DE60032630T2

DE60032630T2 - Gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reduktasegene aus arabidopsis

Info

Publication number: DE60032630T2
Application number: DE60032630T
Authority: DE
Inventors: Ken-ichi Tsukuba-shi NAKAYAMA; Yoshifumi Ushiku-shi JIGAMI
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2020-03-31
Also published as: EP1231266A4; EP1231266A1; DE60032630D1; US7198932B1; JP2001145488A; WO2001038507A1; EP1231266B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Hefe, transformiert mit einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert wird, codiert, und einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydatase codiert.
STAND DER TECHNIK
Es ist bekannt, daß die Zuckerkette von Glycoprotein oder dergleichen in vivo eine sehr wichtige Rolle spielt. Daher stellt die Zuckerkettenmanipulation, durch welche die Struktur der Zuckerkette absichtlich verändert wird, nun ein wichtiges technisches Gebiet dar. Derzeitige Techniken zum Verändern von Zuckerketten umfassen beispielsweise eine chemische Technik, die chemisch synthetisierte Ziel-Zuckerketten an ein Protein bindet, eine biologische Technik, die Gene für die Synthese einer Zuckerkette innerhalb einer Zelle durch eine Genmanipulationstechnik verändert oder Glycoprotein erzeugt, indem ein Glycoprotein erzeugender Wirt verändert wird, und ein Verfahren der Zuckerkettensynthese, welches synthetische Zuckerkettenenzyme verwendet.
Der Fortschritt in der chemischen Technik bereitet nun den Weg für eine Massensynthese, es ist jedoch aufgrund der Komplexität von Zuckerketten noch nicht möglich, alle Typen von Zuckerketten in einfacher Weise bereitzustellen. Andererseits steht aufgrund der Entwicklung der Genmanipulation in der biologischen Technik nun eine Kontrolle der Expression von an der Zuckerkettensynthese beteiligten Genen zur Verfügung, die eine Veränderung von Zuckerketten ermöglicht. Eine einheitliche Synthese aller Typen von Zuckerketten ist jedoch derzeit schwierig, und für gewöhnlich liegt ein Gemisch aus verschiedenen Arten von Zuckerketten innerhalb des Produkts vor.
Im Gegensatz zu diesen Techniken ist die Zuckerkettensynthese in vitro unter Verwendung von synthetischen Zuckerkettenenzymen bei der Synthese von Zuckerketten mit einer einheitlichen Struktur sehr nützlich. Insbesondere ermöglicht die Kombination einer solchen Technik mit der biologischen Technik eine Massenproduktion von einheitlichen Zuckerketten.
Während die Zuckerkettensynthese in vitro die Verwendung von Zuckernukleotiden als Zuckerdonoren für Glycosyltransferase erfordert, machen es die unerschwinglich hohen Kosten der Herstellung von Zuckernukleotiden jedoch schwierig, das Verfahren auf eine Massenproduktion anzuwenden. Das heißt, Zuckernukleotide liegen in vivo in einer sehr geringen Anzahl vor, und es handelt sich dabei um sehr reaktive, instabile Substanzen, die über eine energiereiche Bindung verknüpft sind. Daher wird in jedem Organismus nur eine geringe Anzahl an Zuckernukleotiden erzeugt, und eine Massenproduktion derselben ist schwierig.
In den letzten Jahren hat ein Produktionssystem unter Verwendung von Bakterien ein praktikableres System zur Massenerzeugung relativ vieler Typen von Zuckernukleotiden und eine zuverlässigere Bereitstellung von Zuckernukleotiden ermöglicht. Ein Produktionssystem mit einem relativ langen Reaktionsprozeß führt jedoch zu einer geringen Ausbeute, da das System die Stufen umfaßt, bei denen man zwei Typen von Mikroorganismen mischt und die Herstellung unter Verwendung aufgebrochener Zellen durchführt, um ein in Zellen enthaltenes Material in andere Zellen einzubringen. Somit besteht ein Bedarf nach der Entwicklung einer neuen Technik.
Unter den Zuckernukleotiden ist GDP-L-Fucose als Zuckerdonor von Fucosyltransferase zur Synthese von Fucose enthaltenden Zuckerketten wesentlich. Zuckerketten, zu denen der Fucoserest hinzugefügt wurde, spielen oft eine funktionell wichtige Rolle, und somit wurde darauf gewartet, daß der Zuckerdonor in großen Mengen zu geringen Kosten bereitgestellt werden kann. Es wurde berichtet, daß die GDP-L-Fucose durch 3 Reaktionsstufen aus GDP-D-Mannose synthetisiert wird, und diese 3 Reaktionsstufen werden durch zwei Typen von Enzymen katalysiert (1) (Tonetti et al., J. Biol. Chem., Band 271, 27274 (1996)). Diese Enzyme sind allgemein in allen Organismen, die Fucose verwenden, einschließlich Prokaryonten, wie Escherichia coli, und auch Eukaryonten, wie höhere Säuger, beispielsweise Menschen, verteilt. Diese Organismen verbrauchen jedoch die synthetisierte GDP-L-Fucose, so daß sich GDP-L-Fucose nicht in ihren Zellen ansammelt. Dementsprechend führt die Isolation von GDP-L-Fucose aus einem lebenden Organismus zu einer sehr geringen Menge an GDP-L-Fucose mit hohen Kosten. Darüber hinaus erfordert die Synthese von GDP-L-Fucose auch einen langen Prozeß. Unter den derzeit gegebenen Umständen ist es schwierig, unter Verwendung des obigen Bakteriensystems eine ausreichende Menge an GDP-L-Fucose bereitzustellen.
Zwei Typen der Enzyme, die die 3 Reaktionsstufen katalysieren, sind GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase, welche die erste Reaktionsstufe der Umwandlung von GDP-D-Mannose in GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose durch eine Dehydratisierungsreaktion katalysiert, und GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, die die nachfolgenden beiden Reaktionsstufen der Epimerisierung und der Reduktion katalysiert. Für die Pflanze Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) wurde bereits MUR1 als ein Gen für GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase isoliert, welches die erste Reaktion katalysiert (Bonin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 94, 2085 (1997)). Datenbank EMBL [online] Bonin, C.P. et al.: "Arabidopsis thaliana GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase (GERI) gene, complete CDs", 16. Februar 1998, Datenbank-Hinterlegungsnummer ΔFO45286,049213 beschreibt eine Sequenz, die über ihre gesamte Länge zu 100% identisch zu SEQ ID NO:1 ist, und eine Sequenz, die über ihre gesamte Länge zu 100% identisch zu SEQ ID NO:2 ist.
Die EP0870841 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von GDP-Fucose aus GDP-Mannose durch Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor transformiert wurden, welcher die Nukleinsäuresequenzen enthält, die GDP-Mannose-4,6-dehydratase und GDP-4-keto-6-desoxymannoseepimerase/-reduktase aus E. coli enthalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wird ein Gen (AtFX-Gen) beschrieben, welches GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, abgeleitet aus Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), codiert, die die letzten beiden Reaktionsstufen bei der Synthese von GDP-L-Fucose aus GDP-D-Mannose katalysiert, und die Nukleotidsequenz des Gens wird bestimmt. GDP-L-Fucose kann durch gleichzeitige Expression des Gens und des MUR1-Gens, welches die erste Reaktionsstufe bei der Synthese von GDP-L-Fucose in Arabidopsis katalysiert, in effizienter Weise in vivo und in vitro synthetisiert werden.
Es wird auch das nachfolgende Protein beschrieben: ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert wird.
Weiterhin wird DNA beschrieben, die das nachfolgende Protein codiert: ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert wird.
Es wird ein Expressionsvektor beschrieben, der die DNA umfaßt.
Darüber hinaus wird eine Transformante beschrieben, die mit dem Expressionsvektor transformiert ist. Ein Beispiel einer solchen Transformante ist der Hefe-Stamm W303/pYO-AtFX-Myc (FERM BP-7109). Weiterhin wird auch ein Verfahren zum Herstellen von GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase beschrieben, welches das Kultivieren der Transformante in einem Medium und das Sammeln von GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase aus der erhaltenen Kultur umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert Hefe, transformiert mit einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert wird, codiert, und einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase codiert. Vorzugsweise umfaßt die GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase eine Nukleotidsequenz, die durch SEQ ID NO:2 repräsentiert ist. Ein Beispiel einer solchen Transformante ist der Hefe-Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFx-Myc (FERM BP-7108). Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Umwandeln von GDP-D-Mannose in GDP-L-Fucose unter Verwendung der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung, und ein Verfahren zum Herstellen von GDP-L-Fucose, welches das Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit GDP-D-Mannose in einem Medium und das Sammeln von GDP-L-Fucose aus der erhaltenen Kultur umfaßt.
ERLÄUTERUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS

SEQ ID NO:3 bis 6: Primer

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Enzymreaktionsprozeß von GDP-D-Mannose zu GDP-L-Fucose.
2 ist eine Fotografie von Elektroforese durch Western-Blotten, welche die Expression der MUR1- und AtFX-Proteine zeigt.
3 ist ein HPLC-Chromatogramm, welches die Ergebnisse der Messung der Syntheseaktivität von GDP-L-Fucose zeigt.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.
In der vorliegenden Beschreibung sind abgekürzte Bezeichnungen von Aminosäuresequenzen und Nukleotidsequenzen angegeben, wobei die Codes den Vorschriften von IUPAC-IUB und üblichen Namen oder Verwendungen auf dem technischen Gebiet folgen.
1. Isolation eines Gens für GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase
Das Gen für GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, welches SEQ ID NO:2 umfaßt, kann mit dem PCR-Verfahren unter Verwendung einer aus Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) hergestellten cDNA-Bibliothek als Matrize gemäß Standardtechniken isoliert werden.
Die cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana kann gemäß Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren unter Verwendung allgemein verwendeter Plasmidvektoren, von λ-Phagen abgeleiteter Vektoren oder dergleichen hergestellt werden. Weiterhin kann auch eine kommerziell erhältliche cDNA-Bibliothek, die von Arabidopsis thaliana abgeleitet ist, verwendet werden.
Das PCR-Verfahren ist eine Technik, mit der eine bestimmte Region von DNA unter Verwendung einer Kombination des Sense-Primers und des Antisense-Primers, einer thermostabilen DNA-Polymerase, einem DNA-Vervielfältigungssystem und dergleichen innerhalb von etwa 2 bis 3 Stunden in vitro spezifisch um das 10-fache bis hin zum Millionenfachen vervielfältigt werden kann. Die SEQ ID NO:2 umfassende DNA kann unter Verwendung geeigneter Primer mit dem PCR-Verfahren vervielfältigt werden.
Primer, die in der obigen PCR verwendet werden können, können beispielsweise auf Basis von Nukleotidsequenzhomologie mit anderen Typen von Enzymgenen ausgestaltet werden. Nukleotidsequenzen anderer Typen von Enrymgenen, die hier verwendet werden können, sind diejenigen, die in einer bekannten DNA-Sequenz-Datenbank, wie GenBank, die Fachleute auf dem Gebiet leicht durchsuchen können, hinterlegt wurden. Beispiele solcher Nukleotidsequenzen umfassen diejenigen, die unter den Hinterlegungsnummern 038473, 058766 und AF045286 bei GenBank hinterlegt wurden. Bei der Ausgestaltung eines Primers kann beispielsweise eine Sequenz einer Restriktionsenzymstelle in der Nukleotidsequenz des Primers enthalten sein, wenn nach der PCR-Vervielfältigung eine Genmanipulation in Erwägung gezogen wurde.
Ein Beispiel von Primern, die wie oben beschrieben ausgestaltet sind, umfaßt diejenigen, die die folgenden Nukleotidsequenzen umfassen.
Vorwärts-Primer:

5'-ATTGGTACCATGTCTGACAAATCTGCCAAAATCTTCGTC-3' (SEQ ID NO:3)

Rückwärts-Primer:

5'-TTAGTCGACGATATCTCGGTTGCAAACATTCTTCAAATACCAATCATAAG-3' (SEQ ID NO:4)

Der unterstrichene Abschnitt in der Nukleotidsequenz des Vorwärts-Primers bezeichnet die KpnI-Stelle und der unterstrichene Abschnitt in der Nukleotidsequenz des Rückwärts-Primers be zeichnet die EcoRV-Stelle. Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann mittels PCR unter Verwendung dieser Primer gut vervielfältigt werden.
Zusätzlich zu einer cDNA-Bibliothek, die als Matrize und Primer verwendet wird, sollte die PCR-Lösung für die Durchführung von PCR durch thermostabile DNA-Polymerase, ein Gemisch aus dNTPs und dergleichen ergänzt werden. Eine solche PCR-Lösung kann von Fachleuten auf dem Gebiet in geeigneter Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann eine PCR-Lösung so hergestellt werden, daß sie die Zusammensetzung hat, wie sie in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt ist. Tabelle 1 Zusammensetzung der PCR-Lösung
Die PCR-Bedingungen können von Fachleuten auf dem Gebiet entsprechend den Nukleotidsequenzen der zu verwendenden Primer oder dergleichen in geeigneter Weise bestimmt werden. Beispielsweise kann eine PCR-Reaktion mit 30 Zyklen eines Reaktionszyklus durchgeführt werden, bestehend aus Denaturierung bei 94°C für 15 Sek., Annealen bei 50°C für 30 Sek. und Verlängern bei 68°C für 2 Min. Eine solche Reaktion kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Thermozyklers oder dergleichen leicht durchgeführt werden.
Mit der obigen PCR vervielfältigte DNA kann in ein geeignetes Plasmid kloniert werden. Es kann jedes Plasmid für die Aufnahme von DNA verwendet werden, soweit es verdoppelt und in einem Wirt gehalten werden kann. Beispielsweise können pBR322, pUC19 oder dergleichen, die von Escherichia coli abgeleitet sind, verwendet werden.
Weiterhin kann auch das Klonieren von vervielfältigter DNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits durchgeführt werden. Ein Beispiel eines solchen Kits ist der TA-Klonierungskit (Invitrogen). Wenn ein kommerziell erhältlicher Kit verwendet wird, können die in dem Kit enthaltenen Plasmide verwendet werden.
Beispiele eines Verfahrens für die Einbringung eines Plasmids, welches die SEQ ID NO:2 umfassende DNA enthält, in einen Wirt, wie Escherichia coli, umfassen ein Verfahren, wie es von T. Maniatis et al. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1. Auflage S. 250 (1982)] beschrieben wurde, ein Verfahren, wie es von F.M. Ausubel et al. [Short Protocols in Molecular Biology, 4. Auflage, 1-27 (1999)] beschrieben wurde, und dergleichen.
Die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:2 umfassenden DNA kann durch ein bekanntes Verfahren, wie ein Didesoxyverfahren, unter Verwendung der wie oben beschrieben erhaltenen Plasmide bestimmt werden. Eine solche Sequenzierung kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits durchgeführt werden. Ein Beispiel eines solchen Kits ist ein Sequence-Kit (PE Biosystems). Sobald die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:2 umfassenden DNA bestimmt wurde, kann eine abgeleitete Aminosäuresequenz des SEQ ID NO:1 umfassenden Proteins erhalten werden.
Das Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch SEQ ID NO:1 repräsentiert wird, hat GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase-Aktivität.
Die DNA umfaßt SEQ ID NO:2, die eine Aminosäuresequenz des Proteins, wie oben beschrieben, codiert.
2. Konstruktion eines Expressionsvektors zum Exprimieren der SEQ ID NO:2 umfassenden DNA
Ein Expressionsvektor kann konstruiert werden, indem die SEQ ID NO:2 umfassende klonierte DNA abstromig von einem Promotor innerhalb eines Vektors, der für die Expression der DNA geeignet ist, ligiert wird. Beispiele eines Vektors umfassen von Hefe abgeleitete Plasmide, wie YEp352GAP, YEp51, pSH19 und pYO325 und dergleichen.
Die DNA, die zur Einbringung in einen Expressionsvektor verwendet werden soll, ist die DNA, die SEQ ID NO:2 umfaßt und das Translations-Startcodon, ATG, an ihrem 5'-Ende und das Stopcodon, TAA, TGA oder TAG, an ihrem 3'-Ende hat. Weiterhin können zur Expression beispielsweise ein Gen für ein markiertes Antigen, welches ein Teil eines Hämagglutininproteins ist, oder das Gen für ein markiertes Protein, wie GST-Protein, an das 5'- oder das 3'-Ende gebunden sein.
Um das Gen zu exprimieren, wird vorzugsweise ein Promotor ausstromig von dem Gen ligiert. Es kann jeder Promotor verwendet werden, solange es ein geeigneter Promotor ist, der mit einem für die Genexpression zu verwendenden Wirt kompatibel ist. Beispiele eines Promotors umfassen beispielsweise EN01-Promotor, GAL10-Promotor, GAPDH-Promotor und ADH-Promotor.
Ein Terminator kann abstromig von dem Gen ligiert sein, um die Transkription des Gens zu beenden. Es kann jeder Terminator verwendet werden, solange es ein geeigneter Terminator ist, der einem für die Genexpression zu verwendenden Wirt entspricht. Wenn ein zu transformierender Wirt Hefe ist, umfassen Beispiele eines Terminators z.B. EN01-Terminator, GAL10-Terminator, GAPDH-Terminator und ADH-Terminator.
Die Einbringung der SEQ ID NO:2 umfassenden DNA, eines Promotors, eines Terminators und dergleichen in einen Expressionsvektor kann von Fachleuten auf dem Gebiet in geeigneter Weise durchgeführt werden.
3. Herstellung einer Hefe, die den Expressionsvektor enthält
Eine Hefe, die das SEQ ID NO:1 umfassende Protein exprimiert, kann durch Einbringen des Expressionsvektors, der wie oben unter " 2. Konstruktion eines Expressionsvektors zum Exprimieren der SEQ ID NO:2 umfassenden DNA" beschrieben konstruiert ist, in Hefe hergestellt werden.
Es kann jede Hefe verwendet werden, soweit sie nicht GDP-L-Fucose in vivo verbraucht. Beispiele von Hefe umfassen Spalthefe (Saccharomyces cerevisiae) und andere Hefe (Pichia pastoris und dergleichen). Wenn Hefeextrakte zur Herstellung von GDP-L-Fucose verwendet werden, d.h. wenn GDP-L-Fucose in vitro erzeugt wird, kann jeder Wirt verwendet werden, solange er die Expression des SEQ ID NO:1 umfassenden Proteins innerhalb des Zytoplasmas ermöglicht.
Die obige Hefe kann durch allgemein verwendete Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise wird der Expressionsvektor durch ein Lithiumverfahren, ein Elektroporationsverfahren oder dergleichen eingebracht.
Die erhaltene Transformante ist beispielsweise der Stamm W303/pYO-AtFX-Myc (FERM BP-7109).
Um GDP-L-Fucose durch Kultivieren der Hefe zu erzeugen, ist es erforderlich, daß die Wirte zuvor mit Expressionsvektoren transformiert werden, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase exprimieren, oder daß sie GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase von sich aus exprimieren. Als ein Gen für GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase wird vorzugsweise das von Arabidopsis thaliana abgeleitete MUR1-Gen verwendet.
Ein Expressionsvektor, der GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase exprimiert, kann konstruiert werden, wie es in dem obigen Verfahren für einen Expressionsvektor, der das SEQ ID NO:1 umfassende Protein exprimiert, beschrieben ist. Primer, die in PCR zum Klonieren von DNA, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase codiert, verwendet werden sollen, sollten jedoch beispielsweise durch Vergleichen der Nukleotidsequenzen bekannter GDP-D-Mannose-4,6-dehydratasegene ausgestaltet werden. Beispielsweise können Primer mit den folgenden Nukleotidsequenzen verwendet werden.
Vorwärts-Primer:

5'-GTCGAATTCATGGCGTCAGAGAACAAC-3' (SEQ ID NO:5)

Rückwärts-Primer:

5'-GAACTCGAGAGGTTGCTGCTTAGCATC-3' (SEQ ID NO:6)

Ein Beispiel der oben beschriebenen Hefe mit dem darin eingebrachten Expressionsvektor, der GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase exprimiert, ist der Stamm W303/YEp-MUR1-HA (FERM BP-7107). Weitere Beispiele von Hefe mit dem darin eingebrachten Expressionsvektor umfassen den Stamm W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc (FERM BP-7108).
Die oben genannten Stämme, Stamm W303/pYO-AtFX-Myc, Stamm W303/YEp-MUR1-HA und Stamm W303/YEp-MUR1HA, pYO-AtFX-Myc, wurden mit den Hinterlegungsnummern FERM BP-7109, FERM BP-7107 bzw. FERM BP-7108 bei der internationalen Patent-Organismus-Hinterlegungsstelle, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Chuo-6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, JAPAN), hinterlegt.
4. Herstellung des SEQ ID NO:1 umfassenden Proteins durch Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung
Die Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung, d.h. Hefe, transformiert mit einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert wird, codiert, und einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase codiert (beispielsweise Stamm W303/pYO-AtFX-Myc) oder eine Hefe, in die sowohl der erstgenannte Expressionsvektor als auch ein GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase exprimierender Expressionsvektor eingebracht wurde, wird in einem geeigneten Medium kultiviert, so daß GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase aus der Kultur isoliert werden kann.
Die Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung eines Standardverfahrens zum Kultivieren von Wirten in einem Medium kultiviert werden. Als Medium zum Kultivieren von Transformanten, die unter Verwendung von Hefen als Wirten erhalten wurden, können entweder natürliche oder synthetische Medien verwendet werden, soweit diese Medien Quellen enthalten, die von Mikroorganismen verwendet werden, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze, und eine effiziente Kultivierung der Hefen ermöglichen.
Beispiele der hier verwendeten Kohlenstoffquellen umfassen Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose und Stärke, organische Säuren, wie Essigsäure und Propionsäure, und Alkohole, wie Ethanol und Propanol.
Beispiele der hier verwendeten Stickstoffquellen umfassen anorganische Säuren, wie Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, oder Ammoniumsalze von organischen Säuren, andere Stickstoff enthaltende Verbindungen, Pepton, Brühe und Maisquellwasser.
Beispiele der hier verwendeten anorganischen Salze umfassen primäres Kaliumphosphat, sekundäres Kaliumphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)sulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat.
Insbesondere umfassen Beispiele eines Mediums zum Kultivieren von Hefe ein YPD-Medium und 5D-Medium.
Hefen werden vorzugsweise für 12 Stunden bis 5 Tage bei 25°C bis 37°C kultiviert. Falls es notwendig ist, kann das Kultivieren unter Belüften, Schütteln oder dergleichen durchgeführt werden. Der pH-Wert ist nicht speziell beschränkt, solange er sich in einem normalerweise verwendeten Bereich befindet. Der pH-Wert wird bevorzugt in einem Bereich von 5,0 bis 7,5 und bevorzugter auf ungefähr 7,5 gehalten. Der pH-Wert wird unter Verwendung anorganischer oder organischer Säuren, alkalischer Lösungen oder dergleichen eingestellt. Falls es notwendig ist, können Antibiotika, wie Ampicillin oder Tetracyclin, während des Kultivierens zu dem Medium zugegeben werden. Um Mikroorganismen zu kultivieren, die mit Expressionsvektoren transformiert wurden, welche einen induzierbaren Promotor als Promotor aufweisen, können notwendigenfalls Induktoren zu dem Medium zugegeben werden.
Nach dem Kultivieren wird das SEQ ID NO:1 umfassende Protein aus der Kultur gesammelt. Wenn das Enzym innerhalb der Hefe oder intrazellulär erzeugt wird, kann das Enzym beispielsweise durch Aufspalten der Hefe gesammelt werden. Wenn das Enzym außerhalb der Hefe oder extrazellulär erzeugt wird, wird das Kulturmedium in intaktem Zustand verwendet, um das Enzym zu sammeln, oder das Enzym kann gesammelt werden, nachdem die Hefe mittels Zentrifugation oder der gleichen entfernt wurde. Das Enzym kann mit einem oder mit einer Kombination standardmäßiger biochemischer Verfahren, die zur Isolation und Reinigung von Protein verwendet werden, wie Ammoniumsulfatpiäzipitation, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und dergleichen, gesammelt werden.
Ob es sich bei dem wie oben beschrieben erhaltenen Protein um das SEQ ID NO:1 umfassende Protein handelt, kann durch eine standardmäßige enzymologische Reaktion, Elektroforese, wie SDS-Polyacrylamidgelelektroforese, immunologische Verfahren, wie Antigen-Antikörper-Reaktion, oder dergleichen bestätigt werden.
5. Herstellung von GDP-L-Fucose
GDP-L-Fucose kann durch Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung oder durch Enzymreaktion unter Verwendung von Enzymquellen, die für die Herstellung von GDP-L-Fucose notwendig sind, hergestellt werden.
(1) Herstellung von GDP-L-Fucose durch Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung
Eine Hefe (beispielsweise der Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc), transformiert mit einem darin eingebrachten Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert wird, codiert, und einem darin eingebrachten Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase codiert, wird mit GDP-D-Mannose in einem geeigneten Medium kultiviert, und dann kann GDP-L-Fucose aus der erhaltenen Kultur isoliert und gereinigt werden.
Die Bedingungen zum Kultivieren von Hefen, wie Medium, Temperatur, Zeitdauer der Kultivierung, pH-Wert und andere, sind wie oben unter "4. Herstellung des SEQ ID NO:1 umfassenden Proteins durch Kultivieren der Hefe gemäß der vorliegenden Erfindung" beschrieben. Notwendigenfalls kann ein Cofaktor, wie NADPH, zu einem Medium zugegeben werden.
GDP-L-Fucose kann durch Trennen von Wirtszellen von einem Medium mittels Zentrifugation, Aufbrechen der Wirtszellen, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation, aus der obigen Kultur extrahiert werden. Wenn der Wirt Hefe ist, werden die Zellen beispielsweise mit Glasperlen aufgebrochen und dann Zentrifugation unterworfen, so daß eine Überstandsfraktion, die GDP-L-Fucose enthält, erhalten werden kann.
GDP-L-Fucose kann von Fachleuten auf dem Gebiet leicht aus der obigen Überstandsfraktion isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise kann die Isolation und Reinigung von GDP-L-Fucose durchgeführt werden, indem man Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht mittels einer Gelfiltrationstechnik sammelt und dann mittels HPLC abtrennt. Das Gel für die Gelfiltration, die Säulengröße, das Säulenelutionsmittel, die HPLC-Säule und das -Elutionsmittel und dergleichen, wie sie hier verwendet werden, können von Fachleuten auf dem Gebiet in geeigneter Weise ausgewählt werden.
(2) Herstellung von GDP-L-Fucose durch Enzymreaktion unter Verwendung von Enzymquellen
GDP-L-Fucose kann durch eine Enzymreaktion unter Verwendung von Enzymquellen, die für die Herstellung notwendige Enzyme enthalten, hergestellt werden.
Wenn GDP-D-Mannose als Substrat einer Enzymreaktion verwendet wird, sind GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase und GDP-4-keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase (das SEQ ID NO:1 umfassende Protein) notwendige Enzyme. Diese Enzyme können hier verwendet werden, indem man verschiedene Transformanten, die die beiden Enzyme jeweils exprimieren (beispielsweise Stamm W303/YEp-MUR1-HA und Stamm W303/pYO-AtFX-Myc) in Medium kultiviert, um die Enzyme getrennt zu exprimieren, und dann die Enzyme mischt. Vorzugsweise wird jedoch eine Transformante (beispielsweise Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc), die diese beiden Enzyme exprimiert, für die Expression in Medium kultiviert. Diese Enzyme können gemäß einem Verfahren, wie es oben unter "4. Herstellung des SEQ ID NO:1 umfassenden Proteins durch Kultivieren der Transformante gemäß der vorliegenden Erfindung" beschrieben ist, aus der Transformantenkultur isoliert werden. Des weiteren muß die für die obige Enzymreaktion verwendete Enzymquelle kein gereinigtes Enzym sein, sondern es kann sich um einen Rohextrakt, wie den Zellextrakt der oben beschriebenen Transformante, handeln.
Die Enzymreaktion kann unter Verwendung einer Reaktionslösung, die so hergestellt ist, daß sie die obige Enzymquelle und GDP-D-Mannose zur Verwendung als Substrat enthält, unter geeigneten Bedingungen durchgeführt werden. Die Reaktionslösung kann durch einen Cofaktor, wie NADPH, ergänzt sein, falls dies notwendig ist. Die Reaktionsbedingungen sind nicht speziell beschränkt, da die Bedingungen von Fachleuten auf dem Gebiet in geeigneter Weise bestimmt werden können. Die Temperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 30°C bis 37°C und beträgt bevorzugter ungefähr 37°C. Der pH-Wert liegt vorzugsweise im Bereich von 6,0 bis 8,0 und beträgt bevorzugter etwa 7,5. Um den pH-Wert innerhalb eines gewünschten Bereichs zu haften, kann ein Puffer, wie Tris-HCl, verwendet werden.
GDP-L-Fucose kann von Fachleuten auf dem Gebiet leicht aus einer Enzymreaktionslösung isoliert werden. Beispielsweise wird das Protein in einer Enzymreaktionslösung thermisch denaturiert, gefolgt von Zentrifugation und Enffernung mit einem Membranfilter oder dergleichen, und dann wird die GDP-L-Fucose isoliert und mittels HPLC gereinigt.
Die GDP-L-Fucose ist als ein Zuckerdonor wesentlich, wenn Fucose enthaltende Zuckerketten synthetisiert werden. Das heißt, die GDP-L-Fucose ist bei Hinzufügung von Fucose zu Zuckerketten, von denen angenommen wird, daß sie funktionell wichtig sind, von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung wird nun nachfolgend unter Verwendung von Beispielen ausführlicher beschrieben.
Beispiel 1
Isolation und Sequenzierung des AtFX-Gens
Unter Verwendung der cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) wurde das AtFX-Gen mit dem PCR-Verfahren kloniert. QUICK-Clone-cDNA (CLONTECH) wurde als die cDNA-Bibliothek verwendet.
Primer wurden auf Basis der in einer Datenbank (Name der Datenbank: GenBank, Hinterlegungsnummern: U38473, U58766 und AF045286) hinterlegten Nukleotidsequenzen ausgestaltet. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Primer so ausgestaltet, daß sie zunächst eine KpnI-Stelle auf dem N-terminalen Abschnitt und eine EcoRV-Stelle auf dem C-terminalen Abschnitt enthielten, so daß der ein Protein codierende Abschnitt durch ein Restriktionsenzym leicht gespalten werden konnte und ein Gen für ein markiertes Antigen oder dergleichen leicht eingebracht werden konnte. Die Nukleotidsequenzen der jeweiligen Primer sind unten gezeigt.
Vorwärts-Primer:

5'-ATTGGTACCATGTCTGACAAATCTGCCAAAATCTTCGTC-3' (SEQ ID NO:3)

Rückwärts-Primer:

5'-TTAGTCGACGATATCTCGGTTGCAAACATTCTTCAAATACCAATCATAAG-3' (SEQ ID NO:4)

Hier bezeichnet der unterstrichene Abschnitt in der Nukleotidsequenz des Vorwärts-Primers die KpnI-Ste11e, und der unterstrichene Abschnitt in der Nukleotidsequenz des Rückwärts-Primers bezeichnet die EcoRV-Stelle. Die so ausgestalteten Primer wurden mittels einer Standardtechnik synthetisiert.
PCR wurde unter Verwendung der obigen QUICK-Clone-cDNA (CLONTECH) als Matrize mit den obigen Primern durchgeführt. Die Zusammensetzung der PCR-Lösung ist wie in Tabelle 2 unten gezeigt. Tabelle 2 Zusammensetzung der PCR-Lösung
PCR wurde durch Umsetzen während 30 Zyklen, mit Temperaturbedingungen von 94°C für 15 Sek. (Denaturierung), 50°C für 30 Sek. (Annealen) und 68°C für 2 Min. (Verlängerung) durchgeführt.
Das DNA-Vervielfältigungsfragment mit etwa 1 kBp Länge, erhalten durch PCR, wurde mittels Agaroseelektroforese abgetrennt und dann unter Verwendung des TA-Klonierungskits (Invitrogen) in den pCR2.1-Vektor eingebracht. Die Nukleotidsequenz der klonierten DNA wurde mit einem Sequence-Kit (PE Biosystems) unter Verwendung eines Didesoxyverfahrens bestimmt. Die Nukleo tidsequenz und die durch die Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz werden durch SEQ ID NO:2 bzw. SEQ ID NO:1 repräsentiert.
Beispiel 2
Herstellung des AtFX-Gen-Exoressionsvektors und des MUR1-Gen-Exgressionsvektors und Herstellung einer Hefe-Transformante die diese Plasmide enthält
3x Myc-Gen (Evan et al., Mol. Cell. Biol., Band 5, 3610 (1985)), welches ein markiertes Antigen codiert, wurde in die EcoRV-Stelle in dem AtFX-Gen im Leseraster mit dem AtFX-Gen eingebracht, welches in den pCR2.1-Vektor eingebracht worden war. Das Myc-Gen enthaltendes AtFX-Gen wurde mit KpnI-XhoI herausgespalten. Das Fragment wurde in die KpnI-SalI-Stelle in dem Expressionsvektor YEp352GAP-11 eingebracht, welcher durch Ersetzen der Multiklonierungsstelle des Hefeexpressionsvektors YEp352GAP (Roy et al., J. Biol. Chem., Band 273, 2583 (1998)) durch den Abschnitt EcoRI bis SalI der Multiklonierungsstelle von pUC18 hergestellt wurde. Weiterhin wurde ein Fragment, welches drei Abschnitte, GAPDH-Promotor, AtFX-Myc und GAPDH-Terminator, umfaßte, unter Verwendung von BamHI aus dem Vektor herausgespalten. Das Fragment wurde in die BamHI-Stelle in dem Hefevektor pY0325 mit hoher Kopienzahl (Qadota et al., Yeast, Band 8, 735 (1992)), der LUE2-Marker enthielt, eingebracht, wodurch der Expressionsvektor pYO-AtFX-Myc für das AtFX-Gen konstruiert wurde.
Das MUR1-Gen wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 ebenfalls mittels PCR kloniert, mit der Ausnahme, daß die hier verwendeten PCR-Primer die folgenden Nukleotidsequenzen haben.
Vorwärts-Primer:

5'-GTCGAATTCATGGCGTCAGAGAACAAC-3' (SEQ ID NO:5)

Rückwärts-Primer:

5'-GAACTCGAGAGGTTGCTGCTTAGCATC-3' (SEQ ID NO:6)

Als nächstes wurde das MUR1-Gen in die EcoRI-Stelle in dem Vektor YEp352GAP eingebracht (Roy et al., J. Biol. Chem., Band 273, 2583 (1998)), und dann wurde mit 3x HA markiertes Antigen-Gen im Leseraster in die PvuII-Stelle eingebracht, wodurch der Expressionsvektor YEp-MUR1-HA für das MUR1-Gen konstruiert wurde.
Diese Expressionsvektoren wurden separat oder zusammen in den Hefestamm W303-1A (ura3, lue2, his3, trp1, ade2) (Kainuma et al., Glycobiology, Band 9, 133 (1999)) transformiert, wodurch der Stamm W303/pYO-AtFX-Myc, der nur pYO-AtFX-Myc enthält, Stamm W303/YEp-MUR1-HA, der nur YEp-MUR1-HA enthält, und Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc, der sowohl pYO-AtFX-Myc als auch YEp-MUR1-HA enthält, erhalten wurden.
Beispiel 3
Expression von MUR1-Protein und AtFX-Protein in Hefe
Ob die Proteine in jeder Zelle der in Beispiel 2 erhaltenen Transformanten exprimiert wurden, wurde durch Western-Blotten bestätigt.
Zuerst wurden die obigen Transformanten (Stamm W303/YEp-MUR1-HA, Stamm W303/pYO-AtFX-Myc und Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc) und Stamm W303 separat auf SD-Medium bei 30°C für 24 Stunden kultiviert, und dann wurden die erhaltenen Hefezellen mit Glasperlen aufgebrochen. Die aufgebrochenen Produkte wurden zentrifugiert (100.000 × g, 4°C, 60 Min.), um nur eine Zytoplasmafraktion abzutrennen, so daß nur eine Proteinfraktion unter Verwendung von 75% Ammoniumsulfat präzipitiert wurde. Die präzipitierte Proteinfraktion wurde in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), welche 0,5 mM DTT enthielt, gelöst und mit Sephadex G50 (Pharmacia, 20 mM Tris-HCl, enthaltend 0,5 mM DTT, pH 7,5, 1,3 cm × 2,6 cm) entsalzt unter Erhalt von Enzymlösungen. Die Proteine in den Enzymlösungen wurden unter Verwendung eines BCA-Kits (RIERCE) bestimmt. Aus den Enzymlösungen, die jeweils 100 μg Protein entsprachen, wurden getrennt Proben entnommen, SDS-PAGE unterworfen und elektrisch auf PVDF-Membranen überführt. Nachfolgend wurde die Expression jedes Proteins unter Verwendung von HA-Antikörper oder Myc-Antikörper bestätigt (2).
Im Ergebnis wurde die Expression von MUR1-Protein in Stamm W303/YEp-MUR1-HA und Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYo-AtFX-Myc bestätigt, und die Expression des AtFX-Proteins wurde in Stamm W303/pYO-AtFX-Myc und Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc bestätigt.
Beispiel 4
Messung der Svntheseaktivität von GDP-L-Fucose
Unter Verwendung von GDP-D-Mannose als ein Substrat und 50 mM NADPH als Cofaktor wurde die Syntheseaktivität von GDP-L-Fucose für jede in Beispiel 3 hergestellte Enrymlösung gemessen. Zuerst wurden 50 nmol GDP-D-Mannose zu 50 μl eines Puffers (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA), der 50 mM NADPH enthielt, zugegeben. Dann wurden die Enzymlösungen, die jeweils 700 μg des Proteins entsprachen, zu der Lösung zugegeben und dann bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Als nächstes wurden die Reaktionslösungen bei 100°C für 3 Min. gekocht, und dann wurde das denaturierte präzipitierte Protein mittels Zentrifugation bei 10.000 U.p.M. für 5 Min. entfernt. Der Überstand mit einem Molekulargewicht von 10.000 oder mehr wurde unter Verwendung von Ultrafree (0,20 μm) entfernt, und dann wurden GDP-L-Fucose und GDP-D-Mannose mittels HPLC gemessen. HPLC wurde unter Verwendung einer C18-Säule (Wakosil 5C18-200, Wako Pure Chemical Industries, 0,46 cm Durchmesser × 25 cm Länge) durchgeführt, indem man für die Abtrennung 0,5 M wäßrige KH₂PO₄-Lösung bei 1 ml/Min. durch die Säule laufen ließ.
Im Ergebnis wurde die Syntheseaktivität von GDP-L-Fucose nur für den Stamm W303/YEp-MUR1-HA, pYO-AtFX-Myc, der gleichzeitig MUR1-Protein und AtFX-Protein exprimierte, detektiert (3). Bei dem Stamm, der nur MUR1-Protein und AtFX-Protein exprimierte, zeigte sich keine Aktivität, was darauf hindeutet, daß die Aktivität nicht für eine einzige Expression in Hefe aufrechterhalten wird. Daher wurde gezeigt, daß bei der Synthese von GDP-L-Fucose AtFX-Protein nicht nur nach einer ersten Reaktionsstufe durch MUR1-Protein GDP-L-Fucose erzeugt, sondern daß es auch dahingehend wirkt, daß die aktive Form von MUR1-Protein stabilisiert wird.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die effiziente Massenproduktion von GDP-L-Fucose, die wesentlich ist, um die Hinzufügung von Fucose durchzuführen, die in Zuckerketten eine sehr wichtige Funktion hat. Derzeit gibt es keine etablierte Technik für die einheitliche Synthese der Zuckerkette von Glycoprotein. Eine mögliche Technik besteht darin, einheitliche Zuckerketten durch Modifizieren von Zuckerketten in vitro zu synthetisieren, wofür ein Zuckernukleotid als Zuckerdonor erforderlich ist. Insbesondere ist GDP-L-Fucose als Fucose unerschwinglich teuer, und daher ist es nicht praktikabel, Modifikationsreaktionen in vitro in großem Maßstab durchzuführen. Wenn jedoch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von GDP-L-Fucose in großen Mengen ermöglicht, können in vitro Zuckerketten mit hoher Leistungsfähigkeit, zu denen Fucose hinzugefügt wurde, hergestellt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Hefe, transformiert mit einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NO:1 repräsentiert wird, codiert, und einem Expressionsvektor, welcher DNA umfaßt, die GDP-D-Mannose-4,6-dehydratase codiert.
Hefe nach Anspruch 1, wobei die GDP-4-Keto-6-desoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reduktase eine Nukleotidsequenz, repräsentiert durch SEQ ID NO:2, umfaßt.
Verfahren zur Umwandlung von GDP-D-Mannose in GDP-L-Fucose unter Verwendung der Hefe nach Anspruch 1 oder Anspruch 2.
Verfahren zur Herstellung von GDP-L-Fucose, welches das Kultivieren der Hefe nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zusammen mit GDP-D-Mannose in einem Medium und das Sammeln von GDP-L-Fucose aus der erhaltenen Kultur umfaßt.