HU212927B - Recombinant process for the production of glycosil-transpherases and method for producing hybrid vectors and transformed yeast strains suitable for it - Google Patents

Description

A találmány a rekombináns DNS-technológia területére vonatkozik és egy új módszert nyújt a glikoziltranszferázok előállítására transzformált élesztőtörzsek alkalmazásával.

A glikozil-transzferázok cukor maradékokat visznek át egy aktivált donor szubsztrátról, általában egy nukleotid-cukorról, egy specifikus akceptor cukorra, glikozid kötést létesítve. A transzferált cukor alapján ezeket az enzimeket családokra osztjuk, például galaktozil-transzferázokra, szialil-transzferázokra és fukozil-transzferázokra. A glikozil-transzferázok, amelyek a membrán-proteinek közé tartoznak, elsődlegesen a Golgi-apparátusban helyezkednek el, és egy közös dómén szerkezetet alakítanak ki, amely egy rövid aminoterminális citoplazmatikus részből, egy szignál-anchor doménból és egy kiterjedt törzs-régióból áll, amelyet egy nagy karboxi-terminális katalitikus dómén követ. A szignál-anchor dómén nem-hasítható szignálpeptidként és membrán-áthidaló régióként működik, és a glikozil-transzferáz katalitikus doménjét a Golgi-apparátus üregébe irányítja. Az üregben elhelyezkedő törzsvagy spacer-régió feladata, hogy olyan flexibilis tartóként szolgáljon, amely lehetővé teszi, hogy a katalikus dómén glikozilálja azoknak a membrán-kötött és szolubilis proteineknek a szénhidrát csoportjait, amelyek a kiválasztódásuk folyamatán a Golgi-apparátuson keresztülhaladnak. Felismerték továbbá, hogy a törzsrégió olyan visszatartó szignálként működik, amely az enzimet a Golgi-membránhoz kötve tartja (PCT közzétételi szám: 91/06635). A glikozil-transzferáz szolubilis formái a tejben, szérumban és egyéb testfolyadékokban találhatók meg. A szolubilis glikozil-transzferázok feltehetően az enzimek megfelelő membrán-kötött formáinak endogén proteázos emésztésével jönnek létre, amelyek valószínűleg a katalitikus dómén és a transzmembrán dómén között hasítanak.

A szénhidrát-struktúrák enzimatikus szintézise a nagyfokú sztereoszelektivitás és régiószelektivitás miatt igen előnyös, és így a glikozil-transzferázok értékes eszközként szolgálnak a glikoproteinek, glikolipidek és az oligoszacharidok szintézisénél és módosításánál. Szemben a kémiai módszerekkel így fölöslegessé válik a védőcsoportok időigényes beépítése. Mivel a glikozil-transzferázok a természetben nagyon kis mennyiségben fordulnak elő, természetes forrásból történő izolálásuk és ezt követő tisztításuk nehéz. Ezért dolgozták ki a rekombináns DNS-technológiával történő előállításukat. Például a galaktozil-transzferázokat E. coliban (PCT 90/07000) és kínai hörcsög petefészeksejtekben (CHO) [Smith, D. F. és tsai (1990) J. Bioi. Chem. 265, 6225-34) fejezték ki. A szilail-transzferázokat CHO sejtekben [Lee, E. U. (1990) Diss. Abstr. Int. B. 50, 3453-4) és COS-1 sejtekben [Paulsen, J. C. és tsai (1988) J. Cell. Bioi. 107, 10A) fejezték ki, és a fukozil-transzferázokat COS-1 sejtekben [Goelz, S. E. és tsai (1990) Cell 63, 1349-1356; Larsen R. D. és tsai (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6674-6678] és CHO sejtekben [Potvin, B. (1990) J. Bioi. Chem. 265, 1615-1622] állították elő. Figyelembe véve azokat a tényeket, hogy a prokariótákban történő expresszió glikozilálatlan terméket nyújt, és ez igen hátrányos, hiszen a glikozil-transzferázok glikoproteinek, valamint, hogy a glikozil-transzferáz előállítása emlős sejtekben nagyon drága, mivel az előállítást megnehezíti a kívánt terméket szennyező endogén glikozil-transzferázok jelenléte, szükség van egy javított eljárásra, mely lehetővé teszi a glikozil-transzferázok gazdaságos és nagyléptékű előállítását.

A jelen találmány egyik tárgya, hogy ilyen módszereket nyújtson.

A jelen találmány eljárást nyújt biológiailag aktív glikozil-transzferázok előállítására rekombináns DNStechnológiával, élesztő-vektor expressziós rendszer alkalmazásával.

Még pontosabban a jelen találmány eljárást nyújt egy galaktozil-transzferázból, egy szialil-transzferázból és egy fukozil-transzferázból álló csoportból kiválasztott membrán-kötött emlős glikozil-transzferáz vagy variánsa előállítására, ahol az eljárás egy olyan expressziós kazettát tartalmazó hibridvektorral transzformált élesztőtörzs tenyésztését foglalja magában, ahol az expressziós kazetta egy promotert és egy a promoter ellenőrzése alatt álló az említett glikoziltranszferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, azzal a kikötéssel, hogy a termék visszanyeri enzimatikus aktivitását.

Első megközelítésben a találmány olyan, egy galaktozil-transzferázból, egy szialil-transzférázból és egy fukozil-transzferázból álló csoportból kiválasztott membrán-kötött emlős glikozil-transzferáz vagy variánsa előállítására vonatkozik, ahol az említett eljárás egy expressziós kazettát tartalmazó hibridvektorral transzformált élesztőtörzs tenyésztését foglalja magában, ahol az expressziós kazetta egy promotert. egy a promoter ellenőrzése alatt álló az említett glikoziltranszferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát és egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat tartalmazó DNS szekvenciát tartalmaz, azzal a kikötéssel, hogy a termék visszanyeri enzimatikus aktivitását.

Második megközelítésében a találmány olyan, egy galaktozil-transzferázból, egy szilalil-transzferázból és egy fukozil-transzferázból álló csoportból kiválasztott membrán-kötött emlős glikozil-transzferáz egy variánsa előállítására vonatkozik, ahol az említett eljárás egy expressziós kazettát tartalmazó hibridvektorral transzformált élesztőtörzs tenyésztését foglalja magában, ahol az expressziós kazetta tartalmaz egy promotert, működőképesen kapcsolva egy szignál peptidet kódoló első DNS-szekvenciához, amely megfelelő leolvasási keretben kapcsolódik az említett glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló második DNS szekvenciához, valamint tartalmaz egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat hordozó DNS szekvenciát, azzal a kikötéssel, hogy a termék visszanyeri enzimatikus aktivitását.

A „glikozil-transzferáz” kifejezés, fentebb illetve az alábbiakban alkalmazva, felöleli a galaktozil-transzferázok, a szialil-transzferázok és a fukozil-transzferázok családját. Az említett glikozil-transzferázok természetben előforduló, emlős eredetű, pl. szarvasmarha,

HU 212 927 Β rágcsáló, patkány és humán enzimek. Ezeket az előnyösen természetes, humán, teljes hosszúságú glikoziltranszferázokat az EC-számuk alapján azonosítjuk.

A találmány szerinti eljárással nyerhető membránkötött galaktozil-transzferázok és variánsaik egy galaktozil-maradék átvitelét katalizálják egy aktivált donorról, általában egy nukleotid-aktivált donorról, úgymint az uridin-difoszfát-galaktózról (UDP-Gal) egy szénhidrát csoportra.

Membrán-kötött galaktozil-transzferázra példa az UDP-galaktóz: β-galaktozid a( 1-3-galaktozil-transzferáz (EC 2.4.1.151) amely akceptor szubsztrátként a galaktózt felhasználva egy a(l-3) kötést hoz létre; és az UDP-galaktóz: β-Ν-acetil-glukózamin β( 1-3) kötést hoz létre; és az UDP-galaktóz: β-Ν-acetil-glukózamin B(l-4)-gaIaktozil-transzferáz (EC 2.4.1.22), ami galaktózt visz át az N-acetil-glukózaminra β(1—4) kötést létesítve; illetőleg ezek variánsai, α-laktalbumin jelenlétében az említett β(1—4)-galaktozii-transzferáz glukózt is használhat akceptor szubsztrátként, így a laktóz szintézisét katalizálva.

A legelőnyösebb membrán-kötött galaktozil-transzferáz a szekvencialistában a SEQ ID NO. 1-gyel jelölt aminosav-szekvenciával rendelkezik.

A találmány szerint előállítható membrán-kötött szialil-transzferázok és variánsaik katalizálják a sziálsavak [például az N-acetil-neuraminsav (NeuAc)] átvitelét egy aktivált donorról, általában egy citidin-monofoszfát sziálsavról (CMP-SA) egy szénhidrát akceptor maradékra. A találmány szerint előállítható membránkötött szilalil-transzferázra példa a CMP-NeuAc^-galaktozid a(2-6)-sziIalil-transzferáz (EC 2.4.99.1), amely a NeuAc-a-(2-6)Gal-B(l—4)GlcNAc szekvenciát alakítja ki sok N-kapcsolt szénhidrát csoporttal.

A legelőnyösebb szialil-transzferáz a szekvencialistában a SEQ ID NO. 3-mal jelölt aminosav-szekvenciával rendelkezik.

A találmány szerint előállítható membrán-kötött fukozil-transzferázok és variánsaik katalizálják a fukóz maradék átvitelét egy aktivált donorról, általában egy nukleotid-aktivált donorról, úgymint a guanozin-difoszfát-fukózról (GDP-Fuc) egy szénhidrát csoportra. Ilyen fukozil-transzferáz például a GDP-fukóz^-galaktozid a(l-2)-fukozil-transzferáz (EC 2.4.1.69) és a GDP-fukóz:N-acetil-glukózamin a( l-3/4)-fukoziltranszferáz (EC 2.4.1.65).

Legelőnyösebb membrán-kötött fukozil-transzferáz a szekvencialistában SEQ ID NO. 5-tel jelölt aminosav-szekvenciával rendelkezik.

Az itt használt variánsok kifejezés felöleli az emlős eredetű, természetesen membrán-kötött glikozil-transzferázok mind membrán-kötött, mind szolubilis variánsait, azzal a feltétellel, hogy ezek a variánsok enzimatikusan aktívak. A variánsok előnyösen humán eredetűek. Például a „variánsok” kifejezés felöleli az egyes fajokban megtalálható membrán-kötött glikozil-transzferázok természetben előforduló membrán-kötött variánsait, például egy olyan galaktozil-transzferáz-variánst, amely abban különbözik a SEQ ID NO. 1 aminosav-szekvenciával rendelkező enzimtől, hogy hiányzik a szerint all. pozícióból, illetve valin és tirozin aminosavak vannak az alanin és leucin helyett a 31. és 32. pozícióban. Egy ilyen variánst kódolhat egy ugyanabba a géncsaládba tartozó rokon gén, vagy egy bizonyos gén allélváltozata. A „variánsok” kifejezés felöleli azokat a glikozil-transzferázokat is, amelyeket olyan DNS-sel állítunk elő, melyet in vitro mutagenezisnek vetettünk alá, vigyázva arra, hogy az említett DNS által kódolt protein megőrizze a natív glikozil-transzferáz enzimatikus aktivitását. Ilyen módosítás lehet az aminosavak addíciója, cseréje és/vagy deléciója, az utóbbi rövidített variánst fog eredményezni.

A találmány szerint eljárással előállított előnyös variánsok a rövidített változatok, különösen a szolubilis variánsok, tehát azok a formák, amelyek nem membrán-kötöttek. A rövidített variánsok magukban foglalják például a membrán-kötött glikozil-transzferázok szolubilis formáit és ezek membrán-kötött variánsait, például a fentebb említett variánsokat, melyek transzformált élesztőtörzsek által szekretálhatók a találmány szerinti eljárásban. A jelen találmány szerint ezek a szolubilis enzimek előnyösen csonkolt variánsok. A találmány olyan, egy galaktozil-transzferázból, egy szialil-transzferázból és egy fukozil-transzferázból álló csoportból kiválasztott membrán-kötött emlős glikozil-transzferáz szolubilis variánsának előállítására is vonatkozik, ahol az említett eljárás egy expressziós kazettát tartalmazó hibridvektorral transzformált élesztőtörzs tenyésztését és az említett variáns izolálását foglalja magában, ahol az expreszsziós kazetta tartalmaz egy promotert, működőképesen kapcsolva egy szignál peptidet kódoló első DNSszekvenciához, amely megfelelő leolvasási keretben kapcsolódik az említett variánst kódoló második DNS szekvenciához, és tartalmaz egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat hordozó DNS szekvenciát.

A definíció szerint a glikozil-transzferáz szolubilis formája egy olyan rövidített variáns, mely abban különbözik a neki megfelelő, természetben az endoplazmatikus retikulumban vagy a Golgi-komplexben elhelyezkedő teljes hosszúságú membrán-kötött formától, hogy hiányzik belőle a citoplazmatikus rész, a szignálanchor rész és a kívánt esetben a törzs-régió egy része. Az itt alkalmazott „törzs-régió egy része” kifejezés úgy definiálható, mint a törzs-régió N-terminális felének egy olyan kis része, amely 12 aminosav hosszúságú lehet. Más szavakkal, a jelen találmány szerinti eljárással előállított szolubilis variánsok lényegében tartalmazzák a teljes törzs-régiót és a katalitikus domént. A szolubilis variánsok olyan enzimatikusan aktív enzimek, melyek a megfelelő teljes hosszúságú formától abban különböznek, hogy hiányzik belőlük egy 26-67, különösen egy 26-61 aminosav-maradékból álló NH₂terminális peptid, azzal a kikötéssel, hogy azoknál a formáknál, ahol a törzs-régió egy része hiányzik, csak a fentebb meghatározott kis rész hiányozhat. Előnyösen a szolubilis variánsok azokból a membrán-kötött glikozil-transzferázokból nyerhetők, amelyeket fentebb az EC-számukkal azonosítottunk, továbbá szolu3

HU 212 927 Β bilis variánsok állíthatók elő a SEQ ID NO. 5-tel jellemezhető membrán-kötött fukozil-transzferázból.

A galaktozil-transzferázok előnyös szolubilis variánsai a megfelelő teljes hosszúságú formától abban különböznek, hogy hiányzik belőlük egy 37-55, különösen egy 41-44 aminosavból álló NH₂-terminális peptid. A jelen találmány szerinti eljárással előállított legelőnyösebb szolubilis variáns az az enzim, amely aminosav-szekvenciáját a szekvencialistában SEQ ID NO. 2-vel jelöltünk.

A szialil-transzferázok előnyös szolubilis variánsaiból, összehasonlítva a teljes hosszúságú formával, hiányzik egy 26-38 aminosavból álló NH₂-terminális peptid. A találmány szerinti eljárással előállított legelőnyösebb szolubilis variáns a szekvencialistán SEQ ID NO. 4-gyel ábrázoltuk. Hasonlóképpen előnyös az ST/Lys^-Cys^j-nak nevezett szolubilis variáns, mely a szekvencialistában a SEQ ID NO. 327—406. aminosavait tartalmazza.

A fukozil-transzferázok előnyös szolubilis variánsai megfelelő teljes hosszúságú enzimektől abban különböznek, hogy hiányzik belőlük egy 56-67, különösen egy 56-61 aminosavból álló NH₂-terminális peptid. Különösen előnyös az FTÍArg^-Arg^j-tel jelölt szolubilis variáns, mely a SEQ ID NO. 5 aminosavszekvencia 62-405. aminosavait tartalmazza.

Az élesztő gazdatörzseket és a hibridvektorok alkotórészeit az alábbiakban részletezzük. A transzformált élesztőtörzsek tenyésztése a szakirodalomból ismert módszerek szerint történik.

így a találmány szerint a transzformált élesztőtörzseket olyan folyékony tápközegben tenyésztjük, amely asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmaz.

Különböző szénforrások használhatók. Például előnyös szénforrások az asszimilálható szénhidrátok, úgy mint glukóz, maltóz, fruktóz vagy laktóz, vagy egy acetát, úgy mint a nátrium-acetát, amely önmagában vagy egy megfelelő keverékben is alkalmazható. A megfelelő nitrogénforrások magukban foglalják például az aminosavakat, úgymint kazaminosavakat, peptideket és proteineket és ezek degradáciős termékeit, úgymint tripton-, pepton- vagy húskivonatokat, továbbá élesztőkivonatokat, maláta-extraktumot, gabona-kivonatokat, valamint ammónium-sókat, úgy mint az ammónium-kloridot, -szulfátot vagy -nitrátot, melyek önmagukban vagy megfelelő keverékben is alkalmazhatók. A felhasználható szervetlen sók lehetnek szulfátok, kloridok, foszfátok valamint nátrium-, kálium-, magnézium- és kalcium-karbonát. Továbbá a tápközeg tartalmazhat növekedést elősegítő anyagokat is. Ilyen növekedést elősegítő anyagok közé érthetők például a nyomelemek, úgymint vas, cink, mangán és hasonlóak, vagy egyes aminosavak. Az endogén két-mikronos DNS és a saját replikonnal rendelkező hibridvektorok közötti inkompatibilitásnak tulajdonítható, hogy az ilyen hibridvektorral transzformált élesztőtörzsek hajlamosak a hibridvektor elvesztésére. Ezeket az élesztősejteket szelektív körülmények között kell növeszteni, olyan körülmények között, ahol a növekedéshez szükséges egy a plazmidban kódolt gén kifejeződése. A jelenleg használatos és a találmány szerinti hibridvektorokban (lásd lejjebb) jelenlevő szelektív markerek nagy része olyan gén, amely aminosav- vagy purinbioszintézis enzimet kódol. Ez olyan szintetikus táptalaj használatát teszi szükségessé, amelyből hiányzik a megfelelő aminosav vagy purin bázis. Mindemellett alkalmazható egy adott biociddal szembeni rezisztenciát biztosító gén is (pl. a G418 aminoglikoziddal szembeni rezisztenciát biztosító gén). Az antibiotikum rezisztencia-gént tartalmazó vektorokkal transzformált élesztősejteket olyan komplex tápközegben növesztjük, amely tartalmazza a megfelelő antibiotikumot, és így gyorsabb növekedési ráta és magasabb sejtsűrűség érhető el.

A teljes két-mikronos DNS-t (amely egy funkcionáló replikációs origót hordoz) tartalmazó hibridvektorok stabilan fenntarthatok olyan Saccharomyces cerevisiae törzsekben, amelyek mentesek az endogén két-mikronos plazmidoktól (úgynevezett cir° törzsek), így a tenyésztést nem szelektív növekedési körülmények között, azaz egy komplex médiumban is el lehet végezni.

A konstitutív promotert hordozó hibridplazmidokat tartalmazó élesztősejtek a glikozil-transzferázt kódoló DNS-t az említett promoter szabályozása alatt, indukció nélkül fejezik ki. Azonban, ha az említett DNS egy szabályozott promoter ellenőrzése alatt áll, a tenyésztőközeg összetételét úgy kell átalakítani, hogy az mRNS transzkripciót maximális szinten tartsuk, például mikor PHO5 promotert használunk, a tenyésztőközegnek szervetlen foszfátot kell tartalmaznia alacsony koncentrációban, a promoter depresszálására.

A tenyésztést hagyományos technikákat alkalmazva végezzük. A tenyésztés körülményeit, úgymint a hőmérsékletet, a közeg pH-ját és a fermentációs időt oly módon választjuk meg, hogy a heterológ protein maximális szinten termelődjék. Egy kiválasztott élesztőtörzset előnyösen aerob körülmények között, rázott vagy kevert süllyesztett kultúrában tenyésztjük, 2535 ’C-nál, előnyösen 28 ’C körül, pH 4-7-nél, például pH 5 körül, és legalább 1-3 napig, előnyösen annyi ideig, amíg a protein-hozam megfelelő.

A glikozil-transzferázt vagy variánsát, amely az élesztőben történt kifejeződés után a sejtek belsejében felhalmozódik, vagy a tenyészközegben szekretálódik, a hagyományos eszközökkel izoláljuk. Például első lépésként általában a sejteket centrifugálással elkülönítjük a folyékony kultúrából. Abban az esetben, ha a glikozil-transzferáz vagy variánsa a sejt belsejében halmozódik fel, a proteint a sejtek belsejéből sejtek roncsolásával fel kell szabadítani. Az élesztősejteket különböző, a szakirodalomban jól ismert módon lehet szétroncsolni: például mechanikai erővel, úgymint üveggyöngyökkel való rázatással, ultrahangos kezeléssel, ozmotikus sokkal és/vagy a sejtfal enzimatikus roncsolásával. Ha az izolált glikozil-transzferáz vagy variánsa a membrán-frakcióhoz asszociálódott vagy kötődött, további dúsítást végezhetünk például a sejtkivonat differenciál-centrifugálásával, és kívánt esetben a megfelelő frakciók további, detergenssel, úgymint

HU 212 927 Β

Tritonnal történő kezelésével. A nyers glikozil-transzferáz vagy variánsa tisztítására szolgáló módszerek magukban foglalják a standard kromatográfiás eljárásokat, azaz az affinitás kromatográfiát, például egy megfelelő szubsztráttal, antitesttel vagy Concanavalin A-val, az ioncserés kromatográfiát, gélszűrést, elválasztásos kromatográfiát, HPLC-t, elektroforézist, precipitációs lépéseket, úgymint az ammónium-szulfátos precipitációt és más eljárásokat, különösen azokat amelyek a szakirodalomból jól ismertek.

Ha a glikozil-transzferázt vagy variánsát az élesztősejt a periplazmatikus térbe szekretálja, egyszerűbb izolálást eljárás alkalmazható: a protein a sejt lízise nélkül kinyerhető a sejtfal enzimatikus vagy kémiai ágensekkel, pl. tiol-reagensekkel vagy EDTA-val történő eltávolításával, amely a sejtfalban olyan károsodást okoz, hogy a glikozil-transzferáz felszabadul. Abban az esetben, ha a glikozil-transzferáz vagy variánsa a tápközegbe szekretálódik, onnan közvetlenül kinyerhető, és a fent meghatározott eljárásokkal tisztítható.

A glikozil-transzferáz aktivitásának detektálására az irodalomból ismert mérőmódszerek alkalmazhatók. Például a galaktozil-transzferáz egy alkalmas akceptormolekulába, úgymint egy glikoproteinbe vagy egy szabad cukormaradékba beépült radioaktívan jelzett galaktóz mennyiségének meghatározásával mérhető. Hasonlóképpen a szialil-transzferáz aktivitása pl. a sziálsav egy alkalmas szubsztrátba történő beépülésével, és a fukozil-transzferáz a fukóz egy alkalmas akceptorra való átvitelével mérhető.

A találmány szerinti transzformált élesztősejtek az alábbi lépéseket tartalmazó rekombináns DNS-technikával állíthatók elő:

- egy élesztő promotert és e promoter ellenőrzése alatt álló membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó hibridvektor előállítása

- egy élesztőtörzsnek az említett hibridvektorral történő transzformálása

- és a transzformált sejtek kiválasztása a nemtranszformált sejtek közül.

Expressziós vektorok

A találmány szerinti élesztő hibridvektor egy olyan expressziós kazettát tartalmaz, amely egy élesztő promoterből és egy a promoter ellenőrzése alatt álló az említett glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciából áll.

Első megközelítésben a találmány szerinti élesztő hibridvektor egy olyan expressziós kazettát tartalmaz, amely egy élesztő promotert, egy a promoter ellenőrzése alatt álló, az említett glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát és egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat magában foglaló DNS-szekvenciát tartalmaz.

Második megközelítésben a találmány szerinti élesztő hibridvektor egy olyan expressziós kazettát foglal magában, amely tartalmaz egy promotert működőképesen kapcsolva egy szignál pepiidet kódoló első DNS-szekvenciához, amely megfelelő leolvasási keretben kapcsolódik a promoter ellenőrzése alatt álló, az említett glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló második DNS-szekvenciához, valamint tartalmaz egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat magábanfoglaló DNS-szekvenciát.

Az élesztő promoter egy szabályozott vagy egy konstitutív promoter lehet, amely előnyösen egy magas szinten kifejeződő génből származik, különösen egy Saccharomyces cerevisiae génből. Tehát alkalmazható a TRP1 gén, az ADHI vagy ADHII gén, a savas foszfatáz gén (PH05) promotere, az a vagy α faktort kódoló élesztő párosodási feromonjának promotere, vagy egy glikolitikus enzimet kódoló génből származó promoter, úgymint az enoláz, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAP), 3-foszfoglicerát-kináz (PGK), hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvát-kináz, trióz-foszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz vagy glükokináz gén promotere. Továbbá alkalmazhatók olyan hibrid promóterek, melyek egy élesztő gén úgynevezett upstream aktivációs szekvenciáit és egy másik élesztő gén downstream promoter-elemeit (amely magában foglal egy működőképes TATA-boxot) tartalmazzák. Például ilyen az élesztő PHO5 gén UAS-eit és az élesztő GAP gén működőképes TATAboxát tartalmazó downstream promoter-elemeket magában foglaló hibrid promoter (PH05-GAP hibrid promoter). Előnyös promoter a GAP gén promotere, különösen azok a funkcionális fragmensei, amelyek a GAP gén -550. és -180. pozíciói között, különösen az-540., -263. vagy a -198. nukleotidjánál kezdődnek, és a -5. nukleotidjánál végződnek. Másik előnyös promoter a reguláit típusú PHO5 promoter. Egy konstitutív promoterként előnyös az upstream szabályozó elemektől mentes PHO5 promoter, úgy mint a PHO5(-173) promoter-elem, amely a PHO5 gén -173. nukleotidjánál kezdődik, és a—9. nukleotidjánál fejeződik be.

A szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia (szignálszekvencia) előnyösen egy olyan polipeptidet kódoló élesztőgénből származik, amely a polipeptidet szekretálja. Más, szekretálódő heterológ proteinek szignálszekvenciái is választhatók. Élesztő szignál-szekvenciára példa az élesztő invertáz, az α-faktor, a feromonpeptidáz (KEX1), a „killer toxin” és a represszálható savas foszfatáz (PHO5) gének szignál- és prepro-szekvenciái valamint az Aspergillus awamori glukoamiláz szignál-szekvenciája. Választhatjuk a fuzionált szignál-szekvenciák konstruálásának lehetőségét is, amikor az alkalmazott promoterhez (például a PHO5-höz) természetesen kapcsolódó gén szignál-szekvenciájának egy részét (ha van) kapcsoljuk egy heterológ protein szignál-szekvenciájának egy részéhez. Azok a konstrukciók az előnyösek, ahol lehetséges a szignál-szekvencia és a glikozil-transzferáz aminosav-szekvenciája közötti pontos hasítás. A konstrukciók tartalmazhatnak olyan járulékos szekvenciákat, melyek speciális feldolgozó (processzáló) szignálokat hordozhatnak, hogy elősegítsék a prekurzor-molekula pontos feldolgozását. Illetve létrehozhatók olyan fuzionált proteinek, amelyek olyan belső szignálokat tartalmaznak, amelyek

HU 212 927 Β lehetővé teszik a protein helyes érzését in vivő vagy in vitro. Például, ha Lys-Arg-t tartalmazó feldolgozó szignálokat hozunk létre, ezeket a Golgi-membránokban elhelyezkedő élesztő endopeptidázok fel fogják ismerni. A jelen találmány szerinti előnyös szignál-szekvencia az élesztő invertáz génjének szignál-szekvenciája.

Ha a teljes hosszúságú glikozil-transzferázt vagy membrán-kötött variánsát élesztőben fejezzük ki, az élesztő hibridvektor előnyös egy olyan expressziós kazettát tartalmaz, amely egy élesztő promotert, egy a promoter ellenőrzése alatt álló, az említett glikoziltranszferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát és egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat magában foglaló DNS-szekvenciát tartalmaz. Ha a DNS membrán-kötött enzimet kódol, nincs szükség szignálszekvenciára.

Abban az esetben, ha egy membrán-kötött glikoziltranszferáz szolubilis variánsát fejezzük ki élesztőben, az előnyös hibridvektor egy olyan expressziós kazettát foglal magában, amely tartalmaz egy promotert működőképesen kapcsolva egy szignál peptidet kódoló első DNS-szekvenciához, amely megfelelő leolvasási keretben kapcsolódik a promoter ellenőrzése alatt álló, az említett variánst kódoló második DNS-szekvenciához, valamint tartalmaz egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat magában foglaló DNS-szekvenciát.

A membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS, mely a szakirodalomból ismert eljárásokkal állítható elő, olyan genomiális DNS-ből áll, mely például emlős genomiális DNS-könyvtárból, pl. patkány, rágcsáló, szarvasmarha vagy humán sejtek DNS-könyvtáraiból izolálható. Ha szükséges, az enzimet kódoló genomiális DNS-ben előforduló intronokat kivágjuk. Továbbá, a membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS olyan cDNS-ből is állhat, melyet emlős cDNS-könyvtárból izolálunk, vagy a megfelelő mRNS-ből állítjuk elő. A cDNSkönyvtár különböző szövetek sejtjeiből származhat, például placenta-, vagy májsejtekből. Az mRNS-en át történő cDNS előállítás hagyományos módszerekkel, úgymint a polimeráz láncreakcióval (PCR) valósítható meg.

Például a poli(A)⁺RNS emlős sejtekből, pl. HeLa sejtekből, történő izolálását és az ezt követő egyszálú cDNS szintézisét a szakirodalomban ismert standard eljárásokat követve hajtjuk végre. A PCR, az eljárást a DNS-templát szintetizálásával kezdve, alkalmas a célszekvencia, úgymint a glikozil-transzferáz DNS-e vagy ennek fragmense amplifikálására, mialatt a túlnyomó többségben levő nem-célszekvenciák megsokszorozódása a minimumra csökken. E célból ismerni kell a célszekvencía mindkét végén elhelyezkedő nukleotidok kis területének szekvenciáját. Ezeket az oldalsó szekvenciákat alkalmazzuk két olyan szintetikus egyszálú primer-oligonukleotid tervezésére, amelyek szekvenciáját úgy választjuk meg, hogy komplementerek legyenek a megfelelő oldalsó szekvenciákkal. A PCR az mRNS-DNS hibridszál denaturálásával kezdődik, ezt követi a primerek illesztése (anneálás) a célszekvencia oldalsó szekvenciáihoz. A DNS polimeráz és a dezoxinukleotid-trifoszfátok hozzáadása a kétszálú DNS két példányának kialakulásához vezet, amely a primertől kezdve, a célszekvencián végighaladva, annak lemásolásával jön létre. Az újonnan szintetizált termékek mindegyike templátként szolgál a primer-illesztéshez és a lánchosszabbításhoz (következő ciklus), így ez a folyamat különböző hosszúságú kettősszálú fragmensek exponenciális növekedéséhez vezet.

Továbbá, a membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS enzimatikus vagy kémiai úton is szintetizálható. Egy, a membrán-kötött glikoziltranszferáz enzimatikusan aktív variánsát, melynek aminosav-szekvenciájából egy vagy több aminosav (DNS-fragmens) hiányzik és/vagy ki van cserélve egy vagy több másik aminosavra, mutáns DNS kódolhatja. Továbbá, olyan mutáns DNS-t tervezhetünk, mely néma mutációt hordoz, vagyis egy vagy több nukleotidot más nukleotidokra cserélünk ki úgy, hogy az új kodon(ok) ugyanazt az aminosava(ka)t kódolja(k). Ilyen mutáns DNS-szekvencia a degenerált DNS-szekvencia is. A degenerált DNS-szekvenciák a genetikai kód jelentésén belül degeneráltak, korlátlan számú nukleotid más nukleotidra való cserélésével, anélkül, hogy ez az eredetileg kódolt aminosav-szekvencia megváltozását eredményezné. Az ilyen degenerált DNS-ek jól alkalmazhatóak, mivel különböző restrikciós helyeik vannak, és/vagy különböző az egyes kodonok gyakorisága, melyeket egy adott gazda előnyben részesít. így a glikozil-transzferáz vagy variánsa optimális expresszióját érthetjük el. A szakirodalomban jól ismert eljárásokkal egy mutáns DNS a természetben előforduló genomiális DNS vagy a cDNS in vitro mutációjával is előállítható. Például egy glikozil-transzferáz szolubilis formáját kódoló részleges DNS restrikciós enzimekkel kivágható a megfelelő teljes hosszúságú membrán-kötött glikozil-transzferázt kódoló DNS-ből. Ezért előnyös, ha a megfelelő restrikciós hely elérhető. Az élesztő transzkripciós terminációs szignálokat tartalmazó DNS-szekvencia előnyösen egy élesztő gén 3' szegélyező szekvenciája, mely a transzkripció terminációjának és a poliadenilációnak megfelelő szignálokat tartalmazza. Alkalmas 3' szegélyező szekvenciák például azok a szekvenciák, amelyek természetesen is az alkalmazott promoterhez kapcsoltak. Előnyös a PHO5 gén szegély-szekvenciája.

Az élesztő promotert, kívánt esetben a szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciát és a membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát működőképesen kapcsoljuk össze tandem sorrendben, vagyis olyan sorrendben helyezzük őket egymás mellé, hogy normális funkciójukat fenntartsák. A sorrend olyan, hogy a promoter hatására megfelelő lesz a membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS (amelyet kívánt esetben megelőz a szignál-szekvencia) expressziója, a transzkripciós terminációs szignálok a transzkripció helyes terminációját és a megfelelő poliadenilációt eredményezik, és kívánt esetben a szignál-szekvencia, amely megfelelő leolvasási keretben kapcsolódik a fent említett DNS-szekvenciához, oly módon hogy a szignál-szekvencia utol6

HU 212 927 Β só kodonja közvetlenül az említett DNS-szekvencia első kodonjával kapcsolódik, lehetővé teszi a protein szekrécióját. Ha a promoter és a szignál-szekvencia különböző génekből származik, a promoter előnyösen a nagy mRNS starthely és a promoterhez természetesen kapcsolódó gén ATG kodonja közötti szakaszon kapcsolódik a szignál-szekvenciához. A szignálszekvenciának saját ATG kodonja kell hogy legyen a transzláció beindításához. Ezeknek a szekvenciáknak az összekapcsolása olyan szintetikus oligonukleotidokkal érhető el, amelyek egy endonukleáz felismerő helyét hordozzák.

Az élesztőben történő replikációra és expresszióra alkalmas vektorok élesztő replikációs origót tartalmaznak. Azok a hibridvektorok, amelyek élesztő replikációs origót, például a kromoszomális autonóm replikációs szakaszt (ars) tartalmaznak, a transzformáció után a sejtben extra-kromoszomálisan maradnak fenn, és a mitózis folyamán autonóm módon replikálódnak. Olyan hibridvektorok is alkalmazhatók, melyek a 2p-s plazmid DNS-ével homológ szekvenciát tartalmaznak. Az ilyen hibridvektorok a már a sejtben jelenlévő 2μos plazmidokba integrálódnak rekombinációval, illetve autonóm módon replikálódnak.

Előnyösen a találmány szerinti hibridvektorok egy vagy több, különösen egy vagy két élesztő szelektív genetikai markert tartalmaznak, és tartalmaznak egy olyan markert és replikációs origót is, amely egy bakteriális gazdában, különösen Escherichia coliban működik.

Az élesztőben működő szelektív génmarkerekként olyan markergének alkalmazhatóak, melyek fenotípusos kifejeződésüknek köszönhetően megkönnyítik a transzformánsok kiválasztását. Élesztőben alkalmas markerek például azok, amelyek antibiotikum-rezisztenciát fejeznek ki, vagy az auxotróf élesztőmutánsok esetén azok a gének, amelyek a gazda működésbeli károsodásait komplementálják. Megfelelő gének például a G418, higromicin vagy bleomicin rezisztenciát biztosító gének, vagy azok a gének, amelyek egy auxotróf élesztőmutánsban prototrófiát idéznek elő, például az URA3, LEU2, LYS2 vagy a TRP1 génje.

Mivel a hibridvektorok amplifikálása E. coliban végezhető el egyszerűen, előnyösen a vektor egy E. coli genetikai markért és E. coli replikációs origót tartalmaz. Ezekhez E. coli plazmidokból férhetünk hozzá, úgymint a pBR322-ből vagy egy pUC plazmidból, például a pUCl8-ból vagy a pUC19-ből, melyek tartalmaznak mind E. coli replikációs origót, mind E. coli genetikai markert, mely antibiotikum-rezisztenciát, méghozzá ampicillin rezisztenciát biztosít.

A találmány szerinti hibridvektorok a szakirodalomban ismert módszerek szerint állíthatók elő, például egy élesztő promotert és egy a promoter által kontrollált glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziős kazetta, vagy az expressziós kazetta különböző alkotórészeinek és egy olyan DNS-fragmensek a meghatározott sorrendben történő összekapcsolásával, amely élesztőben és bakteriális gazdasejtben alkalmazható szelektív genetikai markereket valamint élesztő és bakteriális replikációs origót tartalmaz.

A találmány szerinti hibridvektorok az alább leírt élesztőtörzsek transzformációjára alkalmazhatók.

Élesztőtörzsek és transzformációjuk

Alkalmas élesztő gazdaszervezetek a Saccharomyces nemzetiségi (genus) törzsei, különösen a Saccharomyces cerevisiae faj törzsei. Az említett élesztőtörzsek magukban foglalják azokat a törzseket, amelyekből hiányzik az endogén két-mikronos plazmid, és/vagy kívánt esetben hiányosak élesztő peptidáz aktivitásra pl. a ysca, yscA, YscB, yscY és/vagy yscS peptidáz aktivitásra.

A találmány továbbá egy olyan élesztőtörzsre vonatkozik, melyet egy olyan hibridvektorral transzformáltunk, amely egy expressziós vektort tartalmaz, ami egy promotert és egy a promoter ellenőrzése alatt álló az említett glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

Első megközelítésben a találmány szerinti élesztőtörzs egy olyan hibridvektorral van transzformálva, amely egy promoter és egy, a promoter ellenőrzése alatt álló, az említett glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát, valamint egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat hordozó DNS szekvenciát tartalmazó expressziós kazettát tartalmaz.

Második megközelítésben a találmány szerinti élesztőtörzs egy olyan hibridvektorral van transzformálva, amely egy olyan expressziós kazettát tartalmaz, amely tartalmaz egy promotert működőképesen kapcsolva egy szignál peptidet kódoló első DNS-szekvenciához, amely megfelelő leolvasási keretben kapcsolódik az említett promoter ellenőrzése alatt álló, membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló második DNS szekvenciához, valamint tartalmaz egy élesztő transzkripciós terminációs szignálokat hordozó DNS-szekvenciát. A találmány szerinti élesztőtörzseket egy membrán-kötött glikozil-transzferáz vagy variánsa előállítására használjuk.

Az élesztő transzformációját a találmány szerint hibridvektorokkal a szakirodalomból ismert módszerekkel hajtjuk végre, például Hinnen és tsai [Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1978) 75, 1929] és Ito és tsai [J. Bact. (1983) 153, 163-168] által leírt módszerek szerint.

A találmány szerinti eljárással előállított membránkötött glikozil-transzferázokat vagy variánsaikat önmagukban ismert módszereknél alkalmazhatjuk, például glikoproteinek, oligoszacharidok és glikolipidek szintézisénél és/vagy modifikációjánál (4 925 796 számú US szabadalom; EP-A 414 171 számú szabadalmi bejelentés). A találmány különösen a membrán-kötött glikozil-transzferázok és variánsaik, hibridvektorok és transzformált élesztőtörzsek előállítására, valamint a találmány eljárással kapható glikozil-transzferázokra vonatkozik, amint azt a példákban ismertetjük.

A példákban a következő rövidítéseket alkalmazzuk: GT = galaktozil-transzferáz (EC 2.4.1.22), PCR = polimeráz láncreakció, ST-szialil-transzferáz (EC 2.4.99.1), FT = fukozil-transzferáz.

HU 212 927 Β

1. példa

Galaktozil transzferáz (GT) cDNS klónozása HeLa sejtekből

A GT cDNS-t HeLa sejtekből [Watzele, G. és Berger, E. G. (1990) Nucleic Acids Rés. 18, 7174] izoláljuk a polimeráz láncreakció (PCR) módszerével:

1.1. Poli(A)⁺RNS előállítása HeLa sejtekből

Az RNS előállítására a HeLa sejteket egysejtréteg (monolayer) kultúrában növesztjük 5 lemezen (23x23 cm). Az RNS gyors és hatékony izolálását a tenyésztett sejtekből guanidin-HCl-es extrakcióval hajtjuk végre, ahogy azt Mac Donald és tsai leírták [Meth. Enzymol. (1987) 752, 226-227]. Általában a hozam 0,6-1 mg RNS per összefolyó sejteket tartalmazó lemez körül van. A poli(A)⁺RNS dúsítását affinitás-kromatográfiával végezzük oligo(dT)-cellulózon a Maniatis kézikönyvben leírt módszer szerint [Sambrook, J„ Frisch, Ε. E és Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1. kiadás), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA), 4 mg teljes DNS-t alkalmazva 400 μΐ oszlopon. A betöltött DNS 3%-át nyerjük vissza dúsított poli(A)⁺RNS-ként, amelyet alikvotokban gyűjtünk össze, és 3 egység etanollal csapjuk ki -70 °C hőmérsékleten.

7.2. Egyszálú cDNS szintézise a PCR-hez

A poli(A)⁺RNS (mRNS) DNS-sé történő reverz transzkripcióját Moloney rágcsáló leukémia vírus RN10 áz H~ reverz transzkriptázzal (M-MLV H~ RT) (BRL) végezzük, 20 μΐ reakcióelegyben a BRL előírásait követve, kisebb változtatásokkal: 1 μg HeLa sejt poli(A)⁺RNS-t és 500 ng oligo(dT)₁₂_₁₈-t =(Pharmacia) melegítünk 11,5 μΐ steril H₂O-ban 70 °C-ra 10 percig, és aztán gyorsan jégen lehűtjük. Ezután hozzáadunk 4 μΐ, a BRL-nél beszerezhető reakció-puffert (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 373 mM KCI, 15 mM MgCl₂), 2μ1, 0,1 M ditio-treitolt, Ιμΐ dNTP keveréket (10-10 mM dATP, dCTP, dGTP, TTP, Pharmacia) 0,5 μΐ (17,5 egység) RNS-védót (RN-áz inhibitor a Pharmaciától) és 1 μΐ (200 egység) M-MLVH RT-t. A reakciót 42 ’C-on végezzük, és 1 óra múlva a kémcső 95 °C-ra történő 10 perces melegítésével fejezzük be.

A reakció hatékonyságának ellenőrzésére a keverék alikvot mennyiségét (5 μΐ) 2 pCi a-³² dCTP jelenlétében inkubáljuk. A beépült dCTP mérésével a szintetizált cDNS mennyiségét kiszámoljuk. Az első szál szintézisének termelékenysége általában 5-15% között van.

7.3. Polimeráz láncreakció

A PCR-hez használt oligo-dezoxi-nukleotid primereket in vitro szintetizáljuk a foszfor-amidit módszerrel (Μ. H. Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, H. G. Gassen és A. Láng szerk., Verlag Chemie, Weinheim, FRG), az Applied Biosystems Model 38OB szintetizátorán. A primeréket az 1. táblázatban ismertetjük:

7. táblázat PCR-primerek

Primer	Szekvencia (5'-3' irányban)1	Megfelelő bp a GT cDNS-ben2
Piup (KpnI)	cgcgglACCCTTCTTAAAGCGGCGGCGGGAAGATG	(-26)-3
Pl (EcoRI)	gccgaatlcATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTAGCG	1-28
P3 (SacI)	CTGGAGCTCGTGGCAAAGCAGAACCC	448-473
P2d (EcoRI)	gccgaa7TCAGTCTCTTATCCGTGTACCAAAACGCCTA	1222-1192
p4 (HindlII)	cccaagc7OGAATGATGATGGCCACCTTGTGAGG	546-520

¹ a nagybetűk a GT szekvenciáját, a kisbetűk a járulékos szekvenciákat képviselik, a restrikciós enzimek helyeit aláhúzásával, a „start és a „stop” kodont vastag betűvel emeltük ki.

a humán placenta GT cDNS-ének a Gén Bank által publikált szekvenciája (beszerzési szám: M2292I).

A standard PCR-körülmények 30 μΐ inkubációs keverékben a következők: 1 μΐ a reverz transzkriptáz reakció-elegyből (lásd az 1.2 példát), amely kb. 5 ng egyszálú cDNS-t tartalmaz, 15-15 pmól a megfelelő primerekből, 200 pmól mind a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfátból (dATP, dCTP, dGTP és TTP) PCRpufferban (10 mM Tris-HCl pH 8,3 (23 C-on), továbbá 50 mM KCl-t, 1,5 mM MgCl₂-t, 0,001% zselatint és 0,5 egység AmpliTaq polimerázt (Perkin Elmer) tartalmaz. Az amplifikációt Thermocycler 60ban (Biomed) hajtjuk végre, a következő körülmények között: 0,5 perc denaturálás 95 °C-on, 1 perc primer-illesztés (anneálás) 56 ’C-on, és 1 perc 15 másodperc lánchosszabbítás 72 ’C-on, a teljes 20-25 ciklus folyamán. Az utolsó ciklusban a primer lánc50 hosszabbítása 72 ’C-on 5 percig tart. A szekvenáláshoz és a szubklónozáshoz a HeLa GT cDNS-t két átfedő részben amplifikáljuk, különböző primer-kombinációkat alkalmazva:

(1) P1-P4 fragmens: a Pl és P4 printereket alkalmazzuk a 0,55 kb-os DNS-fragmens amplifikálására, amely a 7-556. nukleotid-pozíciónak felel meg a HeLa GT cDNS-en (SEQ ID NO. 1) (2) P3-P2d fragmens: a P3 és P2d printereket alkalmazzuk a 0,77 kb-os fragmens amplifikálására, mely fragmens a 457-1232. nukleotid-pozícióknak felel meg (SEQ ID NO. 1).

Annak érdekében, hogy elkerüljük a hibákat az amplifikáció során, 4 független PCR-t csinálunk mindkét fragmensnél. A „start” kodont követő DNS-szek8

HU 212 927 Β vencia meghatározására a Plup (Kpnl) prímért a P4 primerrel kombinációban alkalmazzuk.

A PCR-amplifikáció után a P1-P4 fragmenst EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, 1,2%-os agaróz gélen elemezzük, eluáljuk a gélből GENECLEAN-nel (BIO 101), és pUC18 vektorba (Pharmacia) szubklónozzuk, amelyet előtte ugyanezekkel az enzimekkel emésztettünk. A P3-P2d fragmenst Saclgyel és EcoRI-gyel emésztjük, 1,2%-os gélen azonosítjuk, eluáljuk, és Sacl-gyel és EcoRI-gyel emésztett pUC 18-ba szubklónozzuk. Az így kapott szubklónok a pUC18/Pl-P4, illetve a pUC18/P3-P2d. A szubklónozáskor, ligáláskor és az E. coli DH5a törzs transzformálásakor standard előírásokat követünk, melyeket a

2. példában írunk le. A pUC18/Pl-P4 és a pUC18/P3P2d minipreparátumait alkalmazunk a denaturált kettős-szálú DNS T7 polimeráz szekvenáló kittel (Pharmacia) történő didezoxi-szekvenálására. M13/pUC szekvenáló primereket és reverz szekvenáló printereket (Pharmacia) alkalmazzuk mindkét, különböző restrikciós enzimekkel hasított DNS-szál átfedő fragmenseinek szekvenálására. A GT gén restrikciós fragmenseinek további szubklónozása szükséges a két szál átfedő fragmenseinek teljes körű szekvenálásához. A független PCR-ekkel amplifikált fragmensek szekvenciája azt mutatja, hogy az amplifikáció hibája kevesebb, mint egy nukleotid 3000 közül. A SEQ ID NO. 1-ben bemutatott teljes HeLa sejt GT cDNS nukleotid-szekvenciája 99,2%-ban homológ a humán piacéntában találhatóval (GenBank, Accession No. M22921).

Három különbséget találunk: (a) a három extra bázispár a 37-39-es nukleotid-pozícióknál (SEQ ID NO. 1) egy további (extra) aminosavat (Ser) eredményez a protein N-terminális régiójában; (b) a 98-101. bp-nál „CTCT” van a humán placentából származó szekvencia „TCTG” helyén, mely két konzervatív aminosavszubsztitúciót eredményez (Alá Leu a Val Tyr helyett) a GT áthidaló-dómén membránjának 31-32. aminosavpozíciójában; (c) az 1047. pozícióban a nukleotid A-ról G-re cserélődött anélkül, hogy ezt aminosav-csere követné. A HeLa GT cDNS-t kódoló 2 átfedő P1-P4 és P3-P2d DNS-fragmens a NotI restrikciós helyen keresztül kapcsolódik egymáshoz a 498-as nukleotid-pozíciónál, mely mindkét fragmensben jelen van.

A teljes HeLa sejt GT cDNS-t (SEQ ID NO. 1)

1,2 kb-os restrikciós fragmensként a pIC-7 plazmidba klónozzuk, mely egy olyan pUCB származék, amely a multiklónozó helyén további restrikciós helyeket tartalmaz [Marsh, J. L., Erfle, M. és Wykes, E. J. (1984) Gene 32, 481-485], így kapjuk a a p4ADl 13 vektort. A GT expressziós kazetta előállítása céljából a cDNS szekvencia 3' végénél lévő (1227. bp) EcoRI restrikciós helyet a következőképpen töröljük: először linearizáljuk a a p4ADl 13 vektort EcoRV-tel történő hasítással, és ezután alkalikus foszfatázzal kezeljük. Ezután 1 pg linearizált plazmid-DNS-t részlegesen emésztünk 0,25 egység EcoRI-gyel, 1 órán át, 37 °C-on. Agaróz gél-elektroforézis után egy, a linearizált plazmidnak (3,95 kb) megfelelő méretű fragmenst izolálunk a gélből GENECLEAN-t alkalmazva. A túlnyúló EcoRI véget Klenow polimerázzal töltjük be, ahogy azt a Maniatis kézikönyv (lásd fentebb) leírja. Fenolos kezelés és etanolos kicsapás után a plazmidot újra ligáljuk, és az E. coli DH5a (Gibco-BRL) törzset transzformáljuk vele. Hat transzformánsból plazmid minipreparátumot készítünk. A kapott plazmidokat restrikciós analízissel a HeLa GT cDNS 3' végénél levő EcoRI és EcoRV restrikciós helyek hiányára vizsgáljuk. A p4AEl 13 jelű plazmidot választjuk ki a következő kísérletekhez, amelynek DNS-szekvenciája megegyezik a p4DA113 plazmidéval, azzal a különbséggel, hogy az EcoRIEcoRV restrikciós helyeket hordozó 1232-1238. bp-ok törölve vannak.

2. példa

Expressziós kazetták szerkesztése a teljes hosszúságú GT-hez

A teljes hosszúságú HeLa GT cDNS szekvenciát (SWQ ID NO. 1) a Saccharomyces cerevisiae-ben történő heterológ expresszióhoz élesztő transzkripciós kontroll szignálhoz fuzionáljuk annak érdekében, hogy a transzkripció iniciációja és terminációja hatékony legyen. A promoter és a terminátor szekvenciák az élesztő savas foszfatáz génjéből (PHO5) (EP-A 100 561) származnak. A teljes hosszúságú PHO5 promotert a tápközeg szervetlen foszfát tartalma szabályozza. Magas P. koncentráció a promoter repressziójához vezet, míg az alacsony P. indukálja azt. Választhatjuk egy rövid, 173 bp-os PHO5 promoter alkalmazását is, melyből hiányzik az összes reguláló elem, és így konstitutív promoterként viselkedik.

2.7 Egy foszfáttal indukálható expressziós kazetta szerkesztése

A GT cDNS szekvenciáját élesztő PHO5 promoterrel és transzkripciós terminátor szekvenciákkal kapcsoljuk össze a következőképpen:

(a) Teljes hosszúságú HeLa GT cDNS szekvencia:

A teljes hosszúságú HeLa GT cDNS szekvenciát tartalmazó p4AEl 13 vektort EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük. A DNS-fragmenseket 1%-os agaróz gélen elektroforetikusan izoláljuk. Az 1,2 kb-os DNS fragmenst, mely a HeLa GT teljes cDNS szekvenciáját tartalmazza, izoláljuk a gélről üvegtejhez történő adszorbeálással, a GENECLEAN kitet alkalmazva. Ezen a fragmensen a GT protein szintézisének „ATG” start-kodonja közvetlenül az EcoRI restrikciós hely mellett helyezkedik el, míg a „TAG” stop-kodont a HeLa GT 3' nem transzlatálódó régiójának 32 bp-ja és a vektor multiklónozó helye követ a BglII restrikciós hellyel.

(b) Vektor az E. coliban történő amplifikációhoz:

A p32R plazmidot (lásd EP 100561), amely egy amplifikációs vektor, és a pBR322 származéka, BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük. A restrikciós fragmenseket 1%-os agaróz gélen szeparáljuk, és a gélből a fentebb leírt módon a 3,5-kb-os vektor-ffagmenst izoláljuk. Ez a DNS-fragmens tartalmazza a pBR322 származék nagy Sall-HindlII vektor-fragmensét, valamint a 377 bp-os PHO5 transzkripciós termi9

HU 212 927 Β nátor szekvenciát a pBR322 HindlII-BamHI szekvenciájában.

(c) Az indukálható PHO5 protomotert tartalmazó szekvencia:

A PH05 promoter-fragmenst, mely a foszfát-indukciós szabályozó elemeket tartalmazza, a p31R plazmidból (lásd EP 100561) izoláljuk Sáli és EcoRI restrikciós enzimes emésztéssel. A 0,8 kb-os Sall-EcoRI DNSfragmens tartalmazza a 276 bp-os Sall-BamHI pBR322 szekvenciát és az 534 bp-os BamHI-EcoRI PHO5 promoter-fragmenst, amelynek 8-as pozíciójánál egy EcoRI linket (5'-GAATTCC-3') van beépítve.

(d) ApGTA 1132 plazmid szerkesztése

A három DNS-fragmenst - (a)-tól (c)-ig - egymáshoz ligáljuk 12 μΐ ligáló elegyben: 100 ng (a) DNSfragmenst és 30-30 ng (b) és (c) fragmenst összekapcsolunk 0,3 egység T4 DNS-ligázzal (Boehringer) kiegészített ligáz-pufferben (66 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl₂, 1 mM ATP) 15 “C-on 18 órán át. A ligációs elegy felét használjuk E. coli DH5a törzs (Gibco/BRL) kompetens sejtjeinek transzformálására. A kompetens sejtek előállításánál és transzformációjánál a Maniatis kézikönyvben (lásd fentebb) megadott standard előírásokat követjük. A sejteket szelektív LB-tápközeget tartalmazó lemezekre oltjuk, amely 75 gg/ml ampicillinnel van kiegészítve, és 37 °C-on inkubáljuk. Körülbelül 120 transzformánst kapunk. Hat független transzformánsból plazmid-minipreparátumot készítünk Bimbóim, H. C. és Doly, J. módosított lúgos lízis eljárását alkalmazva, ahogy az a Maniatis kézikönyvben (fentebb) le van írva. Az Az izolált plazmidokat négy különböző enzimmel (EcoRI, PstI, HindlII, Sáli, és ezek kombinációi) végzett restrikciós analízissel jellemezzük. Mind a hat plazmid a várt restrikciós fragmenseket mutatja. Kiválasztunk egyet a kiónok közül, és pGTA 1132-nek nevezzük el. A pGTA 1132 olyan expressziós kazettát tartalmaz, mely a foszfát-regulálf PHO5 promoter ellenőrzése alatt álló teljes hosszúságú HeLa GT cDNS-t és a PHO5 transzkripciós terminátor szekvenciáját tartalmazza. Ez az expressziós kazetta egy 2,35 kb-os SallHindlH fragmensként, melyet (1A) DNS-fragmensnek nevezünk, kivágható a pGTA 1132-ből.

2.2. Konstitutív expressziós Icazetta szerkesztése:

A konstitutív, nem-szabályzott promoterrel rendelkező expressziós kazetta szerkesztéséhez az 5' végén csonkolt foszfát-szabályozó elemek nélküli PHO5 promoter-fragmenst alkalmazzuk, melyet a p31/PHO5 (-173)RIT plazmidból izolálunk.

(a) Ap31/PHO5 (-173)RIT plazmid szerkesztése

A p31RIT12 plazmid (EP 288 435) tartalmazza a teljes hosszúságú, reguláit PHO5 promotert (egy EcoRI hellyel az 534 bp-os BamHI-EcoRI fragment -8-as pozíciójánál beépítve), melyet az élesztő szignál-szekvenciát kódoló szekvencia (72 bp-os EcoRI-Xhol) követ tandem sorrendben klónozva a pBR322 eredetű vektor BamHI és HindlII helyei közé.

ApJDB207/PHO5(-173)-YHIR plazmidból (EP-A 340170) származó konstitutív PHO5(-173) promoterelem az élesztő PHO5 promoter -9-es pozíciójától a -173-as pozícióig (BstEII restrikciós hely) terjedő nukleotid-szekvenciát tartalmazza, de hiányoznak belőle az upstream regulációs elemek (UASp). A PHO5 (-173) promoter ezért úgy viselkedik, mint egy konstitutív promoter. Ebben a példában p31RIT12 plazmid reguláit PHO5 promoterének rövid, konstitutív PHO5(-183) promoter-elemre történő kicserélését írjuk le, hogy így előállítsuk a p31/PHO5(-173)RIT plazmidot. A p31RIT12 (EP 288 435) és a pJDB207/PHO5(-173)-YHIR (EP 340 170) plazmidokat Sáli és EcoRI endonukleázokkal emésztjük. A megfelelő 3,6 kb-os és 0,4 kb-os Sall-EcoRI fragmenseket 0,8%-os agaróz gélen izoláljuk, eluáljuk a gélből, etanollal kicsapjuk, és 0,1 pmól/μΐ koncentrációban H₂Oban reszuszpendáljuk. A két DNS-fragmenst ligáljuk és a ligációs elegy 1 μΐ-es alikvotjait használjuk az E. coli HB101 (ATTC) kompetens sejtjeinek transzformálására. Az ampicillin-rezisztens kolóniákat egyenként növesztjük ampicillinnel (100 μg/ml) kiegészített LB tápközegen. A plazmid-DNS-t Holmes, D. S. és tsai [Anal. Biochem. (1981) 144, 193) eljárása szerint izoláljuk, és Sáli és EcoRI restrikciós emésztésekkel elemezzük. A helyen restrikciós fragmensekkel rendelkező plazmidot p31/PHO5(-173)RIT-nek nevezzük el.

(b) ApGTB 1135 plazmid megszerkesztése

Ap31/PHO5(-173)RITplazmidot EcoRI és Sáli restrikciós enzimekkel hasítjuk. Az 1%-os agaróz gélen történő szeparáció után egy 0,45 kb-os fragmenst izolálunk a gélből GENECLEAN-nel (BIO 101). Ez a fragmens tartalmazza a pBR322 276 bp-os Sall-BamHI fragmensét és a 173 bp nagyságú BamHI(BstEII)-EcoRI konstitutív PHO5 promoter fragmentumot. A 0,45 kb-os SallEcoRI fragmenst ligáljuk az 1,2 kb-os EcoRI-BglH GT cDNS-sel [(a) fragmens) és a 3,5 kb-os, E. coli-ban történő amplifikációt lehetővé tevő BamHI-Sall vektor-részszel, mely tartalmazza a PHO5 terminátort [(b) fragmens), ahogy a 2.1 példában leírtuk. A ligálást és az E. coli DH5a törzs transzformációját a fentebb leírt módon végezzük. így 58 transzformánst kapunk. Minipreparátumok készítésével hat független kolóniából izoláljuk a plazmidokat, és restrikciós analízissel jellemezzük. Mind a hat plazmid a várt fragmenseket mutatja. Egy helyes kiónt pGTB 1135-nek nevezünk el, és ezt használjuk a további ldónozási kísérleteknél, melyeknél ez a vektor szolgáltatja az expressziós kazettát a GT kifejezéséhez, a konstitutív PHO5(-173) promoter-fragmens szabályozásával. Ez az expressziós kazetta, melyet (lb) DNS-fragmensnek neveztünk el, 2 kb-os Sall-Hindlü fragmensként kivágható a pGTB 1135 vektorból.

3. példa

A pDPGTAB és a pDPGTB5 expressziós vektorok szerkesztése

A heterológ expresszióra alkalmas élesztő vektor a pDP34 (11,8 kb) episzomális vektor. Ez egy olyan élesztó-E. coli ingázó vektor, amely E. coliban működő ampicillin rezisztencia markerrel és URA3 és dLEU2 élesztő szelektív markerekkel rendelkezik. ApDP34 vektort (lásd EP-A 340 170) BamHI restrikciós enzimmel emésztjük.

HU 212 927 Β

A linearizált vektort GENECLEAN-nel izoláljuk, és a túlnyúló végeket Klenow polimerázos kezeléssel töltjük be, ahogy azt a Maniatis kézikönyvben leírták. A reakciót 30 perc múlva, 20 perces 65 °C-ra történő hevítéssel állítjuk le 10 mM EDTA jelenlétében. Etanolos kicsapás után a plazmidot Sall-gyel emésztjük, és gél-elektroforézist végzünk 0,8%-os agaróz gélen. A (BamHI)tompa végű-Sall hasított pDP34 vektort 11,8 kb-os DNS-fragmensként izoláljuk a gélről GENECLEAN kittel.

A vektor kezeléséhez hasonlóan a pGTA 1132 és a pGTB 1135 plazmidokat HindlII-mal emésztjük. A linearizált plazmidok túlnyúló végeit Klenow polimerázos kezeléssel betöltjük, majd Sall-gyel emésztünk, mely eredményeként a következő fragmenseket kapjuk: (2A) egy 2,35 kb-os (HindlII)tompa végű-Sall fragmens, amely a foszfát-reguláit expressziós kazettát tartalmazza, vagy (2b) egy 2,35 kb-os (HindlII)tompa végű-Sall fragmens, amely konstitutív expressziós kazettát tartalmazza.

A tompa végű-Sall pDP34 vektor-fragmens ligálását a 2A vagy 2B fragmenssel és az E. coli DH5a kompetens sejtjeinek transzformálását a 2. példában leírt módon végezzük 80 ng vektorrészt és 40 ng 2A, illetve 2B fragmenst alkalmazva. 58, illetve 24 transzformánst kapunk. Mindegyik transzformációnál 6 plazmidot készítünk, és restrikciós analízissel jellemezzük. A szabályozott expressziós kazetta (2A fragmens) esetén két plazmid mutatja a várt restrikciós mintázatot. Az egyik kiónt kiválasztjuk, és pDPGTAB-nak nevezzük el. A konstitutív expressziós kazetta (2B fragmens) esetén egy plazmid mutatja a várt restrikciós mintázatot, amelyet pDPGTB5-nek nevezünk el.

4. példa

A Saccharomyces cerevisiae BT 150 törzs transzformálása

A pDPGTAB és a pDPGTB5 expressziós vektorok CsCl-lel tisztított DNS-ét R. Treisman előírásait követve a Maniatis kézikönyv szerint (lásd fentebb) állítjuk elő. A proteáz hiányos S. cerevisiae BT 150 (MATa, his4, leu2, ura3, pral, prbl, prcl, cpsl) és H 449 (MATa, prbl, cpsl, ura3d5, leu2-3, 2-112, cir°) törzseket 5 μ pDPGTAB, pDPGTB5 és pDP34 (expressziós kazetta nélküli kontroll) plazmiddal transzformáljuk a lítium-acetátos transzformációs eljárás szerint (Ito, H. és tsai, lásd fentebb). Az ura⁺-transzformánsokat izoláljuk és GT-aktivitásra vizsgáljuk (lásd lejjebb). Egyedi transzformált élesztősejteket izolálunk, és a következőképpen nevezzük el őket:

Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPGTAB

Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPGTB5

Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDP34

Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPGTAB

Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPGTB5

Saccharomyces cerevisiae H 449/pDP34

5. példa

Az élesztőben kifejezett teljes hosszúságú GT enzimaktivitása

5.1. Sejtkivonat előállítása

A transzformált Saccharomyces cerevisiae BT150 és H449 törzsek mindegyikét uracil szelekció alatt növesztjük élesztő minimál-táptalajon (Difco), mely hisztidinnel és leucinnal van kiegészítve. Az expressziós vektorok bevezetése a sejtekbe nem befolyásolja azok növekedési rátáját. Az exponenciálisan növekedő sejteket (0,5 OD₅₇₈-nál) vagy a stacioner állapotú sejteket centrifugálással összegyűjtjük, egyszer mossuk 50 mM 7,4-es pH-jú Tris-HCl pufferban (1. puffer), és reszuszpendáljuk az 1. pufferban 0,1-0,2 OD₅₇₈ koncentrációban. a sejtek mechanikai roncsolását négy perces, üveggyöngyökkel (0,45-0,50 átmérőjű) történő erőteljes rázással érjük el Vortex keverőn, szakaszos hűtés mellett. A nyers kivonatot közvetlenül használjuk az enzimakativitás meghatározására.

Az alkotórészek frakcionálását az extraktum differenciál-centrifugálásával végezzük. Először a kivonatot 450 g-nél 5 percig centrifugáljuk; majd a kapott felülúszót centrifugáljuk 20 000 g-nél 45 percig. A felülúszót összegyűjtük, és a pelletet az 1. pufferban reszuszpendáljuk. A GT expresszió PHO5 promoter ellenőrzött foszfát-indukciójához a BT 150/pDPGTAB, illetve a H 449/pDPGTAB transzformáns sejtjeit alacsony foszfáttartalmú minimál-tápközegre oltjuk [Meyhack, B. és tsai Embo J. (1982) 1, 675-680]. A sejtkivonatokat a fent leírt módon állítjuk elő.

5.2 Protein-assay

A proteinkoncentrációt a BCA-Protein Assay Kittel (Pierce) határozzuk meg.

5.3 GT-aktivitás-assay

A GT-aktivitást radiokémiái módszerekkel, ovalbuminnal vagy szabad GlcNAc akceptor szubsztrát alkalmazásával mérhetjük. Az ovalbumin egy olyan glikoprotein, amelynek kizárólag GlcNAc akceptor helyei vannak. A sejtkivonatokat (a sejtek 1-2-es OD₅₇₈-nál) 45 vagy 60 percen át 37 ’C-on mérjük 100 μΐ inkubációs keverékben, amely 100 mM, 7,4-es pH-jú Tris-HCl-t, 50 nCI UDP-^l4C-Gal-t (325 mCI/mmól), 80 nmól UDP-Gal-t, 1 gmól MnCl₂-t, 1% Triton Χ-100-at és 1 mg ovalbumin vagy 2 pmól GlcNAc akceptort tartalmaz. Abban az esetben, ha glikoprotein szubsztrátot alkalmazunk, a reakciót a protein savas kicsapásával állítjuk le. és az ovalbuminba beépült -^l4C galaktóz mennyiségét folyadék-szcintillációs számlálóval [Berger, E. G. és tsai (1978) Eur. J. Biochem. 90, 213-222] határozzuk meg. A GlcNAc akceptor szubsztrátnál a reakciót 0,4 ml jéghideg víz hozzáadásával állítjuk le, és a felhasználatlan UDP-^,4C-galaktózt elkülönítjük a -¹⁴Saccharomyces cerevisiae C terméktől egy anioncserélő oszlopon (AG Xl-8, BioRad), ahogy azt már leírták [Masibay, A. S. és Gasaba, P. K. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5733-5737). A méréseket akceptor molekulával és anélkül is elvégezzük, hogy megállapítsuk a nukleotid pirofoszfatázok hatására végbemenő UDP-Gal hidrolízisének mértékét. Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be.

HU 212 927 Β

2. táblázat

A különböző plazmátokkal transzformált S. cerevisiae törzs GT-aktivitása

Plazmid	GT-spec. aktivitás (mU/mg protein)
PHO5 promoter	magas Pi	alacsony Pi
pDP34	-	<0,01	n. m.1
pDPGTAB	foszfát reguláit	0,1	0,6-1
pDPGTB5	konstitutív	0,6	n. m.1

nincs meghatározva

A indukálható feltételek közé helyezett (alacsony P koncentrációjú minimál-tápközet) tenyészetek GT aktivitása körülbelül ugyanakkora, mint a minimál-táptalajon növesztett, a GT-t konstitutívan kifejező tenyészeteké (2. táblázat). Ahogy az várható volt, az üres vektorral transzformált sejteknél nem észlelhető enzim-aktivitás.

A frakcionálás alatt a GT aktivitás nagy részét (7090%, lásd a 3. táblázat) és a legmagasabb specifikus aktivitást mindig a nagysebességű pelletekben (20 000 g) találtuk. Az enzimaktivitás 1-2% Triton-X hozzáadásával növelhető a mérés során. Mindkét megállapítás azt sejteti, hogy az élesztőben kifejezett rekombináns GT ugyanúgy membrán-kötött, mind a HeLa sejtekben.

3. táblázat

A GT aktivitás megoszlása a BT I50/pDPGT5 sejtek frakeionálásakor

Frakció	GT aktivitás cpm
a GlcNac-be beépült UDP-14C-Gal	%
nyers kivonat	19 400
pellet 400 g-nél	1 000	4,6%
pellett 20 000 g-nél	14 800	72,5%
felülúszó 20 000 g-nél	5000	22,9%
összesen	21 800	100%

6. példa

A rekombináns GT tisztítása

Annak érdekében, hogy felszabadítsuk a membránkötött enzimet, a BT 150/pDPGTB5 sejtek 20 000 g-s pellet-frakcióját 1% (t/tf) Triton Χ-100-zal kezeljük 10 percig szobahőmérsékleten, és 50 mM 7,4-es pH-jú Tris-HCl-lel, 25 mM MgCl₂-vel, 0,5 mM UMP-vel és 1% (t/tf) Triton Χ-100-zal egyenlítjük ki. A centrifugálás után kapott felülúszót 0,2 gm-es szűrőn átszűrjük, és GlcNAc-p-aminofenil-szefaróz-oszlopon engedjük át [Berger, E. G. és tsai (1976) Experientia 32, 690691] 5 ml ágytérfogatnál, 0,2 ml/perc átfolyási rátával, ’C-on. Az enzimet 50 mM 7,4-es pH-jú Tris-HCl-lel, mM GlcNAc-vel, 25 mM EDTA-val és 1% Triton Χ-100-zal eluáljuk. Egyetlen enzimaktivitás-csúcsot eluálunk 5 frakcióban (méret: 1 ml). Ezeket a frakciókat egyesítjük és dializáljuk 2x11 50 mM 7,4-es pH-jú Tris-HCl-lel és 0,1% Triton Χ-100-zal szemben. A tisztított GT enzimatikusan aktív.

7. példa

Expressziós kazetta szerkesztése a szolubilis GT kifejezésére

Az élesztőben kifejezett galaktozil-transzferáz kiválasztható a tápközegbe abban az esetben, ha egy élesztő promotert kapcsolunk működőképesen egy olyan első DNS-szekvenciához, mely az élesztő SUC2 invertáz génjének szignál-szekvenciáját kódolja, és ehhez kapcsoljuk megfelelő leolvasási keretben a szolubilis GT-t kódoló cDNS-t.

(a) Részleges HeLa GT cDNS szekvencia

A GT cDNS-t a p4AD 113 plazmidból (1. példa) vágjuk ki EcoRI emésztéssel. A teljes GT cDNS-t tartalmazó 1,2 kb-os fragmenst izoláljuk, és részlegesen emésztjük MvnI-gyel (Boehringer), mely a GT szekvenciáját a SEQ ID NO. 1-gyel ábrázolt nukleotid-szekvencia 43., 55., 140. és 288. pozíciójánál hasítja. A 0,2 gg EcoRI-EcoRI fragments 0,75 gg MvnI-gyel egy órán át emésztve a GT cDNS csak egyszer, a 134. nukleotid-pozíciónál hasad, és így egy 1,1 kb-os MvnI-EcoRI fragmenshez jutunk.

(b) Vektor az E. coliban történő amplifikáláshoz

A pUC18 plazmidot (Pharmacia) a multiklónozó helyén BamHI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük. Ezután a plazmidot alkalikus foszfatázzal kezeljük a Maniatis kézikönyvben (lásd fentebb) leírtak szerint, agaróz gélelektroforézist végzünk, és a gélből izoláljuk a 2,7 kbos DNS-fragmenst.

(c) Konstitutív PHO5(-173) promoter és SUC2 szignál-szekvencia

A P31/PHO5(-173)RIT vektort (2. példa) BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel hasítjuk. Egy a konstitutív PHO5(-173) promotert és a szomszédos invertáz szignál-szekvenciát (inv ss) kódoló szekvenciát tartalmazó 0,25 kb-os BamHI-Xhol fragmenst izolálunk. Ezután a fragmenst Hgal-gyel (BioLabs) újból hasítjuk. A Hgal felismerő szekvencia a negatív (antisense) DNS-szálon van. A restrikciós enzim a felismerő szekvenciától felfelé (upstream) vág, oly módon, hogy az antisense szál 5' ragadós vége az invertáz szignált kódoló szekvencia végével illeszkedik. A 0,24 kb-os BamHI-Hgal hasított DNSfragmens tartalmazza a konstitutív PHO5(-173) promotert az invertáz szignál-szekvenciájához kapcsolva.

(d) Adaptor

Az (a) fragmenst a (c) fragmenshez egy adaptor szekvencia segítségével kapcsoljuk, melyet a következő szintetikus oligonukleotidok (Microsynth) ekvimoláris mennyiségeiből állítottunk elő: 5'CT GCA CTG GCT GGC CG 3' és a komplementer szál: 5' CG GCC AGC CAG 3'. Az oligonukleotidokat egymáshoz illesztjük (anneáljuk) először 95 ’C-ra történő melegítéssel, majd 20 ’C-ra történő lassú lehűtéssel. Az így kezelt adaptert fagyasztva tároljuk.

(e) A psGT plazmid szerkesztése

Az összekapcsoláshoz a linearizált (b) vektort, az (a) GT cDNS-fragmenst, a promotert és a szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó (c) fragmenst és a (d) adaptert a következő mólarányban alkalmazzuk: 1:2:2:30-100. A ligálás 12 gl ligáz pufferben (66 mM 7,5-ös pH-jú TrisHCl, 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl₂, 1 mM ATP) 16 ’Con 18 órán át végezzük. A ligációs elegyet E. coli DH5ö

HU 212 927 Β törzs kompetens sejtjeinek transzformálására használjuk, ahogy azt fentebb leírtuk. 24 független transzformánsból minipreparátumot készítünk. Az izolált plazmidokat restrikciós anab'zissel jellemezzük négy különböző enzimet alkalmazva (BamHI, PstI, EcoRI, Xhol, és kombináció- 5 ik). Egy egyedi kiónt, mely a várt restrikciós mintázatot mutatja, psGT-nek nevezünk el. A psGT plazmidban az invertáz szignálpeptidjét kódoló szekvencia és a szolubilis GT-t kódoló cDNS fúziós helyénél a helyes szekvenciát T7 szekvenáló kit (Pharmacia) és a konstitutív PHO5 (-173) promoter -77. pozíciójánál kezdődő 5'AGTCGAGGTTAGTATGGC 3' primer segítségével igazoljuk.

DNS szekvencia¹: MvnI

5' AAA ATA Tct gca ctg get ggc cgC GAC CTG AGC 3' 3' TTT TAT AGA CGT gac cga ccg gcG CAG GAC TCG 5' protein: Lys Ile Ser Alá 1 Leu Alá Gly Arg Asp Leu Ser 16 19 | 42

I inv ss | GT szekvencia szignál és endopeptidáz közötti hasítás helye ¹ a kisbetűk az adaptor szekvenciáját képviselik

A szekretált GT-t kifejező expressziós kazetta, mely a konstitutív PHO5(-173) promotert, az invertáz szignál peptidet kódoló DNS-t és a részleges GT cDNS-t tartalmazza, egy 1,35 kb-os SalI(BamHI)-EcoRI fragmensként nyerhető ki a psGT plazmidból. Az expreszsziós kazettába a még hiányzó PHO5 terminátor szekvenciát a következő klónozási lépésben építjük be.

8. példa

A pDPGTS expressziós vektor szerkesztése

A szolubilis GT-t kifejező expressziős vektor előállítására a következő fragmenseket kapcsoljuk össze:

(a) Vektorrész

A pDP34 plazmidot a 3. példában leírtak szerint emésztjük és előkezeljük, hogy a 11,8 kb-os tompa végű-Sall vektor-fragmenst kapjuk.

(b) Expressziós kazetta

A psGT plazmidot először Sáli emésztéssel (a multiklónozó helyen) linearizáljuk, majd részlegesen emésztjük EcoRI-gyel. Egy 1,35 kb-os DNS-fragmenst izolálunk, mely a konstitutív PHO5(-173) promotert, egy élesztő invertáz szignál peptidet kódoló DNSszekvenciát és a részleges GT cDNS-t kódolja.

(c) A PHO5 terminátor szekvencia

A PHO5 terminátor szekvenciát a p31 plazmidból izoláljuk, mely a p30 plazmidból állítható elő, amint azt az EP 100561-ben leírják. A HindlII-mal történő restrikciós emésztés után a túlnyúló végeket Klenow polimerázzal betöltjük a korábban leírtak szerint. A plazmidot EcoRI-gyel emésztjük, és egy 0,39 kb-os tompa végű-EcoRI fragmenst izolálunk, amely a PHO5 terminátor szekvenciát hordozza.

Az (a), (b) és (c) fragmensek összeligálását és az E. coli DH5a törzs kompetens sejtjeinek transzformálást a 2. példában leírt módon végezzük. A kapott transzformánsokból plazmidokat izolálunk, és restrikciós analízissel jellemezzük. Az egyik klón plazmidját, melynek helyes restrikciós fragmensei vannak, pDPGTS-nek nevezzük el.

9, példa

Szolubilis GT kifejezése élesztőben

A 4. példában hasonlóan, a CsCl-lel tisztított pDPGTS expressziós vektor DNS-ét alkalmazzuk a Saccharomyces cerevisiae BT 150 és H 449 törzsek transzformálására. Az ura⁺ transzformánsokat izoláljuk és GT-aktivitásra vizsgáljuk. Mindkét esetben kiválasz35 tünk egy transzformánst, és Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPGTS-nek, illetve Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPGTS-nek nevezzük el. Az 5. példában leírt mérőmódszert alkalmazva GT-aktivitást észlelünk mindkét transzformáns tápközegében.

10. példa

Humán HepG2 sejtekből származó szialil-transzferáz (ST) cDNS klónozása

Az ST cDNS-t HepG2 sejtekből izoláljuk PCR-rel, a GT cDNS-sel azonos módon. A poli(A)⁺RNS előállítása és az egyszálú cDNS szintézise az 1. példában leüt módon történik.

Az 5. táblázatban felsorolt primereket (Mycrosynth) alkalmazzuk a PCR-hez.

5. táblázat PCR-primerek

Primer	Szekvencia (5'-3z irányban)1	Megfelelő bp az ST cDNS-ben2
	Pstl/EcoRI
SIA1	cgclgeagaatt£aaaATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGT	1-28
	BamHI
SIA3	CgCggatCCTGTGCTTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGCC	1228-1198

¹ a nagybetűk az ST szekvenciáját, a kisbetűk a járulékos szekvenciákat képviselik, a restrikciós enzimek helyeit aláhúzással, a ..start és a „stop” kodont vastag betűvel emeltük ki.

² a humán placenta(27) ST cDNS-ének az EMBL Data Bank által publikált szekvenciája (beszerzési száma: X17247).

HU 212 927 Β

A HepG2 ST cDNS egy 1,2 kb-os fragmensként amplifikálható a SIA1 és SI3 primerek alkalmazásával. A PCR-t a GT cDNS-nél leírt módon végezzük el, a ciklizálás feltételeiben az alábbi módosításokkal: 0,5 perc denaturálás 95 °C-on, 1 perc 15 másodperc primer-illesztés (anneálás) 56 °C-on és 1 perc 30 másodperc lánchosszabbítás 72 °C-on, teljes 25-35 ciklusnál.

Az utolsó ciklusban a primer lánchosszabbítását 72 °C-on 5 percig végezzük.

A PCR amplifikáció után az 1,2 kb-os fragmenst BamHI és PstI restrikciós enzimekkel hasítjuk, 1,2%os agaróz gélen elemezzük, eluáljuk a gélből, és a pUC18 vektorban szubklónozzuk. Az eredményül kapott szubklónt pSIA2-nek nevezzük el.

11. példa

Konstitutív ST expressziós kazetta szerkesztése

A konstitutív heterológ kifejezéshez az ST cDNS-t a konstitutív PHO5(-173) promoter-fragmenshez és a PHO5 terminátor szekvenciához kapcsoljuk.

A pSIA2 plazmidot először BamHI restrikciós enzimes hasítással linearizáljuk, majd részlegesen emésztjük EcoRI-gyel. Mivel az ST cDNS is tartalmaz egy belső EcoRI restrikciós helyet (a 144-es pozíciónál), a teljes ST cDNS-t (SEQ ID NO. 3) tartalmazó 1,2 kb-os fragmenst részleges EcoRI emésztéssel hozzuk létre 1 pg DNS és 0,25 egység EcoRI alkalmazásával (1 óra, 37 °C). Gélelektroforézis után a teljes ST cDNS-t (SEQ ID NO. 3) tartalmazó 1,2 kb-os EcoRI-BamHI fragmenst izoláljuk. A DNS-fragmensen az ST transzlációjának, ATG” startkodonja az EcoRI helyhez közel helyezkedik el. A három adenozin-foszfát (lásd a SIA1 PCR-primert) egy , ATG” start-kodonja az EcoRI helyhez közel helyezkedik el. A három adenozin-foszfát (lásd a SIA1 PCR-primert) egy ,A”-t szolgáltat a 12-es pozícióban, amely megtalálható az élesztőben magas szinten expresszálódó gének, ATG” körüli konszenzus szekvenciájában (Hamilton, R. és tsai (1987) Nucleic Acids Rés. 14, 5125-5149). A BamHI hely a „TAA” stop-kodont és a gén 3' nem-transzlatált régióját követi.

Az 1,2 kb-os EcoRI-BamHI ST cDNS fragmenst a 0,45 kb-ps Sall-EcoRI fragmenshez, mely a konstitutív PHO5(-173) promotert tartalmazza [2.2(b) példa] és a

3,5 kb-os BamHI-Sall E. coli amplifikációs vektor-részhez ligáljuk, mely a PHO5 terminátor-szekvenciát tartalmazza [lásd 2.1 példa (b) fragmens]. A ligálást és az E. coli DH5a törzs transzformációját a 2.1 példában részletezett módon hajtjuk végre. Egy kiónt, mely a várt restrikciós mintázatot mutatja, pST2-nek nevezünk el.

A pST2 vektor egy 2,0 kb-os Sall-Hindül fragmensként tartalmazza a PHO5(-173) promoter szabályozása alatt álló HepG2 ST expressziós kazettát, melyet (IC) DNS-fragmensnek nevezünk.

72. példa

Az ST kifejezése élesztőben

A pDP34 vektort (lásd EP-A 340 170) BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. A linearizált vektort GENECLEAN-nel izoláljuk, és a túlnyúló végeket Klenow polimerázos kezeléssel töltjük be, ahogy azt a

Maniatis kézikönyvben leírták. A reakciót 30 perc múlva, 20 perces 65 °C-ra történő hevítéssel állítjuk le 10 mM EDTA jelenlétében. Etanolos kicsapás után a plazmidot Sall-gyel emésztjük, és gél-elektroforézist végzünk 0,8%-os agaróz gélen. A (BamHI)tompa végű-SalI hasított pDP34 vektort 11,8 kb-os DNS-ffagmensként izoláljuk a gélről GENECLEAN kittel.

A pST2 plazmidot HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, és a vektorrész előállításának analógiájára a HindlII helyet Klenow polimerázos kezeléssel betöltjük. A terméket Sáli emésztésnek vetjük alá, és így egy 2,0 kbos (HindlII)tompa végű-Sall fragmenst kapunk, mely a konstitutív ST expressziós kazettát tartalmazza (2C).

A 80 ng pDP34 vektor ligálását 40 ng 2C fragmenssel és az E. coli DH5a törzs transzformálását a 2. példában leírtak szerint hajtjuk végre. Kiválasztunk egy kiónt, mely a várt restrikciós enzim-mintázatot mutatja, és pDPST5-nek nevezzük el. Az élesztő transzformációjához a pDPST5 expressziós vektor CsCl-lel tisztított DNS-ét a Maniatis kézikönyvben (fentebb) megadott standard módszert követve készítjük el. Mind az S. cerevisiae BT 150, mind a H 449 törzseket 5 pg plazmid-DNS-sel transzformáljuk a lítium-acetátos módszer szerint (Ito, H. és tsai, fentebb). Az ura⁺-transzformánsokat szelektáljuk, és az ST aktivitásukra vizsgáljuk. Mindkét esetben kiválasztunk egy pozitív transzformánst, és Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPST5-nek és Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPST5-nek nevezzük el.

13. példa

Az élesztőben kifejezett teljes hosszúságú ST enzimaktivitása

13.1 Sejtkivonat előállítása

A transzformált Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPST5 sejtjeit uracil szelekció alatt növesztjük élesztő minimál táptalajon (Difco), mely hisztidinnel és leucinnal van kiegészítve. Az exponenciálisan növekedő sejteket (0,5 OD₅₇₈-nál) vagy a stacioner állapotú sejteket centrifügálással összegyűjtjük, egyszer mossuk 50 mM 7,0-s pH-jú imidazol pufferban (1. puffer), és reszuszpendáljuk az 1. pufferban 0,1-0.2 OD₅₇₈ koncentrációban. A sejtek mechanikai roncsolását négy perces, üveggyöngyökkel (0,45-0,50 átmérőjű) történő erőteljes rázással érjük el Vortex keverőn, szakaszos hűtés mellett

Az ST-aktivitást a nyers kivonatokban mérjük az alább leírt assay-t alkalmazva.

13.2 ST-aktivitási assay

Az ST-aktivitás meghatározható a CMP-sziálsavról egy glikoprotein akceptorra transzferált radioaktívan jelzett sziálsav mennyiségének meghatározásával. A reakció sav-kicsapásos leállítása után a csapadékot üvegszálas szűrőkön (Whatman GFA) szüljük, alaposan átmossuk jéghideg etanollal, és a radioaktivitást folyadék-szcintillációs számlálóval [Hersford és tsai (1984), Glycoconjugate J. I, 141-153] meghatározzuk. A sejtkivonatokat 45 percen át egy olyan inkubációs elegyben mérjük, mely hozzávetőlegesen 0,3 mg prote14

HU 212 927 Β innék megfelelő 37 μΐ sejtkivonatot, 3 pl 50 mmól/1, 7,0 pH-jú imidazol puffért, 50 nmól CMP-N-acetil-neuraminsavat (Sigma) tartalmaz, amelyhez annyi CMP³H-N-acetil-neuraminsavat (Amersham) adunk, hogy a végső specifikus aktivitás 7,3 Ci/mól legyen, és 75 pg aszialo-fetuinnal egészítjük ki (előállítva 0,1 M H₂SO₄-gyel történő savas hidrolízissel, 0,1 M H₂SO₄et alkalmazva 80 °C-on 60 percig, melyet semlegesítés, dialízis és liofilizálás követ).

Az S. cerevisiae BT 150/pDPST5 és H

449/pDPST5 sejtekből kinyert nyers extraktumban STaktivitást találunk.

14. példa

Szolubilis (STÍLysyq-Cys^) expressziós kazetta szerkesztése

Az ST(Lys₃₉-Cys₄₀₆)-tal jelölt szolubilis ST egy

N-terminálisán csonkolt variáns, mely 368 aminosavból áll (SEQ ID NO. 4).

(a) Részleges HepG2 ST DNS-szekvencia

A pSIA2 plazmidot EcoRI-gyel hasítjuk, és izoláljuk az 1,1 kb-os EcoRI-EcoRI fragmenst.

(b) Vektor az E. coliban történő amplifikáláshoz

A pUC18 plazmidot (Pharmacia) a multiklónozó helyén BamHI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük. Ezután a plazmidot alkalikus foszfatázzal kezeljük a Maniatis kézikönyvben (lásd fentebb) leírtak szerint, agaróz gélelektroforézist végzünk, és a gélből izoláljuk a 2,7 kbos DNS-fragmenst.

(c) Konstitutív PHO5(-173) promoter és SUC2 szignál-szekvencia A p31/PHO5(-173)RIT vektort (2. példa) BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel hasítjuk. Egy a konstitutív PHO5(-173) promotert és a szomszédos invertáz szignál-szekvenciát (inv ss) kódoló szekvenciát tartalmazó 0,25 kb-os BamHIXhol fragmenst izoláljuk. Ezután a fragmenst Hgal-gyel (BioLabs) újból hasítjuk. A Hgal felismerő szekvencia a rtegatív (antisense) DNS-szálon van. A restrikciós enzim a felismerő szekvenciától felfelé (upstream) vág, oly módon, hogy az antisense szál 5' ragadós vége az invertáz szignált kódoló szekvencia végével illeszkedik. A 0,24 kb-os BamHI-Hgal hasított DNS-fragmens tartalmazza a konstitutív PHO5(-173) promotert az invertáz szignál-szekvenciájához kapcsolva.

(d) Adaptor

Az (a) fragmenst a (c) fragmenshez egy adaptor szekvencia segítségével kapcsoljuk, melyet a következő szintetikus oligonukleotidok ekvimoláris mennyiségeiből állítottunk elő: 5' CTGCAAAATTGCAAACCAAGG 3' és a komplementer szál: 5' AATTCCTTGGTTTGCAATTT 3'. Az oligonukleotidokat egymáshoz illesztjük először 95 °C-ra történő melegítéssel, majd 20 °C-ra történő lassú lehűtéssel. Az így kezelt adaptort fagyasztva tároljuk.

(e) A psST plazmid szerkesztése

Az összekapcsoláshoz a linearizált (b) vektort, az (a) ST cDNS-fragmenst, a promotert és a szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó (c) fragmenst és a (d) adaptort a következő mólarányban alkalmazzuk: 1:2:2:30-100. A ligálás 12 pl ligáz pufferben (66 mM 7,5-ös pH-jú Tris-HCl, 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl₂, 1 mM ATP) 16 °C-on 18 órán át végezzük. A ligációs elegyet E. coli DH5a törzs kompetens sejtjeinek transzformálására használjuk, ahogy azt fentebb leírtuk. 24 független transzformánsból minipreparátumot készítünk. Egy egyedi kiónt, mely a restrikciós analízisnél, ahol négy különböző enzimet alkalmazunk (BamHI, Pstl, EcoRI, Xhol és kombinációik), a várt restrikciós mintázatot mutatja, psST-nek nevezünk el.

A psST plazmidban az invertáz szignálpeptidjét kódoló szekvencia és a szolubilis ST(Lys₃₉-Cys₄₀₆)-t kódoló cDNS fúziós helyénél a helyes szekvenciát T7 szekvenáló kit (Pharmacia) és a konstitutív PHO5 (-173) promoter -77. pozíciójánál kezdődő 5' ACGAGGTTAATGGC 3' primer segítségével igazoljuk.

DNS szekvencia]:

5' AAA ATA Tct gca aaa ttg caa acc aag gAA 3' 3' TTT TAT AGA GTG ttt aac gtt tgg ttc ctt 5' protein: Lys Ile Ser Alá | Lys Leu Gin Thr Lys Glu 16 19 | 39

I inv ss | ST szekvencia szignál és endopeptidáz közötti hasítás ¹ a kis betűk az adaptor szekvenciáját képviselik

A szekretált ST-t kifejező expressziós kazetta, mely a konstitutív PHO5(-173) promotert, az invertáz szignál pepiidet kódoló DNS-t és a részleges ST cDNS-t tartalmazza, egy 1,35 kb-os SalI(BamHI)-EcoRI fragmensként nyerhető ki a psST plazmidból. Az expresz- 55 sziós kazettába a még hiányzó PHO5 terminátor szekvenciát a következő klónozási lépésben építjük be.

15. példa

A pDPSTS expressziós vektor szerkesztése 60

A szolubilis ST(Lys₃₉-Cys₄₀₆)-t kifejező expressziós vektor előállítására a következő fragmenseket kapcsoljuk össze:

(a) Vektorrész

A pDP34 plazmidot a 3. példában leírtak szerint emésztjük és előkezeljük, hogy a 11,8 kb-os tompa végű-Sall vektor-fragmenst kapjuk.

(b) Expressziós kazetta

A PsST plazmidot először Sáli emésztéssel (a multiklónozó helyen) linearizáljuk, majd részlegesen emésztjük EcoRI-gyel. Egy 1,35 kb-os DNS-fragmenst

HU 212 927 Β izolálunk, mely a konstitutív PHO5(-173) promotert, egy élesztő invertáz szignál pepiidet kódoló DNSszekvenciát és a részleges ST cDNS-t kódolja.

(c) A PHO5 terminátor szekvencia

A PHO5 terminátor szekvenciát a p31 plazmidból izoláljuk, mely a p30 plazmidból állítható elő, amint azt az EP 100 561-ben leírják. A HindlII-mal történő restrikciós emésztés után a túlnyúló végeket Klenow polimerázzal betöltjük a korábban leírtak szerint. A plazmidot EcoRI-gyel emésztjük, és egy 0,39 kb-os tompa végű-EcoRI fragmenst izolálunk, amely a PHO5 terminátor szekvenciát hordozza.

Az (a), (b) és (c) fragmensek összeligálását és az E. coli DH5a törzs kompetens sejtjeinek transzformálását a 2. példában leírt módon végezzük. A kapott transzformánsokból plazmidokat izolálunk, és restrikciós analízissel jellemezzük. Az egyik klón plazmidját, melynek helyes restrikciós fragmensei vannak, pDPSTS-nek nevezzük el.

16. példa

Szolubilis ST kifejezése élesztőben

A 4. példához hasonlóan, a CsCl-lel tisztított pDPSTS expressziós vektor DNS-ét alkalmazzuk a Saccharomyces cerevisiae BT 150 és H 449 törzsek transzformálására. Az ura⁺ transzformálásokat izoláljuk és GT-aktivitásra vizsgáljuk. Mindkét esetben kiválasztunk egy transzformánst és Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPSTS-nek, illetve Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPSTS-nek nevezzük el. Az 5. példában leírt mérőmódszert alkalmazva ST-aktivitást észlelünk mindkét transzformáns tápközegében.

17. példa

Szolubilis STfLys^j-Cys^) expressziós kazetta szerkesztése

Az ST(Lys₂₇-Cys₄₀₆)-tal jelölt szolubilis ST egy N-terminálisán csonkolt variáns, mely tartalmazza a katalikus domént és a teljes törzs-régiót, és 380 aminosavból áll, méghozzá a SEQ ID NO. 3 szekvencia 27-406. aminosavaiból.

(a) Részleges HepG2 ST DNS-szekvencia A pSIA2 plazmidot EcoRI-gyel hasítjuk és izoláljuk az

1,1 kb-os EcoRI-EcoRI fragmenst.

(b) Vektor az E. coliban történő amplifikáláshoz

A pUC18 plazmidot (Pharmacia) a multiklónozó helyén BamHI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük. Ezután a plazmidot alkalikus foszfatázzal kezeljük a Maniatis kézikönyvben (lásd fentebb) leírtak szerint, agaróz gélelektroforézist végzünk, és a gélből izoláljuk a 2,7 kbos DNS-fragmenst.

(c) Konstitutív PHO5(-173) promoter és SUC2 szignál-szekvencia

A p31/PHO5(-173)RIT vektort (2. példa) BamHi és Xhol restrikciós enzimekkel hasítjuk. Egy a konstitutív PHO5(-173) promotert és a szomszédos invertáz szignál-szekvenciát (inv ss) kódoló szekvenciát tartalmazó 0,25 kb-os BamHI-Xhol fragmenst izoláljuk. Ezután a fragmenst Hgal-gyel (BioLabs) újból hasítjuk. A Hgal felismerő szekvencia a negatív (antisense) DNS-szálon van. A restrikciós enzim a felismerő szekvenciától felfelé (upstream) vág, oly módon, hogy az antisense szál 5' ragadós vége az invertáz szignált kódoló szekvencia végével illeszkedik. A 0,24 kb-os BamHI-Hgal hasított DNSfragmens tartalmazza a konstitutív PHO5(-173) promotert az invertáz szignál-szekvenciájához kapcsolva.

(d) Adaptor

Az (a) fragmenst a (c) fragmenshez egy adaptorszekvencia segítségével kapcsoljuk, melyet a következő szintetikus oligonukleotidok ekvimoláris mennyiségeiből állítottunk elő: 5' CTGCAAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGG 3' és komplementer szál: 5' AATTCCTTGTTGCAATTTAAAGGAATCATAGTAACTCCCTTTCTTCTTTTCCTT 3'. Az oligonukleotidokat egymáshoz illesztjük először 95 °C-ra történő melegítéssel, majd 20 ’C-ra történő lassú lehűtéssel. Az így kezelt adaptort fagyasztva tároljuk.

(e) ApsSTl plazmid szerkesztése

Az összekapcsoláshoz a linearizált (b) vektort, az (a) ST cDNS-fragmenst, a promotert és a szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó (c) fragmenst és a (d) adaptort a következő mólarányban alkalmazzuk: 1:2:2:30-100. A ligálás 12 μΐ ligáz pufferben (66 mM 7,5-ös pH-jú TrisHCl, 1 mM ditiotreitol, 5 mm MgCl₂, 1 mM ATP) 16 ’Con 18 órán át végezzük. A ligációs elegyet E. coli DH5a törzs kompetens sejtjeinek transzformálására használjuk, ahogy azt fentebb leírtuk. 24 független transzformánsból minipreparátumot készítünk. Egy egyedi klón, mely a restrikciós analízisnél, ahol négy különböző enzimet alkalmazunk (BamHi, PstI, EcoRI, Xhol és kombinációik), a várt restrikciós mintázatot mutatja, psSTl -nek nevezünk el.

A psSTl plazmidban az invertáz szignálpeptidjét kódoló szekvencia és a szolubilis ST(Lys₂7-Cys₄₍₎₆)-t kódoló cDNS fúziós helyénél a helyes szekvenciát T7 szekvencáló kit (Pharmacia) és a konstitutív PHO5 (-173) promoter -77. pozíciójánál kezdődő 5' AGTCGAGTAGTATGGC 3' primer segítségével igazoljuk.

DNS szekvencia¹:

5' AAA ATA Tct gca aag gaa aag aag aaa ggg 3' 3' TTT TAT AGA GTG ttc ctt ttc ttc ttt ccc 5' protein: Lys Ile Ser Alá | Lys Glu Lys Lys Lys Gly

19 I 27 inv ss | ST szekvencia szignál és endopeptidáz közötti hasítás helye ¹ a kisbetűk az adaptor szekvenciáját képviselik

HU 212 927 Β

A szekretált ST(Lys₂₇-Cys₄₀₆)-t kifejező expressziós kazetta, mely a konstitutív PHO5(-173) promotert, az invertáz szignál peptidet kódoló DNS-t és a részleges ST cDNS-t tartalmazza, egy 1,35 kb-os SalI(BamHI)-EcoRI fragmensként nyerhető ki a psSTl plazmidból. Az expressziós kazettába a még hiányzó PH05 terminátor szekvenciát a következő klónozási lépésben építjük be.

18. példa

A pDPSTSl expressziós vektor szerkesztése

A szolubilis ST(Lys₂₇-Cys₄₀₆)-t kifejező expressziós vektor előállítására a következő fragmenseket kapcsoljuk össze:

(a) Vektorrész

A pDP34 plazmidot a 3. példában leírtak szerint emésztjük és előkezeljük, hogy a 11,8 kb-os tompa végű-Sall vektor-fragmenst kapjuk.

(b) Expressziós kazetta

A psSTl plazmidot először Sáli emésztéssel (a multiklónozó helyen) linearizáljuk, majd részlegesen emésztjük EcoRI-gyel. Egy 1,35 kb-os DNS-fragmenst izolálunk, mely a konstitutív PHO5(-173) promotert, egy élesztő invertáz szignál peptidet kódoló DNSszekvenciát és a részleges ST cDNS-t kódolja.

(c) A PH05 terminátor szekvencia

A PH05 terminátor szekvenciát a p31 plazmidból izoláljuk, mely a p30 plazmidból állítható elő, amint azt az EO 100 561-ben leírják. A HindHI-mal történő restrikciós emésztés után túlnyúló végeket Klenow polimerázzal betöltjük a korábban leírtak szerint. A plazmidot EcoRI-gyel emésztjük, és egy 0,39 kb-os tompa végű-EcoRI fragmenst izolálunk, amely a PHO5 terminátor szekvenciát hordozza.

Az (a), (b) és (c) fragmensek összeligálását és az E. coli DH5a törzs kompetens sejtjeinek transzformálást a 2. példában leírt módon végezzük. A kapott transzformánsokból plazmidokat izolálunk, és restrikciós analízissel jellemezzük. Az egyik klón plazmidját, melynek helyes restrikciós fragmensei vannak, pDPSTS 1-nek nevezzük el.

19. példa

Szolubilis STILyStf-CyStfx) kifejezése élesztőben

A 4. példához hasonlóan, a CsCl-lel tisztított pDPSTS 1 expressziós vektor DNS-ét alkalmazzuk a Saccharomyces cerevisiae BT 150 és H 449 törzsek transzformálására. Az ura⁺ transzformánsokat izoláljuk és ST-aktivitásra vizsgáljuk. Mindkét esetben kiválasztunk egy transzformánst, és Saccharomyces cerevisiae BT 150/pDPSTS 1-nek, illetve Saccharomyces cerevisiae H 449/pDPSTS 1-nek nevezzük el. Az 13. példában leírt mérőmódszert alkalmazva ST-akti vitást észlelünk mindkét transzformáns tápközegében.

20. példa

A humán HL60 sejtvonalból származó FT cDNS klónozása

Az a(l-3)-fukozil-transzferázt kódoló ELFT (ELAM-1 ligandumú fukozil-transzferáz) publikált cDNSszekvenciája alapján (Goelz, S. E. és tsai (1990) Cell 63, 1349-1356) a következő oligonukleotid-primereket tervezzük meg az ELFT cDNS nyitott leolvasási keretét magábanfoglaló DNS-fragmenst PCR technológiával történő amplifikálására: 5CAGCGCTGCCTGTTCGCGCCAT-3' (ELFT-1B) és 5'-GGAGATGCACAGTAGAGGATCA-3' (ELFT2B). Az ELFT-1B a publikált szekvencia 38-59. bázispárjaihoz, az ELFT-2B a negatív (antisense) szál 1347-1326. bázispárjaihoz illeszkedik. A primereket egy 1,3 kb-os fragmens amplifikálására alkalmazzuk Perkin-Elmer Cetus Taq polimeráz kittel. A friss HL60 cDNS-ből származó fragmens amplifikálását 5% DMSO és 2 mM MgCl₂ jelenlétében végezzük a következő ciklussal: 95 °C 5 perc, 25x(l perc 95 ’C, 1 perc 60 ’C, 1,5 perc 72 ’C), 10x(l perc 95 ’C, 1 perc 60 ’C,1,5 perc + 15 mperc/ciklus 72 ’C)

Az agaróz gél-elektroforézis láthatóvá teszi a feltűnő 1,3 kb-os sávot, melyet ha Smal-gyel és Apaigyei hasítunk, a publikált szekvencia alapján megjósolt mintázatot mutatja. Az 1,3 kb-os sávot GeneClean kittel (Bio 101) tisztítjuk, és a pCRlOOO vektorba (Invitrogen) szubklónozzuk. Egy, a helyes

1,3 kb-os inzertumot tartalmazó egyedi kiónt kiválasztunk, és BRB.ELFT/pCR 1000-13-nak nevezzük el. A vektorba az FT cDNS a T7 promoterhez képest fordított orientációban inzertálódott. Az FT cDNS nyitott leolvasási keretét teljes mértékben szekvenáljuk, és az azonosnak mutatkozik a publikált szekvenciával (SEQ ID NO. 5).

27. példa

Plazmidok szerkesztése a szolubilis FT(Arg₆₂Arg₄₀₅) élesztőben történő indukálható és konstitutív kifejezésére

A szolubilis FT(Arg₆₂-Arg4₀₅)-t a 241. nukleotidpozíciónál (Nrul restrikciós Hely) kezdődő FT cDNSből fejezzük ki úgy, hogy kihagyjuk a citoplazmatikus részt és a membrán-áthidaló domént (lásd ID NO. 5 szekvenciát). A BRB.ELFT/pCR1000-13 plazmidot HindlII-mal emésztjük, amely az FT cDNS-inzert multiklónozó régiójában hasít. A ragadós végeket tompává alakítjuk Klenow DNS-polimerázzal. Egy Xhol linkért (5' CCTGAGG 3', Biolabs) kinázzal kezelünk, anneáljuk, és ligáljuk a plazmid tompa végeihez, a linker 100-szoros moláris feleslege jelenlétében. A reakcióban részt nem vett linkereket a DNS izopropanolos kicsapásával távolítjuk el, és a DNS-t tovább emésztjük Xhol-gyel és Nrul-gyel (a hasítás a SEQ ID NO. 5 szerinti FT cDNS 240. pozíciójánál megy végbe). Az

1,1 kb-os Nrul-Xhol (a) fragmens tartalmazza, az FT cDNS-szekvenciát, amelyből hiányzik a 61. aminosavtól felfelé eső, a citoplazmatikus részt és a membránáthidaló domént kódoló régió.

A p31RIT12 és p31/PHO5(-173)RIT plazmidokat (lásd 2. példa) Sall-gyel és Xhol-gyel emésztjük. A 0,9 kb-os, illetve a Γ,5 kb-os fragmenseket izoláljuk, és Hgal-gyel hasítjuk. A keletkező ragadós végeket Klenow polimerázzal betöltjük. A létrehozott tompa végek illeszkednek az élesztő szignálpeptid-szekvenciáját kó17

HU 212 927 Β doló szekvencia 3' végéhez. A további BamHI hasítás egy 596 bp-os BamHI-tompa végű (b) fragmenst eredményez, mely az indukálható PHO5 promotert és a saját ATG-vel rendelkező invertáz szignál-szekvenciát tartalmazza, illetve egy 234 bp-os BamHI-tompa végű (c) fragmenst, mely a rövid, konstitutív PHO5(-173) promotert és az invertáz szignál-szekvenciáját tartalmazza. A pRITl 2 plazmidot Sáli restrikciós endonukleázzal linearizáljuk. A részleges HindlII emésztés etídium-bromid jelenlétében egy 1 kb-os Sall-Hindül fragmenst eredményez, mely tartalmazza a 276 bp-os Sall-BamHI pBR322 szekvenciát, az 534 bp-os élesztő PHO5 savas foszfatáz promotert, az élesztő invertáz szignál-szekvenciáját (mely 19 aminosavat kódol) és a PHO5 transzkripciós terminátort. p31RIT12 1 kb-os Sall-HindlII fragmensét a pJDB207 élesztő-E. coli ingázó vektorba (Beggs, J. D., Molecular Genetics in yeast, Alfréd Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, 383-389) klónozzuk, melyet Sall-gyel és HindIH-mal emésztettünk. A kapott plazmidot, mely az 1 kb-os inzertet tartalmazza, pJDB207/PHO5-RIT12nek nevezzük el.

ApJDB207/PHO5-RIT12 plazmidot BamHI-val és Xhol-gyel emésztjük, és a nagy 6,8 kb-os BamHIXhol (d) fragmenst izoláljuk. Ez a fragmens tartalmazza a teljes pJDB207 vektor-szekvenciát és a PHO5 transzkripciós terminátort.

Az 596 bp-os BamHI-tompa végű (b) fragmenst, az 1,1 kb-os Nrul-Xhol (a) fragmenst és a 6,8 kb-os Nrul-Xhol (d) vektor-fragmenst egymáshoz ligáljuk a tompavég-ligálás standard feltételeit alkalmazva. A ligációs keverék alikvotjait használjuk kompetens E. coli HB101 sejtek transzformálására. Az ampicillinrezisztens kolóniák plazmid-DNS-ét restrikciós emésztésekkel elemezzük. Egy egyedi kiónt, mely a helyes expressziós plazmidot tartalmazza, pJDB207/PHO5-I-FT-nek nevezzük el. A (c), (a) és (d) fragmensek 'egymáshoz ligálása a pJDB207/PHO5(-173)—I—FT plazmidhoz vezet. Ezen plazmidot expressziós kazettái az invertáz szignálszekvenciát kódoló szekvenciát a szolubilis a(l—3)fukozil-transzferáz leolvasási keretével fuzionálva tartalmazzák, melyek az indukálható PHO5, illetve a konstitutív PHO5(-173) ellenőrzése mellett fejeződnek ki. Az expressziós kazettákat a pJDB207 élesztőE. coli ingázó vektorba klónozzuk, a BamHI és a HindlII restrikciós helyek közé, az invertáz szignálszekvencia és a szolubilis FT-t kódoló cDNS közötti fúziós hely nukleotid-szekvenciáját a kettősszálú plazmid DNS-ének szekvenálásával igazoljuk az 5' AGTCGAGGTTAGTATGGC 3' prímért alkalmazva, mely a PH05, illetve a PHO5(-173) promoter -77 -60. pozíciók nukleotid-szekvenciáját képviseli. A helyes kapcsolódás a következő:

5' AAA ATA TCT GCA CGA CCG GTG 3'

3' TTT TAT AGA CGT GCT GGC CAC 5'

Lys Ile Ser Alá | Arg Pro Val 19 | 62 inv ss | FT a szignálpeptid hasítási helye

22. példa

Plazmidok szerkesztése a membrán-kötött FT indukálható a konstitutív kifejezésére Ezek a konstrukciók az FT cDNS kódoló szekvenciát a saját ATG-jükkel együtt alkalmazzák. Az ATGtől fölfelé (upstream) elhelyezkedő nukleotid-szekvencia magas G-C tartalma miatt meglehetősen kedvezőtlen az élesztőben történő kifejezéshez. Ezt a régiót a PCR eljárással A-T gazdag szekvenciára cseréljük ki.

Ugyanakkor az új -4--9. nukleotid-pozícióba egy

EcoRI restrikciós helyet vezetünk be.

6. táblázat

Primer	5'-3' szekvencia1	Az FT cDNS megfelelő bp-jai
FT1	cgagaaííeataATGGGGG- CACCGTGGGGC	58-75
FT2	ccgctcgagGAGCGCGGCT- TCACCGCTCG	1285-1266

a nagybetűk az FT szekvenciáját, a kisbetűk a járulékos szekvenciákat képviselik, a restrikciós enzimekhelyeit aláhúzással, a „start” és a „stop” kodont vastag betűvel emeltük ki.

Az FT cDNS FT1 és FT2 primerekkel (lásd 6. táblázat) történő amplifikálásához standart PCR körülményeket alkalmazunk a DNS szintézis harminc ciklusában (Taq DNS polimeráz, Perkin-Elmer, 5 egység/μΐ, 1 perc 72 °C-on). Az eredményül kapott 1,25 kb-os DNS-fragmenst fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítjuk, majd EcoRI-gyel, Xholgyel és Nrul-gyel emésztjük. A 191 bp-os (e) fragmenst izoláljuk egy preparatív 4%-os Nusieve 3:1 agaróz gélen (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA), a gélről pH 8,3 Tris-borát pufferral eluláljuk, és etanollal kicsapjuk. Az (e) fragmens tartalmazza az 1-61. aminosavakat kódoló FT gén 5' részt. A DNS tartalmaz egy 5' meghosszabbítást az FT1 PCR primerben megtalálható EcoRI hellyel.

A pRIT 12 és p31/PHO5(-173)RIT plazmidokat EcoRI-gyel és Xhol-gyel emésztjük. A nagy vektorfragmenseket (f, illetve g) 0,8%-os agaróz gélen izoláljuk, eluáljuk és tisztítjuk. A 4,1 kb-os XhoI-EcoRI (f) fragmens tartalmazza a pBR322 eredetű vektorrészt, z 534 bp-os PHO5 promotert (3' EcoRI hely) és 131 bpos PHO5 promoter (5' Xhol hely) A 3,7 kb-os XholEcoRI(g) fragmens csak abban különbözik ettől, hogy a rövid, konstitutív 172 bp-os PHO5(-173)promotert (EcoRI hely) tartalmazza a teljes hosszúságú PHO5 promoter helyett.

A 191 bp-os EcoRI-NruI (e) fragmenst, az 1,1 kbos Nrul-Xhol (a) fragmenst és a 4,1 kb-os Xhol-EcoRI (f) fragmenst ligáljuk. A ligációs elegy 1 μΙ-es alikvotját használjuk a kompetens E. coli HB101 sejtek transzformálására. Az ampicillin-rezisztens kolóniák plazmid-DNS-ét elemezzük. Egy egyedi klón plazmidDNS-ét p31R/PHO5-ssFT-nek nevezzük el.

Az (e), (a) és (g) fragmensek ligálása a p31R/PHO5(-173)-ssFT-hez vezet.

HU 212 927 Β ezek a plazmidok a membrán-kötött FT-kódoló szekvenciát tartalmazzák az indukálható PHO5, illetve a konstitutív PHO5(-173) promoter ellenőrzése mellett.

23. példa 5

Az FT expressziós kazetták klónozása a pDP34-be

A p31R/PHO5-ssFT és a _P31R/PHO5(-173)-ssFT plazmidokat HindlII-mal emésztjük, ami a PHO5 transzkripciós terminátor 3' végénél hasít. A Klenow polimerizációs reakció után a DNS-t Sall-gyel emésztjük. Izoláljuk a 2,3 kb-os, illetve az 1,9 kb-os Salltompa végű fragmenseket.

A pJDB207-PHO5-I-FT és a pJDB207/PHO5 (-173)-I-FT plazmidokat részlegesen emésztjük HindlII-mal 0,1 mg/ml etídium-bromid jelenlétében, (hogy elkerüljük az invertáz szignál-szekvenciájában levő to10 vábbi HindlII hely hasadását), és ezután a fentebb leírt módon kezeljük Klenow polimerázzal és Sall-gyel. A

2,1 kb-os, illetve az 1,8 kb-os fragmenseket izoláljuk.

Mind a négy DNS-fragmenst a 11,8 kb-os Salltompa végű pDP34 vektor-fragmenshez (lásd a 3. példát) ligáljuk. A kompetens E. coli HB 101 sejtek transzformációja és az egyedi transzformánsok plazmid-analízise után négy helyesen kifejeződő plazmidot _PDP34/PHO5-I-FT-nek, _PDP34/PHO5(-173)-I-FTnek, _PDP34R/PHO5-ssFT-nek és pDP34R/PHO5 (-173)-ssFT-nek nevezünk el.

A S. cerevisiae BT 150 és H 449 törzseket mind a négy expressziós plazmid 5 pg-jával transzformáljuk a 4. példának megfelelően. Egyedi transzformált élesztő kolóniákat választunk ki és a következőképpen nevezzük el:

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

BT 150/pDP34/PHO5-I-FT;

BT 150/pDP34/PHO5(173)-I-FT;

BT 150/pDP34/PHO5-ssFT;

BT150/pDP34R/PHO5(-173)-ssFT;

H449/pDP34/PHO5-I-FT;

H449/pDP34/PHO5(-l 73)-I-FT;

H449/pDP34R/PHO5-ss-FT;

H449/pDP34R/PHO5(-173)-ssFT

A fermentációt és a sejtkivonatok készítését az 5. példa szerint végezzük. Az FT aktivitás mérésére a Goelz és tsai által (fentebb) leírt méréssel analóg eljárást alkalmazunk, és FT-aktivitást találunk a 30 BT150/pDP34R/PHO5-ssFT, BT150/pDP34R/PHO5 (-173)-ssFT, H449/pDP34R/PHO5-ssFT,

H449/pDP34R/PHO5(-173)-ssFT törzsekből előállított nyers kivonatokban, és a H449/pDP34/PHO5-I-FT, H449/pDR34/PHO5(-173)-I-FT, 35

BT150/pDP34/PH05-I-FT és T150/pDP34/PHO5(173)-1-FT törzsek tápközegében.

Mikroorganizmusok deponálása

A következő mikroorganizmus törzseket deponál- 40 tűk a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-nél (DSM), Mascheroder Weg 16, D—3300 Braunschweig (a deponálás dátumát és számát megadjuk):

Escherichia coli JM109/pDP34: 1988. 03. 14., DSM 4473 45

Escherichia coli HB100/p30: 1987. 10. 23., DSM 4297 Escherichia coli HB101/p31R: 1988. 12. 19., DSM 5116

Saccharomyces cerevisiae H449: 1988. 2. 18., DSM 4413 50

Saccharomyces cerevisiae BT 150: 1991. 5. 23., DSM 6530

Szekvencialista

SEQIDNO. 1

SZEKVENCIATÍPUS: nukleotid és a megfelelő protein

SZEKVENCIAHOSSZ: 1256bp SZÁLTÍPUS: kétszálú TOPOLÓGIA: lineáris MOLEKULATÍPUS: rekombináns KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: p4AD113 plazmid az E. coli DH5a/p4ADl 13-ból

JELLEMZŐ: 6-1200. bp	HeLa sejt galaktozil-transz-
	ferázát kódoló cDNS
1-6. bp	EcoRI hely
497-504. bp	NotI hely
1227-1232. bp	EcoRI hely
1236-1Ϊ41. bp	EcoRV hely
1243-1248. bp	BglII hely

TULAJDONSÁGAI: A p4AD113 plazmid EcoRIHindlII fragmense tartalmazza a teljes hosszúságú galaktozil-transzferázt (EC 2.4.1.22) kódoló HeLa cDNS-t.

GAATTC ATG AGG CTT CGG Met Arg Leu Arg

GCC	GCG	ATG	CCA	GGC
Alá	Alá	Met	Pro 15	Gly
CTG	CTC	GTG	GCC	GTC
Leu 25	Leu	Val	Alá	Val

GAG CCG CTC CTG AGC GGC AGC Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser

GCG	TCC	CTA	CAG	CGG
Alá	Ser	Leu	Gin 20	Arg
TGC	GCT	CTG	CAC	CTT
Cys 30	Alá	Leu	His	Leu

GCC Alá	10 TGC Cys	CGC Arg	78
GGC	GTC	ACC	117
Gly	Val	Thr
35

HU 212 927 Β

CTC

GTT

TAC

TAC

CTG

GCT GGC

CGC

GAC

CTG

AGC

CGC

CTG

156

Leu

Val

Tyr

Tyr

Leu

Alá

Gly

Arg

Asp

Leu

Ser

Arg

Leu

40

45

50

CCC

CAA

CTG

GTC

GGA

GTC

TCC

ACA

CCG

CTG

CAG

GGC

GGC

195

Pro

Gin

Leu

Val

Gly

Val

Ser

Thr

Pro

Leu

Gin

Gly

Gly

55

60

TCG

AAC

AGT

GCC

GCC

GCC

ATC

GGG

CAG

TCC

TCC

GGG

GAG

234

Ser

Asn

Ser

Alá

Alá

Alá

Ile

Gly

Gin

Ser

Ser

Gly

Glu

65

70

75

CTC

CGG

ACC

GGA

GGG

GCC

CGG

CCG

CCG

CCT

CCT

CTA

GGC

273

Leu

Arg

Thr

Gly

Gly

Alá

Arg

Pro

Pro

Pro

Pro

Leu

Gly

80

85

GCC

TCC

TCC

CAG

CCG

CGC

CCG

GGT

GGC

GAC

TTC

AGC

CCA

312

Alá

Ser

Ser

Gin

Pro

Arg

Pro

Gly

Gly

Asp

Ser

Ser

Pro

90

95

100

GTC

GTG

GAT

TCT

GGC

CCT

GGC

CCC

GCT

AGC

AAC

TTG

ACC

351

Val

Val

Asp

Ser

Gly

Pro

Gly

Pro

Alá

Ser

Asn

Leu

Thr

105

110

115

TCG

GTC

CCA

GTG

CCC

CAC

ACC

ACC

GCA

CTG

TCG

CTG

CCC

390

Ser

Val

Pro

Val

Pro

His

Thr

Thr

Alá

Leu

Ser

Leu

Pro

120

125

GCC

TGC

CCT

GAG

GAG

TCC

CCG

CTG

CTT

GTG

GGC

CCC

ATG

429

Alá

Cys

Pro

Glu

Glu

Ser

Pro

Leu

Leu

Val

Gly

Pro

Met

120

135

140

CTG

ATT

GAG

TTT

AAC

ATG

CCT

GTG

GAC

CTG

GAG

CTC

GTG

468

Leu

Ile

Glu

Phe

Asn

Met

Pro

Val

Asp

Leu

Glu

Leu

Val

145

150

GCA

AAG

CAG

AAC

CCA

AAT

GTG

AAG

ATG

GGC

GGC

CGC

TAT

507

Alá

Lys

Gin

Asn

Pro

Asn

Val

Lys

Met

Gly

Gly

Arg

Tyr

155

160

165

GCC

CCC

AGG

GAC

TGC

GTC

TCT

CCT

CAC

AAG

GTG

GCC

ATC

546

Alá

Pro

Arg

Asp

Cys

Val

Ser

Pro

His

Lys

Val

Alá

Ile

170

175

180

ATC

ATT

CCA

TTC

CGC

AAC

CGG

CAG

GAG

CAC

CTC

AAG

TAC

585

Ile

Ile

Pro

Phe

Arg

Asn

Arg

Gin

Glu

His

Leu

Lys

Tyr

185

190

TGG

CTA

TAT

TAT

TTG

CAC

CCA

GTC

CTG

CAG

CGC

CAG

CAG

624

Trp

Leu

Tyr

Tyr

Xeu

His

Pro

Val

Leu

Gin

Arg

Gin

Gin

195

200

205

CTG

GAC

TAT

GGC

ATC

TAT

GTT

ATC

AAC

CAG

GCG

GGA

GAC

663

Leu

Asp

Tyr

Gly

Ile

Tyr

Val

Ile

Asn

Gin

Alá

Gly

Asp

210

215

ACT

ATA

TTC

AAT

CGT

GCT

AAG

CTC

CTC

AAT

GTT

GGC

TTT

702

Thr

Ile

Phe

Asn

Arg

Alá

Lys

Leu

Leu

Asn

Val

Gly

Phe

220

225

230

CAA

GAA

GCC

TTG

AAG

GAC

TAT

GAC

TAC

ACC

TGC

TTT

GTG

741

Gin

Glu

Alá

Leu

Lys

Asp

Tyr

Asp

Tyr

Thr

Cys

Phe

Val

235

240

245

TTT

AGT

GAC

GTG

GAC

CTC

ATT

CCA

ATG

AAT

GAC

CAT

AAT

780

Phe

Ser

Asp

Val

Asp

Leu

Ile

Pro

Met

Asn

Asp

His

Asn

250

255

GCG

TAC

AGG

TGT

TTT

TCA

CAG

CCA

CGG

CAC

ATT

TCC

GTT

819

Alá

Tyr

Arg

Cys

Phe

Ser

Gin

Pro

Arg

His

Ile

Ser

Val

260

265

270

GCA

ATG

GAT

AAG

TTT

GGA

TTC

AGC

CTA

CCT

TAT

GTT

CAG

858

Alá

Met

Asp

Lys

Phe

Gly

Phe

Ser

Leu

Pro

Tyr

Val

Gin

275

280

TAT

TTT

GGA

GGT

GTC

TCT

GCT

CTA

AGT

AAA

CAA

CAG

TTT

897

Tyr

Phe

Gly

Gly

Val

Ser

Alá

Leu

Ser

Lys

Gin

Gin

Phe

285

290

295

HU 212 927 Β

CTA

ACC

ATC

AAT

GGA

TTT

CCT

AAT

AAT

TAT

TGG

GGC

TGG

936

Leu

Thr

Ile

Asn

Gly

Phe

Pro

Asn

Asn

Tyr

Trp

Gly

Trp

300

305

310

GGA

GGA

GAA

GAT

GAT

GAC

ATT

TTT

AAC

AGA

TTA

GTT

TTT

975

Gly

Gly

Glu

Asp

Asp

Asp

Ile

Phe

Asn

Arg

Leu

Val

Phe

315

320

AGA

GGC

ATG

TCT

ATA

TCT

CGC

CCA

AAT

GCT

GTG

GTC

GGG

1014

Arg

Gly

Met

Ser

Ile

Ser

Arg

Pro

Asn

Alá

Val

Val

Gly

325

330

335

AGG

TGT

CGC

ATG

ATC

CGC

CAC

TCA

AGA

GAC

AAG

AAA

AAT

1053

Arg

Cys

Arg

Met

Ile

Arg

His

Ser

Arg

Asp

Lys

lys

Asn

340

345

GAA

CCC

AAT

CCT

CAG

AGG

TTT

GAC

CGA

ATT

GCA

CAC

ACA

1092

Glu

Pro

Asn

Pro

Gin

Arg

Phe

Asp

Arg

Ile

Alá

His

Thr

350

355

360

AAG

GAG

ACA

ATG

CTC

TCT

GAT

GGT

TTG

AAC

TCA

CTC

ACC

1131

Lys

Glu

Thr

Met

Leu

Ser

Asp

Gly

Leu

Asn

Ser

Leu

Thr

365

370

375

TAC

CAG

GTG

CTG

GAT

GTA

CAG

AGA

TAC

CCA

TTG

TAT

ACC

1170

Tyr

Gin

Val

Leu

Asp

Val

Gin

Arg

Tyr

Pro

Leu

Tyr

Thr

380

385

CAA

ATC

ACA

GTG

GAC

ATC

GGG

ACA

CCG

AGC

TAGGACTTTT

1210

Gin

Ile

Thr

Val

Asp

Ile

Gly

Thr

Pro

Ser

390

395

GGTACAGGTA AAGACTGAAT TCATCGATAT CTAGATCTCG 1250

AGCTCGCGAA AGCTT 1265

SEQ ID NO. 2

SZEKVENCIATÍPUS: protein SZEKVENCIAHOSSZ: 357 aminosav

MOLEKULATÍPUS: a teljes hosszúságú HeLa sejt galaktozil-transzferázának C-terminális fragmense TULAJDONSÁGAI: HeLa sejtből származó szolubilis galaktozil-transzferáz (EC 2.4.1.22)

Leu

Alá

Gly

Arg

Asp c

Leu

Ser

Arg

Leu

Pro

Gin

Leu

Val

□ Gly

Val

Ser

Thr

Pro

Leu

Gin

Gly

Gly

10

15

20

Ser

Asn

Ser

Alá

Alá

Alá

Ile

Gly

Gin

Ser

Ser

Gly

Glu

25

30

35

Leu

Arg

Thr

Gly

Oly

Alá

Arg

Pro

Pro

Pro

Pro

Leu

Gly

40

45

Alá

Ser

Ser

Gin

Pro

Arg

Pro

Gly

Gly

Asp

Ser

Ser

Pro

50

55

60

Val

Val

Asp

Ser

Gly

Pro

Gly

Pro

Alá

Ser

Asn

Leu

Thr

65

70

Ser

Val

Pro

Val

Pro

His

Thr

Thr

Alá

Leu

Ser

Leu

Pro

75

80

85

Alá

Cys

Pro

Glu

Glu

Ser

Pro

Leu

Leu

Val

Gly

Pro

Met

90

95

100

Leu

Ile

Glu

Phe

Asn

Met

Pro

Val

Asp

Leu

Glu

Leu

Val

105

110

Alá

Lys

Gin

Asn

Pro

Asn

Val

Lys

Met

Gly

Gly

Arg

Tyr

115

120

125

Alá

Pro

Arg

Asp

Cys

Val

Ser

Pro

His

Lys

Val

Alá

Ile

130

135

Ile

Ile

Pro

Phe

Arg

Asn

Arg

Gin

Glu

His

Leu

Lys

Tyr

140

145

150

Trp

Leu

Tyr

Tyr

Leu

His

Pro

Val

Leu

Gin

Arg

Gin

Gin

155

160

165

Leu

Asp

Tyr

Gly

Ile

Tyr

Val

Ile

Asn

Gin

Alá

Gly

Asp

170

175

HU 212 927 Β

Thr

Ile 180

Phe

Asn Arg

Ala

Lys 185

Leu

Leu

Asn

Val

Gly 190

Phe

Gin

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

Tyr

Asp

Tyr

Thr

Cys

Phe

Val

195

200

Phe

Ser

Asp

Val

Asp

Leu

Xle

Pro

Met

Asn

Asp

His

Asn

205

210

215

Ala

Tyr

Arg

Cys

Phe

Ser

Gin

Pro

Arg

His

Ile

Ser

Val

220

225

230

Ala

Met

Asp

Lys

Phe

Gly

Phe

Ser

Leu

Pro

Tyr

Val

Gin

235

240

Tyr

Phe

Gly

Gly

Val

Ser

Ala

Leu

Ser

Lys

Gin

Gin

Phe

245

250

255

Leu

Thr

Ile

Asn

Gly

Phe

Pro

Asn

Asn

Tyr

Trp

Gly

Trp

260

265

Gly

Gly

Glu

Asp

Asp

Asp

Ile

Phe

Asn

Arg

Leu

Val

Phe

270

275

280

Arg

Gly

Met

Ser

Ile

Ser

Arg

Pro

Asn

Ala

Val

Val

Gly

285

290

295

Arg

Cys

Arg

Met

Ile

Arg

His

Ser

Arg

Asp

Lys

Lys

Asn

300

305

Glu

Pro

Asn

Pro

Gin

Arg

Phe

Asp

Arg

Ile

Ala

His

Thr

310

315

320

Lys

Glu

Thr

Met

Leu

Ser

Asp

Gly

Leu

Asn

Ser

Leu

Thr

325

330

Tyr

Gin

Val

Leu

Asp

Val

Gin

Arg

Tyr

Pro

Leu

Tyr

Thr

335

340

345

Gin

Ile

Thr

Val

Asp

Ile

Gly

Thr

Pro

Ser

350

355

SEQ ID NO. 3

SZEKVENCIATÍPUS: nukleotid a neki megfelelő proteinnel

SZEKVENCIAHOSSZ: 1246 bp

SZÁLTÍPUS: kétszálú

TOPOLÓGIA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: rekombináns

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: A pSIA2 plazmid az E. coli DH5a/PSIA2-ből JELLEMZŐI: 15-1232. bp a HepG2 sejt szialil-transzferázát kódoló cDNS szekvencia

1-6. bp PstI hely

6-11. bp EcoRI hely 144-149. bp EcoRI hely 1241-1246. bp BamHI hely

TULAJDONSÁGAI: a PSIA2 plazmid Pstl-BamHI fragmense, amely a teljes hosszúságú szialil-transzferázt (EC 2.4.99.1) kódoló HepG2 cDNS-t tartalmazza

CTGCAGAATT CAAA ATG ATT CAC ACC AAC

CTG AAG AAA

38

Met

Ile

His

Thr

Asn c

Leu

Lys

Lys

AAG

TTC

AGC

TGC

□ TGC

GTC

CTG

GTC

TTT

CTT

CTG

TTT

GCA

77

Lys

Phe

Ser

Cys

Cys

Val

Leu

Val

Phe

Leu

Leu

Phe

Ala

10

15

20

GTC

ATC

TGT

GTG

TGG

AAG

GAA

AAG

AAG

AAA

GGG

AGT

TAC

116

Val

Ile

Cys

Val

Trp

Lys

Glu

Lys

Lys

Lys

Gly

Ser

Tyr

25

30

TAT

GAT

TCC

TTT

AAA

TTG

CAA

ACC

AAG

GAA

TTC

CAG

GTG

155

Tyr

Asp

Ser

Phe

Lys

Leu

Gin

Thr

Lys

Glu

Phe

Gin

Val

35

40

45

TTA

AAG

AGT

CTG

GGG

AAA

TTG

GCC

ATG

GGG

TCT

GAT

TCC

194

Leu

Lys

Ser

Leu

Gly

Lys

Leu

Ala

Met

Gly

Ser

Asp

Ser

50

55

60

CAG

TCT

GTA

TCC

TCA

AGC

AGC

ACC

CAG

GAC

CCC

CAC

AGG

233

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Gin

Asp

Pro

His

Arg

65

70

HU 212 927 Β

GGC

CGC

CAG

ACC

CTC GGC AGT CTC AGA GGC

CTA

GCC

AAG

272

Gly

Arg

Gin

Thr

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Gly

Leu

Alá

Lys

75

80

85

GCC

AAA

CCA

GAG

GCC

TCC

TTC

CAG

GTG

TGG

AAC

AAG

GAC

311

Alá

Lys

Pro

Glu

Alá

Ser

Phe

Gin

Val

Trp

Asn

Lys

Asp

90

95

AGC

TCT

TCC

AAA

AAC

CTT

ATC

CCT

AGG

CTG

CAA

AAG

ATC

250

Ser

Ser

Ser

Lys

Asn

Leu

Ile

Pro

Arg

Leu

Gin

Lys

Ile

100

105

110

TGG

AAG

AAT

TAC

CTA

AGC

ATG

AAC

AAG

TAC

AAA

GTG

TCC

389

Trp

Lys

Asn

Tyr

Leu

Ser

Met

Asn

Lys

Tyr

Lys

Val

Ser

115

120

125

TAC

AAG

GGG

CCA

GGA

CCA

GGC

ATC

AAG

TTC

AGT

GCA

GAG

428

Tyr

Lys

Gly

Pro

Gly

Pro

Gly

Ile

Lys

Phe

Ser

Alá

Glu

130

135

GCC

CTG

CGC

TGC

CAC

CTC

CGG

GAC

CAT

GTG

AAT

GTA

TCC

467

Alá

Leu

Arg

Cys

His

Leu

Arg

Asp

His

Val

Asn

Val

Ser

140

145

150

ATG

GTA

GAG

GTC

ACA

GAT

TTT

CCC

TTC

AAT

ACC

TCT

GAA

506

Met

Val

Glu

Val

Thr

Asp

Phe

Pro

Phe

Asn

Thr

Ser

Glu

155

160

TGG

GAG

GGT

TAT

CTG

CCC

AAG

GAG

AGC

ATT

AGG

ACC

AAG

545

Trp

Glu

Gly

Tyr

Leu

Pro

Lys

Glu

Ser

Ile

Arg

Thr

Lys

165

170

175

GCT

GGG

CCT

TGG

GGC

AGG

TGT

GCT

GTT

GTG

TCG

TCA

GCG

584

Alá

Gly

Pro

Trp

Gly

Arg

Cys

Alá

Val

Val

Ser

Ser

Alá

180

185

190

GGA

TCT

CTG

AAG

TCC

TCC

CAA

CTA

GGC

AGA

GAA

ATC

GAT

623

Gly

Ser

Leu

Lys

Ser

Ser

Gin

Leu

Gly

Arg

Glu

Ile

Asp

195

200

GAT

CAT

GAC

GCA

GTC

CTG

AGG

TTT

AAT

GGG

GCA

CCC

ACA

662

Asp

His

Asp

Alá

Val

Leu

Arg

Phe

Asn

Gly

Alá

Pro

Thr

205

210

215

GCC

AAC

TTC

CAA

CAA

GAT

GTG

GGC

ACA

AAA

ACT

ACC

ATT

701

Alá

Asn

Phe

Gin

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Lys

Thr

Thr

Ile

220

225

CGC

CTG

ATG

AAC

TCT

CAG

TTG

GTT

ACC

ACA

GAG

AAG

CGC

740

Arg

Leu

Met

Asn ‘Ser

Gin

Leu

Val

Thr

Thr

Glu

Lys

Arg

230

235

240

TTC

CTC

AAA

GAC

AGT

TTG

TAC

AAT

GAA

GGA

ATC

CTA

ATT

779

Phe

Leu

Lys

Asp

Ser

Leu

Tyr

Asn

Glu

Gly

Ile

Leu

Ile

245

250

255

GTA

TGG

GAC

CCA

TCT

GTA

TAC

CAC

TCA

GAT

ATC

CCA

AAG

818

Val

Trp

Asp

Pro

Ser

Val

Tyr

His

Ser

Asp

Ile

Pro

Lys

260

265

TGG

TAC

CAG

AAT

CCG

GAT

TAT

AAT

TTC

TTT

AAC

AAC

TAC

857

Trp

Tyr

Gin

Asn

Pro

Asp

Tyr

Asn

Phe

Phe

Asn

Asn

Tyr

270

275

280

AAG

ACT

TAT

CGT

AAG

CTG

CAC

CCC

AAT

CAG

CCC

TTT

TAC

896

Lys

Thr

Tyr

Arg

Lys

Leu

His

Pro

Asn

Gin

Pro

Phe

Tyr

285

290

ATC

CTC

AAG

CCC

CAG

ATG

CCT

TGG

GAG

CTA

TGG

GAC

ATT

935

Ile

Leu

Lys

Pro

Gin

Met

Pro

Trp

Glu

Leu

Trp

Asp

Ile

295

300

305

CTT

CAA

GAA

ATC

TCC

CCA

GAA

GAG

ATT

CAG

CCA

AAC

CCC

974

Leu

Gin

Glu

Ile

Ser

Pro

Glu

Glu

Ile

Gin

Pro

Asn

Pro

310

315

320

CCA

TCC

TCT

GGG

ATG

CTT

GGT

ATC

ATC

ATC

ATG

ATG

ACG

1013

Pro

Ser

Ser

Gly

Met

Leu

Gly

Ile

Ile

Ile

Met

Met

Thr

325 330

HU 212 927 Β

CTG

TGT

GAC

CAG

GTG

GAT

ATT

TAT

GAG

TTC

CTC

CCA

TCC

1052

Leu

Cys

Asp

Gin

Val

Asp

Ile

Tyr

Glu

Phe

Leu

Pro

Ser

335

340

345

AAG

CGC

AAG

ACT

GAC

GTG

TGC

TAC

TAC

TAC

CAG

AAG

TTC

1091

Lys

ARg

Lys

Thr

Asp

Val

Cys

Tyr

Tyr

Tyr

Gin

Lys

Phe

350

355

TTC

GAT

AGT

GCC

TGC

ACG

ATG

GGT

GCC

TAC

CAC

CCG

CTG

1130

Phe

Asp

Ser

Alá

Cys

Thr

Met

Gly

Alá

Tyr

His

Pro

Leu

360

365

370

CTC

TAT

GAG

AAG

AAT

TTG

GTG

AAG

CAT

CTC

AAC

CAG

GGC

1169

Leu

Tyr

Glu

Lys

Asn

Leu

Val

Lys

His

Leu

Asn

Gin

Gly

375

380

385

ACA

GAT

GAG

GAC

ATC

TAC

CTG

CTT

GGA

AAA

GCC

ACA

CTG

1208

Thr

Asp

Glu

Asp

Ile

Tyr

Leu

Leu

Gly

Lys

Alá

Thr

Leu

390

395

CCT

GGC

TTC

CGG

ACC

ATT

CAC

TGC

TAAGCACAGG ATCC

1246

Pro

Gly

Phe

Arg

Thr

Ile

His

Cys

400

405

SEQID NO. 4

SZEKVENCIATÍPUS: protein

SZEKVENCIAHOSSZ: 368 aminosav

MOLEKULATÍPUS: a teljes hosszúságú szialil-transzferáz C-terminális fragmense TULAJDONSÁGAI: humán HepG2 sejtekből származó szolubilis szialil-transzferáz

Lys

Leu

Gin

Thr

Lys c

Glu

Phe

Gin

Val

Leu

Lys

Ser

Leu

□ Gly

Lys

Leu

Alá

Met

Gly

Ser

Asp

Ser

10

15

20

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Gin

Asp

Pro

His

Arg

25

30

35

Gly

Arg

Gin

Thr

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Gly

Leu

Alá

Lys

40

45

Alá

Lys

Pro

Glu

Alá

Ser

Phe

Gin

Val

Trp

Asn

Lys

Asp

50

55

60

Ser

Ser

Ser

Lys

Asn

Leu

Ile

Pro

Arg

Leu

Gin

Lys

Ile

65

70

Trp

Lys

Asn

Tyr

Leu

Ser

Met

Asn

Lys

Tyr

Lys

Val

Ser

75

80

85

Tyr

Lys

Gly

Pro

Gly

Pro

Gly

Ile

Lys

Phe

Ser

Alá

Glu

90

95

100

Alá

Leu

Arg

Cys

His

Leu

Arg

Asp

His

Val

Asn

Val

Ser

105

110

Met

Val

Glu

Val

Thr

Asp

Phe

Pro

Phe

Asn

Thr

Ser

Glu

115

120

125

Trp

Glu

Gly

Tyr

Leu

Pro

Lys

Glu

Ser

Ile

Arg

Thr

Lys

130

135

f

Alá

Gly

Pro

Trp

Gly

Arg

Cys

Alá

Val

Val

Ser

Ser

Alá

140

145

150

Gyl

Ser

Leu

Lys

Ser

Ser

Gin

Leu

Gly

Arg

Glu

Ile

Asp

155

160

165

Asp

His

Asp

Alá

Val

Leu

Arg

Phe

Asn

Gly

Alá

Pro

Thr

170

175

Alá

Asn

Phe

Gin

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Lys

Thr

Thr

Ile

180

185

190

Arg

Leu

Met

Asn

Ser

Gin

Leu

Val

Thr

Thr

Glu

Lys

Arg

195

200

Phe

Leu

Lys

Asp

Ser

Leu

Tyr

Asn

Glu

Gly

Ile

Leu

Ile

205

210

215

Val

Trp

Asp

Pro

Ser

Val

Tyr

His

Ser

Asp

Ile

Pro

Lys

220

225

230

HU 212 927 Β

Trp Tyr Gin

Asn Pro Asp 235

Tyr

Asn

Phe

Phe Asn 240

Asn Tyr

Lys

Thr

Tyr

Arg

Lys

Leu

His

Pro

Asn

Gin

Pro

Phe

Tyr

245

250

255

Ile

Leu

Lys

Pro

Gin

Met

Pro

Trp

Glu

Leu

Trp

Asp

Ile

260

265

Leu

Gin

Glu

Ile

Ser

Pro

Glu

Glu

Ile

Gin

Pro

Asn

Pro

270

275

280

Pro

Ser

Ser

Gly

Met

Leu

Gly

Ile

Ile

Ile

Met

Met

Thr

285

290

295

Leu

Cys

Asp

Gin

Val

Asp

Ile

Tyr

Glu

Phe

Leu

Pro

Ser

300

305

Lys

Arg

Lys

Thr

Asp

Val

Cys

Tyr

Tyr

Tyr

Gin

Lys

Phe

310

315

320

Phe

Asp

Ser

Alá

Cys

Thr

Met

Gly

Alá

Tyr

His

Pro

Leu

325

330

Leu

Tyr

Glu

Lys

Asn

Leu

Val

Lys

His

Leu

Asn

Gin

Gly

335

340

345

Thr

Asp

Glu

Asp

Ile

Tyr

Leu

Leu

Gly

Lys

Alá

Thr

Leu

350

355

360

Pro

Gly

Phe

Arg

Thr

Ile

His

Cys

365

SEQ ID NO. 5

SZEKVENCIATÍPUS: nukleotid-szekvencia a neki megfelelő proteinnel SZEKVENCIAHOSSZ: 1400 bp SZÁLTÍPUS: kétszálú TOPOLÓGIA: lineáris

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: BRB.ELFT/pCR1000-13

JELLEMZŐI: 58-1272. bp humán a(l-3)fukozil-transzferázt kódoló cDNS-szekvencia

238-243. bp Nrul hely

TULAJDONSÁGAI: a teljes hosszúságú a(l-3)fukozil-transzferázt kódoló HL60 cDNS CGCTCCTCCA CGCCTGCGGA CGCGTGGCGA GCGGAGGCAG CGCTGCCTGT 50

TCGCGCC ATG GGG GCA

CCG TGG GGC TCG

CCG ACG Pro Thr

GCG Alá 10

GCG Alá

90

Met Gly

Alá

Pro Trp 5

Gly

Ser

GCG

GGC

GGG

CGG

CGC

GGG

TGG

CGC

CGA

GGC

CGG

GGG

CTG

129

Alá

Gly

Gly

Arg

Arg

Gly

Trp

Arg

Arg

Gly

Arg

Gly

Leu

15

*

20

CCA

TGG

ACC

GTC

TGT

GTG

CTG

GCG

GCC

GCC

GGC

TTG

ACG

168

Pro

Trp

Thr

Val

Cys

Val

Leu

Alá

Alá

Alá

Gly

Leu

Thr

25

30

35

TGT

ACG

GCG

CTG

ATC

ACC

TAC

GCT

TGC

TGG

GGG

CAG

CTG

207

Cys

Thr

Alá

Leu

Ile

Thr

Tyr

Alá

Cys

Trp

Gyl

Gin

Leu

40

45

50

CCG

CCG

CTG

CCC

TGG

GCG

TCG

CCA

ACC

CCG

TCG

CGA

CCG

246

Pro

Pro

Leu

Pro

Trp

Alá

Ser

Pro

Thr

Pro

Ser

Arg

Pro

55

60

GTG

GGC

GTG

CTG

CTG

TGG

TGG

GAG

CCC

TTC

GGG

GGG

CGC

285

Val

Gly

Val

Leu

Leu

Trp

Trp

Glu

Pro

Phe

Gly

Gly

Arg

65

70

75

GAT

AGC

GCC

CCG

AGG

CCG

CCC

CCT

GAC

TGC

CGG

CTG

CGC

324

Asp

Ser

Alá

Pro

Arg

Pro

Pro

Pro

Asp

Cys

Arg

Leu

ARg

80

85

TTC

AAC

ATC

AGC

GGC

TGC

CGC

CTG

CTC

ACC

GAC

CGC

GCG

363

Phe

Asn

Ile

Ser

Gly

Cys

Arg

Leu

Leu

Thr

Asp

Arg

Alá

90

95

100

TCC

TAC

GGA

GAG

GCT

CAG

GCC

GTG

CTT

TTC

CAC

CAC

CGC

402

Ser

Tyr

Gly

Glu

Alá

Gin

Alá

Val

Leu

Phe

His

His

Arg

105

110

115

HU 212 927 Β

GAC

CTC

GTG

AAG

GGG

CCC

CCC

GAC

TGG

CCC

CCG

CCC

TGG

441

Asp

Leu

Val

Lys

Gly 120

Pro

Pro

Asp

Trp

Pro 125

Pro

Pro

Trp

GGC

ATC

CAG

GCG

CAC

ACT

GCC

GAG

GAG

GTG

GAT

CTG

CGC

480

Gly

Ile 130

Gin

Alá

His

Thr

Alá 135

Glu

Glu

Val

Asp

Leu 140

Arg

GTG

TTG

GAC

TAC

GAG

GAG

GCA

GCG

GCG

GCG

GCA

GAA

GCC

519

Val

Leu

Asp

Tyr 145

Glu

Glu

Alá

Alá

Alá 150

Alá

Alá

Glu

Alá

CTG

GCG

ACC

TCC

AGC

CCC

AGG

CCC

CCG

GGC

CAG

CGC

TGG

558

Leu 155

Alá

Thr

Ser

Ser

Pro 160

Arg

Pro

Pro

Gly

Gin 165

Arg

Trp

GTT

TGG

ATG

AAC

TTC

GAG

TCG

CCC

TCG

CAC

TCC

CCG

GGG

597

Val

Trp

Met 170

Asn

Phe

Glu

Ser

Pro 175

Ser

His

Ser

Pro

Gly 180

CTG

CGA

AGC

CTG

GCA

AGT

AAC

CTC

TTC

AAC

TGG

ACG

CTC

636

Leu

Arg

Ser

Leu

Alá 185

Ser

Asn

Leu

Phe

Asn 190

Trp

Thr

Leu

TCC

TAC

CGG

GCG

GAC

TCG

GAC

GTC

TTT

GTG

CCT

TAT

GGC

675

Ser

Tyr 195

Arg

Alá

Asp

Ser

Asp 200

Val

Phe

Val

Pro

Tyr 205

Gly

TAT

CTC

TAC

CCC

AGA

AGC

CAC

CCC

GGC

GAC

CCG

CCC

TCA

714

Tyr

Leu

Tyr

Pro 210

Arg

Ser

His

Pro

Gly 215

Asp

Pro

Pro

Ser

GGC

CTG

GCC

CCG

CCA

CTG

TCC

AGG

AAA

CAG

GGG

CTG

GTG

753

Gly 220

Leu

Alá

Pro

Pro

Leu 225

Ser

Arg

Lys

Gin

Gly 230

Leu

Val

GCA

TGG

GTG

GTG

AGC

CAC

TGG

GAC

GAG

CGC

CAG

GCC

CGG

792

Alá

Trp

Val 235

Val

Ser

His

Trp

Asp 240

Glu

Arg

Gin

Alá

Arg 245

GTC

CGC

TAC

TAC

CAC

CAA

CTG

AGC

CAA

CAT

GTG

ACC

GTG

831

Val

Arg

Tyr

Tyr

His 250

Gin

Leu

Ser

Gin

His 255

Val

Thr

Val

GAC

GTG

TTC

GGC

CGG

GGC

GGG

CCG

GGG

CAG

CCG

GTG

CCC

870

Asp

Val 260

Phe

Gly

Arg

Gly

Gly 265

Pro

Gly

Gin

Pro

Val 270

Pro

GAA

ATT

GGG

CTC

CTG

CAC

ACA

GTG

GCC

CGC

TAC

AAG

TTC

909

Glu

Ile

Gly

Leu 275

•Leu

His

Thr

Val

Alá 280

Arg

Tyr

Lys

Phe

TAC

CTG

GCT

TTC

GAG

AAC

TCG

CAG

CAC

CTG

GAT

TAT

ATC

948

Tyr 285

Leu

Alá

Phe

Glu

Asn 290

Ser

Gin

His

Leu

Asp 295

Tyr

Ile

ACC

GAG

AAG

CTC

TGG

CGC

AAC

GCG

TTG

CTC

GCT

GGG

GCG

987

Thr

Glu

Lys 300

Leu

Trp

Arg

Asn

Alá 305

Leu

Leu

Alá

Gly

Alá 310

GTG

CCG

GTG

GTG

CTG

GGC

CCA

GAC

CGT

GCC

AAC

TAC

GAG

1026

Val

Pro

Val

Val

Leu 315

Gly

Pro

Asp

Arg

Alá 320

Asn

Tyr

Glu

CGC

TTT

GTG

CCC

CGC

GGC

GCC

TTC

ATC

CAC

GTG

GAC

GAC

1065

Arg

Phe 325

Val

Pro

Arg

Gly

Alá 330

Phe

Ile

His

Val

Asp 335

Asp

TTC

CCA

AGT

GCC

TCC

TCC

CTG

GCC

TCG

TAC

CTG

CTT

TTC

1104

Phe

Pro

Ser

Alá 340

Ser

Ser

Leu

Alá

Ser 345

Tyr

Leu

Leu

Phe

CTC

GAC

CGC

AAC

CCC

GCG

GTC

TAT

CGC

CGC

TAC

TTC

CAC

1143

Leu 350

Asp

Arg

Asn

Pro

Alá 355

Val

Tyr

Arg

ARg

Tyr 360

Phe

His

TGG

CGC

CGG

AGC

TAC

GCT

GTC

CAC

ATC

ACC

TCC

TTC

TGG

1182

Trp

Arg

Arg 365

Ser

Tyr

Alá

Val

His 370

Ile

Thr

Ser

Phe

Trp 375

HU 212 927 Β

GAC

GAG

CCT

TGG

TGC

CGG

GTG

TGC

CAG

GCT

GTA

CAG

AGG

1221

Asp

Glu

Pro

Trp

Cys

Arg

Val

Cys

Gin

Alá

Val

Gin

Arg

380

385

GCT

GGG

GAC

CGG

CCC

AAG

AGC

ATA

CGG

AAC

TTG

GCC

AGC

1260

Alá

Gly

Asp

Arg

Pro

Lys

Ser

Ile

Arg

Asn

Leu

Alá

Ser

390

395

400

TGG TTC GAG CGG TGAAGCCGCG CTCCCCTGG AGCGACCCAG 1302

Trp Phe Glu Arg

405

GGGAGGCCAA GTTGTCAGCT TTTTGATCCT CTACTGTGCA TCTCCTTGC 1352

TGCCGCATCA TGGGAGTAAG TTCTTCAAAC ACCCATTTTT GCTCTATG 1400

Claims (20)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy galaktozil-transzferáz vagy egy szialil-transzferáz nevű membrán-kötött emlős glikoziltranszferáz vagy variánsa előállítására, azzal jellemezve, hogy egy promotert és egy, a promoter ellenőrzése alatt álló, az említett glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós kazettát hordozó hibridvektorral transzformált élesztőtörzset tenyésztünk, és kinyerjük az enzimatikusan aktív expresszált terméket.

   (Elsőbbsége: 1991. 05. 31.)
2. 2. Eljárás egy fukozil-transzferáz nevű membránkötött emlős glikozil-transzferáz vagy variánsa előállítására, azzal jellemezve, hogy egy promotert és egy, a promoter ellenőrzése alatt álló, a fukozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós kazettát hordozó hibridvektorral transzformáit élesztőtörzset tenyésztünk, és kinyerjük az enzimatikusan aktív expresszált terméket.

   (Elsőbbsége: 1992. 03. 04.)
3. 3. Eljárás egy galaktozil-transzferáz vagy egy szialil-transzferáz nevű membrán-kötött emlős glikoziltranszferáz szolubilis variánsának előállítására, mely variáns a megfelelő teljes hosszúságú glikozil-transzferáztól abban különbözik, hogy hiányzik belőle a citoplazmatikus rész, a szignálanchor szakasz és kívánt esetben a törzs-régió kis része, azzal jellemezve, hogy egy expressziós kazettát tartalmazó hibridvektorral transzformált élesztőtörzset tenyésztünk, ahol az expressziós kazetta egy promotert tartalmaz működőképesen kapcsolva egy szignál peptidet kódoló első DNSszekvenciához, amely megfelelő leolvasási keretben kapcsolódik az említett variánst kódoló második DNS szekvenciához, amely DNS-t az említett promoter ellenőriz, és kinyerjük az enzimatikusan aktív expresszált terméket.

   (Elsőbbsége: 1991. 05. 31.)
4. 4. Eljárás egy fukozil-transzferáz nevű membránkötött emlős glikozil-transzferáz szolubilis variánsának előállítására, mely variáns a megfelelő teljes hosszúságú glikozil-transzferáztól abban különbözik, hogy hiányzik belőle a citoplazmatikus rész, a szignál-anchor szakasz és kívánt esetben a törzs-régió kis része, azzal jellemezve, hogy egy expressziós kazettát tartalmazó hibridvektorral transzformált élesztőtörzset tenyésztünk, ahol az expressziós kazetta egy promotert tartalmaz működőképesen kapcsolva egy szignál peptidet kódoló első DNS-szekvenciához, amely megfelelő leolvasási keretben kapcsolódik az említett variánst kódoló második DNS szekvenciához, amely DNS-t az említett promoter ellenőriz, és kinyerjük az enzimatikusan aktív expresszált terméket.

   (Elsőbbsége: 1992. 03. 04.)
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikozil-transzferázként egy galaktozil-transzferázt vagy annak egy variánsát állítjuk elő.

   (Elsőbbsége: 1991.05.31.)
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy galaktozil-transzferázként az UDP-galaktóz:P-galaktozid cc(l-3)-galaktozil-transzferázból (EC 2.4.151), az UDP-galaktóz:P-N-acetil-glukózamin P(l-4)-galaktozil-transzferázból (EC 2.4.1.22), vagy ezek variánsaiból álló csoportból kiválasztott galaktozil-transzferázt állítjuk elő.

   (Elsőbbsége: 1991.05.31.)
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy galaktozil-transzferázként a SEQ ID NO. 1gyel jelölt aminosav-szekvenciával rendelkező galaktozil-transzferázt állítjuk elő.

   (Elsőbbsége: 1991.05.31.)
8. 8. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy galaktozil-transzferázként a SEQ ID NO. 2-vel jelölt aminosav-szekvenciával rendelkező galaktoziltranszferázt állítjuk elő.

   (Elsőbbsége: 1991. 05. 31.)
9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikozil-transzferázként egy szilalil-transzferázt vagy annak egy variánsát állítjuk elő.

   (Elsőbbsége: 1991.05.31.)
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szialil-transzferázként a CMP-NeuAc^-galaktozid a(2-6)-szialil-transzferázt (EC 2.4.99.1) vagy annak egy variánsát állítjuk elő.

    (Elsőbbsége: 1991.05. 31.)
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szialil-transzferázként a SEQ ID NO. 3-maI jelölt aminosav-szekvenciával rendelkező szialiltranszferázt állítjuk elő.

    (Elsőbbsége: 1991.05. 31.)
12. 12. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szialil-transzferázként az ST(Lys₂7-Cys4_O6)tal jelölt, a SEQ ID NO. 3 aminosav-szekvencia 27406. aminosavait tartalmazó szialil-transzferázt állítjuk elő.

    (Elsőbbsége: 1992.03.04.)

    HU 212 927 Β
13. 13. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szialil-transzferázként a SEQ ID NO. 4-gyel jelölt aminosav-szekvenciával rendelkező szialiltranszferázt állítjuk elő.

    (Elsőbbsége: 1991. 05. 31.)
14. 14. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fukozil-transzferázként a GDP-fukóz: β-galaktozid a(l-2)-fukozil-transzferázt (EC 2.4.1.69), a GDP-fiikóz:N-acetil-glukózamin a(l-3/4)-fukoziltranszferázt (EC 2.4.1.65), vagy ezek variánsait tartalmazó csoportból kiválasztott fukozil-transzferázt állítjuk elő.

    (Elsőbbsége: 1992. 03. 04.)
15. 15. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fukozil-transzferázként a SEQ ID NO. 5-tel jelölt aminosav-szekvenciával rendelkező íukoziltranszferázt állítjuk elő.

    (Elsőbbsége: 1992. 03. 04.)
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fukozil-transzferázként az FT(Arg₆₂-Arg₄₀₅)tel jelölt, a SEQ ID NO. 5 aminosav-szekvencia 62405. aminosavait tartalmazó fukozil-transzferázt állítjuk elő.

    (Elsőbbsége: 1992. 03. 04.)
17. 17. Eljárás egy 1. igénypont szerinti glikozil-transzferázt vagy variánsát kifejező hibridvektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy élesztő promotert és a promoter ellenőrzése alatt álló, 1. igénypont szerinti membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós kazettát és olyan DNS-fragmenseket kapcsolunk össze működőképesen, amely DNS-fragmensek élesztő és bakteriális gazda szelekciós markereket, és élesztő és bakteriális gazdában működő replikációs origókat tartalmaznak.

    (Elsőbbsége: 1991.05. 31.)
18. 18. Eljárás egy 2. igénypont szerinti glikozil-transzferázt vagy variánsát kifejező hibridvektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy élesztő promotert és a promoter ellenőrzése alatt álló, 2. igénypont szerinti membrán-kötött glikozil-transzferázt vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós kazettát és olyan DNS-fragmenseket kapcsolunk össze működőképesen, amely DNS-fragmensek élesztő és bakteriális gazda szelekciós markereket, és élesztő és bakteriális gazdában működő replikációs origókat tartalmaznak.

    (Elsőbbsége: 1992. 03. 04.)
19. 19. Eljárás transzformált élesztőtörzs előállítására, azzal jellemezve, hogy egy élesztő gazdaszervezetet egy a 17. igénypont szerint előállított hibridvektorral transzformálunk, és a transzformált sejteket kiválasztjuk a nem-transzformált sejtek közül.

    (Elsőbbsége: 1991. 05. 31.)
20. 20. Eljárás transzformált élesztőtörzs előállítására, azzal jellemezve, hogy egy élesztő gazdaszervezetet egy a 18. igénypont szerint előállított hibridvektorral transzformálunk, és a transzformált sejteket kiválasztjuk a nem-transzformált sejtek közül.