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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Hefe, transformiert mit einem Expressionsvektor,
welcher DNA umfaßt,
die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, umfassend
eine Aminosäuresequenz,
wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert
wird, codiert, und einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die
GDP-D-Mannose-4,6-dehydatase codiert.
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STAND DER
TECHNIK
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Es
ist bekannt, daß die
Zuckerkette von Glycoprotein oder dergleichen in vivo eine sehr
wichtige Rolle spielt. Daher stellt die Zuckerkettenmanipulation,
durch welche die Struktur der Zuckerkette absichtlich verändert wird,
nun ein wichtiges technisches Gebiet dar. Derzeitige Techniken zum
Verändern
von Zuckerketten umfassen beispielsweise eine chemische Technik,
die chemisch synthetisierte Ziel-Zuckerketten an ein Protein bindet,
eine biologische Technik, die Gene für die Synthese einer Zuckerkette
innerhalb einer Zelle durch eine Genmanipulationstechnik verändert oder
Glycoprotein erzeugt, indem ein Glycoprotein erzeugender Wirt verändert wird,
und ein Verfahren der Zuckerkettensynthese, welches synthetische
Zuckerkettenenzyme verwendet.
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Der
Fortschritt in der chemischen Technik bereitet nun den Weg für eine Massensynthese,
es ist jedoch aufgrund der Komplexität von Zuckerketten noch nicht
möglich,
alle Typen von Zuckerketten in einfacher Weise bereitzustellen.
Andererseits steht aufgrund der Entwicklung der Genmanipulation
in der biologischen Technik nun eine Kontrolle der Expression von
an der Zuckerkettensynthese beteiligten Genen zur Verfügung, die
eine Veränderung
von Zuckerketten ermöglicht.
Eine einheitliche Synthese aller Typen von Zuckerketten ist jedoch
derzeit schwierig, und für
gewöhnlich
liegt ein Gemisch aus verschiedenen Arten von Zuckerketten innerhalb
des Produkts vor.
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Im
Gegensatz zu diesen Techniken ist die Zuckerkettensynthese in vitro
unter Verwendung von synthetischen Zuckerkettenenzymen bei der Synthese
von Zuckerketten mit einer einheitlichen Struktur sehr nützlich.
Insbesondere ermöglicht
die Kombination einer solchen Technik mit der biologischen Technik
eine Massenproduktion von einheitlichen Zuckerketten.
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Während die
Zuckerkettensynthese in vitro die Verwendung von Zuckernukleotiden
als Zuckerdonoren für
Glycosyltransferase erfordert, machen es die unerschwinglich hohen
Kosten der Herstellung von Zuckernukleotiden jedoch schwierig, das
Verfahren auf eine Massenproduktion anzuwenden. Das heißt, Zuckernukleotide
liegen in vivo in einer sehr geringen Anzahl vor, und es handelt
sich dabei um sehr reaktive, instabile Substanzen, die über eine
energiereiche Bindung verknüpft
sind. Daher wird in jedem Organismus nur eine geringe Anzahl an
Zuckernukleotiden erzeugt, und eine Massenproduktion derselben ist
schwierig.
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In
den letzten Jahren hat ein Produktionssystem unter Verwendung von
Bakterien ein praktikableres System zur Massenerzeugung relativ
vieler Typen von Zuckernukleotiden und eine zuverlässigere
Bereitstellung von Zuckernukleotiden ermöglicht. Ein Produktionssystem
mit einem relativ langen Reaktionsprozeß führt jedoch zu einer geringen
Ausbeute, da das System die Stufen umfaßt, bei denen man zwei Typen
von Mikroorganismen mischt und die Herstellung unter Verwendung
aufgebrochener Zellen durchführt,
um ein in Zellen enthaltenes Material in andere Zellen einzubringen.
Somit besteht ein Bedarf nach der Entwicklung einer neuen Technik.
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Unter
den Zuckernukleotiden ist GDP-L-Fucose als Zuckerdonor von Fucosyltransferase
zur Synthese von Fucose enthaltenden Zuckerketten wesentlich. Zuckerketten,
zu denen der Fucoserest hinzugefügt
wurde, spielen oft eine funktionell wichtige Rolle, und somit wurde
darauf gewartet, daß der
Zuckerdonor in großen Mengen
zu geringen Kosten bereitgestellt werden kann. Es wurde berichtet,
daß die
GDP-L-Fucose durch 3 Reaktionsstufen aus GDP-D-Mannose synthetisiert
wird, und diese 3 Reaktionsstufen werden durch zwei Typen von Enzymen
katalysiert (1) (Tonetti et al., J. Biol.
Chem., Band 271, 27274 (1996)). Diese Enzyme sind allgemein in allen
Organismen, die Fucose verwenden, einschließlich Prokaryonten, wie Escherichia
coli, und auch Eukaryonten, wie höhere Säuger, beispielsweise Menschen,
verteilt. Diese Organismen verbrauchen jedoch die synthetisierte
GDP-L-Fucose, so daß sich
GDP-L-Fucose nicht in ihren Zellen ansammelt. Dementsprechend führt die
Isolation von GDP-L-Fucose aus einem lebenden Organismus zu einer
sehr geringen Menge an GDP-L-Fucose mit hohen Kosten. Darüber hinaus
erfordert die Synthese von GDP-L-Fucose
auch einen langen Prozeß.
Unter den derzeit gegebenen Umständen
ist es schwierig, unter Verwendung des obigen Bakteriensystems eine
ausreichende Menge an GDP-L-Fucose bereitzustellen.
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Zwei
Typen der Enzyme, die die 3 Reaktionsstufen katalysieren, sind GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase, welche
die erste Reaktionsstufe der Umwandlung von GDP-D-Mannose in GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose
durch eine Dehydratisierungsreaktion katalysiert, und GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase,
die die nachfolgenden beiden Reaktionsstufen der Epimerisierung
und der Reduktion katalysiert. Für
die Pflanze Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) wurde bereits MUR1
als ein Gen für
GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase isoliert, welches die erste Reaktion
katalysiert (Bonin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 94,
2085 (1997)). Datenbank EMBL [online] Bonin, C.P. et al.: "Arabidopsis thaliana
GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase (GERI) gene, complete
CDs", 16. Februar
1998, Datenbank-Hinterlegungsnummer ΔFO45286,049213 beschreibt eine
Sequenz, die über
ihre gesamte Länge
zu 100% identisch zu SEQ ID NO:1 ist, und eine Sequenz, die über ihre
gesamte Länge
zu 100% identisch zu SEQ ID NO:2 ist.
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Die
EP0870841 offenbart ein
Verfahren zum Herstellen von GDP-Fucose aus GDP-Mannose durch Kultivieren von Zellen,
die mit einem Vektor transformiert wurden, welcher die Nukleinsäuresequenzen
enthält, die
GDP-Mannose-4,6-dehydratase und GDP-4-keto-6-desoxymannoseepimerase/-reduktase
aus E. coli enthalten.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
wird ein Gen (AtFX-Gen) beschrieben, welches GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase,
abgeleitet aus Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), codiert, die
die letzten beiden Reaktionsstufen bei der Synthese von GDP-L-Fucose
aus GDP-D-Mannose katalysiert, und die Nukleotidsequenz des Gens
wird bestimmt. GDP-L-Fucose kann durch gleichzeitige Expression
des Gens und des MUR1-Gens, welches die erste Reaktionsstufe bei
der Synthese von GDP-L-Fucose
in Arabidopsis katalysiert, in effizienter Weise in vivo und in
vitro synthetisiert werden.
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Es
wird auch das nachfolgende Protein beschrieben: ein Protein, welches
eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie
sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert
wird.
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Weiterhin
wird DNA beschrieben, die das nachfolgende Protein codiert: ein
Protein, welches eine Aminosäuresequenz
umfaßt,
wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert
wird.
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Es
wird ein Expressionsvektor beschrieben, der die DNA umfaßt.
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Darüber hinaus
wird eine Transformante beschrieben, die mit dem Expressionsvektor
transformiert ist. Ein Beispiel einer solchen Transformante ist
der Hefe-Stamm W303/pYO-AtFX-Myc (FERM BP-7109). Weiterhin wird
auch ein Verfahren zum Herstellen von GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase beschrieben,
welches das Kultivieren der Transformante in einem Medium und das
Sammeln von GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase aus der
erhaltenen Kultur umfaßt.
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Die
vorliegende Erfindung liefert Hefe, transformiert mit einem Expressionsvektor,
welcher DNA umfaßt,
die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, umfassend
eine Aminosäuresequenz,
wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert
wird, codiert, und einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die
GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase codiert. Vorzugsweise umfaßt die GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase
eine Nukleotidsequenz, die durch SEQ ID NO:2 repräsentiert
ist. Ein Beispiel einer solchen Transformante ist der Hefe-Stamm
W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFx-Myc (FERM BP-7108). Weiterhin liefert
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Umwandeln von GDP-D-Mannose
in GDP-L-Fucose unter Verwendung der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung,
und ein Verfahren zum Herstellen von GDP-L-Fucose, welches das Kultivieren
der Hefe gemäß der vorliegenden
Erfindung zusammen mit GDP-D-Mannose in einem Medium und das Sammeln
von GDP-L-Fucose aus der erhaltenen Kultur umfaßt.
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ERLÄUTERUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS
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- SEQ ID NO:3 bis 6: Primer
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
einen Enzymreaktionsprozeß von
GDP-D-Mannose zu GDP-L-Fucose.
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2 ist
eine Fotografie von Elektroforese durch Western-Blotten, welche
die Expression der MUR1- und AtFX-Proteine zeigt.
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3 ist
ein HPLC-Chromatogramm, welches die Ergebnisse der Messung der Syntheseaktivität von GDP-L-Fucose
zeigt.
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BESTE AUSFÜHRUNGSFORM
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.
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In
der vorliegenden Beschreibung sind abgekürzte Bezeichnungen von Aminosäuresequenzen
und Nukleotidsequenzen angegeben, wobei die Codes den Vorschriften
von IUPAC-IUB und üblichen
Namen oder Verwendungen auf dem technischen Gebiet folgen.
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1. Isolation eines Gens
für GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase
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Das
Gen für
GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, welches
SEQ ID NO:2 umfaßt,
kann mit dem PCR-Verfahren unter Verwendung einer aus Arabidopsis
(Arabidopsis thaliana) hergestellten cDNA-Bibliothek als Matrize
gemäß Standardtechniken
isoliert werden.
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Die
cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana kann gemäß Fachleuten
auf dem Gebiet bekannten Verfahren unter Verwendung allgemein verwendeter
Plasmidvektoren, von λ-Phagen
abgeleiteter Vektoren oder dergleichen hergestellt werden. Weiterhin
kann auch eine kommerziell erhältliche
cDNA-Bibliothek, die von Arabidopsis thaliana abgeleitet ist, verwendet
werden.
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Das
PCR-Verfahren ist eine Technik, mit der eine bestimmte Region von
DNA unter Verwendung einer Kombination des Sense-Primers und des
Antisense-Primers, einer thermostabilen DNA-Polymerase, einem DNA-Vervielfältigungssystem
und dergleichen innerhalb von etwa 2 bis 3 Stunden in vitro spezifisch
um das 10-fache bis hin zum Millionenfachen vervielfältigt werden
kann. Die SEQ ID NO:2 umfassende DNA kann unter Verwendung geeigneter
Primer mit dem PCR-Verfahren
vervielfältigt
werden.
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Primer,
die in der obigen PCR verwendet werden können, können beispielsweise auf Basis
von Nukleotidsequenzhomologie mit anderen Typen von Enzymgenen ausgestaltet
werden. Nukleotidsequenzen anderer Typen von Enrymgenen, die hier
verwendet werden können,
sind diejenigen, die in einer bekannten DNA-Sequenz-Datenbank, wie
GenBank, die Fachleute auf dem Gebiet leicht durchsuchen können, hinterlegt wurden.
Beispiele solcher Nukleotidsequenzen umfassen diejenigen, die unter
den Hinterlegungsnummern 038473, 058766 und AF045286 bei GenBank
hinterlegt wurden. Bei der Ausgestaltung eines Primers kann beispielsweise
eine Sequenz einer Restriktionsenzymstelle in der Nukleotidsequenz
des Primers enthalten sein, wenn nach der PCR-Vervielfältigung
eine Genmanipulation in Erwägung
gezogen wurde.
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Ein
Beispiel von Primern, die wie oben beschrieben ausgestaltet sind,
umfaßt
diejenigen, die die folgenden Nukleotidsequenzen umfassen.
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Vorwärts-Primer:
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- 5'-ATTGGTACCATGTCTGACAAATCTGCCAAAATCTTCGTC-3' (SEQ ID NO:3)
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Rückwärts-Primer:
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- 5'-TTAGTCGACGATATCTCGGTTGCAAACATTCTTCAAATACCAATCATAAG-3' (SEQ ID NO:4)
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Der
unterstrichene Abschnitt in der Nukleotidsequenz des Vorwärts-Primers
bezeichnet die KpnI-Stelle und der unterstrichene Abschnitt in der
Nukleotidsequenz des Rückwärts-Primers
be zeichnet die EcoRV-Stelle. Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung
kann mittels PCR unter Verwendung dieser Primer gut vervielfältigt werden.
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Zusätzlich zu
einer cDNA-Bibliothek, die als Matrize und Primer verwendet wird,
sollte die PCR-Lösung
für die
Durchführung
von PCR durch thermostabile DNA-Polymerase, ein Gemisch aus dNTPs
und dergleichen ergänzt
werden. Eine solche PCR-Lösung
kann von Fachleuten auf dem Gebiet in geeigneter Weise hergestellt
werden. Beispielsweise kann eine PCR-Lösung so hergestellt werden,
daß sie
die Zusammensetzung hat, wie sie in der nachfolgenden Tabelle 1
gezeigt ist. Tabelle
1 Zusammensetzung
der PCR-Lösung
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Die
PCR-Bedingungen können
von Fachleuten auf dem Gebiet entsprechend den Nukleotidsequenzen
der zu verwendenden Primer oder dergleichen in geeigneter Weise
bestimmt werden. Beispielsweise kann eine PCR-Reaktion mit 30 Zyklen
eines Reaktionszyklus durchgeführt
werden, bestehend aus Denaturierung bei 94°C für 15 Sek., Annealen bei 50°C für 30 Sek.
und Verlängern
bei 68°C
für 2 Min.
Eine solche Reaktion kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Thermozyklers oder dergleichen leicht durchgeführt werden.
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Mit
der obigen PCR vervielfältigte
DNA kann in ein geeignetes Plasmid kloniert werden. Es kann jedes Plasmid
für die
Aufnahme von DNA verwendet werden, soweit es verdoppelt und in einem
Wirt gehalten werden kann. Beispielsweise können pBR322, pUC19 oder dergleichen,
die von Escherichia coli abgeleitet sind, verwendet werden.
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Weiterhin
kann auch das Klonieren von vervielfältigter DNA unter Verwendung
eines kommerziell erhältlichen
Kits durchgeführt
werden. Ein Beispiel eines solchen Kits ist der TA-Klonierungskit (Invitrogen). Wenn
ein kommerziell erhältlicher
Kit verwendet wird, können
die in dem Kit enthaltenen Plasmide verwendet werden.
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Beispiele
eines Verfahrens für
die Einbringung eines Plasmids, welches die SEQ ID NO:2 umfassende DNA
enthält,
in einen Wirt, wie Escherichia coli, umfassen ein Verfahren, wie
es von T. Maniatis et al. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1. Auflage S. 250 (1982)] beschrieben wurde, ein Verfahren,
wie es von F.M. Ausubel et al. [Short Protocols in Molecular Biology,
4. Auflage, 1-27 (1999)] beschrieben wurde, und dergleichen.
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Die
Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:2 umfassenden DNA kann durch ein
bekanntes Verfahren, wie ein Didesoxyverfahren, unter Verwendung
der wie oben beschrieben erhaltenen Plasmide bestimmt werden. Eine
solche Sequenzierung kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Kits durchgeführt
werden. Ein Beispiel eines solchen Kits ist ein Sequence-Kit (PE
Biosystems). Sobald die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:2 umfassenden
DNA bestimmt wurde, kann eine abgeleitete Aminosäuresequenz des SEQ ID NO:1 umfassenden
Proteins erhalten werden.
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Das
Protein, welches eine Aminosäuresequenz
umfaßt,
die durch SEQ ID NO:1 repräsentiert
wird, hat GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase-Aktivität.
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Die
DNA umfaßt
SEQ ID NO:2, die eine Aminosäuresequenz
des Proteins, wie oben beschrieben, codiert.
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2. Konstruktion eines
Expressionsvektors zum Exprimieren der SEQ ID NO:2 umfassenden DNA
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Ein
Expressionsvektor kann konstruiert werden, indem die SEQ ID NO:2
umfassende klonierte DNA abstromig von einem Promotor innerhalb
eines Vektors, der für
die Expression der DNA geeignet ist, ligiert wird. Beispiele eines
Vektors umfassen von Hefe abgeleitete Plasmide, wie YEp352GAP, YEp51,
pSH19 und pYO325 und dergleichen.
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Die
DNA, die zur Einbringung in einen Expressionsvektor verwendet werden
soll, ist die DNA, die SEQ ID NO:2 umfaßt und das Translations-Startcodon,
ATG, an ihrem 5'-Ende
und das Stopcodon, TAA, TGA oder TAG, an ihrem 3'-Ende hat. Weiterhin können zur
Expression beispielsweise ein Gen für ein markiertes Antigen, welches
ein Teil eines Hämagglutininproteins
ist, oder das Gen für
ein markiertes Protein, wie GST-Protein, an das 5'- oder das 3'-Ende gebunden sein.
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Um
das Gen zu exprimieren, wird vorzugsweise ein Promotor ausstromig
von dem Gen ligiert. Es kann jeder Promotor verwendet werden, solange
es ein geeigneter Promotor ist, der mit einem für die Genexpression zu verwendenden
Wirt kompatibel ist. Beispiele eines Promotors umfassen beispielsweise
EN01-Promotor, GAL10-Promotor, GAPDH-Promotor und ADH-Promotor.
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Ein
Terminator kann abstromig von dem Gen ligiert sein, um die Transkription
des Gens zu beenden. Es kann jeder Terminator verwendet werden,
solange es ein geeigneter Terminator ist, der einem für die Genexpression
zu verwendenden Wirt entspricht. Wenn ein zu transformierender Wirt
Hefe ist, umfassen Beispiele eines Terminators z.B. EN01-Terminator,
GAL10-Terminator, GAPDH-Terminator
und ADH-Terminator.
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Die
Einbringung der SEQ ID NO:2 umfassenden DNA, eines Promotors, eines
Terminators und dergleichen in einen Expressionsvektor kann von
Fachleuten auf dem Gebiet in geeigneter Weise durchgeführt werden.
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3. Herstellung einer Hefe,
die den Expressionsvektor enthält
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Eine
Hefe, die das SEQ ID NO:1 umfassende Protein exprimiert, kann durch
Einbringen des Expressionsvektors, der wie oben unter " 2. Konstruktion
eines Expressionsvektors zum Exprimieren der SEQ ID NO:2 umfassenden
DNA" beschrieben
konstruiert ist, in Hefe hergestellt werden.
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Es
kann jede Hefe verwendet werden, soweit sie nicht GDP-L-Fucose in
vivo verbraucht. Beispiele von Hefe umfassen Spalthefe (Saccharomyces
cerevisiae) und andere Hefe (Pichia pastoris und dergleichen). Wenn
Hefeextrakte zur Herstellung von GDP-L-Fucose verwendet werden,
d.h. wenn GDP-L-Fucose in vitro erzeugt wird, kann jeder Wirt verwendet
werden, solange er die Expression des SEQ ID NO:1 umfassenden Proteins
innerhalb des Zytoplasmas ermöglicht.
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Die
obige Hefe kann durch allgemein verwendete Verfahren hergestellt
werden. Beispielsweise wird der Expressionsvektor durch ein Lithiumverfahren,
ein Elektroporationsverfahren oder dergleichen eingebracht.
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Die
erhaltene Transformante ist beispielsweise der Stamm W303/pYO-AtFX-Myc
(FERM BP-7109).
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Um
GDP-L-Fucose durch Kultivieren der Hefe zu erzeugen, ist es erforderlich,
daß die
Wirte zuvor mit Expressionsvektoren transformiert werden, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase
exprimieren, oder daß sie GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase
von sich aus exprimieren. Als ein Gen für GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase
wird vorzugsweise das von Arabidopsis thaliana abgeleitete MUR1-Gen
verwendet.
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Ein
Expressionsvektor, der GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase exprimiert,
kann konstruiert werden, wie es in dem obigen Verfahren für einen
Expressionsvektor, der das SEQ ID NO:1 umfassende Protein exprimiert,
beschrieben ist. Primer, die in PCR zum Klonieren von DNA, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase
codiert, verwendet werden sollen, sollten jedoch beispielsweise
durch Vergleichen der Nukleotidsequenzen bekannter GDP-D-Mannose-4,6-dehydratasegene
ausgestaltet werden. Beispielsweise können Primer mit den folgenden
Nukleotidsequenzen verwendet werden.
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Vorwärts-Primer:
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- 5'-GTCGAATTCATGGCGTCAGAGAACAAC-3' (SEQ ID NO:5)
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Rückwärts-Primer:
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- 5'-GAACTCGAGAGGTTGCTGCTTAGCATC-3' (SEQ ID NO:6)
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Ein
Beispiel der oben beschriebenen Hefe mit dem darin eingebrachten
Expressionsvektor, der GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase exprimiert,
ist der Stamm W303/YEp-MUR1-HA (FERM BP-7107). Weitere Beispiele von Hefe mit
dem darin eingebrachten Expressionsvektor umfassen den Stamm W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc
(FERM BP-7108).
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Die
oben genannten Stämme,
Stamm W303/pYO-AtFX-Myc, Stamm W303/YEp-MUR1-HA und Stamm W303/YEp-MUR1HA,
pYO-AtFX-Myc, wurden mit den Hinterlegungsnummern FERM BP-7109,
FERM BP-7107 bzw. FERM BP-7108 bei der internationalen Patent-Organismus-Hinterlegungsstelle,
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
(Chuo-6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, JAPAN), hinterlegt.
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4. Herstellung des SEQ
ID NO:1 umfassenden Proteins durch Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung
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Die
Hefe gemäß der vorliegenden
Erfindung, d.h. Hefe, transformiert mit einem Expressionsvektor, welcher
DNA umfaßt,
die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, umfassend
eine Aminosäuresequenz,
wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert
wird, codiert, und einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die
GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase codiert (beispielsweise Stamm W303/pYO-AtFX-Myc)
oder eine Hefe, in die sowohl der erstgenannte Expressionsvektor
als auch ein GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase exprimierender Expressionsvektor
eingebracht wurde, wird in einem geeigneten Medium kultiviert, so
daß GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase
aus der Kultur isoliert werden kann.
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Die
Hefe gemäß der vorliegenden
Erfindung kann unter Verwendung eines Standardverfahrens zum Kultivieren
von Wirten in einem Medium kultiviert werden. Als Medium zum Kultivieren
von Transformanten, die unter Verwendung von Hefen als Wirten erhalten
wurden, können
entweder natürliche
oder synthetische Medien verwendet werden, soweit diese Medien Quellen
enthalten, die von Mikroorganismen verwendet werden, wie eine Kohlenstoffquelle,
eine Stickstoffquelle und anorganische Salze, und eine effiziente
Kultivierung der Hefen ermöglichen.
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Beispiele
der hier verwendeten Kohlenstoffquellen umfassen Kohlenhydrate,
wie Glucose, Fructose, Saccharose und Stärke, organische Säuren, wie
Essigsäure
und Propionsäure,
und Alkohole, wie Ethanol und Propanol.
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Beispiele
der hier verwendeten Stickstoffquellen umfassen anorganische Säuren, wie
Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat,
oder Ammoniumsalze von organischen Säuren, andere Stickstoff enthaltende
Verbindungen, Pepton, Brühe
und Maisquellwasser.
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Beispiele
der hier verwendeten anorganischen Salze umfassen primäres Kaliumphosphat,
sekundäres
Kaliumphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid,
Eisen(II)sulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat.
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Insbesondere
umfassen Beispiele eines Mediums zum Kultivieren von Hefe ein YPD-Medium und 5D-Medium.
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Hefen
werden vorzugsweise für
12 Stunden bis 5 Tage bei 25°C
bis 37°C
kultiviert. Falls es notwendig ist, kann das Kultivieren unter Belüften, Schütteln oder
dergleichen durchgeführt
werden. Der pH-Wert ist nicht speziell beschränkt, solange er sich in einem
normalerweise verwendeten Bereich befindet. Der pH-Wert wird bevorzugt
in einem Bereich von 5,0 bis 7,5 und bevorzugter auf ungefähr 7,5 gehalten.
Der pH-Wert wird unter Verwendung anorganischer oder organischer
Säuren,
alkalischer Lösungen
oder dergleichen eingestellt. Falls es notwendig ist, können Antibiotika,
wie Ampicillin oder Tetracyclin, während des Kultivierens zu dem
Medium zugegeben werden. Um Mikroorganismen zu kultivieren, die
mit Expressionsvektoren transformiert wurden, welche einen induzierbaren
Promotor als Promotor aufweisen, können notwendigenfalls Induktoren
zu dem Medium zugegeben werden.
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Nach
dem Kultivieren wird das SEQ ID NO:1 umfassende Protein aus der
Kultur gesammelt. Wenn das Enzym innerhalb der Hefe oder intrazellulär erzeugt
wird, kann das Enzym beispielsweise durch Aufspalten der Hefe gesammelt
werden. Wenn das Enzym außerhalb
der Hefe oder extrazellulär
erzeugt wird, wird das Kulturmedium in intaktem Zustand verwendet,
um das Enzym zu sammeln, oder das Enzym kann gesammelt werden, nachdem
die Hefe mittels Zentrifugation oder der gleichen entfernt wurde.
Das Enzym kann mit einem oder mit einer Kombination standardmäßiger biochemischer
Verfahren, die zur Isolation und Reinigung von Protein verwendet
werden, wie Ammoniumsulfatpiäzipitation,
Affinitätschromatographie,
Ionenaustauschchromatographie und dergleichen, gesammelt werden.
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Ob
es sich bei dem wie oben beschrieben erhaltenen Protein um das SEQ
ID NO:1 umfassende Protein handelt, kann durch eine standardmäßige enzymologische
Reaktion, Elektroforese, wie SDS-Polyacrylamidgelelektroforese,
immunologische Verfahren, wie Antigen-Antikörper-Reaktion, oder dergleichen bestätigt werden.
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5. Herstellung von GDP-L-Fucose
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GDP-L-Fucose
kann durch Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung
oder durch Enzymreaktion unter Verwendung von Enzymquellen, die
für die
Herstellung von GDP-L-Fucose
notwendig sind, hergestellt werden.
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(1) Herstellung von GDP-L-Fucose
durch Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden
Erfindung
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Eine
Hefe (beispielsweise der Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc),
transformiert mit einem darin eingebrachten Expressionsvektor, welcher
DNA umfaßt,
die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase,
umfassend eine Aminosäuresequenz,
wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert
wird, codiert, und einem darin eingebrachten Expressionsvektor,
welcher DNA umfaßt,
die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase codiert, wird mit GDP-D-Mannose
in einem geeigneten Medium kultiviert, und dann kann GDP-L-Fucose
aus der erhaltenen Kultur isoliert und gereinigt werden.
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Die
Bedingungen zum Kultivieren von Hefen, wie Medium, Temperatur, Zeitdauer
der Kultivierung, pH-Wert und andere, sind wie oben unter "4. Herstellung des
SEQ ID NO:1 umfassenden Proteins durch Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden
Erfindung" beschrieben.
Notwendigenfalls kann ein Cofaktor, wie NADPH, zu einem Medium zugegeben
werden.
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GDP-L-Fucose
kann durch Trennen von Wirtszellen von einem Medium mittels Zentrifugation,
Aufbrechen der Wirtszellen, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation,
aus der obigen Kultur extrahiert werden. Wenn der Wirt Hefe ist,
werden die Zellen beispielsweise mit Glasperlen aufgebrochen und
dann Zentrifugation unterworfen, so daß eine Überstandsfraktion, die GDP-L-Fucose
enthält,
erhalten werden kann.
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GDP-L-Fucose
kann von Fachleuten auf dem Gebiet leicht aus der obigen Überstandsfraktion
isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise kann die Isolation
und Reinigung von GDP-L-Fucose
durchgeführt
werden, indem man Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht mittels
einer Gelfiltrationstechnik sammelt und dann mittels HPLC abtrennt.
Das Gel für
die Gelfiltration, die Säulengröße, das
Säulenelutionsmittel,
die HPLC-Säule
und das -Elutionsmittel und dergleichen, wie sie hier verwendet
werden, können
von Fachleuten auf dem Gebiet in geeigneter Weise ausgewählt werden.
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(2) Herstellung von GDP-L-Fucose
durch Enzymreaktion unter Verwendung von Enzymquellen
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GDP-L-Fucose
kann durch eine Enzymreaktion unter Verwendung von Enzymquellen,
die für
die Herstellung notwendige Enzyme enthalten, hergestellt werden.
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Wenn
GDP-D-Mannose als Substrat einer Enzymreaktion verwendet wird, sind
GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase
und GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase (das
SEQ ID NO:1 umfassende Protein) notwendige Enzyme. Diese Enzyme
können
hier verwendet werden, indem man verschiedene Transformanten, die
die beiden Enzyme jeweils exprimieren (beispielsweise Stamm W303/YEp-MUR1-HA
und Stamm W303/pYO-AtFX-Myc) in Medium kultiviert, um die Enzyme
getrennt zu exprimieren, und dann die Enzyme mischt. Vorzugsweise
wird jedoch eine Transformante (beispielsweise Stamm W303/YEp-MUR1-HA,
pYO-AtFX-Myc), die diese beiden Enzyme exprimiert, für die Expression
in Medium kultiviert. Diese Enzyme können gemäß einem Verfahren, wie es oben
unter "4. Herstellung
des SEQ ID NO:1 umfassenden Proteins durch Kultivieren der Transformante
gemäß der vorliegenden
Erfindung" beschrieben ist,
aus der Transformantenkultur isoliert werden. Des weiteren muß die für die obige
Enzymreaktion verwendete Enzymquelle kein gereinigtes Enzym sein,
sondern es kann sich um einen Rohextrakt, wie den Zellextrakt der
oben beschriebenen Transformante, handeln.
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Die
Enzymreaktion kann unter Verwendung einer Reaktionslösung, die
so hergestellt ist, daß sie
die obige Enzymquelle und GDP-D-Mannose zur Verwendung als Substrat
enthält,
unter geeigneten Bedingungen durchgeführt werden. Die Reaktionslösung kann
durch einen Cofaktor, wie NADPH, ergänzt sein, falls dies notwendig
ist. Die Reaktionsbedingungen sind nicht speziell beschränkt, da
die Bedingungen von Fachleuten auf dem Gebiet in geeigneter Weise
bestimmt werden können.
Die Temperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 30°C bis 37°C und beträgt bevorzugter
ungefähr
37°C. Der
pH-Wert liegt vorzugsweise im Bereich von 6,0 bis 8,0 und beträgt bevorzugter
etwa 7,5. Um den pH-Wert innerhalb eines gewünschten Bereichs zu haften,
kann ein Puffer, wie Tris-HCl, verwendet werden.
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GDP-L-Fucose
kann von Fachleuten auf dem Gebiet leicht aus einer Enzymreaktionslösung isoliert werden.
Beispielsweise wird das Protein in einer Enzymreaktionslösung thermisch
denaturiert, gefolgt von Zentrifugation und Enffernung mit einem
Membranfilter oder dergleichen, und dann wird die GDP-L-Fucose isoliert
und mittels HPLC gereinigt.
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Die
GDP-L-Fucose ist als ein Zuckerdonor wesentlich, wenn Fucose enthaltende
Zuckerketten synthetisiert werden. Das heißt, die GDP-L-Fucose ist bei
Hinzufügung
von Fucose zu Zuckerketten, von denen angenommen wird, daß sie funktionell
wichtig sind, von Nutzen.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun nachfolgend unter Verwendung von
Beispielen ausführlicher
beschrieben.
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Beispiel 1
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Isolation und Sequenzierung
des AtFX-Gens
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Unter
Verwendung der cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis (Arabidopsis thaliana)
wurde das AtFX-Gen mit dem PCR-Verfahren kloniert. QUICK-Clone-cDNA
(CLONTECH) wurde als die cDNA-Bibliothek
verwendet.
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Primer
wurden auf Basis der in einer Datenbank (Name der Datenbank: GenBank,
Hinterlegungsnummern: U38473, U58766 und AF045286) hinterlegten
Nukleotidsequenzen ausgestaltet. Zu diesem Zeitpunkt wurden die
Primer so ausgestaltet, daß sie
zunächst
eine KpnI-Stelle auf dem N-terminalen
Abschnitt und eine EcoRV-Stelle auf dem C-terminalen Abschnitt enthielten,
so daß der
ein Protein codierende Abschnitt durch ein Restriktionsenzym leicht
gespalten werden konnte und ein Gen für ein markiertes Antigen oder
dergleichen leicht eingebracht werden konnte. Die Nukleotidsequenzen
der jeweiligen Primer sind unten gezeigt.
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Vorwärts-Primer:
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- 5'-ATTGGTACCATGTCTGACAAATCTGCCAAAATCTTCGTC-3' (SEQ ID NO:3)
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Rückwärts-Primer:
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- 5'-TTAGTCGACGATATCTCGGTTGCAAACATTCTTCAAATACCAATCATAAG-3' (SEQ ID NO:4)
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Hier
bezeichnet der unterstrichene Abschnitt in der Nukleotidsequenz
des Vorwärts-Primers
die KpnI-Ste11e, und der unterstrichene Abschnitt in der Nukleotidsequenz
des Rückwärts-Primers
bezeichnet die EcoRV-Stelle. Die so ausgestalteten Primer wurden
mittels einer Standardtechnik synthetisiert.
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PCR
wurde unter Verwendung der obigen QUICK-Clone-cDNA (CLONTECH) als
Matrize mit den obigen Primern durchgeführt. Die Zusammensetzung der
PCR-Lösung
ist wie in Tabelle 2 unten gezeigt. Tabelle
2 Zusammensetzung der PCR-Lösung
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PCR
wurde durch Umsetzen während
30 Zyklen, mit Temperaturbedingungen von 94°C für 15 Sek. (Denaturierung),
50°C für 30 Sek.
(Annealen) und 68°C
für 2 Min.
(Verlängerung)
durchgeführt.
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Das
DNA-Vervielfältigungsfragment
mit etwa 1 kBp Länge,
erhalten durch PCR, wurde mittels Agaroseelektroforese abgetrennt
und dann unter Verwendung des TA-Klonierungskits (Invitrogen) in
den pCR2.1-Vektor eingebracht. Die Nukleotidsequenz der klonierten
DNA wurde mit einem Sequence-Kit (PE Biosystems) unter Verwendung
eines Didesoxyverfahrens bestimmt. Die Nukleo tidsequenz und die
durch die Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz werden durch SEQ
ID NO:2 bzw. SEQ ID NO:1 repräsentiert.
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Beispiel 2
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Herstellung des AtFX-Gen-Exoressionsvektors
und des MUR1-Gen-Exgressionsvektors und Herstellung einer Hefe-Transformante
die diese Plasmide enthält
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3x
Myc-Gen (Evan et al., Mol. Cell. Biol., Band 5, 3610 (1985)), welches
ein markiertes Antigen codiert, wurde in die EcoRV-Stelle in dem
AtFX-Gen im Leseraster mit dem AtFX-Gen eingebracht, welches in
den pCR2.1-Vektor eingebracht worden war. Das Myc-Gen enthaltendes
AtFX-Gen wurde mit
KpnI-XhoI herausgespalten. Das Fragment wurde in die KpnI-SalI-Stelle
in dem Expressionsvektor YEp352GAP-11 eingebracht, welcher durch
Ersetzen der Multiklonierungsstelle des Hefeexpressionsvektors YEp352GAP
(Roy et al., J. Biol. Chem., Band 273, 2583 (1998)) durch den Abschnitt
EcoRI bis SalI der Multiklonierungsstelle von pUC18 hergestellt
wurde. Weiterhin wurde ein Fragment, welches drei Abschnitte, GAPDH-Promotor,
AtFX-Myc und GAPDH-Terminator, umfaßte, unter Verwendung von BamHI
aus dem Vektor herausgespalten. Das Fragment wurde in die BamHI-Stelle
in dem Hefevektor pY0325 mit hoher Kopienzahl (Qadota et al., Yeast,
Band 8, 735 (1992)), der LUE2-Marker enthielt, eingebracht, wodurch
der Expressionsvektor pYO-AtFX-Myc für das AtFX-Gen konstruiert
wurde.
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Das
MUR1-Gen wurde in ähnlicher
Weise wie in Beispiel 1 ebenfalls mittels PCR kloniert, mit der
Ausnahme, daß die
hier verwendeten PCR-Primer die folgenden Nukleotidsequenzen haben.
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Vorwärts-Primer:
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- 5'-GTCGAATTCATGGCGTCAGAGAACAAC-3' (SEQ ID NO:5)
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Rückwärts-Primer:
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- 5'-GAACTCGAGAGGTTGCTGCTTAGCATC-3' (SEQ ID NO:6)
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Als
nächstes
wurde das MUR1-Gen in die EcoRI-Stelle in dem Vektor YEp352GAP eingebracht
(Roy et al., J. Biol. Chem., Band 273, 2583 (1998)), und dann wurde
mit 3x HA markiertes Antigen-Gen im Leseraster in die PvuII-Stelle
eingebracht, wodurch der Expressionsvektor YEp-MUR1-HA für das MUR1-Gen konstruiert
wurde.
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Diese
Expressionsvektoren wurden separat oder zusammen in den Hefestamm
W303-1A (ura3, lue2, his3, trp1, ade2) (Kainuma et al., Glycobiology,
Band 9, 133 (1999)) transformiert, wodurch der Stamm W303/pYO-AtFX-Myc,
der nur pYO-AtFX-Myc enthält,
Stamm W303/YEp-MUR1-HA,
der nur YEp-MUR1-HA enthält,
und Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc, der sowohl pYO-AtFX-Myc
als auch YEp-MUR1-HA enthält,
erhalten wurden.
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Beispiel 3
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Expression von MUR1-Protein
und AtFX-Protein in Hefe
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Ob
die Proteine in jeder Zelle der in Beispiel 2 erhaltenen Transformanten
exprimiert wurden, wurde durch Western-Blotten bestätigt.
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Zuerst
wurden die obigen Transformanten (Stamm W303/YEp-MUR1-HA, Stamm
W303/pYO-AtFX-Myc und Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc) und
Stamm W303 separat auf SD-Medium bei 30°C für 24 Stunden kultiviert, und
dann wurden die erhaltenen Hefezellen mit Glasperlen aufgebrochen.
Die aufgebrochenen Produkte wurden zentrifugiert (100.000 × g, 4°C, 60 Min.),
um nur eine Zytoplasmafraktion abzutrennen, so daß nur eine
Proteinfraktion unter Verwendung von 75% Ammoniumsulfat präzipitiert
wurde. Die präzipitierte
Proteinfraktion wurde in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), welche 0,5 mM
DTT enthielt, gelöst
und mit Sephadex G50 (Pharmacia, 20 mM Tris-HCl, enthaltend 0,5
mM DTT, pH 7,5, 1,3 cm × 2,6
cm) entsalzt unter Erhalt von Enzymlösungen. Die Proteine in den
Enzymlösungen
wurden unter Verwendung eines BCA-Kits (RIERCE) bestimmt. Aus den
Enzymlösungen,
die jeweils 100 μg
Protein entsprachen, wurden getrennt Proben entnommen, SDS-PAGE
unterworfen und elektrisch auf PVDF-Membranen überführt. Nachfolgend wurde die
Expression jedes Proteins unter Verwendung von HA-Antikörper oder
Myc-Antikörper
bestätigt
(2).
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Im
Ergebnis wurde die Expression von MUR1-Protein in Stamm W303/YEp-MUR1-HA
und Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYo-AtFX-Myc bestätigt, und die Expression des
AtFX-Proteins wurde in Stamm W303/pYO-AtFX-Myc und Stamm W303/YEp-MUR1-HA,
pYO-AtFX-Myc bestätigt.
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Beispiel 4
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Messung der Svntheseaktivität von GDP-L-Fucose
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Unter
Verwendung von GDP-D-Mannose als ein Substrat und 50 mM NADPH als
Cofaktor wurde die Syntheseaktivität von GDP-L-Fucose für jede in
Beispiel 3 hergestellte Enrymlösung
gemessen. Zuerst wurden 50 nmol GDP-D-Mannose zu 50 μl eines Puffers
(10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA), der 50 mM NADPH enthielt,
zugegeben. Dann wurden die Enzymlösungen, die jeweils 700 μg des Proteins
entsprachen, zu der Lösung
zugegeben und dann bei 37°C
für 1 Stunde
inkubiert. Als nächstes
wurden die Reaktionslösungen
bei 100°C
für 3 Min.
gekocht, und dann wurde das denaturierte präzipitierte Protein mittels
Zentrifugation bei 10.000 U.p.M. für 5 Min. entfernt. Der Überstand
mit einem Molekulargewicht von 10.000 oder mehr wurde unter Verwendung
von Ultrafree (0,20 μm)
entfernt, und dann wurden GDP-L-Fucose und GDP-D-Mannose mittels
HPLC gemessen. HPLC wurde unter Verwendung einer C18-Säule (Wakosil
5C18-200, Wako Pure Chemical Industries, 0,46 cm Durchmesser × 25 cm
Länge)
durchgeführt,
indem man für
die Abtrennung 0,5 M wäßrige KH2PO4-Lösung bei
1 ml/Min. durch die Säule
laufen ließ.
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Im
Ergebnis wurde die Syntheseaktivität von GDP-L-Fucose nur für den Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc,
der gleichzeitig MUR1-Protein und AtFX-Protein exprimierte, detektiert (3).
Bei dem Stamm, der nur MUR1-Protein und AtFX-Protein exprimierte,
zeigte sich keine Aktivität,
was darauf hindeutet, daß die
Aktivität
nicht für
eine einzige Expression in Hefe aufrechterhalten wird. Daher wurde gezeigt,
daß bei
der Synthese von GDP-L-Fucose AtFX-Protein nicht nur nach einer
ersten Reaktionsstufe durch MUR1-Protein GDP-L-Fucose erzeugt, sondern
daß es
auch dahingehend wirkt, daß die
aktive Form von MUR1-Protein stabilisiert wird.
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INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
die effiziente Massenproduktion von GDP-L-Fucose, die wesentlich
ist, um die Hinzufügung
von Fucose durchzuführen,
die in Zuckerketten eine sehr wichtige Funktion hat. Derzeit gibt
es keine etablierte Technik für
die einheitliche Synthese der Zuckerkette von Glycoprotein. Eine mögliche Technik
besteht darin, einheitliche Zuckerketten durch Modifizieren von
Zuckerketten in vitro zu synthetisieren, wofür ein Zuckernukleotid als Zuckerdonor
erforderlich ist. Insbesondere ist GDP-L-Fucose als Fucose unerschwinglich
teuer, und daher ist es nicht praktikabel, Modifikationsreaktionen
in vitro in großem
Maßstab
durchzuführen.
Wenn jedoch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von GDP-L-Fucose
in großen Mengen
ermöglicht,
können
in vitro Zuckerketten mit hoher Leistungsfähigkeit, zu denen Fucose hinzugefügt wurde,
hergestellt werden. SEQUENZPROTOKOLL