primeira realização, o invento está relacionado com um processo para a produção de uma glicosiltransferase ligada a membranas seleccionada do grupo constituído por uma galacto-siltransferase, uma sialiltransferase e uma fucosiltransferase ou suas variantes respectivamente, o referido processo compreendendo a cultura de uma estirpe de levedura que foi transformada com um vector híbrido compreendendo uma cassete de expressão contendo um promotor, uma sequência de DNA codificadora da referida glicosiltransferase ou sua variante, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor e uma sequência de DNA contendo os sinais de terminação da transcrição de levedura e recuperação da actividade enzimática.

Numa segunda realização, o invento está relacionado com um processo para a produção de uma glicosiltransferase ligada a membranas seleccionada do grupo constituído por uma galactosil-transferase, uma sialiltransferase e uma fucosiltransferase ou 5 \

suas variantes, respectivamente. o referido processo sendo caracterizado pela cultura de uma estirpe de levedura que foi transformada com um vector híbrido compreendendo uma cassete de expressão tendo um promotor operacionalmente ligado uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na I grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codifi cadora da referida glicosiltransferase ou variante e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e recuperação da actividade enzimática. * 0 termo "glicosiltransferase" sempre que aqui usado destina-se a englobar a família das galactosiltransferases , a família das sialiltransferases e a família de fucosiltransfera-ses. As referidas glicosiltransferases sendo enzimas naturais de mamíferos, e.g. de origem bovina, murina, de rato ou humana. São preferidas as glicosiltransferases de tamanho completo humanas naturais incluindo as enzimas identificadas daqui em diante pelos seus números EC.

As galactosiltransferases ligadas a membranas e suas variantes obtidas de acordo com o processo do invento catalisam a transferência de um resíduo de galactose de um dador activado, ( geralmente um dador de nucleôtidos activado como seja difosfato de uridina-galactose (UDP-Gal), para um grupo açúcar. São exemplos de galactosiltransferases ligadas a membranas UDP-Galactose:B-galactósido a(1-3)-galactosiltransfe-) rase (EC 2.4.1.151) que usa galactose como substrato aceitador formando uma ligação a(l-3) e UDP-Galactose:β-Ν-acetilglucosamina β(1-4)-galactosiltransferase (EC 2.4.1.22) que transfere galactose para N-acetilglucosamina (GlcNAc) formando uma ligação β(1-4), incluindo respectivas variantes. Na presença de a-lactal-bumina, a referida β(1-4)-galactosiltransferase também aceita 6

glucose como substrato aceitador, catalisando a síntese de lactose. A galactosiltransferase ligada a membranas mais preferida é a enzima tendo a sequência de aminoãcidos descrita na sequência apresentada em SEQ ID N0.1.

As sialiltransferases ligadas a membranas e suas variantes obtidas de acordo com o processo do invento catalisa a transferência de ácidos siálicos (por exemplo ácido N-acetilneu-raminico (NeuAc)) de um dador activado, geralmente um monofosfato de citidina-ãcido siálico (CMP-SA) para um resíduo aceitador de açúcar. Um exemplo de uma sialiltransferase ligada a membranas obtida de acordo com o invento é a CMP-NeuAc:S-galactósido α (2-6)sialiltransferase (EC 2.4.99.1) que forma a sequência NeuAc-a(2-6)Gal-β(1-4)GlcNAc comum a muitos grupos de açúcar ligados em N. A sialiltransferase ligada a membrana mais preferida é a enzima que possui a sequência de aminoãcidos descrita na sequência apresentada em SEQ ID NO.3.

As fucosiltransferases ligadas a membranas e suas variantes obtidas de acordo com o processo do invento catalisam a transferência de um resíduo de fucose de uma dador activado, geralmente um dador de nucleótidos activado, tais como difosfato de guanosina-fucose (GDP-Fuc) para um grupo açúcar. São exemplos de tais fucosiltransferases GDP-Fucose:fí-galactõsido α(1-2)-fuco-siltransferase (EC 2.4.1.69) e GDP-Fucose:N-acetilglucosamina α(1-3/4)-fucosiltransferase (EC 2.4.1.65). 7

~ X . A fucosiltransferase ligada a membranas mais preferida é a enzima que possui a sequência de aminoácidos descrita na lista de sequências com SEQ ID NO.5. 0 termo variantes como aqui é usado destina-se a englobar variantes ligadas a membranas e solúveis de glicosil-transferases ligadas a membranas naturais derivadas de mamífero com a condição de estas serem variantes serem enzimaticamente activas. São preferidas as variantes de origem humana.

Por exemplo, o termo "variantes" destina-se a incluir variantes naturais ligadas a membranas das glicosiltransferases ligadas a membranasencontradas dentro de uma espécie particular, e.g. uma variante de galactosiltransferase que difere da enzima tendo a sequência de a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 por não possuir serina na posição 11 e ter os aminoácidos valina e tirosina em vez de alanina e leucina nas posições 31 e 32, respectivamente. Tal variante pode ser codificada por um gene relacionado da mesma família de genes ou por uma variante alélica de um gene particular. 0 termo "variantes" também engloba glicosiltransferases produzidas a partir de um DNA que foi sujeito a mutagénese in vitro. com a condição de a proteína codificada pelo referido DNA ter a actividade enzimática da glicosiltransferase nativa. Tais modificações podem consistir numa adição, troca e/ou deleção de aminoácidos, esta última resultando em variantes mais curtas. I As variantes preferidas de acordo com o processo do invento são variantes encurtadas, particularmente variantes solúveis, i.e. variantes que não estão ligadas a membranas. As variantes encurtadas incluem por exemplo formas solúveis de glicosiltransferases ligadas a membranas e suas variantes ligadas a membranas, e.g. as variantes referidas atrás, as quais podem 8

ser secretadas por uma estirpe de levedura transformada usada no processo de acordo com o invento. De acordo com o presente invento, estas enzimas solúveis são as variantes truncadas preferidas. O invento também está relacionado com um processo para a produção de uma variante solúvel de uma glicosiltransferase ligada a membranas seleccionada do grupo constituido por uma galactosiltransferase, uma sialiltransferase e uma fucosiltrans-ferase, o referido processo compreendendo a cultura de uma estirpe de levedura que foi transformada com um vector híbrido compreendendo uma cassete de expressão consistindo num promotor gperacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificador de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora da referida variante e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e isolamento da referida variante.

Por definição a forma solúvel de uma glicosiltransfe-rase é uma variante encurtada diferindo da correspondente forma de tamanho completo, i.e. a forma ligada a membranas natural situada no reticulo endoplasmático ou no complexo de Golgi, pela ausência da cauda citoplasmática, o sinal de ancoragem e, facultativamente, parte da região do pedunculo. 0 termo "parte da região do pedunculo" como aqui é usado é definido como sendo uma pequena parte do lado N-terminal da região do pedunculo consistindo até 12 aminoácidos. Por outras palavras, as variantes solúveis preparadas de acordo com o processo do presente invento consiste essencialmente na região do pedunculo na sua totalidade e no domínio catalítico.

As variantes solúveis são enzimas enzimaticamente activas diferindo das formas correspondentes de tamanho completo 9 pela ausência de um peptídeo NH2-terminal consistindo em 26 a 67, particularmente 26 a 61, resíduos de aminoácidos, com a condição daquelas formas sem parte da região do pedunculo só não têm a parte mais pequena definida atrás. São preferidas as variantes solúveis obtidas a partir das glicosiltransferases ligadas a membranas identificada atrás pelos seus números EC e ainda variantes solúveis obtidas a partir da fucosiltransferase ligada a membranas com SEQ ID NO.5.

As variantes solúveis preferidas das galactosiltransfe-rases são diferentes das correspondentes formas de tamanho completo por não possuírem um peptídeo NH2-terminal consistindo em 37 a 55, particularmente 41 a 44, aminoácidos. A variante solúvel mais preferida preparada de acordo com o processo do invento é a enzima tendo a sequência de aminoácidos descrita na lista de sequências em SEQ ID NO.2.

As variantes solúveis preferidas de sialiltransferases não têm um peptídeo NH2-terminal consistindo em 26 a 38 aminoácidos comparado com a forma de tamanho completo. A variante solúvel mais preferida preparada de acordo com o processo do invento é a enzima tendo a sequência de aminoácidos descrita na lista de sequências em SEQ ID NO. 4. É igualmente preferida a variante solúvel designada ST(Lis27-Cis4Q6) consistindo nos aminoácidos 27 a 406 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO.3.

As variantes solúveis preferidas das fucosiltransfera-ses diferem das correspondentes enzimas de tamanho completo por não possuírem um peptídeo NH2-terminal connsistindo em 56 a 67, particularmente 56 a 61 aminoácidos. É especialmente preferida a variante solúvel designada FT (Arg^-Arg^,.) consistindo nos aminoácidos 62 a 405 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO.5. 10

As estirpes hospedeiras de levedura e os constituintes dos vectores híbridos são os especificados abaixo.

As estirpes de levedura transformadas são cultivadas usando métodos conhecidos.

Assim, as estirpes de levedura transformadas de acordo com o invento são cultivadas num meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos.

Podem ser usadas várias fontes de carbono. São exemplos de fiontes de carbono preferidas os açúcares assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol, frutose ou lactose ou um acetato como seja acetato de sódio, que podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. Fontes de azoto adequadas incluem, por exemplo, aminoãcidos, tais como casaminoácidos, peptídeos e proteínas e seus produtos de degradação, como seja triptona, peptona ou extractos de carne, ainda extracto de levedura, extracto de malte, melaço, assim como sais de amónio, tais como cloreto, sulfato ou nitrato de amónio que podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. Sais inorgânicos que podem ser usados incluem, por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. Em adição o meio nutritivo pode também conter substâncias promotoras do crescimento. Substâncias que promovem o crescimento incluem, por exemplo, micronutrientes, tais como ferro, zinco, manganês e similares ou aminoácidos individuais.

Devido à incompatibilidade entre o DNA de dois micron endógeno e os vectores híbridos portadores do seu replicão, as células de levedura transformadas com tais vectores híbridos tendem a perder este último. Tais células de levedura têm de crescer em condições selectivas, i.e., condições que requerem a 11 11

expressão do gene codificado pelo plasmídeo para o crescimento. A maior parte das marcas selectivas normalmente usadas e presentes nos vectores híbridos de acordo com o invento (infra) são genes codificadores de enzimas da biossíntese de aminoácidos ou puri-nas. Isto torna necessário usar meios mínimos sintéticos deficientes no correspondente aminoácido ou base purina. No entanto podem ser igualmente usados genes que conferem resistência a um biocida adequado [e.g. um gene que confere resistência ao amino-glicósido G418]. As células de levedura transformadas com vectores contendo genes de resistência a antibióticos são cultivadas em meios complexos contendo o correspondente antibiótico pelo que são atingidas velocidades de crescimento e densidades celulares mais altas.

Os vectores híbridos compreendendo o DNA de dois micron completos (incluindo uma origem de replicação funcional) são mantidos estavelmente dentro de estirpes de Saccharomvces cerevisiae que não possuam plasmídeos dois micron endógenos (as chamadas estirpes cir°) de forma que a cultura pode ser realizada em condições de crescimento não selectivas, i.e. num meio complexo.

As células de levedura contendo plasmídeos híbridos com um promotor constitutivo expressam o DNA codificador de uma glicosiltransferase ou uma sua variante, controlada pelo referido promotor sem indução. No entanto, se o referido DNA estiver sob o controle de um promotor regulado a composição do meio de crescimento tem de ser adaptada de forma a obter-se níveis máximos de transcritos de mRNA, e.g. quando se usa o promotor PH05 o meio de crescimento deve conter uma concentração baixa de fosfato inorgânico para a desrepressão deste promotor. A cultura é realizada usando técnicas convencionais. As condições de cultura, tais como temperatura, pH do meio e tempo de fermentação são seleccionadas / 12 de forma a que sejam produzidos níveis máximos da proteína heteróloga. Uma estirpe de levedura escolhida é preferencialmente cultivada em condições aeróbicas em cultura submersa com agitação a uma temperatura entre cerca de 25°C e 35°C, preferencialmente a cerca de 28°C, a um.valor de pH entre 4 e 7, por exemplo a aproximadamente pH 5 e durante pelo menos l a 3 dias, preferencialmente durante o tempo em que se obtem rendimentos satisfatórios da proteína.

Por exemplo o primeiro passo geralmente consiste na separação das células do meio de cultura por centrifugação. No caso da glicosiltransferase ou sua variante ter acumulado dentro das células, a proteína tem de ser libertada do interior da célula por rebentamento desta. As células de levedura podem ser rebentadas de várias formas bem conhecidas na área: e.g. por forças mecânicas tais como agitação com esferas de vidro, por vibração ultrassónica, choque osmõtico e/ou por digestão enzimá-tica da parede celular. No caso da glicosiltransferase ou sua variante a ser isolada estiver associada ou ligada a uma fracção membranar, pode ser conseguido um enriquecimento por centrifugação diferencial do extracto celular e facultativamente, tratamento subsequente da fracção particular com um detergente, como seja Triton. Métodos adequados para a purificação da glicosiltransfe-rase bruta ou sua variente incluem processos cromatográficos convencionais tais como cromatografia de afinidade, por exemplo com um substrato adequado, anticorpos ou Concanavalina A, cromatograf ia de permuta iónica, filtração em gel, cromatografia de partição, HPLC, electroforese, passos de precipitação tais como precipitação com sulfato de amónio e outros processos, especialmente os conhecidos da literatura.

No caso da glicosiltransferase, ou sua variante, ser secretada pela célula de levedura para o espaço periplasmático, 13

pode ser usado um protocolo de isolamento simplificado: a proteína é recuperada sem lise celular por remoção enzimática da parede celular ou por agentes químicos, e.g. reagentes de tiol ou EDTA, que dão origem a danificação da parede celular permitindo que a glicosiltransferase produzida seja libertada. No caso da glico-siltransferase, ou sua variante, ser secretada para o caldo de cultura, ela pode ser recuperada directamente a partir dele e purificada usando os métodos especificados atrás.

Para detectar actividade de glicosiltransferase podem ser usados ensaios conhecidos da literatura. Por exemplo, a atividade de galactosiltransferase pode ser medida determinando a quantidade de galactose marcada radioactivamente incorporada numa molécula aceitadora adequada como seja uma glicoproteína ou um resíduo de açúcar livre. De modo análogo,a actividade de sialil-transferase pode ser testada e.g. pela incorporação de ácido siálico em substratos adequados e a actividade de fucosiltransfe-rase pode ser testada pela transferência de fucose para um aceitador adequado.

As células hospedeiras de levedura transformadas de acordo com o invento podem ser preparadas por técnicas de DNA recombinante compreendendo os passo de: preparação de um vector híbrido compreendendo um promotor de levedura e uma sequência de DNA codificadora de uma glicosiltransferase ligada a membranas ou uma sua variante, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor, transformação de uma estirpe hospedeira de levedura com o referido vector híbrido e selecção das células de levedura transformadas de entre as células de levedura não transformadas.

VECTORES DE EXPRESSÃO O vector híbrido de levedura de acordo com o invento compreende uma cassete de expressão contendo um promotor de levedura e uma sequência de DNA codificadora de uma glicosil-transferase ligada a membrana ou uma sua variante, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor.

Numa primeira realização, o vector híbrido de levedura de acordo com o invento compreende uma cassete de expressão compreendendo um promotor de levedura, uma sequência de DNA codificadora de uma glicosiltransferase ligada a membrana ou uma sua variante, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor e uma sequência de DNS contendo sinais de terminação da transcrição de levedura.

Numa segunda realização, o vector híbrido de levedura de acordo com o invento compreende uma cassete de expressão contendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificador de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma glicosiltransferase ligada a membrana ou uma sua variante e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura. 0 promotor de levedura é um promotor regulado ou constitutivo preferencialmente derivado de um gene de levedura altamente expresso, especialmente um gene de Saccharomvces cerevisiae. Assim, podem ser usados o promotor do gene TRP1. o gene ADHI ou ADHII. o gene da fosfatase ácida (PH05), um promotor dos genes da feromona de conjugação codificador do factor a ou a ou um promotor derivado de um gene codificador de uma enzima glicolítica como seja o promotor dos genes da enolase, 15 gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAP), 3-fosfoglicerato-ci-nase (PGK), hexocinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutocina-se, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruva-to-cinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase ou glucocinase. Ainda, é possível usar promotores híbridos compreen-, dendo sequências de activação a montante (UAS) de um gene de levedura e elementos promotores a jusante incluindo uma caixa TATA funcional de um outro gene de levedura, por exemplo um promotor híbrido incluindo o gene UAS(s) do gene PH05 de levedura e elementos promotores a jusante do promotor incluindo uma caixa 1 TATA funcional do gene GAP de levedura (promotor híbrido PH05-GAP). Um promotor preferido é o promotor do gene GAP, especialmente seus fragmentos funcionais começando nos nucleóti-dos entre as posições -550 e -180, em particular no nucleótido -540, -263 ou -198 e terminando no nucleótido -5 do gene GAP. Um outro promotor preferido do tipo regulado é o promotor PH05. Como promotor constitutivo prefere-se um promotor da fosfatase ácida PH05 encurtado sem os elementos reguladores a montante (UAS) pois é o elemento promotor PH05 (-173) começando no nucleótido -173 e terminando no nucleótido -9 do gene PH05. A sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ^ ("sequência sinal") deriva preferencialmente de um gene de levedura codificador de um polipeptídeo que normalmente é secre-tado. Também podem ser escolhidas outras sequências sinal de proteínas heterólogas, as quais são normalmente secretadas. Sequências sinal de levedura são por exemplo as sequências sinal ) e prepro dos genes de levedura invertase, factor a, feromona-pep- tidase (KEX1), "toxina assassina" e genes da fosfatase ácida (PH05) reprimíveis e a sequência sinal da glucoamilase de Asperoillus awamori. Como alternativa, podem ser construídas sequências sinal fundidas por ligação de parte da sequência sinal (se presente) do gene naturalmente ligado ao promotor usado (por 16

exemplo PHQ5) com parte da sequência sinal de uma outra proteína heteróloga. São favorecidas as combinações que permitam uma clivagem precisa entre a sequência sinal e a sequência de aminoã-cidos da glicosiltransferase. Sequências adicionais, tais como sequências pro ou espaçadoras que podem ou não ser portadoras de sinais de processamento específicos podem também ser incluídas nas construções para facilitar o processamento preciso das moléculas precursoras. Como alternativa, podem ser geradas proteínas fundidas contendo sinais de processamento interno que permitam a maturação correcta in vivo e in vitro. Por exemplo, os sinais de processamento contêm Lis-Arg, que é reconhecido por uma endopeptidase de levedura situada nas membranas do Golgi. A sequência sinal preferida de acordo com o presente invento é a do gene da invertase de levedura.

Se uma glicosiltransferase de tamanho completo ou uma sua variante ligada a membrana for expressa em levedura, o vector híbrido de levedura preferido compreende uma cassete de expressão contendo um promotor de levedura, uma sequência de DNA codificadora da referida glicosiltransferase ou sua variante, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura. Se o DNA codificar uma enzima ligada a membrana existe a necessidade de uma sequência sinal adicional.

No caso de uma variante solúvel de uma glicosiltransferase ligada a membranas ser expressa em levedura, o vector híbrido de levedura preferido compreende uma cassete de expressão contendo um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora da referida variante e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição da levedura. 17

DNA codificador de uma glicosiltransferase ligada a membrana ou de uma sua variante, pode ser preparado por métodos conhecidos e compreende DNA genómico, e.g. isolado a partir de uma biblioteca de DNA genómico de mamífero, e.g. de células de rato, murganho, bovinas ou humanas. Se necessário, os intrões presentes no DNA genómico codificador da enzima são eliminados. Ainda, DNA codificador de uma glicosiltransferase ligada a membrana ou sua variante, compreende cDNA que pode ser isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de mamífero ou produzido a partir do correspondente mRNA. A biblioteca de cDNA pode derivar de células de diferentes tecidos, e.g. células da placenta ou células do fígado. A preparação de cDNA via mRNA é conseguida usando métodos convencionais tais como reacção em cadeia com polimerase (PCR).

Por exemplo, isolamento de RNA poli (A)+ a partir de células de mamífero, e.g. células HeLa e subsequente síntese da primeira cadeia do cDNA são realizadas seguindo processos convencionais conhecidos. Partindo deste DNA molde, pode-se usar PCR para amplificar a sequência alvo, i.e. o DNA da glicosiltransfe-rase ou um seu fragmento, enquanto a amplificação das sequências supranumerárias que não são alvo é minimizada. Para este fim, a sequência de um pequeno segmento de nucleótidos de cada lado da sequência alvo devem ser conhecidos. Estas sequências flanquean-tes são usadas para projectar dois oligonucleótidos iniciadores sintéticos de cadeia simples cuja sequência é escolhida de forma a ser complementar da respectiva sequência flaqueante. PCR começa pela desnaturação do híbrido mRNA-DNA, seguido de emparelhamento dos iniciadores com sequências flanqueantes do alvo. A adição de uma DNA-polimerase e trifosfatos de desoxinucleótidos dá origem à formação de dois segmentos de DNA de cadeia dupla, cada um deles começando no iniciador e prolongando-se ao longo da sequência alvo, copiando-a. Cada um dos produtos sintetizados de novo pode 18

servir como molde para o emparelhamento de inciadores e extensões (ciclo seguinte) conduzindo assim a um aumento exponencial nos fragmentos de cadeia dupla de tamanho discreto. • Ainda, DNA codificador de uma glicosiltransferase ligada a membranas ou sua variante, pode ser sintetizado enzimá- tica ou quimicamente. Uma variante de uma glicosiltransferase ligada a membranas tendo actividade enzimática e uma sequência de aminoácidos em que um ou mais aminoácidos foram eliminados (fragmentos de DNA) e/ou trocados por um ou mais aminoácidos, é codificada por um DNA mutante. Ainda, um.DNA mutante destina-se a incluir um mutante silencioso em que um ou mais nucleótidos são » substituídos por outros nucleótidos com os novos codões codificando os mesmos aminoácidos. Tal sequência mutante é também uma sequência degenerada dentro do significado do código genético uma vez que um número ilimitado de nucleótidos são substituídos por outros nucleótidos sem resultarem numa alteração da sequência de aminoácidos originalmente codificada. Tais sequências de DNA degeneradas podem ser úteis devido aos seus sítios de restrição diferentes e/ou frequência de codões particulares que são preferidos pelo hospedeiro específico para se obter expressão óptima de uma glicosiltransferase ou uma sua variante. Preferencialmente, tais sequências de DNA têm os codões preferidos de levedura.

Um DNA mutante pode também ser obtido por mutação in vitro de um DNA genómico ou cDNA de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, o DNA parcila codificador de uma forma solúvel de uma glicosiltransferase pode ser retirado do DNA de tamanho completo codificador da correspondente glicosiltransferase ligada a membranas usando enzimas de restrição. A disponibilidade de um sítio de restrição adequado é pois vantajoso. 19

Uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura é preferencialmente a sequência flanque-ante 3' de um gene de levedura que contem sinais correctos para a terminação da transcrição e poliadenilação. Sequências flanque-antes 3' adequadas são por exemplo as do gene de levedura naturalmente ligado ao promotor usado. A sequência flanqueante preferida é a do gene PH05 de levedura. 0 promotor de levedura, a sequência de DNA facultativa codificadora do peptídeo sinal, a sequência de DNA codificadora de uma glicosiltransferase ligada a membranas ou uma sua variante e a sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura são operacionalmente ligados num ensaio em tandem, i.e. elas são justapostas de forma a que as suas funções normais sejam mantidas. O arranjo é tal que o promotor efectua a expressão correcta da sequência de DNA codificadora de uma glicosiltransferase ligada a membranas, ou de uma sua variante, (facultativamente precedida de uma sequência sinal), os sinais de terminação da transcrição efectuam terminação da transcrição e poliadenilação correctas e a sequência sinal facultativa é ligada na grelha de leitura correcta à sequência de DNA atrás referida de forma a que o último codão da sequência sinal esteja directamente ligada ao primeiro codão da referida sequência de DNA e secreção da proteína ocorra. Se o promotor e sequência sinal derivarem de genes diferentes, o promotor é preferencialmente ligado à sequência sinal num sítio entre o principal sítio de iniciação de mRNA e o ATG do gene naturalmente ligada ao promotor. A sequência sinal deverá ter o seu próprio ATG para iniciação da tradução. A junção estas sequências pode ser efectuada por meio de oligonu-cleótidos adapatadores sintéticos portadores da sequência de reconhecimento de uma endonuclease. 20

Vectores adequados para a replicáção e expressão em levedura contêm uma origem de replicáção de levedura. Vectores híbridos que contêm uma origem de replicáção de levedura, por exemplo um ou mais segmentos cromossómicos de replicáção autónoma, são mantidos fora de cromossomas dentro da célula de levedura após transformação e são replicados autonomamente durante a mitose. Também podem ser usados vectores híbridos que contêm sequências homólogas do DNA do plasmídeo 2 μ de levedura. Tais vectores híbridos são integrados por recombinação em plasmídeos 2μ já presentes dentro da célula ou replicam-se autonomamente.

De preferência os vectores híbridos de acordo com o invento uma ou mais, especialmente uma ou duas, marcas genéticas selectivas para levedura e tal marca e uma origem de replicáção para um hospedeiro bacteriano, especialmente Escherichia coli.

Como marcas selectivas para levedura, qualquer marca pode ser usada desde que facilite a selecção de transformantes devido à expressão fenotípica da marca. Marcas adequadas para levedura são por exemplo as que expressam resistência a antibióticos ou no caso de mutantes de levedura auxotróficos, genes que complementem lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exemplo, resistência aos antibióticos G418, higro-micina ou bleomicina ou proporcionam prototrofia num mutante de levedura auxotrófico, por exemploo gene URA3. LEU2, LYS2 ou TRP1.

Como a amplificação dos vectores híbridos é por conveniência feita em E. coli. são incluídas vantajosamente uma marca genética para E. coli e uma origem de replicáção para E. coli. Estas podem ser obtidas a partir de plasmídeos de E. coli. tais como pBR322 ou um plasmídeo pUC, por exemplo pUC18 ou pUC19, os quais contem origem de replicáção de e. coli e marca genética de 21 21

E. coli conferindo resistência a antibióticos tais como ampici-lina.

Os vectores híbridos de acordo com o invento são preparados por métodos conhecidos por exemplo ligando a cassete de expressão compreendendo um promotor de levedura e uma sequência de DNA codificadora de uma glicosiltransferase ou uma sua variante, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor, ou ligando os vários constituintes da cassete de expressão e os fragmentos de DNA contendo marcas genéticas selectivas para levedura e para um hospedeiro bacteriano e origens de replicação para levedura e para um hospedeiro bacteriano na ordem predeterminada.

Os vectores híbridos do invento são usados na transformação das estirpes de levedura descritas abaixo.

Estirpes de levedura e sua transformação

Leveduras hospedeiras adequadas são estirpes do género Saccharomvces. especialmente estirpes de Saccharomvces cerevisiae. As referidas estirpes de levedura incluem estirpes que, facultativamente, foram libertas dos plasmídeos endógenos de 2 microns e/ou que facultativamente não possuem uma ou mais actividades de peptidases de levedura, e.g.actividade de pepti-dase ysca, yscA, yscB, yscY e/ou yscS.. O invento diz ainda respeito a uma estirpe de levedura que foi transformada com um vector híbrido compreendendo uma cassete de expressão contendo um promotor de levedura e uma sequência de DNA codificadora de uma glicosiltransferase ligada a membranas ou uma sua variante, DNA esse que é controlado pelo referido promotor. 22 22

Numa primeira realização, a estirpe de levedura de acordo com o invento foi transformada com um vector híbrido contendo uma cassete de expressão contendo um promotor de levedura, uma sequência de DNA codificadora de uma glicosiltransferase ligada a membranas ou uma sua variante, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura.

Numa segunda realização, a estirpe de levedura de acordo com o invento foi transformada cora ura vector híbrido contendo uma cassete de expressão constituída por um promotor de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma glicosltransferase ligada a membranas ou uma sua variante e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura.

As estirpes de levedura do invento são usadas para a preparação de uma glicosiltransferase ligada a membranas ou uma sua variante. A transformação de levedura com os vectores híbridos de acordo com o invento é conseguida por métodos conhecidos, por exemplo de acordo com os métodos descritos por Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1978) 75, 1929) e Ito et al., (J. Bact. (1983) 153, 163-168).

As glicosiltransferases ligadas a membranas e suas variantes, preparadas pelo processo de acordo com o invento podem ser usadas de forma conhecida per se, e.g. para a síntese e/ou modiciação de glicoproteínas, oligossacáridos e glicolípidos (Patente US 4,925,796; Pedido EP 414 171). 0 invento diz respeito especialmente .ao método para a produção de glicosiltransferases ligadas a memmbranas suas variantes, os vectores híbridos, as estirpes de levedura transformadas e as glicosiltransferases obtidas de acordo com o processo do invento, como descrito nos Exemplos.

Nos Exemplos, são usadas as abreviaturas que se seguem: GT= galactosiltransferase (EC 2.4.1.22), PCR= reacção em cadeia com polimerase; ST = sialiltransferase (EC 2.4.99.1); FT = fucosiltransferase. EXEMPLO 1: Clonacrem do cDNA de qalactosiltransferase (GT) derivada de células HeLa cDNA de GT foi isolado a partir de células HeLa (Watzele, G. e Berger, E.G. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 7174) pelo método de reacção em cadeia com polimerase (PCR): 1.1 Preparação de RNA poli(A)+ derivado de células HeLa

Para a preparação de RNA as células HeLa são cultivadas numa cultura em monocamada em 5 placas (23x23 cm) . O isolamento rápido e eficaz de RNA a partir das células em cultura é realizado por extracção com guanidina-HCl como descrito por Mac Donald, R.J. et al.f (Meth. Enzymol. (1987) 152, 226-227). De um modo geral, os rendimentos são de cerca de 0,6-1 mg de RNA total por placa de células confluentes. 0 enriquecimento em RNA poli(A)+ é conseguido por cromatografia de afinidade em oligo(dT) -celulose de acordo com o método descrito no manual de Maniatis (Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2§ ed), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) aplicando 4 mg do RNA total numa coluna de 400 μΐ. 3% do RNA aplicado são recuperados como RNA enriquecido em poli(A)+ o qual é guardado dividido em pequenas quantidades precipitado com 3 volumes de etanol a -70 até ser usado.

1.2 Síntese da primeira cadeia de cDNA por PCR RNA poli(A)+ (mRNA) foi sujeito à acção de transcripta-se reversa para dar DNA usando RNAse H trancriptase reversa do vírus da leucémia murina de Moloney (M-MLV H~RT) (BRL). Ao estabelecer-se a mistura de reacção, seguiu-se o protocolo proporcionado pela BRL com pequenas variações: 1 μg de RNA poli (A)+ de células HeLa e 500 ng de Oligo(dT) , 0 (Pharmacia) lZ"lo 25

em 11,5 μΐ de H20 estéril são aquecidos a 70°C durante 10 minutos e depois rápidamente arrefecidos em gelo. Em seguida adiciona-se 4 μΐ de tampão de reacção fornecido pela BRL (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) 2 μΐ 0,1M ditiotreitol, 1 μΐ de mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, TTP 10 mM cada, Pharmacia), 0,5 μΐ (17,5 U) de RNAguard (Inibidor de RNAses da Pharmacia) e 1 μΐ (200 U) M-MLVH RT. A reacção foi realizada a 42°C e parada após 1 h por aquecimento do tubo a 95°C durante 10 minutos.

Para testar a eficácia da reacção uma pequena quantida-de da mistura (5 μΐ) foi incubado na presença de 2μΟ. a- P dCTP. Através da medição do dCTP incorporado foi calculada a quantidade de cDNA sintetizado. O rendimento da síntese da primeira cadeia é normalmente entre 5 e 15%. 1.3 Reacção em cadeia com polimerase

Os oligodesoxinucleótidos iniciadores usados para PCR são sintetizados in vitro pelo método do fosforamideto (M.H. Caruthers, em Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, H.G. Gassen e A. Lang, eds., Verlag Chemie, Weinheim, FRG) num sintetizador Applied Biosystems Modelo 380B. Eles estão apresentados na Tabela 1. 26 26

TABELA l: Iniciadores de PCR iniciador sequência (5' para 31)1^ correspondendo aos pb em cDNA de GT2^ PI (Kpnl) cqçqqtACCCTTCTTAAAGCGGCGGCGGGAAGATG (-26) - 3 PI (EcoRI) gccqaattçATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAGCC 1 - 28 p3 (Saci) GTGGAGCTCGTGGCAAAGCAGAACCC 448 - 473

Pad (EcoRI) qccqaaTTCAGTCTCTTATCCGTGTACCAAAACGCCTA 1222 - 1192 P4 (HindIII) cccaaqctTGGAATGATGATGGCCACCTTGTGAGG 546 - 520 1) Letras maiusculas representam sequências de GT, letras minúsculas são sequências adicionais, sítios para enzimas de restrição estão sublinhados. Os codões de iniciação e de paragem da tradução do RNA estão a carregado. 2) sequência de cDNA de GT derivada de placenta humana conforme publicado por GenBank (Ns de Acesso M22921).

As condições de PCR convencionais para uma mistura de incubação de 30 μΐ são: 1 μΐ de reacção da transcriptase reversa (ver Exemplo 1.2) contendo cerca de 5 ng da primeira cadeia de cDNA, 15 pmoles de cada um dos iniciadores importantes, 200 μιηοίβε de cada um dos quatro trifosfatos de desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP e TTP) em tampão PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,3 (a 23°C), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,001% de gelatina) e 0,5 U de polimerase AmpliTaq (Perkin Elmer). A amplificação foi realizada no Thermocycler 60 (Biomed) usando as seguintes condições: 0,5 min de desnaturação a 95°C, 1 min. de emparelhamento a 56°C e 1 27 minuto 15 seg de extensão a 72°C, durante um total de 20 - 25 ciclos. No último ciclo, a extensão do iniciador a 72°C foi realizada durante 5 minutos. Para sequenciação e subclonagem, o cDNA de GT de HeLa foi amplificado em dois fragmentos sobreponí-veis usando diferentes combinações de iniciadores:

I (1) Fragmento P1-P4: Iniciadores PI e P4 foram usados para amplificar um fragmento de DNA de 0,55 Kb cobrindo as posições 7-556 na sequência de cDNAda GT de HeLa (SEQ ID NO. 1) 1 (2) Fragmento P3-P2d: Iniciadores P3 e P2 foram usados para amplificar um fragmento de 0,77 Kb cobrindo as posições dos nucleótidos 457-1232 (SEQ ID NO.1).

Para evitar erros durante a amplificação realizaram-se quatro PCRs independentes para cada fragmento. Também o iniciador Plup(Kpnl) em combinação com o iniciador P4 foi usado para determinar a sequência de DNA seguida de um codão de iniciação.

Após amplificação por PCR, o fragmento P1-P4 foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII, analisado num gel de 1,2% de agarose, eluido do gel por GENECLEAN (BIO 101) e subclonado no vetor pUC18 (Pharmacia), digerido com as mesmas ) enzimas. 0 fragmento P3-P2d foi digerido com Saci e EcoRI, analisado num gel de 1,2%, eluido e subclonado em pUC18, digerido com Saci e EcoRI. Os subclones resultantes são pUC18/Pl-P4 e pUC18/P3-P2d, respectivamente. Para subclonagem, ligação e ) transformação de E. coli estirpe DH5a, seguiram-se protocolos convencionais como descrito no Exemplo 2. Minipreparações de plasmídeos pUC18/Pl-P4 e pUC18/P3-P2d foram usados para sequenciação didesoxi do DNA de cadeia dupla desnaturado com o kit de sequenciação com polimerase de T7 (Pharmacia). Iniciadores de sequenciação M13/pUC e iniciadores de sequenciação reversos (Pharmacia) foram aplicados a fragmentos sobreponíveis da sequência produzidos a partir de ambas as cadeias de DNA por digestão com várias enzimas de restrição. Posterior subclonagem dos fragmentos de restrição do gene GT é necessário para uma sequen-ciação extensiva de fragmentos sobreponíveis de ambas as cadeias. A sequência dos fragmentos amplificados por PCRs independentes mostra que o erro da amplificação é inferior a 1 em 3000 nucleó-tidos. A sequência de nucleótidos completa do cDNA de GT de células HeLa que está apresentado em SEQ ID NO. 1 é 99,2% homólogo do de placenta humana (Genbank N2 de Acesso M22921). Encontra-ramse três diferenças: (a) Três pares de bases extra nas posições de nucleótidos 37-39 (SEQ ID NO. 1) resultando num aminoãcido extra (Ser) na região N-terminal da proteína; (b) pb 98 a 101 são 'CTCT' em vez de 'TCTG' na sequência da placenta humana, conduzindo a duas substituições de aminoácidos conservadas (Ala Leu em vez de ValTir) nas posições de aminoácidos 31 e 32 no domínio de GT que atravessa a membrana; (c) o nucleótido na posição 1047 é alterado de Ά' para 'G' sem assegurar uma alteração na sequência de aminoácidos.

Os dois fragmentos de DNA sobreponíveis P1-P4 e P3-P2d codificadores de cDNA de GT de HeLa estão ligados no sítio de restrição Notl na posição de nucleótidos 498 que está presente em ambos os fragmentos. 0 cDNA completo de GT de células HeLa (SEQ ID NO. 1) foi clonado como um fragmento de restrição EcoRI-EcoRI de 1,2 Kb no plasmídeo pIC-7, um derivado de pUC8 com sítios de restrição adicionais no sítio de multiclonagem (Marsh, J.L., Erfle, M. e Wykes, E.J. (1984) Gene 32, 481-485), resultando no vector p4AD113. Com a finalidade de criar uma cassete de expressão de GT o sítio de restrição EcoRI (pb 1227) no extremo 3' da sequência de cDNA foi eliminado como se segue: vector p4AD113 foi primeiro linearizado por digestão com EcoRV e depois tratado com fosfatase alcalina. Ainda, 1 Mg de DNA do plasmídeo linearizado foi parcialmente digerido com 0,25 U de EcoRI durante 1 hora a 37°C. Após electroforese em gel de agarose um fragmento correspondendo ao tamano do plasmídeo liearizado (3,95 Kb) foi isolado do gel por GENECLEAN (Bio 101). O extremo saliente EcoRI foi preenchido com polimerase Klenow como descrito no manual de Maniatis (supra) . Após extracção com fenol e precipitação com etanol o plasmídeo foi novamente ligado e usado para transformar E. coli DH5a (Gibco/BRL). Fizeram-se minipreparações de plasmídeos a partir de seis transformantes. Os plasmídeos obtidos foram testados por análise de restrição relativamente à ausência dos - . 3 sítios de restrição EcoRI e EcoRV no extremo , do cDNA de GT de

HeLa. 0 plasmídeo designado p4AE113 foi escolhido para as experiências seguintes, a sua sequência de DNA sendo idêntica à do plasmídeo p4AD113, com excepção dos pb 1232-1238 dentro dos sítios de restrição EcoRI-EcoRV estarem eliminados. EXEMPLO 2: Construção de cassetes de expressão para GT de tamanho completo

Para a expressão heteróloga em Saccharomvces cerevisiae a sequência de cDNA de GT de HeLa de tamanho completo (SEQ ID N0.1) foi fundida com sinais de controle da transcrição de levedura para iniciação e terminação da transcrição eficazes. As sequências de promotor e de terminador derivadas do gene da fosfatase ácida de levedura (PHQ5) (EP 100561). O promotor PH05 de tamanho completo é regulado pela quantidade de fosfato inorgânico no meio de cultura. Concentrações elevadas dê P^ conduzem à repressão do promotor enquanto que P^ baixo actua por indução. Como alternativa, usa-se um pequeno fragmento do promotor PH05 de 30 173 pb, o qual não possui elementos reguladores eportanto comporta-se como um promotr constitutivo. 2.1 Construção de uma cassete de expressão induzivel por fosfato A sequência de cDNA de GT foi combinada com o promotor PH05 de levedura e sequências de terminação da transcrição como se segue: (a) Sequência de cDNA de tamanho completo de GT de HeLa: O vector p4AE113 com a sequência de cDNA de GT de tamanho completo foi digerida com as enzimas de restrição EcoRI e BglII. Os fragmentos de DNA foram separados electroforeticamente num gel de 1% de agarose. Um fragmento de DNA de 1,2 Kb contendo a sequência de cDNA completa de GT de HeLa foi isolado do gel por adsorção a vidro, usando o kit GENECLEAN (BIO 101). Neste fragmento o codão de inciação 'ATG' para a síntese proteica de GT está situado directamente atrás do sítio de restrição EcoRI, enquanto que o codão de paragem 'TAG' é seguido de 32 pb contribuído pela região 3' não traduzida de GT de HeLa e pelo sítio de multiclonagem do vector com o sítio de restrição BglII. (b) Vector para amplificação em E. coli: O vector para amplificação, plasmídeo p31R (cf. EP 100561), um derivado de pBR322, foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Sall. Os fragmentos de restrição foram separados num gel de 1% de agarose e isolado um fragmento vector de 3,5 Kb a partir do gel como descrito atrás. Este fragmento de DNA contem o fragmento vector SalI-HindIII do derivado do pBR322 assim como uma sequência terminadora da transcrição de 337 pb de PHQ5 em vez da sequência HindIII-BamHI do pBR322. 31 (c) Sequência para o promotor induzível PH05; O fragmento promotor PH05 contendo os elementos reguladores (UASp) para a indução por fosfatos foi isolado a partir do plasmídeo p31R (cf. EP 100561) por digestão com as enzimas de restrição Sall e EcoRI. 0 fragmento de DNA SalI-EcoRI de 0,8 Kb compreende a sequência SalI-BamHI de 276 pb do pBR322 e o fragmento promotor BamHI-EcoRI de 534 pb do PH05 com um adaptador EcoRI (5'-GAATTC-3') introduzido na posição -8 da sequência do promotor. (d) Construção do plasmídeo pGTA 1132

Os três fragmentos de DNA (a) a (c) foram ligados numa mistura de ligação de 12 μΐ: 100 ng do fragmento de DNA (a) e 30 ng de cada um dos fragmentos (b) e (c) foram ligados usando 0,3 U de DNA-ligase de T4 (Boehringer) no tampão ligase fornecido (66 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl , 1 roM ATP) a 15°C durante 18 horas. Metade da mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de E. coli estirpe DH5a (Gibco/BRL). Para a preparação de células competentes e para a transformação seguiu-se o protocolo convencional descrito no manual de Maniatis (supra). As células foram semeadas em meio LB selectivo, suplementado com 75 ^g/ml de ampicilina e incubado a 37°C. Obtiveram-se cerca de 120 transformantes. Fizeram-se minipreparações de plasmídeo a partir de seis transformantes independentes usando o protocolo de lise alcalina modificado de Birnboim, H.c. e Doly, J. como descrito no manual de Maniatis (supra). Os plasmídeos isolados são caracterizados por análise de restrição com quatro enzimas diferentes (EcoRI, PstI, HindIII, Sall, também em combinação). Os seis plasmídeos apresentaram os fragmentos de restrição esperados. Um dos clones foi escolhido e referido com pGTA 1132. 0 plasmídeo pGTA 1132 contem a cassete de 32 expressão com o cDNA de tamanho completo de GT de HeLa sob o controle do promotor PH05 regulado por fosfato e a sequência de terminação da transcrição de PHQ5. Esta cassete de expressão pode ser removida a partir de pGTA 1132 como um fragmento SalI-HindIII de 2,35 Kb, referido como fragmento de DNA (IA). 2.2 Construção de uma cassete de expressão constitutiva:

Para a construção de uma cassete de expressão com um promotor não regulado constitutivo, é usado um fragmento do promotor PH05 truncado em 5' sem elementos regulados por fosfato, o qual é isolado a partir do plasmídeo p31/PH05(-173)RIT.

(a) Construção do plasmídeo pl3/PH05(-173)RIT 0 plasmídeo p31 RIT12 (EP 288435) compreende o promotor PH05 regulado de tamanho completo (com um sítio EcoRI introduzido na posição de nucleótidos -8 num fragmento BamHI-EcoRI de 534 pb, seguido pela sequência codificadora da sequência sinal da inver-tase de levedura (EcoRI-Xhol de 72 pb) e o sinal de terminação da transcrição de PH05 (Xhol-HindIII de 135 pb) clonado num arranjo em tandem entre BamHl e HindIII do vector derivado de pBR322. O elemento promotor constitutivo PH05 (-173) derivado do plasmídeo pJDB207/PH05(-173)-YHIR (EP 340170) compreende a sequência de nucleótidos do promotor PH05 de levedura desde a posição de nucleótidos -9 a -173 (sítio de restrição BstEII), mas não tem sequências reguladoras a montante (UASp). O promotor PH05(-173), comporta-se portanto como um promotor constitutivo. Este exemplo descreve a substituição do promotor PH05 regulado no plasmídeo p31RIT12 pelo elemento promotor constitutivo PH05(-173) de forma a obter-se o plasmídeo p31/PH05(-173)RIT. 33

Os plasmídeos p31RIT12 (EP 288435). e PJDB207/PHQ5 f--173)-YHIR (EP 340170) foram digeridos com as endonucleases de restrição Sall e EcoRI. Os respectivos fragmentos SalI-EcoRI de 3,6 e 0,4 Bk foram isolados num gel de 0,8% de agarose, eluido do gel, precipitado com etanol e ressuspenso em í^O numa concentração de 0,1 pmoles/μΐ. Ambos os fragmentos de DNA foram ligados e amostras de 1 μΐ da mistura de ligação foram usadas para transformar células competentes de E. coli HB101 (ATCC). As colónias resistentes â ampicilina foram cultivadas individualmente em meio LB suplementado com ampicilina (00 μg/ml). O DNA de plasmídeo foi isolado de acordo com o método de Holmes, D.S. et al., (Anal. Biochem. (1981) 144,193) e analisado por digestão com as enzimas de restrição Sall e EcoRI. O plasmídeo de um clone com os fragmentos de restrição correctos foi referido como p31/PH05(-173)RIT. (b) Construção do plasmídeo pGTB1135 O plasmídeo p31/PH05(-173)RIT foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Sall. Após separação num gel de 1% de agarose isolou-se um fragmento SalI-EcoRI de 0,45 Kb a partir do gel por GENECLEAN (BIO 101). Este fragmento contem a sequência SalI-BamHI de 276 pb do pBR322 e o fragmento BamHI(BstEII)-EcoRI de 173 pb do promotor constitutivo PHQ5. O fragmento SalI-EcoRI de 0,45 Kb foi ligado ao fragmento EcoRI-BglII de 1,2 Kb do cDNA de GT (fragmento (a) e parte BamHI-SalI de 3,5 Kb do vector para amplificação em E. coli com o terminador PHQ5 (fragmento (b)) descrito no Exemplo 2.1 A ligação e transformação de E. coli estirpe DH5a foram realizados como descrito atrás dando 58 transformantes. Os plasmídeos foram isolados a partir de seis colónias independentes por minipreparações e caracterizado por análise de restrição. Os seis plasmídeos apresentaram os fragmentos esperados. Um clone correcto foi referido como pGTB 1135 e 34

usado para outras experiências de clonagem para proporcionar a cassete de expressão de GT de HeLa sob o controle do fragmento do promotor constitutivo PH05(-173). Esta cassete de expressão pode ser retirada do vector pGTB 1135 como um fragmento Sall--HindlII de 2Kb, referido como fragmento de DNA (1B).

EXEMPLO 3:Construção dos vectores de expressão PDPGTA8 e oDPGTBS O vector de levedura isolado para a expressão heteró-loga é o vector epissomal pDP34 (11,8 Kb) que é um vector vai-vem levedura-E.coli com a marca da resistência à ampicilina para E. coli e as marcas selectivas para levedura URA3 e dLEU2. 0 vector pDP34 (cf. EP 340170) foi digerido com a enzima de restrição BamHI. 0 vector linearizado foi isolado com GENECLEAN e os extremos salientes foram preenchidos por tratamento com polime-rase Klenow como descrito no manual de Maniatis (supra). A reacção foi parada após 30 minutos por aquecimento a 65°C durante 2 0 minutos na presença de 10 mM EDTA. Após precipitação com etanol o plasmídeo foi digerido com Sall e sujeito a electrofo-rese em gel num gel de 0,8% de agarose. O vector pDP34 extremo cerse (BamHI)-Sall foi isolado como um fragmento de DNA de 11,8 Kb a partir do gel com o kit de GENECLEAN.

Por analogia com a preparação do vector os plasmídeos pGTA 1132 e pGTB 1135 foram digeridos com HindIII. Os extremos protuberantes dos plasmídeos linearizados foram preenchidos por tratamento com polimerase Klenow e subsequentemente sujeito a digestão com Sall, resultando em (2A) um fragmento extremo cerses (HindIII)-Sall de 2,0 Kb com a cassete de expressão regulada por fosfatos ou (2B) um fragmento extremo cerse (HindIII)-Sall de 2,0 Kb com a cassete de expressão constitutiva. 35

A ligação do vector pDP34 extremo cerse-SalI com o fragmento 2A ou com o fragmento 2B e transformação de células competentes de E. coli estirpe DH5a é realizada como descrito no Exemplo 2 usando 80 ng de vector e 40 ng do fragmento IA ou 2B, respectivamente. Obtiveram-se 58 e 24 transformantes, respectiva-mente. A partir de cada transformação prepararam-se seis plasmí-deos que se caracterizaram por análise de restrição. Para a construção com a cassete de expressão regulada (fragmento 2A), dois plasmídeos apresentaram o padrão de restrição esperado. Um dos clones foi escolhido e designado pDPGTA8.

Para a construção com a cassete de expressão constitutiva (fragmento 2B) um plasmídeo mostra o padrão de restrição esperado e foi designado pDPGTB5. EXEMPLO 4: Transformação de S. cerevisiae estirpe BT 150 DNA purificado em CsCl dos vectores de expressão pDPGTA8 e pDPGTB5 foi preparado seguindo o protocolo de R.

Treisman no manual de Maniatis (supra). As estirpes de S. cerevisiae deficientes em proteases BT 150 (MATa, his4, leu2, ura3, pral, prbl, prcl, cpsl) e H449 (MATa, prbl, cpsl, ura3delta5, leu 2-3, 2-112, cir°) foram transformadas individualmente com 5 pq de cada um dos plasmídeos pDPGTA8, pDPGTB5 e pDP34 (testemunha sem cassete de expressão) de acordo com o método de transformação com acetato de lítio (Ito, H. et al., supra). Os transformantes Ura+ foram isolados e despistados relátivamente à actividade GT (infra). Células de levedura transformadas isoladas foram seleccionadas e referidas como Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPGTA8

Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPGTB5 Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDP34 Saccharomvces cerevisiae BT 449/pDPGTA8

Saccharomvces cerevisiae BT 449/pDPGTB5 Saccharomvces cerevisiae BT 449/pDP34 EXEMPLO 5: Actividade enziiaática de GT de tamanho completo expressa em levedura 5.1 Preparação de extractos celulares Células das estirpes transformadas de Saccharomvces cerevisiae estirpes BT150 e H449 foram cultivadas sob selecção com uracilo em meio mínimo para leveduras (Difco) suplementado com histidina e leucina. A velocidade de crescimento das células não é afectada pela introdução de qualquer um dos vectores de expressão. As células em crescimento exponencial (a 0D57g de 0,5) ou células na fase estacionária foram colhidas por centrifugação, lavadas uma vez com tampão 50 mM Tris-HCl pH 7,4 (tampão 1) e ressuspensas em tampão 1 numa concentração correspondendo a 0,1-0,2 0 rebentamento mecânico das células foi efectuado por agitação forte num vortex com esferas de vidro (0,45-0,5 mm de diâmetro) durante 4 minutos com arrefecimento intermitente. Os extractos brutos foram usados directamente para a determinação da actividade enzimãtica. O fraccionamento dos componentes celulares foi conseguido por centrifugação diferencial do extracto. Primeiro o extracto foi centrifugado a 450 g durante 5 minutos; em seguida o sobrenadante obtido foi centrifugado a 20000g durante 45 minutos. O sobrenadante foi colhido e os sedimentos ressuspensos em tampão 1.

Para a indução com fosfato da expressão de GT sob o controle do promotor induzível PH05. células dos transformantes 37 BT 150/pDPGTA8 e H449/pDPGTA8 foram transferidas em massa para meio mínimo com baixo teor de fosfatos, respectivamente, (Meyhack, B. et al., Embo J. (1982) 1, 675-680). Os extractos celulares foram preparados como descrito atrás. ; • 5.2 Ensaio de proteínas A concentração de proteína foi determinada usando o kit BCA-Protein Assay (Pierce).

I

5.3 Ensaio da actividade GT A actividade GT pode ser medida por métodos radioquí- micos usando ovalbumina, uma glicoproteína que apenas expõe

GlcNAc como sítio aceitador ou GlcNAc livre como substrato aceitador. Os extractos celulares (de 1-2 0D,.„o de células) foram testados durante 45 ou 60 minutos a 37°C em 100 μΐ de mistura de incubação contendo 100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 nCi UDP-14C-Gal (325 mCi/mmol) , 80 nmol UDP-Gal, Ιμιαοί MnCl2, 1% Triton X-100 e 1 mg de ovalbumina ou 2 μιηοΐ GlcNAc como aceitador. No caso de ser usado uma glicoproteína como substrato aceitador, a reacção é parada por precipitação da proteína com ácido e a quantidade de 14 . , i C galactose incorporada na ovalbumina e determinada por conta gem de cintilação líquida (Berger, E.G. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 90, 213-222). Para GlcNAc como substrato aceitador a reacção é parada pela adição de 0,4 ml de HO arrefecida em gelo 14 ^ 14 e a UDP- -galactose não usada é separada dos produtos C numa ^ coluna de permuta aniõnica (AG X1-8, BioRad) como descrito

(Masibay, A.S. e Qasaba, P.K. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 5733-5737). Os ensaios são realizados com e sem moléculas aceitadoras para testar o grau de hidrólise de UDP-Gal por pirofosfatases de nucleótidos. Os resultados estão apresentados na Tabela 2. TABELA 2: Actividade GT em S. cerevisiae estirpe BT 150 transformado com diferentes plasmídeos. 1- |plasmídeo promotor PH05 actividade específica GT Pi elevado -! (mU/mg de | proteína) | Pi elevado| |pDP34 — < 0,01 n.d. | |pDPGTA8 regulado por fosfato 0,1 0,6-1 | |pDPGTB5 1 constitutivo 0,6 n.d.1) | _1 1) não determinado A actividade GT das culturas mudadas para condições induziveis (meio mínimo baixo Pi) é aproximadamente a mesma das culturas em meios mínimos expressando GT constitutivamente (Tabela 2). Conforme esperado, a maior parte da actividade GT (70-90%, ver Tabela 3) e a actividade específica mais elevada é sempre encontrado no sedimento de alta velocidade (20000 g). A actividade enzimática pode ser aumentada pela adição de 1-2% de Triton X-100 ao ensaio enzimático. Ambos os resultados sugerem que GT recombinante está ligada à membrana nas células de levedura tal como nas células HeLa. 39

TABELA 3; Distribuição da actividade GT durante o fraccionamento de células BT 150/pDPGT5

Actividade GT 14 cpm UDP- C-Gal incorporados |Fracção em GlcNAc % |extracto bruto 19400 | 400g sedimento 1000 4,6% | 20000g sedimento 15800 72,5% | 20000g sobrenadante 5000 22,9% 1_ total: 21800 100 % EXEMPLO 6: Purificação da GT recombinante

Para libertar a enzima ligada a membranas, a fracção do sedimento de 20000 g das células BT 150/pDPGTB5 foi tratada com 1% (p/v) de Triton X-100 durante 10 minutos à temperatura ambiente e equilibrado com 50 mM Tris HC1 pH 7,4, 25 mM MgCl2, 0,5 mM UMP e 1% (p/v) Triton X-100. 0 sobrenadante obtido após centrifugação foi filtrado por 0,2 μιη e passado numa coluna GlcNAc-p-ami-nofenil-Sepharose (Berger, E.G. et al. (1976) Experiência 32, 690-691) com um volume de leito de 5 ml com um fluxo de 0,2 ml/min a 4°C. A enzima foi eluida com 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM GlcNAc, 25 mM EDTA e 1% Triton X-100. Um único pico de actividade enzimática foi eluido dentro de cinco fracções (tamanho: 1 ml). Estas fracções foram reunidas e dialisadas contra 2x 1 1 de 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1% Triton X-100. A GT purificada é enzimati-camente activa. 40 EXEMPLO 7: Construção de uma cassete de expressão para Gt solúvel A galactosiltransferase expressa em levedura pode ser secretada para o meio de cultura se um promotor de levedura estiver operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora da sequência sinal do gene da invertase de levdura SUC2 ligado na grelha de leitura correcta a um cDNA codificador de GT solúvel. (a) Sequência parcial do cDNA de GT de HeLa cDNA de GT de HeLa foi retirado do plasmídeo p4AD113 (Exemplo 1) por digestão com EcoRI (Exemplo 1) por digestão com EcoRI. 0 fragmento de 1,2 Kb contendo o cDNA completo de GT foi isolado e parcialmente digerido com MvnI (Boerhinger) cortando a sequência nas posições 43, 55, 140 e 288 da sequência de nucleó-tidos descrita em SEQ ID NO.l. Quando da digestão de 0,2 pg do fragmento EcoRI com 0,75 μ MvnI durante 1 hora o cDNA de GT é cortado apenas uma vez na posição de nucleótidos 134 dando um fragmento MvnI-EcoRI. (b) Vector para a amplificação em E. coli O plasmídeo pUC18 (Pharmacia) foi digerido com BamHI e EcoRI no sítio de clonagem múltipla. Em seguida o plasmídeo foi tratado com fosfatase alcalina como descrito no manual Maniatis (supra), sujeito a electroforese em gel de agarose e isolado do gel como um fragmento de DNA de 2,7 Kb. (c) Promotor constitutivo PHQ5 (-173) e sequência sinal SUC2 O vector P31/PH05 f-173)RIT (Exemplo 2) foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Xhol com o promotor constitutivo 41 ΡΗ05(-173) e a sequência codificadora adjacente da sequência sinal da invertase (inv ss) foi isolada. Em seguida o fragmento foi cortado com Hgal (BioLabs). A sequência de reconhecimento Hgal está na cadeia de DNA anticodão. A enzima de restrição corta a montante da sequência de reconhecimento de forma a que o extremo coesivo 5' da cadeia anticodão coincida com o fim da sequência codificadora da sequência sinal da invertase. 0 fragmento de DNA de 0,24Kb cortado com BamHI e Hgal contem a sequência do promotor constitutivo PHQ5 (-173) ligada à sequência sinal da invertase de levedura. (d) Adaptador 0 fragmento (a) foi ligado ao fragmento (c) por meio de uma sequência adaptadora que foi preparada a partir de quantidades equimolares dos oligonucleótidos sintéticos (Microsynth) 5'CT GCA CTG GCT GGC CG3' e 5'CG GCC AGC CAG 3' para a cadeia complementar. Os oligonucleótidos foram emparelhados uns com os outros aquecendo primeiro até 95°C e depois deixando arrefecer lentamente até 20°C. O adaptador emparelhado foi guardado congelado.

(e) Construção do plasmídeo psGT

Para ligação, o vector linearizado (b), o fragmento de cDNA de GT (a), o fragmento (c) contendo o promotor e a sequência codificadora do peptídeo sinal e o adaptador (d) foram usados numa proporção molar de 1:2:2:30:100. A ligação foi realizada em 12 μΐ de tampão ligase (66 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl^, 1 mM MgCl^, 1 mM ATP) a 16°C durante 18 horas. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de E. coli estirpe DH5a como descrito atrás. As minipreparações de plasmídeo foram realizadas a partir de 24 transformantes independentes. Os plasiuídeos isolados foram caracterizados por análise de restrição usando quatro enzimas diferentes (BamHI, PstI, EcoRI, Xhl, também em combinação). Um único clone com o padrão de restrição esperado foi referido como psGT. A sequência correcta no sítio de fusão da sequência codificadora do peptídeo sinal da invertase com o cDNA codificador de GT solúvel foi confirmado para o plasmídeo psGT usando o kit de sequenciação com T7 (Pharmacia) e o iniciador 5' AGTCGAGGTTAGTATGGC3' começando na posição -77 no promotor contitutivo PHQ5.

Sequência

para MvnI DNA^ ^ : 5' AAA ATA Tct gca ctg gct ggc cgC GAC CTG AGC 3 ’ 3’ TTT TAT AGA CGT gac cga ccg gcG CAG GAC TCG 5' Proteína: Lis Ile Ser Ala| Leu Ala Gli Arg Asp Leu Ser 16 19 42

inv ss | sequênica GT sítio de clivagem pela endopeptidase de sinal 1)

Letras minúsculas representam a sequência do adaptador. A cassete de expressão para GT secretada contendo o promotor constitutivo PH05(-173), a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal da invertase e o cDNA parcial de GT derivados do plasmídeo psGT podem ser retirados como um fragento Sall (BamHI) - EcoRI de 1,35 Kb. A cassete de expressão ainda não tem 43 43

as sequências terminadoras de PH05 a serem adicionadas no passo de clonagem seguinte.

EXEMPLO 8: Construção do vector de expressão pDPGTS

Para a construção do vector de expressão para GT solúvel combinaram-se os seguintes fragmentos: (a) Parte do vector O plasmídeo pDP34 foi digerido e pré-tratado como descrito no Exemplo 3 resultando num fragmento vector de 11,8 Kb extremo cerse-SalI. (b) Cassete de expressão 0 plasmídeo psGT foi primeiro linearizado por digestão com Sall (no sítio de clonagem múltipla) e depois parcialmente digerido com EcoRI. Um fragmento de DNA de 1,35 Kb foi isolado

contendo o promotor constitutivo PH05(-173), uma sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal da invertase de levedura e o cDNA parcial de GT. (c) Sequência terminadora de PH05 A sequência terminadora de PHQ5 foi isolada a partir do plasmídeo p31 que foi construído partindo do plasmídeo p30 como descrito em EP 100561. Após digestão com a enzima de restrição HindIII os extremos protuberantes foram preenchidos com polime-rase Klenow como descrito atrás. Em seguida o plasmídeo foi digerido com EcoRI e isolado o fragmento de 0,39 Kb extremo cerse-EcoRI com as sequências terminadoras de PHQ5. 44

A ligação dos fragmentos (a) , (b) e (c) e transformação de células competentes de E. coli estirpe DH5a foram realizadas como descrito no Exemplo 2. A partir dos transformantes obtidos isolaram-se plasmídeos e caracterizaram-se por análise de restrição. 0 plasmídeo de um clone com os fragmentos de restrição correctos foi referido como pDPGTS. EXEMPLO 9: Expressão de GT solúvel em levedura

Por analogia como o Exemplo 4, DNA purificado em CsCl do vector de expressão pDPGTS foi usado para transformar S. cerevisiae estirpes BT 150 e H 449. Os transformantes Ura+ foram isolados e despistados relativamente à actividade GT. Em cada um dos casos um transformante foi seleccionado e referido como Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPGTS e Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPGTS, respectivamente. Empregando o ensaio descrito no Exemplo 5 encontrou-se actividade GT nos caldos de cultura de ambos os transformantes. EXEMPLO 10: Clonaoem do cDNA da sialiltransferase CST^ a partir de células humanas HepG2 cDNA de ST foi isolado a partir de células HepG2 por PCR em analogia com cDNA de GT. A preparação de RNA poli(A)+ e a síntese da primeira cadeia do cDNA foi realizada como descrito no Exemplo 1. Os iniciadoras (Microsynth) apresentados na Tabela 5 foram usados para PCR.

TABELA 5: Iniciadores de PCR iniciador sequência (5'para

correspondendo aos pb em cDNA1 2) de ST

PstI/EcoRI SIA1 cqctqcaqaattcaaaATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGT 1-28

BamHI SIA3 cgcggatCCTGTGCTTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGCC 1228-1198 1

Letras maiúsculas representam sequências de ST, letras minúsculas são sequências adicionais com sítios paraenzimas de restrição (sublinhado). Os codões para "iniciação" e "paragem" da síntese proteica estão indicados a cheio. 2 ' Sequência de cDNA de ST de placenta humana (27) conforme publicado no EMBL Data Bank (N2 de Acesso X17247) . cDNA de ST de HepG2 pode ser amplificado como um fragmento de DNA de 1,2 Kb usando os iniciadores SIA1 e SIA3. PCR foi realizado como descrito para cDNA de GT em condições ligeiramente diferentes: 0,5 min de desnaturação a 95°C, 1 min. 15 seg de emparelhamento a 56°C e 1 min 30 seg de extensão a 72°C, durante um total de 25-35 ciclos. No último ciclo, a extensão do iniciador a 72°C foi realizada durante 5 minutos.

Após amplificação por PCR, o fragmento de 1,2 Kb foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e PstI, analisado num gel de 1,2% de agarose, eluido do gel e subclonado no vector pUC18,. 0 subclone resultante foi designado pSIA2.

EXEMPLO 11: Construção da cassete de expressão constitutiva de ST

Para aexpressão heteróloga constitutiva, cDNA de ST foi ligado ao fragmento do promotor constitutivo PHQ5 (-173) e sequências terminadoras de PHQ5. O plasmídeo pSIA2 foi primeiro linearizado por digestão com a enzima de restrição BamHI e subsequentemente parcialmente digerido com EcoRI. Uma vez que o cDNA de ST também contem um sítio de restrição interno para a enzima EcoRI (no pb 144), um fragmento de 1,2 Kb com o cDNA de ST completa (SEQ ID NO. 3) foi criado por digestão parcila com EcoRI usando 1 μq de DNA e 0,25 U EcoRI (lh, 37°C). Apôs electroforese em gel isolou-se o fragmento EcoRI-BamHI de 1,2 Kb compreendendo o cDNA completo de ST (SEQ ID NO.3).Neste fragmento de DNA o codão de iniciação 'ATG' para a tradução de ST está situado perto do sítio de restrição EcoRI. Três fosfatos de adenosina (ver iniciador de PCR SIA1) proporciona um Ά' na posição de pb 12, o qual se encontra na sequência consensus à volta do 'ATG' de genes altamente expressos em levedura (Hamilton, R. et al., (1987) Nucleic Acids Res. 14, 5125-5149). 0 codão de paragem 'TAA' e os 5pb da região não traduzida do gene são seguidos do sítio BamHI. O fragmento EcoRI-BamHI de 1,2 Kb de ST foi ligado ao fragmento SalI-EcoRI de 0,45 Kb contendo o promotor constitutivo PH05f-173) (Exemplo 2.2(b)) e um fragmento vector BamHI-SalI de 3,5 Kb para amplificação em E. coli contendo a sequência termina-dora de PH05 (cf. Exemplo 2.1, fragmento (b)). A ligação e transformação de E. coli estirpe DH5a foram realizadas como descrito no Exemplo 2.1. Um clone tendo o padrão de restrição esperado foi designado pST2. O vector pST2 compreende a cassete de expressão para ST de HepG2 sob o controle do promotor constitutivo de PH05 (-173) como um fragmento SalI-HindIII de 2,0 Kb, referido como fragmento de DNA (1C). EXEMPLO 12: Expressão de ST em levedura O vector pDP34 (cf. 340 170) foi digerido com a enzima de restrição BamHI. O vector linearizado foi isolado com GENECLEAN e os extremos protuberantes foram preenchidos por tratamento com polimerase Klenow como descrito no manual de Maniatis (supra). A reacção foi parada após 30 minutos por aquecimento a 65°C durante 20 minutos na presença de 10 mM EDTA. Após precipitação com etanol o plasmídeo foi digerido com Sall e sujeito a electroforese em gel num gel de 0,8% de agarose. O vector pDP34 com extremos cerse (BamHI) e cortado com Sall foi isolado como um fragmento de DNA de 11,8 Kb com um 'kit' GENECLEAN. O plasmídeo pST2 foi digerido com a enzima de restrição HindIII e por analogia com a preparação do fragmento vector preenchido no sítio HindIII por tratamento com polimerase Klenow. O produto foi sujeito a digestão com Sall, resultando num fragmento extremo cerse (HindIII)-Sall de 2,0 Kb compreendendo a cassete de expressão constitutiva ST (2C). A ligação de 80 ng do vector pDP34 com 40 ng do fragmento 2C e transformação de células competentes de E. coli estirpe DH5a foram realizadas como descrito no Exemplo 2. Um clone apresentando o padrão de restrição esperado foi escolhido e referido como pDPSTS. 48 48

Para a transformação de levedura, ' DNA purificado por CsCl do vector de expressão . pDPST5 foi preparado seguindo o processo convencional descrito em Maniatis (supra). S. cerevisiae estirpes BT 150 e H 449 foram transformadas com 5pg de DNA de plasmídeo de acordo com o método de transformação que usa acetato de lítio (Ito, H., et al, supra). Os transformantes ura+ são seleccionados e rastreados relativamente à actividade ST. Em cada caso um transformante positivo é seleccionado e referido como Saccharomvces cerevisiae BT l50/pDSPST5 e Saccharomvces cerevisiae. EXEMPLO 13 Actividade enzimática de ST de cumprimento total expresso em levedura 13.1 Preparação de extractos de células Células de Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDST5 são desenvolvidas sob selecção de uracilo em meio mínimo de levedura suplementado com histidina e leucina. As células desenvolvem-se exponencialmente (a OD578 de 0,5) ou as células estacionárias são recolhidas" por centrifugação, lavadas uma vez com tampão de imidazole 50 mM, pH7 (tampão 1) e ressuspensas em tampão 1 numa concentração correspondente a 0,1-0,2 OD57g. A quebra mecânica das células é efectuada por meio de agitação vigorosa num misturador de vórtice com pérolas de vidro (diâmetro de 0,45-0,5 mm) durante 4 minutos com arrefecimento intermitente. A actividade ST pode ser medida nos extractos brutos empregando o ensaio a seguir descrito.

13.2 Ensaio relativo à actividade ST A actividade ST pode ser determinada medindo a 49

quantidade de ácido siãlico radiomarcado o qual é transferido do ácido siálico CMP para uma glicoproteína aceitadora. Após terminação da reacção por precipitação com ácido o precipitado é filtrado usando filtros de fibra de vidro (Whatman GFA) lavado extensivamente com etanol arrefecido em gelo e determinada a radioactividade por contagem de cintilação líquida (Hesford, et al. (1984), Glycoconjugate, J. 1, 141-153). Os extractos celulares foram testados durante 45 minutos numa mistura de incubação contendo 37 μΐ de extracto celular correspondendo a aproximada-mente 0,5 mg de proteína, 3 μΐ de tampão imidazole 50 mMol/1, pH 7,0; 50 nMol ácido CMP-N-acetilneuraminico (Sigma) a que foi . . . 3 , . . adicionado acido CMP- H-N-acetilneuraminico (Amersham) para dar uma actividade específica final de 7,3 Ci/mol e 75 μg de asialo-fetuina (preparado por hidrólise ácida usando 0,1M H2S04 a 80°C durante 60 minutos, seguido de neutralização, diãlise e liofili-zação). A actividade ST foi encontrada nos extractos brutos preparados a partir de células de S. cerevisiae BT 150/pDPST5 e H 449/pDPST5. · EXEMPLO 14: Construção de uma cassete de expressão para ST solúvel (Lis39-Cis406) A ST solúvel designada ST(Lis3g-Cis4Q6) é uma variante truncada no extremo N e consiste em 368 aminoãcido (SEQ ID NO.4). (a) Sequência parcial do cDNA de HepG2 O plasmídeo pSIA2 foi digerido com EcoRI e isolado um fragmento EcoRI de 1,1 Kb. 50

(b) Vector para amplificação em E. coli 0 plasmídeo pUC18 (Pharmacia) foi digerido com BamHI e EcoRI no sítio de clonagem múltipla. Em seguida o plasmídeo foi tratado com fosfatase alcalina como descrito no manual de Maniatis (supra), sujeito a electroforese em gel de agarose e isolado a partir do gel como um fragmento de DNA de 2,7 Kb. (c) Promotor constitutivo PH05(-173) e sequência sinal SUC2 0 vector p31/PH05 RIT (Exemplo 2) foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Xhol. Um fragmento BamHI-Xhol dde 0,25 Kb com o promotor constitutivo PH05f-1731 e a sequência codificadora adjacente da sequência sinal da invertase (inv ss) foi isolado. Em seguida o fragmento foi novamente cortado com Hgal (Biolabs). A sequência de reconhecimento Hgal está na cadeia de DNA anticodão. A enzima de restrição corta a montante da sequência de reconhecimento de forma que o extremo 5' coesivo da cadeia anticodão coincide com o extremo da sequência codificadora da sequência sinal da invertase. 0 fragmento de DNA de 0,24 Kb cortado com BamHI e Hgal contem a sequência do promotor constitutivo PHQ5(-173) ligada à sequência sinal da invertase de levedura. (d) Adaptador O fragmento (a) foi ligado ao fragmento (c) por meio de 1 uma sequência adaptadora que foi preparada a partir de quantida des equimolares dos oligonucleótidos sintéticos 5’CTGCAAAATTGCAAACCAAGG3' e 5'AATTCCTTGGTTTGCAATTT3' para a cadeia complementar. Os oligonucleótidos foram emparelhados um com o outro aquecendo primeiro a 95°C e depois deixando arrefecer 51 lentamente até 2 0°C. O adaptador emparelhado foi guardado congelado.

(e) Construção do plasmídeo psST

Para a ligação, o vector linearizado (b) , o fragmento de cDNA de ST (a), o fragmento (c) contendo o promotor e a sequência codificadora do peptídeo sinal e o adaptador (d) foram usados numa proporção molar de 1:2:2:30:100. A ligação foi realizada em 12 μΐ de tampão ligase (66 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP) a 16°C durante 18 horas. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de E. coli estirpe DH5a como descrito atrás. Minipreparações de plasmídeo foram realizadas para 24 transformantes independentes. Um único clone mostrando o padrão de restrição esperado após caracterização por análise de restrição usando quatro enzimas diferentes (BamHI, PstI, EcoRI, Xhol, também em combinação) foi referido como psST. A sequência correcta no sítio de fusão da sequência codificadora do peptídeo sinal da invertase com a o cDNA codificador de ST(Lis3g-Cis406) solúvel) -foi confirmado para ó plasmídeo psST usando o kit de T7-Sequencing (Pharmacia) e o iniciador 5'ACGAGGTTAATGGC3' começando na posição -77 no promotor constitutivo PH05.(-173) .

Sequência para DNA1): 5' AAA ATA Tct gca aaa ttg caa acc aag gAA 3' 3 ' TTT TAT AGA CGT ttt aac gtt tgg ttc ctt 5' Proteína: Lis Ile Ser Ala | Lis Leu Gin Tre Lis Glu 16 19 39

inv ss | sequênica ST sítio de clivagem pela endopeptidase de sinal 1^ Letras minúsculas representam a sequência do adaptador. A cassete de expressão para ST secretada contendo o promotor consttutivo PH05(-173), a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal da invertase e o cDNA parcila de ST do plasmí-deo psST podem ser retirados como um fragmento de 1,35 Kb Sall (BamHI)- EcoRI. À cassete de expressão ainda lhe falta as sequências terminadoras de PH05 a serem adicionadas no passo de clona-gem seguinte.

EXEMPLO 15: Construção do vector de expressão pDPSTS

Para a construção do vector de expressão para ST(Lis3g-Cis4Q6) solúvel combinaram-se os seguintes fragmentos: (a) Parte de Vector 0 plasmídeo pDP34 foi digerido e pré-tratado como descrito no Exemplo 3 resultando num fragmento vector de 11,8 Kb extremo cerse-SalI. 53

(b) Cassete de expressão 0 plasmídeo psST foi primeiro linearizado por digestão com Sall (no sítio de clonagem múltipla) e depois parcialmente digerido com EcoRI. Um fragmento de DNA de 1,35 Kb foi isolado contendo o promotor PHQ5(-173), uma sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal da invertase de levedura e o cDNA parcial de ST. (c) Sequência terminadora de PH05 A sequência terminadora de PHQ5 foi isolada a partir do plasmídeo p31 que foi construido a partir do plasmídeo p30 como descrito em EP 100561. Após digestão com a enzima de restrição HindIII os extremos protuberantes foram preenchidos por tratamento com polimerase Klenow como descrito atrás. Em seguida o plasmídeo foi digerido com EcoRI e isolado um fragmento de 0,39 extremo cerse - EcoRI com as sequências terminadoras de PH05. A ligação dos fragmentos (a), (b) e (c) e transformação de células competentes de E. coli estirpe DH5a foi realizado como descrito no exemplo 2. A partir dos transformantes obtidos isolaram-se e caracterizaram-se plasmídeos por análise de restrição. O plasmídeo de um clone com os fragmentos de restrição correctos foi referido como pDPSTS. EXEMPLO· 16: Expressão de ST solúvel em levedura

Por analogia com o Exemplo 4, DNA purificado em CsCl do vector de expressão pDPSTS foi usado para transformar S, cerevisiae estirpes BT150 e H449. Os transformantes Ura+ foram isolados e despistados relativamente à actividade ST. Em cada um dos casos um transformante foi seleccionado e referido como 54 -

Saccharomvces cerevisiae BT 150/pDPSTS e Saccharomvces cerevisiae H449/pDPSTS. Usando o ensaio descrito no Exemplo 13 encontrou-se actividade ST nos caldos de cultura de ambos os transformantes. EXEMPLO 17: Construção de uma cassete de expressão para ST solúvel (Lis27-CÍs4QG) A ST solúvel designada ST(Lis_„-CisAnc) é uma variante truncada no extremo N contendo um domínio catalítico e toda a região do pedunculo e consistindo em 380 aminoácidos, i.e. aminoácidos 27 a 406 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO.3. (a) Sequência parcial do cDNA de HepG2 O plasmídeo pSIA2 foi digerido com EcoRI e isolado um fragmento EcoRI de 1,1 Kb. (b) Vector para amplificação em E. coli 0 plasmídeo pUC18 (Pharmacia) foi digerido com BamHI e EcoRI no sítio de clonagem múltipla. Em seguida o plasmídeo foi tratado com fosfatase alcalina como descrito no manual de Maniatis (supra), sujeito a electroforese em gel de agarose e isolado a partir do gel como um fragmento de DNA de 2,7 Kb. (c) Promotor constitutivo PHQ5(-173) e sequência sinal SUC2 O vector p31/PH05(-173)RIT (Exemplo 2) foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Xhol. Um fragmento BamHI-Xhol de 0,25 Kb com o promotor constitutivo PH05(-173) e a sequência codificadora adjacente para a sequência sinal da invertase (inv ss) foi isolada. Em seguida o fragmento foi cortado com Hgal 55 55

(BioLabs). A sequência de reconhecimento Hgal está na cadeia de DNA anti-codão. A enzima de restrição corta a montante da sequência de reconhecimento de forma a que o extremo protuberante 5' da cadeia anti-codão coincida com o extremo da sequência codificadora da sequência sinal da invertase. 0 fragmento de DNA de 0,24 Kb cortado com BamHI e Hgal contem a sequência do promotor constitutivo PHQ5(-173) ligada à sequência sinal da invertase de levedura. (d) Adaptador O fragmento (a) foi ligado ao fragmento (c) por meio de uma sequência adaptadora que foi preparada a partir de quantidades equimolares dos oligonucleótidos sintéticos 5' CTGCAAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGG3' e 5' AATTCCTTGTTGCAATTTAAAGGAATCATAGTAACTCCCTTTCTTCTTTTCCTT3' para a cadeia complementar. Os oligonucleótidos foram emparelhados uns com os outros aquecendo primeiro a 95°C e depois deixando arrefecer lentamente atá 20°C. O adaptador emparelhado foi guardado congelado. (e) Construção do plasmídeo psSTl

Para a ligação, o vector linearizado (b), o fragmento (a) de cDNA de ST, o fragmento (c) contendo o promotor e a sequência codificadora do peptídeo sinal e o adaptador (d) foram usados numa proporção molar de 1:2:2:30:100. A ligação foi realizada em 12 μΐ de tampão ligase (66 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl , 1 mM ATP) a 16°C durante 18 horas. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de E. coli estirpe DH5a como descrito atrás. Fizeram-se minipre-parações de plasmídeos para 24 transformantes independentes. Um clone isolado mostrando o padrão de restrição esperado após 56

caracterização por análise de restrição usando quatro enzimas diferentes (BamHI, PstI, EcoRI, Xhol, também em combinação) foi referido como psSTl. A sequência correcta no sítio de fusão da sequência codificadora do peptídeo sinal da invertase com o cDNA codificador de ST(Lis27~Cis406) solúvel foi confirmado para o plasmídeo psSTl usando o kit de T7-Sequencing (Pharmacia) e o iniciador 5'AGTCGAGTAGTATGGC3' começando na posição -77 no promotor constitutivo PH05Í-173). 5' AAA ATA Tct gca aag gaa aag aag aaa ggg 3' 3' TTT TAT AGA CGT ttc ctt ttc ttc ttt ccc 5' Lis Ile Ser Ala Lis Glu Lis Lis Lis Gli 16 19 27

Sequência para DNA1):

Proteína:

inv ss | sequênica ST sítio de clivagem pela endopeptidase de sinal 1)

Letras minúsculas representam a sequência do adaptador. A cassete de expressão para ST(Lis„-Cis.contendo o promotor constitutivo PH05(-173), a sequência codificadora do peptídeo sinal e o cDNA parcial de ST do plasmídeo psSTl podem ser removidos como um fragmento de 1,35 Kb Sall (BamHI) -EcoRI. A cassete de expressão ainda não possui as sequências terminadoras de PH05 a serem adicionadas no passo de clonagem seguinte. 57

EXEMPLO 18: Construção do vector de expressão oDPSTSl

Para a construção do vector de expressão para a ST(Lis27-Cis406) solúvel foram combinados os seguintes fragmentos: (a) Parte vector O plasmídeo pDP34 foi digerido e pré-tratado como descrito no Exemplo 3 num vector de 11,8 Kb extremo cerse-SalI. (b) Cassete de expressão 0 plasmídeo psSTl foi primeiro linearizado por digestão com Sall (no sítio de clonagem múltipla) e depois parcialmente digerido com EcoRI. Um fragmento de DNA de 1,35 Kb foi isolado contendo o promotor constitutivo PH05(-173), uma sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal da invertase de levedura e o cDNA parcial de ST. (c) Sequência terminadora de PHQ5 A sequência terminadora de PH05 foi isolada a partir do plasmídeo p31 que foi construído partindo do plasmídeo p30 como descrito em EP 100561. Após digestão com a enzima de restrição HindIII os extremos protuberantes foram preenchidos por tratamento com polimerase Klenow como descrito atrás. Em seguida foi isolado o plasmídeo foi digerido com EcoRI e um fragmento de 0,39 Kb extremo cerse - EcoRI com as sequências do terminador de PH05. A ligação dos fragmentos (a), (b) e (c) e a transformação de células competentes de E. coli estirpe DH5a foram realizadas como descrito no Exemplo 2. A partir dos transformantes 58 obrtidos isolaram-se plasmídeos e caracterizaram-se por análise de restrição. O plasmídeo de um clone com os fragmentos de restrição correctos foi referido como pDPSTSl. EXEMPLO 19 : Expressão de ST ÍLis.,„-Cis . n r) solúvel em levedura 2, / 4 U o

Por analogia com o Exemplo 4, DNA purificado em CsCl do vector de expressão pDPSTSl foi usado para transformar S. cerevisiae estirpes BT 150 e H 449. Os transformantes Ura+ foram isolados e despistados relativamente à actividade ST. Em cada um dos casos foi seleccionado um transformante e referido como Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPSTSl e Saccharomvces cerevisiae H449/pDPSTSl. Usando o ensaio descrito no Exemplo 13, a actividade ST foi encontrada nos caldos de cultura de ambos os transformantes. EXEMPLO 20: Clonaqem do cDNA de FT derivado da linha de células humanas HL60

Com base na sequência de cDNA publicada (Goelz, S.E. et al. (1990) Cell 63, 1349-1356) para ELFT (ELAM-1 ligando da fucosiltransferase) codificadora de a(1-3)-fucosiltransferase projectaram-se os seguintes oligonucleótidos iniciadores para amplificar um fragmento de DNA englobando a grelha de leitur aberta do cDNA de ELFT por tecnologia de PCR: 5'-CAGCGCTGCCTGTTCGCGCCAT-3' (ELFT-1B) e 5'-GGAGARGCACAGTAGAGGATCA-3' (ELFT-2B). ELFT-1B inicia nos pars ) de bases 38-59 da sequência publicada e ELFT-2B começa nos pb 1347-1326 na cadeia anti-codão. Os iniciadores são usados para amplificar um fragmento de 1,3 Kb usando um kit de polimerase Ta Perkin-Elmer Cetus. O fragmento foi am+lifiçado a partir de cDNA de HL60 fresco na presença de 5% de DMSO e 2 mM MgCl2 com o seguinte ciclo: 59

95°C 5 min, 25x (1 min 95°C, l min 60°C, 1,5 min 72°C), ΙΟχ (1 min 95°C, 1 min 60°C, 1,5 min + 15 seg/ciclo 72°C). A electroforese em gel de agarose revela uma banda forte de 1,3Kb que quando digerida com Smal ou Apal dá o padrão previsto pela sequência publicada. A banda de 1,3 Kb foi purificada usando um kit Gene-Clean (Bio 101) e foi subclonado no vector pCRIOOO (Invitrogen).

Um clone com a inserção correcta de 1,3 Kb foi selec-cionado e referido como BRB.ELFT/pCR1000-13. O cDNA de FT foi inserido no vector numa orientação contrária relativamente ao promotor de T7. A grelha de leitura aberta do cDNA de FT foi totalmente sequenciada e é idêntica à sequência publicada (SEQ ID NO.5). EXEMPLO 21: Construção de plasmídeos para a expressão induzível e constitutiva de FT (Arcr^^-Arcr^Qr-) solúvel em levedura FT(Arg62-Arg4Q5) solúvel foi expressa a partir de cDNA de FT começando na posição de nucleótido 241 (sítio de restrição NruI) omitindo a região N-terminal codificadora da cauda cito-plasmática e do domínio que atravessa a membrana (ver sequência ID NO.5). O plasmídeo BRB.ELFT/pCR1000-13 foi digerido com HindIII, a qual corta na região de multiclonagem 3' da inserção de cDNA de FT. Os extremos coesivos foram convertidos em extremos cerses numa reacção com DNA-polimerase Klenow. O adaptador Xhol (5' CCTCGAGC3', Biolabs) foi fosforilado, emparelhado e ligado aos extremos cerses do plasmídeo, usando um excesso molar de 100 vezes de adaptadores. Os adaptadores que não reagiram foram 60 60

removidos por precipitação do DNA com isopropanol, o qual foi ainda digerido com Xhol e NruI (clivagem na posição de nucleõtido 240 do cDNA de FT de acordo com a Sequência ID NO. 5). 0 fragmento de 1,1 Kb Nrul-Xhol (a) contem a sequência de cDNA de FT sem a região que codifica a cauda citoplasmática e o domínio que atravessa a membrana atá ao aminoácido 61.

Os plasmídeos p31 RIT12 e p31/PH05(-173)RIT (ver Exemplo 2) foram digeridos com Sall e Xhol. Os fragmentos de 0,9 Kb e 0,5 Kb, respectivamente foram isolados e cortados com Hgal. Os extremos coesivos resultantes foram preenchidos por DNA-poli-merase Klenow. Os extremos cerses criados coincidem com o extremo 3' da sequência codificadora da sequência sinal da invertase de levedura. Clivagem subsequente com BamHI liberta um fragmento BamHI-extremo cerse de 596 pb (b) que compreende o promotor induzível PH05 e a sequência sinal da invertase com o seu próprio ATG ou um fragmento BamHI-extremo cerse de 234 pb (c) compreendendo o promotor curto constitutivo (PH05(-173) e a sequência sinal da invertase. 0 plasmldeo p31RIT12 foi linearizado com a endonuclease de restrição Sall. A digestão com HindIII na presença de brometo de etídio resulta num fragmento SalI-HindIII compreendendo uma sequência SalI-BamHI de 276 pb do pBR322, o promotor de 534 pb da fosfatase ácida de levedura PH05, a sequência sinal da invertase de levedura (codificadora de 19 aminoácidos) e o terminador da transcrição PH05. O fragmento SalI-HindIII de 1 Kb do p31RIT12 foi clonado no vector vai-vem de levedura-E.coli pJDB207 (Beggs, J.D. em: Molecular Genetics in Yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, pp. 383-389), o qual foi cortado com Sall e HindIII. O plasmídeo resultante contendo a inserção de 1 kb é referido como pJDB207/PHO5-RIT12. 61

0 plasmídeo pJDB207/PH05-RIT12 foi digerido com BamHI e Xhol e o fragmento BamHI-Xhol de 6,8 Kb (d) foi isolado. Este fragmento contem todas as sequências do vector pJDB207 e o terminador da transcrição de PH05. > O fragmento BamHI extremo cerse de 596 pb (b), o

fragmento Nrul-Xhol de 1,1 Kb (a) e o fragmento vector de 6,8 Kb Xhol-BamHl (d) foram ligados usando condições convencionais para a ligação de extremos cerses. Amostras da mistura de ligação foram usadas para transformar células competentes E. coli HB101. 0 DNA de plasmídeo das colónias resistentes à ampicilina foi analisado por digestão com enzimas de restrição. Um clone isolado com o plasmídeo de inserção correcta foi referido como pJDB207/PHO5-I—FT. A ligação dos fragmentos de DNA (c), (a), e (d) conduz ao plasmídeo de expressão pJDB207/PH05-(-173)-I-FT. As cassetes de expressão destes plasmídeos compreendem a sequência codificadora da sequência sinal da invertase fundida na mesma grelha de leitura com a α(1-3)fucosiltransferase que é expressa sob o controle do promotor PH05 induzível ou do promotor constitutivo PH05(-173), respectivamente. As cassetes de expressão foram clonadas no vector vai-vem levedura-E. coli pJDB207 entre os sítios de restrição BamHI e HindIII. A sequência de nucleó-tidos no sítio da fusão entre a sequência sinal da invertase e o cNA codificador de FT solúvel foi confirmado por sequenciação de DNA em DNA de plasmídeo de cadeia dupla usando o iniciador 5'AGTCGAGGTTAGTATGGG3' representando a sequência de nucleótidos na posição -77 a -60 de PH05, assim como o promotor PH05(-173). A I junção correcta é: 62

5' AAA ATA TCT GCA 1 CGA CCG GTG 3' 3' TTT TAT AGA CGT 1 GCT GGC CAC 5' Lis Ile Ser Ala 1 Arg Pro Vai 19 1 62 Inv. ss 1 1 FT sitio de clivagem pela endopeptidase de sinal EXEMPLO 2 2; Construção dos plasmldeos para a expressão induzIvel e constitutiva de FT ligado a membrana em levedura

Estas construções usam a sequência codificadora do cDNA de FT com o seu próprio ATG. A sequência de nucleótidos imediatamente a montante do ATG, no entanto,' é bastante desfavorável à expressão em levedura devido ao seu alto teor GC. Ao mesmo tempo um sítio de restrição EcoRI é introduzido nas novas posições de nucleótidos -4 a -9.

I

TABELA 6: Iniciadores de PCR

correspondendo aos pb em cDNA de FT iniciador sequência (5'para 3')^ FT1 cgaoaattcataATGGGGCACCGTGGGGC 58 a 75 FT2 ccactcaaaGAGCGCGGCTTCACCGCTCG 1285 a 1266 ^ Letras maiusculas representam nucleótidos derivados de FT, letras minúsculas são novas sequência adicionais, sítios de restrição estão sublinhados e os codões de "iniciação" e "paragem" estão em destaque.

Usaram-se condições de PCR convencionais para amplificar o cDNA de FT com os iniciadores FT1 e FT2 (ver Tabela 6) em 30 ciclos de síntese de DNA (DNA-polimerase Taq, Perkin-Elmer, 5ϋ/μ1, 1 min a 72°C) , desnaturação (10 seg a 93°C) e emparelha-mento (40 seg a 60°C. O fragmento de DNA resultante de 1,25Kb foi purificado por extracção com fenol e precipitação com etanol, depois digerido com EcoRI, Xhol e Nrul. O fragmento EcoRI-NruI de 191 pb (e) foi isolado em gel preparativo de 4% Nusieve 3:1 de agarose (FMC Bioproiducts, Rockland, ME, USA) em tampão tris-bo-rato pH 8,3, eluido do gel e precipitado com etanol. O fragmento (e) compreende a parte 5' do gene FT codificador dos aminoácidos 1 a 61. O DNA tem uma extensão 5' com o sítio EcoRI como no iniciador de PCR FT1.

Os plasmídeos p31RIT12 e p3l/PH05(-173)RIT foram digeridos com EcoRI e Xhol. Os fragmentos grandes do vector (f e g, respectivamente) foram isolados num gel preparativo de 0,8% de agarose, eluidos e purificados. O fragmento Xhol-EcoRI de 4,1 Kb (f) compreende o vector derivado do pBR322, o promotor PH05 de 64

534 pb (sítio EcoRI) e o terminador da transcrição de PH05 de 131 pb (sítio Xhol). O fragmento Xhol-EcoRI de 3,7 Kb (g) apenas difere pelo promotor curto constitutivo PH05(-173) de 172 pb (sítio EcoRI) em vez do promotor PH05 de tamanho completo. 0 fragmento EcoRI-NruI de 191 pb (e), o fragmento Nrul-Xhol de 1,1 Kb (a) e o fragmento Xhol-EcoRI (f) foram ligados. Uma amostra de 1 μΐ da mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. cli HB101. o DNA de plasmídeo das colónias resistentes à ampicilina foi analisado. 0 DNA de plasmídeo de um clone isolado foi referido como p31R/PH05-ssFT. A ligação dos fragmentos de DNA (e) e (g) conduz ao plasmídeo p31R/PH05(-173)-ssFT. Estes plasmídeos compreendem a sequência codificadora de FT ligada a membranas sob o controle do promotor induzível PHQ5 ou do promotor constitutivo PHQ5(-173), respectivamente. EXEMPLO 23: Clonagem das cassetes de expressão de FT em pDP34:

Os plasmídeos p31R/PH05-ssFT e p31R/PH05(-173)-ssFT foram digeridos com HindIII, que corta 3' relativamente ao terminador da transcrição de PH05. Após uma reacção com DNA-poli-merase Klenow, o DNA foi digerido com Sall. Os fragmentos Sall--extremo cerse de 2,3 Kb e de 1,9 Kb, respectivamente foram isolados.

Os plasmídeos PJDB207/PH05-I-FT e pJDB207/PH05(-173)-I--IFT foram parcialmente digeridos com HindIII na presença de 0,1 mg/ml de brometo de etídio (para evitar clivagem num sítio adicional HindIII na sequência sinal da invertase) e depois tratado com DNA-polimerase Klenow e Sall como atrás. Foram isolados os fragmentos de 2,1 Kb e 1,8 Kb, respectivamente.

Os quatro fragmentos de DNA foram ligados ao fragmento vector Sall-extremo cerse de 11,8 Kb do pDP34 (ver Exemplo 3). Quando da transformação de células competentes E. coli HB101 e análise do DNA do plasmídeo de transformante individuais, quatro plasmideos de expressão correctos foram referidos como PDP34/PH05-I-FT; pDP34/PH05(-173)-I-FT; pDP34R/PH05-ssFT e pDP34R/PH05(-173)-SSFT. S. cerevisiae estirpes BT150 e H449 foram transformadas com 5 μg de cada um dos quatro plasmideos de expressão (atrás) de acordo com o Exemplo 4. Colónias de levedura transformadas isoladas foram seleccionadas e referidas como:

Saccharomvces cerevisiae BT150/pDP34/PHO5-I-FT; BT150/pDP34/PHO5(-173)-I-FT; BT150/pDP34R/PHO5-ssFT; BT150/pDP34R/PHO5(-173)-ssFT; H449/pDP34/PH05—I-FT; H449/pDP34/PH05(-173)-I-FT; H449/pDP34R/PH05-ssFT; H449/pDP34R/PH05(-173)-ssFT; A fermentação e preparação dos extractos celulares foi realizada de acordo com o Exemplo 5. Usando um ensaio análogo ao descrito por Goelz et al., (supra) encontrou-se actividade FT nos extractos brutos preparados a partir das estirpes BT150/pDP34R/PH05-ssFT, BT150/pDP34R/PH05(-173)-SSFT, H449/PD34R/PH05-SSFT e H449/pDP34R/PH05(-173)-SSFT e no caldo de cultura das estirpes H449/pDP34/PH05-I-FT, H449/pDP34/PH05(-173)-I-FT, BT150/pDP34/PH05-I-FT e BT150/pDP34/PH05(-173)-I-FT. 66

Depósito de microorganismos

As estirpes de microorganismos que se seguem foram depositadas na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 16, D-3300 Braunschweig (datas de depósito e números de acesso dados):

Escherichia coli JM109/pDP34: 14 de Março, 1988; DSM 4473 Escherichia coli HB101/p30: 23 de Outubro, 1987; DSM 4297 Escherichia coli HB101/p31R: 19 de Dezembro, 1988; DSM 5116 Sacccharomvces cerevisiae H449: 18 de Fevereiro, 1988; DSM 4413 Saccharomvces cerevisiaeBT 150: 23 de Maio, 1991; DSM 6530 l 67

Listagem de sequências SEP ID NO.l TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1265pb TIPO DE CADEIA: dupla TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: recombinante FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA: plasmídeo p4AD113 de E. coli DH5a/p4AD113 CARACTERÍSTICAS: de 6 a 1200 pb sequência de cDNA codificadora da galactosiltransferase de células HeLa

de 1 a 6 pb sítio EcoRI de 497 a 504 pb sítio Notl

de 1227 a 1232 pb sítio EcoRI

de 1236 a 1241 pb sítio EcoRV

de 1243 a 1248 pb sítio BglII PROPRIEDADES: Fragmento EcoRI-HindIII do plasmídeo p4AD113 compreendendo o cDNA de células HeLa codificador de galactosiltransferase de tamanho completo (EC 2.4.1.22) 68

GAATTC ATG AGG CTT CGG GAG CCG CTC CTG AGC GGC AGC 39

Met Arg Leu A.rg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser 5 10 GCC GCG ATG CCA GGC GCG TCC CTA CAG CGG GCC TGC CGC 7 8

Ala Ala Met Pro Gly Ala Ser Leu Gin Arg Ala Cys Arg 15 20 CTG CTC GTG GCC GTC TGC GCT CTG CAC CTT GGC GTC ACC 117

Leu Leu Vai Ala Vai Cys Ala Leu His Leu Gly Vai Thr 25 30 35 CTC GTT TAC TAC CTG GCT GGC CGC GAC CTG AGC CGC CTG 156

Leu Vai Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu 40 45. 50 69 ccc CAA CTG GTC GGA GTC TCC ACA CCG CTG CAG GGC GGC 195 Pro Gin Leu Vai Gly Vai Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly 55 60 TCG AAC AGT GCC GCC GCC ATC GGG CAG TCC TCC GGG GAG 234 Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gin Ser Ser Gly Glu 65 70 75 CTC CGG ACC GGA GGG GCC CGG CCG CCG CCT CCT CTA GGC 273 Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly 80 85 GCC TCC TCC CAG CCG CGC CCG GGT GGC GAC TCC AGC CCA 312 Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 90 95 100 GTC GTG GAT TCT GGC CCT GGC CCC GCT AGC AAC TTG ACC 351 Vai Vai Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr 105- 110 115 TCG GTC CCA GTG CCC CAC ACC ACC GCA CTG TCG CTG CCC 390 Ser Vai Pro Vai Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 120 125 GCC TGC CCT GAG GAG TCC CCG CTG CTT GTG GGC CCC ATG 429 Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Vai Gly Pro Met 120 135 140 CTG ATT GAG TTT AAC ATG CCT GTG GAC CTG GAG CTC GTG 468 Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Vai Asp Leu Glu Leu Vai 145 150 GCA AAG CAG AAC CCA AAT GTG AAG ATG GGC GGC CGC TAT 507 Ala Lys Gin Asn Pro Asn Vai Lys Met Gly Gly Arg Tyr 155 160 165 70

** y-k r* /» /·» ^ O Z.1* TGC GTC r~prp iL 1 CCT C -C f " n r-w—.o GTC GCC A. C r— t r Alà Pro Ar g Asp Cys Vs 1 Sor Pro His JjV 5 Vai Ala ZI e 1~ 0 175 180 w r.*\. ATT r-' f~~ -w 'w Γ· Γ—<—1/— * * V- CGC AAC CGG CAG GAG CAC CTC o TAC 585 lie ·« ^ £" — w Phe v* Asn Arg Gin Glu His ul Lys 185 ISO r"/“1 /*1 1 oO CTA Π7Φ ihi TAT TTG CAC CCA GTC 'CTG CAG CGC CAG CAG 624 ^ Trp Leu Tyr *7% -v Leu His Pro Vai Leu Gin Arg Gin Gin 1S5 200 205 CTG GAC TAT GGC ATC TAT GTT ATC AAC CAG GCG GGA GAC 663 Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Vai Ile Asn Gin Ala Gly Asp 210 215,· ACT ATA TTC AAT CGT GCT AAG CTC CTC, AAT GTT GGC TTT 702 Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Vai Gly Phe 220 225 230 CAA GAA GCC TTG AAG GAC TAT GAC TAC ACC TGC TTT GTG 741 Gin w Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Vai 235 240 245 TTT AGT GAC GTG GAC CTC ATT CCA ATG AAT GAC CAT AAT 780 Phe ) Ser Asp Vai Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 250 255 GCG TAC AGG TGT TTT TCA CAG CCA Ovj CAC ATT TCC GTT 819 Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Vai 260 265 270 GCA ATG GAT AAG TTT GGA TTC AGC- CTA CCT TAT GTT CAG 858 Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Vai Gin 275 280 71

TAT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA AGT AAA CAA CAG TTT 897 Tyr Phe Gly Gly Vai Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 285 290 295 CTA ACC ATC AAT GGA TTT CCT AAT AAT TAT TGG GGC TGG 936 Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 300 305 310 GGA GGA GAA GAT GAT GAC ATT TTT AAC AGA TTA GTT TTT 975 Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Vai Phe 315 320 AGA GGC ATG TCT ATA TCT CGC CCA AAT GCT GTG GTC GGG 1014 Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Vai Vai Gly 325 330 335 AGG TGT CGC ATG ATC CGC CAC TC A AGA GAC AAG AAA AAT 1053 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn 340 345 GAA CCC AAT CCT CAG AGG TTT GAC CGA ATT GCA CAC ACA 1092 Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr 350 355 360 "" AAG GAG ACA ATG CTC TCT GAT GGT TTG AAC TC A CTC ACC 1131 Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 365 370 375 TAC CAG GTG CTG GAT GTA CAG AGA TAC CCA TTG TAT ACC 1170 Tyr Gin Vai Leu Asp Vai Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 380 385 CAA ATC ACA GTG GAC ATC GGG ACA CCG AGC TAGGACTTTT 1210 Gin Ile Thr Vai Asp Ile Gly Thr Pro Ser 390 395

GGTACAGGTA AAGACTGAAT TCATCGATAT CTAGATCTCG 72 SEP ID NO.2 TIPO DE SEQUÊNCIA: Proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 357 aminoãcidos TIPO DE MOLÉCULA:Fragmento C-terminal da galactosiltransferase de células HeLa de tamanho completo PROPRIEDADES: galactosiltransferase solúvel (EC 2.4.1.22) derivada de células HeLa

Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu 5

Pro Gin Leu Vai Gly Vai Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly 10 15 20

Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gin Ser Ser Gly Glu 25 30 35

Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly 40 45

Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro 50 55 60

Vai Vai Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr 65 70

Ser Vai 75 Ala Cys

Pro Vai Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 80 85

Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Vai Gly Pro Met 90 95 100

Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Vai Asp Leu Glu Leu Vai 105 110

Ala Lys Gin Asn Pro Asn Vai Lys Met Gly Gly Arg Tyr 115 120 125 73 73

Ala Pro Arg Asp Cys Vai Ser Pro His Lys Vai Ala Ile 130 135 '

Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu Lys Tyr 140 145 150

Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Vai Leu Gin Arg Gin Gin 155 160 165

Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Vai Ile Asn Gin Ala Gly Asp 170 175

Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Vai Gly Phe 180 185 190

Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Vai 195 200

Phe Ser Asp Vai Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 205 210 215

Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Vai 220 225 230

Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Vai Gin 235 240

Tyr Phe Gly Gly Vai Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe 245 250 255

Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 260 265.

Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Vai Phe 270 275 280 74 74

Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Vai Vai Gly 285 290 295

Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn 300 305

Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr 310 315 320

Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 325 330

Tyr Gin Vai Leu Asp Vai Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 335 340 345

Gin Ile Thr Vai Asp Ile Gly Thr Pro Ser 350 355 SEP ID NO.3 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente proteína de 1 a 6 pb de 6 a 11 pb de 144 a 149 pb de 1241 a 1246 pb de 1243 a 1248 pb PROPRIEDADES: Fragmento PstI-BamHI do cDNA de HepG2 codificador de completo (EC 2.4.99.1) COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1246pb TIPO DE CADEIA: dupla TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: recombinante FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA: DH5a/pSIA2 CARACTERÍSTICAS: de 15 a 1232 pb plasmídeo pSIA2 de E. coli

sequência de cDNA codificadora da sialiltransferase de células HepG2 sítio PstI sítio EcoRI sítio EcoRI sítio EcoRV sítio BglII do plasídeo pSIA2 compreenden-sialiltransferase de tamanho 76

CTGCAGAATT CAAA ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA 38 Met Ile HÍS Thr Asn 5 Leu Lys Lys AAG TTC AGC TGC TGC GTC CTG GTC TTT CTT CTG TTT GCA 77 Lys Phe Ser Cys Cys Vai Leu Vai Phe Leu Leu Phe Ala 10 15 20 GTC ATC TGT GTG TGG AAG GAA AAG AAG AAA GGG AGT TAC 116 Vai Ile Cys Vai Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly Ser Tyr 25 30 TAT GAT TCC TTT AAA TTG CAA ACC AAG GAA TTC CAG GTG 155 Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Vai 35 40 45 77

ΤΤΑ AAG AGT CTG GGG AAA TTG GCC ATG GGG TCT GAT TCC 194 Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser 50 55 60 CAG TCT GTA TCC TCA AGC AGC ACC CAG GAC CCC CAC AGG 233 Gin Ser Vai Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg 65 70 GGC CGC CAG ACC CTC GGC AGT CTC AGA GGC CTA GCC AAG 272 Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys 75 80 8.5 GCC AAA CCA GAG GCC TCC TTC CAG GTG TGG AAC AAG GAC 311 Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Vai Trp Asn Lys Asp 90 95 AGC TCT TCC AAA AAC CTT ATC CCT AGG CTG CAA AAG ATC 350 Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gin Lys Ile 100 105 110 TGG AAG AAT TAC CTA AGC ATG AAC AAG TAC AAA GTG TCC 389 Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Vai Ser 115 120 125 TAC AAG GGG CCA GGA CCA GGC ATC AAG TTC AGT GCA GAG 428 Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu 130 . 135 GCC CTG CGC TGC CAC CTC CGG GAC CAT GTG AAT GTA TCC 467 Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Vai Asn Vai Ser 140 145 150 ATG GTA GAG GTC ACA GAT TTT CCC TTC AAT ACC TCT GAA 506 Met Vai Glu Vai Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 155 160 78

TGG GAG GGT TAT CTG CCC AAG GAG AGC ATT AGG ACC AAG 545 Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 165 170 175 GCT GGG CCT TGG GGC AGG TGT GCT GTT GTG TCG TC A GCG 584 Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 180 185 190 GGA TCT CTG AAG TCC TCC CAA CTA GGC AGA GAA ATC GAT 623 Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp 195 200 GAT CAT GAC GCA GTC CTG AGG TTT AAT GGG GCA CCC ACA 662 Asp His Asp Ala val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr 205 210 215 GCC AAC TTC CAA CAA GAT GTG GGC ACA AAA ACT ACC ATT 701 Ala Asn Phe Gin Gin Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 220 225 CGC CTG ATG AAC TCT CAG TTG GTT ACC ACA GAG AAG CGC 740 Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu val Thr Thr Glu Lys Arg 230 235 240 TTC CTC AAA GAC AGT TTG TAC AAT GAA GGA ATC CTA ATT 779 Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 245 - 250 255 GTA TGG GAC CCA TCT GTA TAC CAC TC A GAT ATC CCA AAG 818 Vai Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys 260 265 TGG TAC CAG AAT CCG GAT TAT AAT TTC TTT AAC AAC TAC 857 Trp Tyr Gin Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr 270 275 280

AAG ACT TAT CGT AAG CTG CAC CCC AAT CAG CCC TTT TAC 896 Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gin Pro Phe Tyr 285 290 ATC CTC AAG CCC CAG ATG CCT TGG GAG CTA TGG GAC ATT 935 Ile Leu Lys Pro Gin Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile 295 300 305 CTT CAA GAA ATC TCC CCA GAA GAG ATT CAG CCA AAC CCC 974 Leu Gin Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gin Pro Asn Pro 310 315 320 CCA TCC TCT GGG ATG CTT GGT ATC ATC ATC ATG ATG ACG 1013 Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr 325 330 CTG TGT GAC CAG GTG GAT ATT TAT GAG TTC CTC CCA TCC 1052 Leu Cys Asp Gin Vai Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser 335 340 345 AAG CGC AAG ACT GAC GTG TGC TAC TAC TAC CAG AAG TTC 1091 Lys Arg Lys Thr Asp Vai Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe 350 355 TTC GAT AGT GCC TGC ACG ATG GGT GCC TAC CAC CCG CTG 1130 Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr His Pro Leu 360 365 - 370 CTC TAT GAG AAG AAT- TTG GTG AAG CAT CTC AAC CAG GGC 1169 Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Vai Lys His Leu Asn Gin Gly 375 380 385 ACA GAT GAG GAC ATC TAC CTG CTT GGA AAA GCC ACA CTG 1208 Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 390 395 CCT GGC TTC CGG ACC ATT CAC TGC TAAGCACAGG ATCC 1246 Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 400 405 80 SEO ID NO.4 TIPO DE SEQUÊNCIA: Proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 368 aminoácidos TIPO DE MOLÉCULA:Fragmento C-terminal da sialiltransferase de tamanho completo PROPRIEDADES: sialiltransferase solúvel (EC 2.4.99.1) derivada de células HepG2 humanas.

Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Vai 5

Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser 10 15 20

Gin Ser Vai Ser Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg 25 30 35

Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys 40 45

Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Vai Trp Asn Lys Asp 50 55 60

Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gin Lys Ile 65 70

Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Vai Ser 75 80 85

Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu 90 95 100

Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Vai Asn Vai Ser 105 110

Met Vai Glu Vai Thr 115

Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 120 125 81

Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 130 135 ' • Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Vai Vai Ser Ser Ala 140 145 150

Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ile Asp 155 160 165

Asp His Asp Ala Vai Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr 170 175

Ala Asn Phe Gin Gin Asp Vai Gly Thr Lys Thr Thr Ile 180 185 190

Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu Vai Thr Thr Glu Lys Arg 195 200

Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 205 210 215

Vai Trp Asp Pro Ser Vai Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys 220 225 230

Trp Tyr Gin Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr 235 240

Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn Gin Pro Phe Tyr 245 250 255

Ile Leu Lys Pro Gin Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile 260 265

Leu Gin Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gin Pro Asn Pro 270 275 280 82

Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly ile Ile Ile Met Met Thr 285 290 295

Leu Cys Asp Gin Vai Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser 300 305

Lys Arg Lys Thr Asp Vai Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe 310 315 320

Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr His Pro Leu 325 330

Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Vai Lys His Leu Asn Gin Gly 335 340 345

Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 350 355 360

Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 365 i 83 SEP ID NO.5 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com correspondente proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1400pb TIPO DE CADEIA: dupla TOPOLOGIA: linear FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA: BRB.ELFT/pCR1000-13 CARACTERÍSTICAS: de 58 a 1272 pb sequência de cDNA codificadora

da a(l-3)fucosiltransferase de 238 a 243 pb sítio NruI PROPRIEDADES: cDNA de HL60 codificador de α(1-3)fucosiltransferase de tamanho completo 84 CGCTCCTCCA CGCCTGCGGA CGCGTGGCGA GCGGAGGCAG CGCTGCCTGT 50 TCGCGCC ATG GGG GCA CCG TGG GGC TCG CCG ACG GCG GCG 90 Met Gly Ala Pro Trp Gly Ser Pro Thr Ala Ala 5 10 GCG GGC GGG CGG CGC GGG TGG CGC CGA GGC CGG GGG CTG 129 Ala Gly Gly Arg Arg Gly Trp Arg Arg Gly Arg Gly Leu 15 20 CCA TGG ACC GTC TGT GTG CTG GCG GCC GCC GGC TTG ACG 168 Pro Trp Thr Vai Cys Vai Leu Ala Ala Ala Gly Leu Thr 25 . 30 35 TGT ACG GCG CTG ATC ACC TAC GCT TGC TGG GGG CAG CTG 207 Cys Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Ala Cys Trp Gly Gin Leu 40 45 50 CCG CCG CTG CCC TGG GCG TCG CCA ACC CCG TCG CGA CCG 246 Pro Pro Leu Pro Trp Ala Ser Pro Thr Pro Ser Arg Pro 55 60

I 85

GTG GGC GTG CTG CTG TGG TGG GAG CCC TTC GGG GGG CGC 285 Vai Gly Vai Leu Leu Trp Trp Glu Pro Phe Gly Gly Arg 65 70 75 GAT AGC GCC CCG AGG CCG CCC CCT GAC TGC CGG CTG CGC 324 Asp Ser Ala Pro Arg Pro Pro Pro Asp Cys Arg Leu Arg 80 85 TTC AAC ATC AGC GGC TGC CGC CTG CTC ACC GAC CGC GCG 363 Phe Asn Ile Ser Gly Cys Arg Leu Leu Thr Asp Arg Ala 90 95 100 TCC TAC GGA GAG GCT CAG GCC GTG CTT TTC CAC CAC CGC 402 Ser Tyr Gly Glu Ala Gin Ala Vai Leu Phe His His Arg 105 110 115 GAC CTC GTG AAG GGG ccc CCC GAC TGG CCC CCG CCC TGG 441 Asp Leu Vai Lys Gly Pro Pro Asp Trp Pro Pro Pro Trp 120 125 GGC ATC CAG GCG CAC ACT GCC GAG GAG GTG GAT CTG CGC 480 Gly Ile Gin Ala His Thr Ala Glu Glu Vai Asp Leu Arg 130 135 140 GTG TTG GAC TAC GAG GAG GCA GCG GCG GCG GCA GAA GCC 519 Vai Leu Asp Tyr Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala 145 • · 150 CTG GCG ACC TCC AGC CCC AGG CCC CCG GGC CAG CGC TGG 558 Leu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Pro Gly Gin Arg Trp 155 160 165 GTT TGG ATG AAC TTC GAG TCG CCC TCG CAC TCC CCG GGG 597 Vai Trp Met Asn Phe Glu Ser Pro Ser His Ser Pro Gly 170 175 180

CTG CGA AGC CTG GCA AGT AAC CTC TTC AAC TGG ACG CTC 636 Leu Arg Ser Leu Ala Ser Asn Leu Phe Asn Trp Thr Leu 185 190 TCC TAC CGG GCG GAC TCG GAC GTC TTT GTG CCT TAT GGC 675 Ser Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Vai Phe Vai Pro Tyr Gly 195 200 205 TAC CTC TAC CCC AGA AGC CAC CCC GGC GAC CCG CCC TC A 714 Tyr Leu Tyr Pro Arg Ser His Pro Gly Asp Pro Pro Ser 210 215 GGC CTG GCC CCG CCA CTG TCC AGG AAA CAG GGG CTG GTG 753 Gly Leu Ala Pro Pro Leu Ser Arg Lys Gin Gly Leu Vai 220 225 230 GCA TGG GTG GTG AGC CAC TGG GAC GAG CGC CAG GCC CGG 792 Ala Trp Vai Va.l Ser His Trp Asp Glu Arg Gin Ala Arg 235 240 245 GTC CGC TAC TAC CAC CAA CTG AGC CAA CAT GTG ACC GTG 831 Vai Arg Tyr Tyr His Gin Leu Ser Gin His Vai Thr Vai 250 255 GAC GTG TTC GGC CGG GGC GGG CCG GGG CAG CCG GTG CCC 87 0 Asp Vai Phe Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gin Pro Vai Pro 260 265 270 GAA ATT GGG CTC CTG CAC ACA GTG GCC CGC TAC AAG TTC 909 Glu Ile Gly Leu Leu His Thr Vai Ala Arg Tyr Lys Phe 275 280 TAC CTG GCT TTC GAG AAC TCG CAG CAC CTG GAT TAT ATC 948 Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Gin His Leu Asp Tyr Ile 285 290 295 87

ACC GAG AAG. CTC TGG CGC AAC GCG TTG CTC GCT GGG GCG 987 Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Leu Ala Gly Ala 300 305 310 GTG CCG GTG GTG CTG GGC CCA GAC CGT GCC AAC TAC GAG 1026 Vai Pro Vai Vai Leu Gly Pro Asp Arg Ala Asn Tyr Glu 315 320 CGC TTT GTG CCC CGC GGC GCC TTC ATC CAC GTG GAC GAC 1065 Arg Phe Vai Pro Arg Gly Ala Phe Ile His Vai Asp Asp 325 330 335 TTC CCA AGT GCC TCC TCC CTG GCC TCG TAC CTG CTT TTC 1104 Phe Pro Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Tyr Leu Leu Phe 340 345 CTC GAC CGC AAC CCC GCG GTC TAT CGC CGC TAC TTC CAC 1143 Leu Asp Arg Asn Pro Ala Vai Tyr Arg Arg iyr Phe His 350 355 360 TGG CGC CGG AGC TAC GCT GTC CAC ATC ACC TCC TTC TGG 1182 Trp Arg Arg Ser Tyr Ala Vai His Ile Thr Ser Phe Trp 365 370 375 GAC GAG CCT TGG TGC CGG GTG TGC CAG GCT GTA CAG AGG 1221 Asp Glu Pro Trp Cys Arg Vai Cys Gin Ala Vai Gin Arg 380 385 GCT GGG GAC CGG CCC AAG AGC ATA CGG AAC TTG GCC AGC 1260 Ala Gly ASp Arg Pro Lys Ser Ile Arg Asn Leu Ala Ser 390 395 400 TGG TTC GAG CGG TGAAGCCGCG CTCCCCTGGA AGCGACCCAG Trp Phe Glu Arg 405 1302 88

GGGAGGCCAA GTTGTCAGCT TTT7GATCCT CTÀCTGTGCA TCTCCTTC-AC 1352

TGCCGuAiCA TGGGAGTAAG TTCTTCAAA

AC ACCCATTTTT GCTCTATG 1400

Lisboa, 29 de Maio de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3* 1200 LISBOA

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES ia. - Processo para a produção de uma glicosiltransfe-rase de mamífero ligada a membranas seleccionada do grupo constituído por uma galactosiltransferase, uma sialiltransferase e uma fucosiltransferase, ou uma sua variante, respectivamente, carácter izado por compreender a cultura de uma estirpe de levedura que foi transformada com um vector híbrido compreendendo uma cassete de expressão contendo um promotor e uma sequência de DNA codificadora da referida glicosiltransferase ou sua variante, DNA esse que é controlado pelo referido promotor, e recuperação da activi-dade enzimática. 2a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carácter izado por a glicosiltransferase ser de origem humana.
2. 32. - Processo para a produção de uma variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a variante diferir da correspondente glicosiltransferase de tamanho completo pela ausência da cauda citoplasmática, o sinal de ancoragem e, facultativamente, uma parte pequena da região do pé.
3. 42. - Processo para a produção de uma variante de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender a cultura de uma estirpe de levedura compreendendo uma cassete de expressão contendo um promotor operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura. correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora da referida variante, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor e recuperação da actividade enzimática.
4. 53. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado por a glicosiltransferase ser uma galactosiltransferase.
5. 63. - Processo de acordo com a reivindicação 5, carac-terizado por a galactosiltransferase ser seleccionada do grupo constituido por UDP-Galactose: β-galactósido α(1-3)-galactosiltransferase (EC 2.4.1.151) e UDP-Galactose: β-Ν-acetilglucosamina β(1-4)-galactiltransferase (EC 2.4.122).
6. 73. - Processo de acordo com a reivindicação 5, carac-terizado por a galactosiltransferase ter a sequência de aminoáci-dos descrita em SEQ ID NO. 1.
7. 83. - Processo de acordo com a revindicação 5, caracte-rizado por a galactosiltransferase ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 2.
8. 93. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado por a glicosiltransferase ser uma sialiltransferase. 10â. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a sialiltransferase ser CMP-NeuAc β-galactósido a(2-6)-sialiltransferase (EC 2.4.99.1). lis. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a sialiltransferase tem o aminoácido descrito em SEQ ID NO.3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a sialiltransferase ser designada 3

   ST(Lis27*-Cis406) e consistir nos aminoácidos 27 a 406 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ. ID. NO. 3. 13a. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a sialiltransferase ter o aminoãcido descrito em SEQ ID NO.4. 14 a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a glicosiltransferase ser uma fucosiltransfera-se.
9. 153. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a fucosiltransferase ser seleccionada do grupo constituído por GDP-Fucose:fi-galactõsido a(1-2)-fucosiltransferase (EC 2.4.1.69) e GDP-Fucose:N-acetilglucosamina α(1-3/4)-fucosiltransferase (EC 2.4.1.65).
10. 163. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a fucosiltransferase ter a sequência de aminoácidos descrita na sequência apresentada em SEQ ID NO.5.
11. 173. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a fucosiltransferase ser designada FT(Argg2--Arg4Q5) e consistir nos aminoácidos 62 a 405 da sequência de aminoácidos descrita na lista de sequências em SEQ ID. NO.5.
12. 183. - Vector híbrido de levedura, caracterizado por compreender uma cassete de expressão compreendendo um promotor de levedura e uma sequência de DNA codificadora de de uma glicosiltransferase de mamífero ligada a membranas seleccionada do grupo constituído por uma galactosiltransferase, uma sialiltransferase 4 e uma fucosiltransferase ou uma sua variante, respectivamente, sequência de DNA essa que é controlada pelo referido promotor. Lisboa, 29 de Maio de 1992

    J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.· 1200 USBQA