JP3283551B2 - 酵母中でスクアレンおよび特異的なステロールの蓄積を増加させるための方法と組成物 - Google Patents

酵母中でスクアレンおよび特異的なステロールの蓄積を増加させるための方法と組成物

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵母においてスクアレ
ンおよび特異的なステロールの蓄積を増加させるための
方法および組成物に関するものである。ステロールおよ
びステロールの蓄積は、HMG-CoA還元酵素活性を持つポ
リペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを上昇させ
ることにより増加させる。
【０００２】
【従来の技術】ここで用いられる、「ステロール」とい
う語は、３つの融合したフェナントレン配置のシクロヘ
キサン環(A、B、およびC)、および末端のシクロペンタン環
(D)を含み、以下に示す構造式および炭素分子位置番号を
持つ、融合還元環系シクロペンタ-[α]-フェナントレン
の誘導物を意味する:
【０００３】
【０００４】ここでRは8から10炭素原子の側鎖である。
【０００５】ステロールは代謝的には酢酸に由来する。
酢酸補酵素A(CoA)はアセトアセチルCoAと反応して3-ヒ
ドロキシ-3-メチルグルタリルCoA(HMG-CoA)を形成する。
HMG-CoAは、HMG-CoA還元酵素によって触媒される不可逆
反応によって還元されてメバロン酸となる。メバロン酸
はリン酸化された後、脱カルボキシル化されてイソペン
テニル-ピロフォスフェート(IPP)となる。連続的な異性
体化、縮合、および脱水素反応過程により、IPPはジェラニ
ルピロフォスフェート(GPP)に転換される。GPPはIPPと結
合してファルネシルピロフォスフェート(FPP)を形成し、
その2分子が還元的に縮合して30炭素のステロール前駆
体であるスクアレンを形成する。
【０００６】酵母では、スクアレンはスクアレンエポキ
シドに転換され、次に環状化されてラノステロールを形
成する。ラノステロールは4位に二つのメチル基、14位に
メチル基、8(9)位に二重結合、およびCH3CH(CH2)2CH=C(CH
3)2の化学式で示される８炭素の側鎖を持つ。
【０００７】ラノステロールは連続的に14位および4位
で脱メチル化されて、ザイモステロール(コレスタ-8,24-
ジエノール)を形成し、それは図１に模式的に示した5つ
の一連の酵素反応によって天然の野生型酵母で合成され
る最も豊富なステロールであるエルゴステロール(エル
ゴスタ-5,7,22-トリエノール)に転換される。
【０００８】５つの反応は： ａ． ２４−メチルトランスフェラーゼによって触媒さ
れる、２４位の炭素のメチル化；ｂ．Δ８−Δ７イソメ
ラーゼによって触媒される、８（９）位から７（８）位
への二重結合の移動； ｃ． ５−デヒドロゲナーゼ（脱飽和酵素）によって触
媒される、５（６）位への二重結合の導入； ｄ． ２２−デヒドロゲナーゼ（脱飽和酵素）によって
触媒される、２２（２３）位への二重結合の導入；およ
び、 ｅ． ２４（２８）−ヒドロゲナーゼ（還元酵素）によ
って触媒される、２４（２８）位の二重結合の除去、で
ある。
【０００９】サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyce
s cerevisiae)(S.セレビシエ)の野生型酵母においては、
これらの反応の優先順位はa、b、c、d、およびeであると考
えられている[パークス(Parks)他、CRC Critical Review
s in Microbiology, 6:301-341 (1978)]。
【００１０】このような優先経路にしたがえば、ザイモ
ステロールは連続的にフェコステロール[エルゴスタ-8,
24(28)-ジエノール]、エピステロール[エルゴスタ-7,24
(28)-ジエノール]、エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノー
ル、エルゴスタ-5,7,22,24(28)-テトラエノール、そして
最後にエルゴステロールに転換される。
【００１１】優先経路に関与する反応を触媒する酵素が
基質特異的なものならば、上述のステロール6種のみを酵
母中で見いだせることが期待される。しかしながら、そう
ではなかった。18種のステロールが見いだされ、報告され
ている[たとえば、パークス他、CRC Critical Reviews in
Microbiology, 6:301-341 (1978);ウッズ(Woods)他、 M
icrobios, 10(A):73-80 (1974);バード(Bard)他、Lipid
s, 12:645-654 (1977)を参照のこと(表1参照)]。したが
って、少なくともこれらの酵素の幾つかは基質特異的で
はない。
【００１２】 表１ ステロール 必要な酵素* 1. ザイモステロール(コレスタ-8,24-ジエノール) なし 2. フェコステロール(エルゴスタ-5,24(28)-ジエノール) a 3. エピステロール(エルゴスタ-7,24(28)-ジエノール) a,b 4. エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノール a,b,c 5. エルゴスタ-5,7,22,24(28)-テトラエノール a,b,c,d 6. エルゴステロール(エルゴスタ-5,7,22-トリエノール a,b,c,d,e 7. エルゴスタ-7,22,24(28)-トリエノール a,b,d 8. コレスタ-7,24-ジエノール b 9. コレスタ-5,7,24-トリエノール b,c 10. コレスタ-5,7,22,24-テトラノール b,c,d 11. エルゴスタ-5,7-ジエノール a,b,c,e 12. エルゴスタ-7,22-ジエノール a,b,d,e 13. エルゴスタ-7-エノール a,b,e 14. エルゴスタ-5,8-ジエノール a,c,e 15. エルゴスタ-5,8,22-トリエノール a,c,d,e 16. エルゴスタ-8,22-ジエノール a,d,e 17. エルゴスタ-8-エノール a,e 18. エルゴスタ-8,14,24(28)-トリエノール a * 示されたステロールの合成に理論的に必要とされる酵素 基質特異性が欠けているにもかかわらず、ステロール生
合成経路の特異的な変化により予想できる結果が得られ
ることも期待され得る。現在入手可能なデータからはこ
のような予想可能性は存在しないことが示されている。
【００１３】例えば、ザイモステロール-24-メチルトラ
ンスフェラーゼ(酵素a)の発現に欠損のある、erg6と呼ば
れるS.セレビシエ変異株は、合成にこの酵素の活性が理
論的に必要とされないステロールである、表1のステロー
ル1および8-10が蓄積することが予測され得る。パークス
他、CRC Critical Reviews in Microbiology, 6:301-341
(1978)では、しかしながら、erg6変異株はザイモステロ
ール(#1)、コレスタ-5,7,24-トリエノール(#9)、およびコ
レスタ-5,7,22,24-テトラノール(#10)のみを蓄積するこ
とが報告されている。一方、バード他、Lipids、12:645-654
(1977)ではerg6変異株はステロール#1と#10のみが蓄積
すると報告されている。
【００１４】エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノール-22-
デヒドロゲナーゼ(酵素d)の発現に欠損のある、erg5と呼
ばれるS.セレビシエ変異株は、ステロール1-4、6、8、9、11、
13、14、17、および18が蓄積すると予測され得る。パークス
他、CRC Critical Reviews in Microbiology, 6:301-341
(1978)は、erg5変異株は、エルゴスタ-5,7-ジエノール(#1
1)、エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノール(#4)、エルゴス
タ-8,14,24(28)-トリエノール(#18)、およびエピステロ
ール(#3)のみが蓄積すると報告している。それに対して、
バード他、Lipids、12:645-654(1977)は、erg5変異株は、ザ
イモステロール(#1)、エルゴスタ-5,7-ジエノール(#11)、
エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノール(#4)、エピステロ
ール(#3)、および、エルゴスタ-8,14,24(28)-トリエノー
ル(#18)が蓄積すると報告している。
【００１５】さらにまた、エピステロール-5-デヒドロゲ
ナーゼ(酵素c)に欠損のある、erg3と呼ばれるS.セレビシ
エ変異株は、ステロール1-3、7、8、12、13、および16-18を蓄
積することが期待され得る。パークス他、CRC Critical R
eviews in Microbiology, 6:301-341(1978)は、erg3変異
株は、エルゴスタ-7,22-ジエノール(#12)、エルゴスタ-8,
22-ジエノール(#16)、エルゴスタ-7、22、24(28)-トリエノ
ール(#7)、フェコステロール(#2)、およびエピステロール
(#3)のみが蓄積することを報告している。
【００１６】これらのデータを総合すると、一つのステ
ロール合成酵素の発現の欠損は、ステロール蓄積の予想
可能な変化にはつながらないことが示されている。同程
度の予想不能性は、ステロール生合成経路の二つの酵素
の欠損を持つ変異株に関してステロール蓄積を調べた場
合にも見られる。
【００１７】したがって、たとえば、erg5-erg6二重変異
株(酵素dおよびaの欠損)はステロール1、8、および9を蓄
積することが予想され得る。パークスら、およびバードら
(上述)は、erg5-erg6二重変異株は、ザイモステロール(#
1)およびコレスタ-55,7,24-トリエノール(#9)のみを蓄
積することを報告している。
【００１８】酵母におけるステロール蓄積に関するこれ
らのデータは、酵素活性の特異的な変化はステロール蓄
積の予想される変化にはつながらないことを示してい
る。これらのデータはさらに、同一の変化を調べる研究者
間での統一見解が欠けていることも示している。本発明
は、酵母におけるスクアレンおよび特異的ステロールの
蓄積を増加させる方法および組成物を与えることによ
り、予想不能性の問題に対する解決を与えるものである。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、一般的に
は、ステロール生合成経路の酵素の発現に単一または二
重の欠損を持つ変異株酵母で、スクアレンおよび特異的
なステロールの蓄積を増加させる方法を与えるものであ
る。本方法は、HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペプチ
ドをコードする外来性DNA断片、および形質転換された酵
母内でHMG-CoA還元酵素の発現を行わせるのに適したプ
ロモーターに機能するように連結されたベクターを含む
組み換えDNA分子で上述の変異体酵母を形質転換するこ
とからなる。
【００２０】HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペプチド
をコードする構造遺伝子は、活性のある、短縮されたHMG-
CoA還元酵素をコードすることが望ましく、該酵素はHMG-
CoA還元酵素の触媒領域および少なくとも連結領域の一
部は含むが膜結合領域は含まない。構造遺伝子のコピー
数は、HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペプチドをコード
する外来性DNA断片、および形質転換された酵母内でコー
ドされたポリペプチドの発現を行わせるのに適したプロ
モーターに機能するように連結されたベクターを含む組
み換えDNA分子で、変異体酵母を形質転換することによ
り、増加させる。
【００２１】適当なプロモーターは、酵母に対して外来
性または内在性の因子によって誘導的制御が行われるプ
ロモーターを含む。プロモーターと外来性DNA断片の双方
が、形質転換された酵母の染色体DNAに挿入されることが
望ましい。
【００２２】本発明は、もっとも望ましくは、ザイモステ
ロール-24-メチルトランスフェラーゼ(erg6)およびエル
ゴスタ-5,7,24(28)-トリエノール-22-デヒドロゲナーゼ
(erg5)の発現に欠損を持つS.セレビシエ変異株中で、HMG
-CoA還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造
遺伝子の発現レベルを上昇させることからなる、S.セレ
ビシエ株中でスクアレン、ザイモステロール、コレスタ-
7,24-ジエノール、およびコレスタ-5,7,24-トリエノール
の蓄積を増加させる方法を与えるものである。
【００２３】さらに望ましい態様では、酵素エピステロ
ール-5-デヒドロゲナーゼ(erg3)の発現に欠損を持つ変
異株酵母の形質転換により、スクアレン、エルゴスタ-8,2
2-ジエノール、エルゴスタ-7,22-ジエノール、エルゴスタ
-8-エノール、およびエルゴスタ-7-エノールが過剰に蓄
積する形質転換体変異株酵母が得られる。ザイモステロ
ール-24-メチルトランスフェラーゼとエピステロール-5
-デヒドロゲナーゼ(erg6とerg3)の発現に二重の欠損を
持つ変異株酵母の形質転換により、スクアレン、ザイモス
テロール、およびコレスタ-7,24-ジエノールが過剰に蓄
積する形質転換体変異株酵母が得られる。エルゴスタ-5,
7,24(28)--トリエノール-22-デヒドロゲナーゼ(erg5)の
発現に欠損のある変異株酵母の形質転換により、ザイモ
ステロールおよび、エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノー
ルとエルゴスタ-5,7-ジエノールの混合物を過剰に蓄積
する形質転換体変異株酵母が得られる。
【００２４】変異株酵母の形質転換は、プラスミドpSOC7
25ARC、pSOC106ARC、pARC300D、pARC300S、pARC300T、および
pARC304Sからなるプラスミドベクター群から選択された
組み換えDNA分子を用いて行うことが望ましい。もっとも
望ましいのはプラスミドpARC304Sである。
【００２５】本発明はさらにS.セレビシエの変異株を与
えるものであり、該変異株はザイモステロール-24-メチ
ルトランスフェラーゼおよびエルゴスタ-5,7,24(28)-ト
リエノール-22-デヒドロゲナーゼ(erg5およびerg6)の発
現に二重の欠損を持つ。このS.セレビシエ変異株はATC04
02muと呼ばれる。
【００２６】本発明はさらにまた、スクアレンからエル
ゴステロールへの転換を触媒する酵素の発現に単一また
は二重の欠損のあるS.セレビシエ変異株を、上述のよう
な組み換えDNA分子で形質転換したものを与える。
【００２７】本発明はさらに、形質転換体変異株酵母が
スクアレンおよび特異的なステロールを過剰に蓄積する
ように、変異株酵母を形質転換するのに用いられる組み
換えDNA分子を与える。望ましい組み換えDNA分子は、プラ
スミドpARC304S、pARC300S、pARC300T、pARC300D、pARC306
E、pSOC106ARC、およびpSOC725ARCである。
【００２８】本発明はいくつかの利益および利点を与え
る。
【００２９】本発明の一つの利点は、特異的なステロー
ルの予想可能な蓄積が行われるような方法を与えること
である。
【００３０】本発明の別の利点は、形質転換されていな
い酵母で見いだされるレベルよりもはるかに高いレベル
で、特異的なステロールを蓄積させられることである。
【００３１】さらなる利益および利点は、本分野の技術
者には以下の説明から明らかとなるであろう。
【００３２】
【課題を解決するための手段】
I. 定義 以下の用語および句は、以下に示した意味を有する。
【００３３】発現: 構造遺伝子がポリペプチドを産生す
るために行われるものである、転写および翻訳を含む、細
胞内過程の組み合わせ。
【００３４】発現ベクター: 機能する形で構造遺伝子に
連結されると、その遺伝子の発現を制御する調節因子を
形成するDNA配列。
【００３５】機能する形で連結: 発現ベクターの場合
は、その制御下に構造遺伝子が来るように、構造遺伝子が
正しい読み枠で別のDNA(または適切な場合にはRNA)に共
有的に結合されること。
【００３６】プロモーター: 構造遺伝子に体して発現調
節因子を与えるDNA配列またはDNA配列群上の認識部位で
あって、それに対してRNAポリメラーゼが特異的に結合
し、その遺伝子のRNA合成(転写)を開始するもの。
【００３７】組み換えDNA分子: 天然で通常は一緒には
見いだされない、少なくとも2種のヌクレオチド配列から
なるハイブリッドDNA配列。
【００３８】構造遺伝子: ポリペプチド、すなわちアミ
ノ酸残基配列として発現されるDNA配列。
【００３９】ベクター: 細胞内で複製可能なDNA分子、お
よび/または、連結された断片の複製を行わせるために別
のDNA断片が機能するように連結され得るDNA分子。もし
くは、ベクターは、形質転換された細胞の染色体に挿入さ
れる非複製ベクターである可能性もある。プラスミドは
ベクターの一例である。
【００４０】II. 発明 本発明は、酵母中でスクアレンおよび特異的なステロー
ルの蓄積を増加させる組成物および方法、および形質転
換されていない酵母と比較してスクアレンおよびステロ
ールの蓄積が増加した酵母に関するものである。望まし
い酵母は、サッカロミセス(Saccharomyces)属およびカン
ディダ(Candida)属の酵母である。より望ましい酵母はサ
ッカロミセス・セレビシエ(S.セレビシエ)である。
【００４１】本発明で用いられる酵母は、HMG-CoA還元酵
素活性を持つポリペプチドをコードする付加された構造
遺伝子で形質転換され、該コードされたポリペプチドは
形質転換された酵母内で発現される。望ましい非形質転
換体酵母は、ザイモステロールからエルゴステロールへ
の転換に関与する酵素(ステロール生合成経路酵素)が単
一または二重に欠損している変異株である。比較される
非形質転換体酵母および形質転換体酵母は、S.セレビシ
エなどの同一の種である。
【００４２】本発明の酵母培養液中のステロール産生
は、HMG-CoA還元酵素の細胞活性を上昇させることによっ
て増加するものであり、該酵素は3-ヒドロキシ-3-メチル
グルタリル補酵素A(HMG-CoA)からメバロン酸への転換を
触媒する。ここで用いる「細胞活性」とは、酵母細胞におけ
るHMG-CoA還元酵素の全体の触媒活性を意味する。
【００４３】細胞性HMG-CoA還元酵素活性は、HMG-CoA還
元酵素触媒活性を持つポリペプチドをコードする構造遺
伝子の発現レベルを上昇させることによって増加する。
このコードされている構造遺伝子の発現がその酵素の細
胞活性を増加させる。発現レベルは、本分野では既知の方
法によって増加させる。例えば、構造遺伝子の発現はプロ
モーターを脱制御することによって増加されるものであ
り、該プロモーターがそのような構造遺伝子の発現を制
御する。通常の野生型酵母においてHMG-CoA還元酵素遺伝
子の発現を制御するプロモーターを同定し、ゲノムから
切断することが可能である。次に、HMG-CoA還元酵素遺伝
子の過剰発現を行わせるような新しいプロモーターが、
標準的な形質転換技術によって挿入される。HMG-CoA還元
酵素触媒活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝
子の発現レベルを増加させる望ましい方法は、そのよう
なポリペプチドをコードする構造遺伝子のコピー数を増
加させることである。
【００４４】コピー数は、HMG-CoA還元酵素活性を持つポ
リペプチドをコードする外来性DNA断片、および該酵母で
該ポリペプチドが発現されるのに適したプロモーターに
機能するように連結されたベクターを含む組み換えDNA
分子で酵母細胞を形質転換することによって増加させ
る。
【００４５】したがって、形質転換体酵母細胞は、同じ種
の非形質転換体酵母と比較して、HMG-CoA還元酵素活性を
持つポリペプチドをコードする遺伝子が一つ以上追加さ
れている。このように、形質転換体酵母は、既知の、DNA断
片やmRNAのアガロース分離およびそれに続くトランスフ
ァーと適当なDNAまたはRNAでのブロッティング、あるい
は、ポリメラーゼ連鎖反応技術などの標準的な技術によ
って、非形質転換体酵母と区別することができる。形質転
換体酵母および非形質転換体酵母の相対的なHMG-CoA還
元酵素活性も、形質転換を示唆する形質転換体酵母にお
けるHMG-CoA還元酵素活性の相対的な増加によって、比較
することが可能である。
【００４６】スクアレンおよび特異的なステロールの蓄
積も、非形質転換体酵母と形質転換体酵母を区別するた
めに用いることができる。
【００４７】A. 構造遺伝子 本発明では、HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペプチドを
コードする構造遺伝子で酵母を形質転換することを行
う。動物および酵母細胞のHMG-CoA還元酵素はいずれも3
種のことなるアミノ酸残基配列領域を含み、これらの領
域は触媒領域、膜結合領域、および連結領域と呼ばれる。
【００４８】触媒領域はHMG-CoA還元酵素の活性部位を
含み、全体の約40%からなり、完全なHMG-CoA還元酵素のCO
OH末端部分に位置する。膜結合領域は疎水性アミノ酸残
基を含み、全体の約50%からなり、完全なHMG-CoA還元酵素
のNH2末端に位置する。連結領域は、触媒領域と膜結合領
域を結び、全体の酵素の残りの約10%を占める。
【００４９】以下で詳細に述べるように、ここではHMG-C
oA還元酵素の触媒領域のみが必要である。したがって、触
媒領域に対応するポリペプチドをコードする構造遺伝子
が、酵母の形質転換に必要とされる最小遺伝子である。し
かしながら、より大きなポリペプチド酵素とその構造遺
伝子が望ましい。したがって、本発明は、HMG-CoA還元酵素
の活性触媒領域、または触媒領域と少なくとも連結領域
の一部を含むが、膜結合領域を含まない領域をコードす
る、短縮された構造遺伝子を使用する。
【００５０】HMG-CoA構造遺伝子活性を持つポリペプチ
ドをコードする構造遺伝子は、多様な方法によって、多様
な材料から入手、あるいは構築することができる[たとえ
ば、カールソン(Carlson)他、Cell, 28:145 (1982); リネ
(Rine)他、Proc. Natl. Acad.Sci. USA、 80:6750(1983)
参照]。このような構造遺伝子の例は、HMG-CoA還元酵素を
コードする哺乳類および酵母遺伝子である。
【００５１】哺乳類ゲノムはHMG-CoA還元酵素をコード
する唯一の遺伝子を含む。HMG-CoA還元酵素のハムスター
およびヒト遺伝子のヌクレオチド塩基配列が報告され
た。ハムスターHMG-CoA還元酵素の、mRNAに対応するcDNA
の構成ヌクレオチド配列、および予測されるアミノ酸残
基配列は、チン(Chin)他、Nature,308:613(1984)およびSE
Q ID NO:3で示されている。この論文の構成ヌクレオチド
配列は約4606塩基対からなり、完全なハムスターHMG-CoA
還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５２】完全なHMG-CoA還元酵素は約887アミノ酸残
基からなり、SEQ ID NO:4に示されている。
【００５３】望ましい構造遺伝子は、酵素の触媒領域の
みに対応するポリペプチドをコードするものである。ハ
ムスターHMG-CoA還元酵素の2つの触媒的活性のある断片
が同定された[リスカム(Liscum)他、J. Biol. Chem., 26
0(1):522(1985)]。一つの触媒領域は約63kDaの見かけの
サイズを持ち、SEQ ID NO:4の約373位から約887位までの
アミノ酸残基を含む。第2の触媒領域は約53kDaの見かけ
のサイズを持ち、SEQ IDNO:4の約460位から約887位まで
のアミノ酸残基を含む。約63kDaの触媒活性断片は、SEQ I
D NO:3の配列のヌクレオチド約1282位からヌクレオチド
約2824位までの塩基対によってコードされる。約53kDaの
触媒活性領域は、SEQ ID NO:3の配列のヌクレオチド約15
43位からヌクレオチド約2824位までの塩基対によってコ
ードされる。
【００５４】望ましい態様では、用いられる構造遺伝子
は、HMG-CoA還元酵素の触媒領域と少なくとも連結領域の
一部をコードする。ハムスターHMG-CoA還元酵素の連結領
域は、約340位から約373位、あるいは約340位から約460位
のアミノ酸残基を含み、どのように触媒領域が定義され
るかに依存している。これらの連結領域は、SEQ ID NO:3
の配列のヌクレオチド約1183位からヌクレオチド約1282
位、あるいは約1183位から約1543位までの塩基対にコー
ドされる。連結領域をコードする構造遺伝子は、触媒領域
をコードする構造遺伝子に、機能するような形で連結さ
れる。
【００５５】特に望ましい態様の一つでは、触媒活性を
持つ短縮されたＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする構
造遺伝子は、酵素の膜結合領域のわずかな部分をコード
する塩基対も任意に含むことができる。ＨＭＧＲ−Δ２
２７と呼ばれる短縮されたハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還
元酵素遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチ
ド１６４−１９０、および１１８７−２８２４のヌクレ
オチド配列を含み、アミノ酸残基１−９（膜結合領域か
ら）および３４２−８８７をコードしており、ＨＭＧ−
ＣｏＡ還元酵素を欠く細胞の形質転換に用いられた［ギ
ル（Ｇｉｌ）他、Ｃｅｌｌ、４１：２４９（１９８
５）］。
【００５６】酵母などの他の生物由来の、触媒活性を持
ち、短縮された、あるいは完全なHMG-CoA還元酵素を含む
ポリペプチドをコードする構造遺伝子も本発明で使用す
ることができる。
【００５７】酵母細胞はHMG-CoA還元酵素をコードするH
MG-CoA還元酵素をコードする2つの遺伝子を含んでいる。
HMG1およびHMG2と呼ばれる二つの酵母遺伝子は、HMG-CoA
還元酵素1およびHMG-CoA還元酵素2と呼ばれる二つのこ
となる形のHMG-CoA還元酵素をコードする。HMG-CoAのヌ
クレオチド塩基配列(SEQ ID NO:1)およびHMG-CoA還元酵
素1のアミノ酸残基配列(SEQ ID NO:2)を、バッソン(Bass
on)他、Mol.Cell Biol., 8(9):3797(1988)から転載した
表９に示す。
【００５８】完全なHMG1遺伝子は約3360塩基対からな
る。完全なHMG-CoA還元酵素1は約1054アミノ酸残基のア
ミノ酸配列からなる。
【００５９】完全なHMG2遺伝子はSEQ ID NO:5に示され
た約3348塩基対からなる。完全なHMG-CoA還元酵素2はSEQ
ID NO:6に示された約1045アミノ酸残基からなる(バッ
ソン他、前出)。
【００６０】短縮されたハムスター構造遺伝子と同様
に、酵母由来の触媒活性を持つ、短縮されたHMG-CoA還元
酵素を含むポリペプチドをコードする構造遺伝子も、本
発明で使用可能である。
【００６１】HMG-CoA還元酵素1の触媒領域は約残基618
から約残基1054までのアミノ酸領域、すなわちCOOH末端
からなる。触媒領域をコードする構造遺伝子は、表９およ
び配列番号：1のヌクレオチド約1974位から約3282位ま
での塩基対からなる。
【００６２】HMG-CoA還元酵素1の連結領域は約525残基
から約617残基までのアミノ酸配列からなる。連結領域を
コードする構造遺伝子は、表９の約1695位から約1974位
までのヌクレオチドを含む。酵母HMG-CoA還元酵素1の触
媒領域および少なくとも連結領域の一部を含むポリペプ
チドをコードする構造遺伝子は、酵素の触媒領域をコー
ドする構造遺伝子に機能する形で連結した、酵素の連結
領域をコードする構造遺伝子からなることが望ましい。
【００６３】また、短縮されたハムスター遺伝子と同様
に、短縮されたHMG1遺伝子は、酵素の膜結合領域の小部分
をコードするヌクレオチド塩基対を任意に含むことが可
能である。このような構造遺伝子は、表９および配列番
号:1のヌクレオチド約121位から約146位、および約1695
位から約3282位までの塩基対からなることが望ましい。
【００６４】酵母HMG-CoA還元酵素2の同等の領域由来
の、上述と類似の構造も使用可能である。
【００６５】ここで示した拡散配列は、上述の配列の場
合のように明瞭な場合にも、あるいは一般的に知られて
おりここに示されていない核酸配列のように不明瞭な場
合にも、遺伝暗号の元来の縮重、および修飾や改変が行わ
れるポリペプチドの重要でない領域により、修飾され得
ることは、本分野の技術者には明らかであろう。この点に
おいて、本発明は,HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペプ
チドをコードする構造遺伝子のアリル異形体を使用す
る。
【００６６】上述のDNA断片は、最短長を持つと記述さ
れ、全長も示されている。この最短長は、HMG-CoA還元酵素
活性を持つ特異的なポリペプチドをコードする配列を持
つDNA断片の長さを定義するものである。本分野ではよく
知られているように、目的のDNA配列が存在し、適当な読
み枠であるかぎり、(開始および終止シグナルを含む)、さ
らなる塩基対が断片のいずれかの末端に存在することが
可能であり、その断片はタンパク質の発現にも使用され
得る。これはもちろん、断片内に、機能する形で連結され
ている、発現を抑制するDNA配列、発現されるべき酵素を
消費するさらなる産物を発現するDNA配列、目的の酵素以
外の産物を発現するDNA配列、あるいはDNA断片の構造遺
伝子を阻害するDNA配列が存在しないことを仮定してい
る。
【００６７】したがって、DNA断片にこのような阻害的な
DNA配列がない限り、組み換えDNA分子、特に発現ベクター
の最大長は、複製と発現に必要な最小DNA配列のすべてが
存在すれば、望むならば、ほとんど簡便さと、宿主細胞に
受け入れられるベクターの大きさによって支配される。
典型的には、本発明のDNA断片は15,000塩基対まで可能で
ある。最小ベクターサイズはよく知られている。
【００６８】B. 組み換えDNA分子 本発明の組み換えDNA分子は、ここで述べるようなプラス
ミドを形成する有用なDNA断片にベクターを機能する形
で連結させることにより、作製される。特に望ましい組み
換え分子は、以下の実施例2から7で詳細に述べられる。HM
G-CoA還元酵素活性を持つポリペプチドの発現を行わせ
ることのできるベクターは、ここでは「発現ベクター」と
呼ぶ。
【００６９】このような発現ベクターは、プロモーター
を含む発現調節因子を含む。ポリペプチドをコードする
遺伝子は発現ベクターに機能する形で連結され、RNAポリ
メラーゼの結合および目的のポリペプチドをコードする
遺伝子の発現が、プロモーター配列によって引き起こさ
れるようになる。ポリペプチドをコードする遺伝子を発
現する際に有用なのは、ポツコウスキー(Poszkowski)他、
EMBO J.,3:2719(1989)およびオデール(Odell)他、Natur
e,313:810(1985)に記載されている誘導プロモーター、ウ
イルス性プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモ
ーター、および、チャウ(Chau)他、Science,244:174-181(1
989)に記載されている、時間的制御プロモーター、空間的
制御プロモーター、および時間および空間的制御プロモ
ーターなどのプロモーターである。プロモーターは、構造
遺伝子の発現を制御する機能が細胞内のステロール量に
実質的に影響されないようなプロモーター配列を含むこ
とが望ましい。ここで用いた「実質的に影響されない」と
いう語は、プロモーターが、形質転換された細胞に蓄積し
たステロールによる直接のフィードバック制御に反応性
でないことを意味する。
【００７０】プロモーターは、HMG-CoA還元酵素活性を持
つポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して、形質
転換された酵母の転写活性を引き起こす能力に関しても
選択される。構造遺伝子は酵母の多様なプロモーターに
よって発現される。
【００７１】本発明で用いられたプロモーターは、形質
転換された細胞の内因的または外因的環境において追跡
され、調節され得る因子によって制御されることが望ま
しい。細胞の外因的環境の因子(外因的因子)によって誘
導的に制御されるプロモーターの例は、GAL1プロモータ
ー、GAL10プロモーター、GAL1-10プロモーター、GAL7プロ
モーター、メタロチオネインプロモーター、a因子プロモ
ーター、インベルターゼプロモーター、およびエノラーゼ
プロモーターなどである。望ましいものは、よく知られて
いるGAL1、GAL10、GAL1-10プロモーターである。
【００７２】細胞の内因的環境の因子(内因的因子)によ
って誘導的制御をうけるプロモーターの例は、フォスフ
ォグリセレートキナーゼ(PGK)プロモーター、トリオース
リン酸イソメラーゼ(TPI)プロモーター、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ(ADH)プロモーター、および抑制性の酸フォ
スファターゼプロモーターなどである。望ましいものは、
よく知られているPGKおよびADHプロモーターである。
【００７３】どの発現ベクター、および究極的にはどの
プロモーターをポリペプチドをコードする遺伝子に機能
する形で連結するかという選択は、目的の機能の性質、例
えば、タンパク質発現の場所およびタイミング、および形
質転換される宿主細胞に直接依存する。組み換えDNA分子
を構築する際に生じるよく知られている制限が存在す
る。しかしながら、本発明を行うのに有用なベクターは、
機能する形で連結されているDNA断片中に含まれるポリ
ペプチドをコードする遺伝子の発現を行わせることがで
きる。
【００７４】本方法ではプラスミドベクターを用いる。
本発明のプラスミドベクターは、形質転換された細胞の
染色体に取り込まれる(挿入される)か、取り込まれない
(エピソーマル)で存在する。エピソーマルプラスミドは
酵母の複製開始点、HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペプ
チドをコードする核酸配列、プラスミド、選択マーカーを
含む。選択マーカーは、そのプラスミドベクターが存在す
ると、抗生物質耐性を与える遺伝子、あるいは、栄養要求
性の宿主が、それがなければ代謝されない基質を代謝で
きるようにする遺伝子が含まれる。 しかしながら、選択
マーカーとして抗生物質耐性を用いることは、抗生物質
培地中で生物を培養することを必要とする。抗生物質が
高価であることから、抗生物質に依存する生物は商業的
には発展しにくい。一般的に、酵母に関しては栄養要求性
生物が用いられる。栄養要求性生物は、本分野ではよく知
られている突然変異および培養技術によって作製され
る。栄養要求性の宿主生物を相補し得る選択マーカーに
は、よく知られている、フォスフォリボシルアントラニリ
ンイソメラーゼをコードするTRP1遺伝子、オロチン-5'リ
ン酸デカルボキシレートをコードするURA3遺伝子、イソ
プロピルマレイン酸イソメラーゼをコードするLEU2遺伝
子、およびヒスチジノールデヒドロゲナーゼをコードす
るHIS3遺伝子が含まれる。栄養要求性宿主の選択マーカ
ーとして望ましいものはTRP1である。望ましいエピソー
マルプラスミドベクターは、pSOC725ARCおよびpSOC106AR
Cである。
【００７５】エピソーマルに複製するベクターを液体培
地で長時間宿主細胞内で維持するのは、特にベクターを
維持するのに用いられる選択圧が栄養要求性の相補であ
る場合には、しばしば困難である。本発明の望ましい態様
では、HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペプチドとプロモ
ーターを含む塩基配列を維持する選択圧がほとんど、あ
るいは全く必要でない、挿入ベクターが含まれる。
【００７６】本発明で用いられる挿入ベクターは、HMG-C
oA還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする塩基配
列、プロモーター、選択マーカー、および、相同的組み換え
によって塩基配列を染色体中に組み込ませるための宿主
染色体DNAに相同な配列を含む。相同領域は、プラスミド
を直鎖状にできるような制限酵素部位を含む。直鎖状の
形態で、プラスミドは染色体の相同領域において組み換
えを行うことができる。挿入ベクターは、宿主生物の複製
開始点は含まない。
【００７７】望ましい挿入ベクターは、pARC300S、pARC30
0T、pARC300D、pARC306E、およびpARC304Sである。プラスミ
ドベクターpARC304Sは、ステロール蓄積を増加させる能
力が最も高いことが示されているので、最も望ましい(実
施例15参照)。望ましいプラスミドベクターの基本的な遺
伝子特性は、以下の表2にまとめて示す。
【００７８】 表２プラスミドベクター 遺伝的特徴 pSOC106 TRP1-2μori-GAL1-HMG1* pSOC725 TRP1-2μori-GAL10-tHMG1** pARC306E TRP1-PGK-tHMG1 pARC300D TRP1-PGK-tHMG1 pARC300S,T URA3-PGK-tHMG1-ura3 term pARC304S URA3-ADH-tHMG1-ura3 term * HMG1-完全なS.セレビシエHMG-CoA還元酵素1をコードする遺伝子 ** tHMG1-S.セレビシエHMG-CoA還元酵素1の触媒領域と連結領域をコードする遺 伝子 エピソーマルベクターおよび挿入ベクターはしばしば目
的の宿主以外の生物で増幅され、宿主以外の生物での複
製および選択手段を必要とすることは、本分野の技術者
には容易に認識されるであろう。一般的に、非宿主生物
は、そのよく知られた特徴および性質により、大腸菌(Esc
herichia coli)が用いられる。
【００７９】望ましい態様では、ポリペプチドをコード
する遺伝子の発現に用いられるベクターは、URA3またはT
RP1マーカーなどの、酵母細胞中で効果的な選択マーカー
を含む。細菌中でベクターを増幅する際に用いられる他
の適当な選択手段には、β-ラクタマーゼ(ペニシリン耐
性)、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ(クロ
ラムフェニコール耐性)、およびネオマイシンフォスフォ
トランスフェラーゼ(カナマイシンおよびネオマイシン
耐性)をコードする遺伝子などの、抗生物質マーカーが含
まれる。
【００８０】相補的な粘着末端または平滑末端を介して
DNAを機能する形でベクターに連結するための多様な方
法が開発されている。たとえば、相補的なホモポリマー配
列を、挿入されるDNA断片とベクターDNAに付加すること
ができる。つぎにベクターとDNA断片を、相補的なホモポ
リマーテイルの間の水素結合によって結合させて、組み
換えDNA分子を形成させる。
【００８１】あるいは、一つ以上の制限酵素部位を含む
合成リンカーを、DNA断片と発現ベクターの間の結合に用
いることが可能である。平滑末端のDNA断片を大過剰の合
成リンカー分子とともに、バクテリオファージT4 DNAリ
ガーゼなどの平滑末端DNA分子の連結反応を触媒するこ
とのできる酵素の存在下でインキュベートすることによ
って合成リガーゼを平滑末端DNA断片に結合させる。した
がって、反応産物はその末端に合成リンカーを持つDNA断
片である。これらのDNA断片は適当な制限酵素で切断し、
これらの合成リンカーと結合し得る末端が得られるよう
な酵素で切断した発現ベクターに連結する。多様な制限
酵素部位を持つ合成リンカーは、ニュー・イングランド・
バイオラブズ社、ベバリー、MAを含む多数の企業から商業
的に入手することができる。
【００８２】本発明によって、上述の組み換えDNA分子に
相当するRNAも用いられる。
【００８３】C. 形質転換体酵母と形質転換法 HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする
遺伝子のコピー数は、構造遺伝子を含む適当なベクター
で目的の酵母を形質転換することによって増加させる。
この遺伝子の形質転換体酵母における発現が、HMG-CoA還
元酵素の活性を上昇させる。
【００８４】本発明において酵母細胞は、酵母形質転換
技術を用いるものにはすでに知られており、容易に行わ
れる方法によって形質転換される[ヒンネン(Hinnen)他、
Proc.Natl. Acad. Sci. USA、75:1929-(1978);イトウ他、
Bact.、5:163-168(1983)参照]。
【００８５】形質転換の望ましい一般的な方法は、上述
のイトウらの酢酸リチウム法である。酵母細胞を、酵母抽
出物、バクトペプトン、およびグルコースを含む培地でお
よそ2×107細胞/mlの濃度となるまで培養する。細胞を低
速遠心によって集め、Tris-EDTA緩衝液中に酢酸リチウム
を含む形質転換培地に再懸濁する。
【００８６】細胞を形質転換培地中で、約30℃で1時間維
持する。目的の構成の組み換えDNA分子を形質転換培地中
の細胞懸濁液に添加し、30℃で1時間維持する。つぎに、ポ
リエチレングリコール(M.W.4000)を、ポリエチレングリ
コールの最終濃度が約35パーセント重量/体積(w/v)とな
るように細胞懸濁液に加える。ポリエチレングリコール
溶液中で30℃で約2時間細胞を維持し、つぎに約42℃でさ
らに5分間維持する。滅菌水を細胞懸濁液に加え、細胞を
低速遠心で集菌する。さらに詳しい点については以下で
述べる。
【００８７】形質転換が成功した細胞は、選択培地で形
質転換した細胞を培養し、形質転換を示唆する細胞の性
質(すなわち、スクアレンまたは特異的なステロールの蓄
積の増加)を同定し、サザン分析などの標準的な方法で形
質転換体細胞から単離した核酸を解析することによっ
て、同定される[ホルム(Holm)他、Gene、42:169(1986)]。
【００８８】D. 変異体酵母 本発明で用いる酵母は、ザイモステロールからエルゴス
テロールへの転換を職場いする酵素の発現に単一あるい
は二重の欠損を持つ変異体酵母である。このような酵素
はここでは“erg"遺伝子産物と呼ぶ。以下の表3は、特異
的な酵素発現欠損を表す個々のerg名を列挙したもので
ある。
【００８９】 表３酵素発現の欠損 変異体名 ザイモステロール-24-メチルトランスフェラーゼ erg6 エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノール- 22-デヒドロゲナーゼ erg5 エピステロール-5-デヒドロゲナーゼ erg3 本発明で用いられる変異株は、イースト・ジェネティック
・ストック・センター(バークレー、CA)などから商業的に
購買あるいは作製することができる。たとえば、erg5とer
g5-erg6二重変異株は、商業的に入手可能なものから作製
される。
【００９０】ｅｒｇ５−ｅｒｇ６二重変異株である酵母
ＡＴＣ０４０２ｍｕは、商業的に入手可能なｅｒｇ６変
異株酵母Ｍ６１０−１２Ｂを、商業的に入手可能なｅｒ
ｇ５変異株ｐｏ１５αΔ２２と掛け合わせ、得られた二
重変異株ＡＴＣ０４０３ｍｕを野生型酵母と掛け合わせ
ることによって作製した。変異株酵母ＡＴＣ０４０２ｍ
ｕおよびその誘導変異株酵母ＡＴＣ０３１５ｒｃは、本
発明プラスミドベクターで形質転換するのに最も望まし
い変異株である。
【００９１】あるいは、ATC0403は異なる野生型株と掛け
合わせ、望みの遺伝子型を持つ変異株を野生型酵母と2回
バッククロスを行い、erg5変異株であるATC4124を得た。
【００９２】変異株は、変異を誘導する既知の方法によ
っても得られる。たとえば、ボーケ(Boeke)他、Mol. Gen.
Genet., 197:345-346(1984);シャーマン(Sherman)他、Me
thodsand Yeast Genetics, コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、N.Y.(1986)、参照。
【００９３】望ましい態様では、野生型酵母は誘導可能
な“TY1-neo"トランスポゾンを変異導入剤として用いて
形質転換を行う。GAL:TY1-neo発現カセットを含むプラス
ミドpJEF1105が形質転換剤として用いられる。ボーケ他、
Schience,239:280-282(1989)。ネオマイシンとナイスタ
チンの双方に耐性を示す有意な形質転換体について、続
いてステロール含量に関する定量を行う。
【００９４】pJEF1105による野生型酵母の形質転換によ
って、erg3変異株であるATC6118および、erg6変異株であ
るATC0501が得られた。
【００９５】単一の発現欠損を持つ変異株は、つぎに酵
素発現に二重の欠損を持つ変異株を作製するために掛け
合わせる。たとえば、変異株ATC6118と変異株ATC0501を掛
け合わせて、erg3-erg6二重変異株ATC6119が得られる。
【００９６】本発明で用いるための変異株の遺伝子が他
の例を以下の表4に示す。遺伝子型記号は、モーティマー
(Mortimer)他、Yeast,5:321-403(1989)、およびブローチ
(Broach)、The Molecular Biology of the Yeast Saccha
romyces, Life Cycle and Inheritance、 ストラザン(St
rathern)、ジョーンズ(Jones)、およびブローチ編集、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、pp.653-727
(1981)に引用された慣習にしたがって用いた。
【００９７】 表４ 種 遺伝子型 pol5αΔ22 a,erg5 M610-12β α,ile3,erg6-5,trp1,gal2 DBY745 α,ade1,ura3-52,leu2-100,leu2-122,MEL,gal1 gal10 YNN281 α,trp1-Δ、his3Δ-200,ura3-52,lys2 ATC0403mu a,trp1,gal,erg5,erg6 ATC0402mu a,trp1,GAL,erg5,erg6 ATC6118 a,his3Δ-200,erg3,ura3-52,GAL ATC4124 α,erg5,trp1,GAL ATC4154 a,ura3-52,erg7,gal ATC6119 α,erg3,erg6,ura3-52,GAL ATC1500cp a,erg5,erg6 ATC0315rc a,ura3,erg5,erg6 ATC1551 a,erg5,erg6Ｅ． 形質転換体酵母におけるスクアレンおよびステロ
ールの蓄積 本発明の形質転換された変異株酵母種は、同じ種の形質
転換されていない変異株と比較して、スクアレンおよび
特異的なステロールを過剰に蓄積する。形質転換されて
いないｅｒｇ３変異株と比較して、ここで用いたプラス
ミドベクターで形質転換したｅｒｇ３変異株は、スクア
レン、エルゴスタ−８，２２−ジエノール、エルゴスタ
−７，２２−ジエノール、エルゴスタ−８−エノール、
およびエルゴスタ−７−エノールを過剰に蓄積する。
【００９８】形質転換されていないerg5変異株と比較し
て、ここで用いたプラスミドベクターで形質転換したerg
5変異株は、スクアレン、ザイモステロール、およびエルゴ
スタ-5,7,24(28)-トリエノールとエルゴスタ-5,7-ジエ
ノールの混合物を蓄積する。ステロール合成経路酵素に
二重の欠損を持つ変異株を形質転換した場合にも、同様
の結果が見られる。形質転換されていないerg3-erg6変異
株と比較して、有用なプラスミドベクターで形質転換さ
れたerg3-erg6変異株は、スクアレン、ザイモステロール、
およびコレスタ-7,24-ジエノールを過剰に蓄積する。
【００９９】形質転換されていないerg5-erg6変異株と
比較して、ここで有用なプラスミドベクターで形質転換
されたerg5-erg6変異株は、スクアレン、ザイモステロー
ル、コレスタ-5,7,24-トリエノール、およびコレスタ-7,2
4-ジエノールを過剰に蓄積する。F. 形質転換体酵母中のHMG-CoA還元酵素活性 本発明の形質転換された酵母におけるHMG-CoA還元酵素
活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子の発現
により、該HMG-CoA還元酵素の細胞内活性が上昇する。形
質転換の結果として、HMG-CoA還元酵素活性を持つポリペ
プチドをコードする添加された遺伝子のコピー数は、1か
ら約2から約10へと増加する。
【０１００】このような形質転換体細胞におけるHMG-Co
A還元酵素の細胞内活性は、コピー数が約6まではコピー
数にほとんど直線的に比例して増加し、コピー数が9にな
るとわずかに活性が下がる。したがって、コピー数が約2
に増加すれば、HMG-CoA還元酵素活性は形質転換されてい
ない酵母で見られる活性の約1.4倍のレベルに上昇する。
コピー数を約6までさらに増加させると、HMG-CoA還元酵
素活性は形質転換されていない酵母で見られるレベルの
約2.6倍までさらに上昇する。約6を越えてから約9までの
コピー数の増加により、HMG-CoA還元酵素活性はさらに上
昇する。約9のコピー数を持つ形質転換体酵母は、形質転
換されていない酵母の活性の約2倍に等しいHMG-CoA還元
酵素活性レベルを有する。
【０１０１】G. ステロールの回収 望むならば、形質転換された酵母は集菌されて、ステロー
ル産物が回収される。本発明の遺伝的に形質転換された
酵母中のステロールのほとんどは、脂肪酸エステルの形
となる。遊離のステロールを得るためには、たとえば以下
の実施例で示すような塩基(20% w/v KOHを含む2:1 EtOH
/H2O)中で“酵母パルプ"をサポニン化することが必要で
ある。
【０１０２】望ましい態様では、回収過程は: (i) 形質転換されたステロールを含む酵母をホモジナイ
ズしてパルプを作製すること;および、(ii) 有機溶媒な
どの適当な塩基性溶媒、あるいは、適当な溶媒中での超臨
界抽出とそれに続く塩基のサポニン化によってパルプか
らステロールを抽出し[ファバティ(Favati)他、J.Food S
ci.、53:1532(1988)およびその中の引用文献]、ステロー
ルを含む溶液または懸濁液を調製すること;および、(ii
i) 溶液または懸濁液からステロールを単離すること、か
らなる。
【０１０３】形質転換された酵母はホモジナイズして、
本分野の技術者にはよく知られた方法を用いてパルプを
調製する。このホモジナイゼーションは、手動、機械、ある
いは化学的方法によって行われ得る。パルプは、目的のス
テロール、前駆体の残渣、細胞性器官および細胞質内容物
からなり、抽出過程にかけられる。
【０１０４】ステロールは、上で調製されたパルプから
抽出されて、ステロールを含む溶液または懸濁液が調製
される。このような抽出過程は本分野の技術者には一般
的であり、よく知られている。たとえば、抽出過程は、適当
な溶媒にパルプを浸すあるいは染み込ませることからな
る。この適当な溶媒は、ステロールを含む溶液または懸濁
液のもとになるパルプ中に存在するステロールを溶解ま
たは懸濁することができる。このような抽出過程に有用
な溶媒は本分野の技術者にはよく知られており、メタノ
ール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニ
トリル、テトラヒドロフラン(THF),ヘキサンおよびクロ
ロホルム、そして水溶性有機溶媒混合液などのいくつか
の有機溶媒とその組み合わせが含まれる。ピーナツ、とう
もろこし、大豆などの植物性油およびそれに類似した油
もこの抽出に使用可能である。
【０１０５】活性のある短縮されたHMG-CoA還元酵素の
構造遺伝子で形質転換された酵母は、ステロールが合成
されるのに十分な器官、適当な培地条件下で培養される。
ステロールを含む酵母細胞は次に、化学的あるいは機械
的に破砕し、上述のように液体有機溶媒を用いて破砕さ
れた細胞から抽出され、ステロールを含む溶液または懸
濁液が調製される。その後、ステロールはクロマトグラフ
ィーなどの通常の手段によって、溶液または懸濁液から
単離される。
【０１０６】ステロールは上述の溶液または懸濁液か
ら、ステロール単離の分野の技術者には既知の方法を用
いて単離される。これらの方法は、多様な溶媒中の溶解度
に基づいた精製法、カラムクロマトグラフィーなどのク
ロマトグラフィー技術を含むが、それに制限されるもの
ではない。
【０１０７】
【実施例】以下の実施例は、本発明を実施する最適の態
様を示したものであり、特許請求の範囲をいかなるかた
ちにも制限するように作られたものではない。
【０１０８】
【実施例１】S.セレビシエの形質転換 酵母S.セレビシエは、酢酸リチウム法によって形質転換
された[イトウ他、J.Bacteriol.,153:163-168(1983)]。酵
母細胞を50mlのYEPD培地(酵母抽出物 1% w/v、バクトペ
プトン、2% w/v; およびグルコース 1% w/v)中で、30℃で
一晩培養した。細胞の濃度が約2×107細胞/mlとなったと
きに、細胞を低速遠心で集菌した。遠心後ペレットとなっ
ている細胞を、約50mlのTE緩衝液(10mM Tris-Cl、1mM EDT
A)に懸濁し、遠心によって再度ペレット状にした。この2
回目の遠心によるペレットを、約1.0mlのTE緩衝液に再懸
濁した。この細胞懸濁液0.5mlに0.5mlの0.2M酢酸リチウ
ム(LiOAc)を添加し、懸濁液を約30℃で1時間、連続的に振
盪しながら維持した組み換えDNA(15μlまでのTE緩衝液
あたり約10μg)を100μlのTE-LiOAc細胞懸濁液に添加
し、その混合液を振盪せずに30℃で30分間維持した。つぎ
に、DNAを含む細胞懸濁液に、ポリエチレングリコール(PE
G;44% w/v)を最終濃度が約35% (w/v)となるように加え
てよく混合した。
【０１０９】このPEG溶液中の細胞を約2時間30℃で維持
し、その後、約42℃で5分間維持した。約10mlの滅菌水を各
懸濁液に加え、細胞を低速遠心で集菌した。この過程を繰
り返し、集められた細胞を1.0mlの滅菌水に懸濁した。約1
00μlから200μlのこの懸濁液をつぎに、選択培地に広げ
て平板に蒔いた。
【０１１０】細胞の形質転換は、選択培地上での増殖、形
質転換を示唆する細胞の性質の同定(すなわち、選択され
たステロールあるいはスクアレンのレベルの上昇)、およ
び形質転換された細胞から単離した核酸のサザン分析に
よって確認される。
【０１１１】
【実施例２】エピソーマルプラスミドpSOC725ARCの構築 プラスミドpSOC725ARC(図２参照)は、GAL1-10プロモータ
ーのGAL1部分の制御下に短縮したHMG1遺伝子のコード配
列を置くように構築された。プラスミドpSOC725ARCはま
た、TRP1遺伝子と酵母の2μ複製開始領域(IRI)を含む。こ
のプラスミドは以下のような中間的プラスミドから調製
した。
【０１１２】プラスミドYRP12からS.セレビシエのTRP1-
ARS遺伝子を、EcoRIで消化することによって除去した[ス
ティンチコーム(Stinchcomb)他、Nature,282:39(1979)]。
TRP1-ARS遺伝子を含む1445塩基対のDNA断片はアガロー
スゲルで精製され、プラスミドpUC8に連結し(ビエラ他、G
ene、(1982))、EcoRIで消化し、プラスミドpSOC742が形成
された。
【０１１３】精製されたS.セレビシエの2μm プラスミ
ドDNAから得られた酵母のエピソーマル複製開始点をEco
RIで消化し、つぎに大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー
断片で処理し、DNA複製の2μm複製開始点を含む約2240
塩基対が得られた。約2240塩基対の断片はアガロースゲ
ル電気泳動で精製され、プラスミドpUC8に連結され、SmaI
で消化されてプラスミドpSOC743が形成された。
【０１１４】プラスミドpSOC742はBamHIおよびBglIIで
切断されて、857塩基対のTRP1を含む遺伝子断片が得ら
れ、それはBamHIで切断しておいたpSOC743に挿入されて、
プラスミドpSOC744が形成された。
【０１１５】MEL1遺伝子は、プラスミドpMP550[サムナー
スミス(Samunaer-Smith)他、Gene,36:333-340(1985)]か
ら制限酵素EcoRIおよびBamHIによって除去され、MEL1を
含む約2858塩基対の制限断片はアガロースゲルで精製さ
れた。精製された断片はつぎに、EcoRIとBamHIで切断して
おいたプラスミドpUC8に連結され、プラスミドpSOC741が
形成された。
【０１１６】pSOC740の作製の最終段階は、TRP1と2ミク
ロン複製開始点を含むpSOC744の約3101塩基対のEcoRI制
限断片を精製し、EcoRI制限酵素で切断しておいたプラス
ミドpSOC741に連結し、プロモーターpSOC740が得られた。
【０１１７】GAL1-10プロモーターは、pMB258[ジョンス
トン(Johnston)他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79:697
1-6975(1982)]から、約685塩基対のBamHI-EcoRI制限断片
として切り出し、BamHIとEcoRIで消化しておいたpUC18に
連結して、プラスミドpSOC711が作製された。
【０１１８】プラスミドpSOC740はEcoRIで消化され、2ミ
クロン複製開始点とTRP1遺伝子を含む、得られた3101塩
基対断片が単離され、EcoRIで消化したプラスミドpSOC71
1に連結されて、プラスミドpSOC712が得られ、それにおい
てTRP1遺伝子はGAL1-10プロモーターの近傍に位置する。
【０１１９】HMG-CoA還元酵素1のアミノ酸残基529-530
のコード配列にまたがるPstI制限部位が、新しいBamHI制
限部位と新しい開始メチオニンコドンの双方を導入する
地点として選択された。HMG-CoA還元酵素1のCOOH末端側
半分のコード配列を含む、1706塩基対のPstI-EcoRI制限
断片が、pJR59[バッソン他、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、83:5563-3367(1986)]の切断産物から精製された。この
精製されたpJR59断片と、合成オリゴヌクレオチド: をBamHIとEcoRIで切断しておいたpUC18[ヤニシュ-ペロ
ン(Yanisch-Perron)他、Gene,33:103-119(1985)]ととも
に連結した。
【０１２０】得られたプラスミドpSOC937は、短縮された
HMG-CoA還元酵素コード配列の開始メチオニンの12塩基
対上流のBamHI制限部位を含むようになった。この地点で
の開始により形成されたポリペプチドは、最初のメチオ
ニンとプロリンに続いて、天然のHMG-CoA還元酵素1のア
ミノ酸残基530から1054を含む。
【０１２１】該遺伝子の3'末端にあるEcoRI制限酵素部
位は、短縮されたHMG-CoA還元酵素タンパク質のコード配
列の末端よりも135塩基対下流に存在する。短縮されたHM
G-CoA還元酵素遺伝子は、短縮された還元酵素遺伝子の3'
末端のEcoRI部位をBamHI部位に転換し(クレノーポリメ
ラーゼで埋め、BamHI制限酵素部位を含むオリゴヌクレオ
チドd5-CGGATCCGと連結する)、制限酵素BamHIで切断する
ことによって、プラスミドpSOC712内に挿入した。精製さ
れた、得られた1728塩基対のBamHIで終わるpSOC937由来
の制限酵素断片をBamHIで切断したpSOC712に連結し、プ
ラスミドpSOC725ARCが作製され、その模式的な制限酵素
地図は図２に示されている。
【０１２２】
【実施例３】エピソーマルプラスミドpSOC106ARCの構築 プラスミドpSOC106ARC(図３参照)は、完全なHMG1のコー
ド配列を、GAL1-10プロモーターのGAL1部分の制御下に置
いて構築された。
【０１２３】HMG-CoA還元酵素コード配列の開始部分周
辺のDNAを含む、pJR59由来の610塩基対のBglII断片(約90
26位から9636位)が単離され、さらにDdeIで消化されて、H
MG-CoA還元酵素コード領域の開始コドンの68塩基対上流
から開始するDNA断片(約9151位から約9636位)が得られ
た。
【０１２４】DdeIおよびBglII断片はDNAポリメラーゼの
クレノー断片で処理されて、“平滑"末端となった。次に、
断片をBamHI切断部位を含むオリゴヌクレオチドリンカ
ー(BRLリンカー)、d5'-CCGGATCCGG-3 (配列番号:9)、と連
結させた。連結した断片をBamHIで消化してBamHI切断末
端と連結可能な末端が得られ、HMG-CoA還元酵素コード配
列の開始部分を含む得られた499塩基対断片をBamHIで消
化したプラスミドpBR322に連結して、プラスミドpSOC104
が得られた。
【０１２５】HMG-CoA還元酵素コード配列の残りは、HMG-
CoA還元酵素コード配列の5'側半分を含む、pJR59の1477
塩基対のXbaI-SacI DNA断片と、HMG-CoA還元酵素コード
配列の3'側半分を含むpJR59由来の2101塩基対SacI-SalI
断片とをXbaIとSalIで消化したpSOC104に連結し、HMG-Co
A還元酵素の完全なコード配列を有する3903塩基対のBam
HI-SalI制限断片を含むpSOC105を作製することによっ
て、新しい5' BamHI部位の下流を再構築した。この3903塩
基対断片をBamHI-SalIで消化したpSOC712(実施例2参照)
に連結して、プラスミドpSOC106ARCを作製した。
【０１２６】
【実施例４】挿入プラスミドpARC306Eの構築 プラスミドpARC306E(図４参照)は、短縮されたHMG1のコ
ード配列を、GAL1-10プロモーターのGAL1部分の制御下に
置くために構築された。
【０１２７】プラスミドpARC306Eは、アンピシリン耐性
を示す大腸菌レプリコン上のS.セレビシエTRP1遺伝子お
よび、GAL1プロモーターから読まれる短縮されたHMG-CoA
還元酵素遺伝子を含む。pARC306E上にはS.セレビシエの
複製開始点は存在しない。TRP1遺伝子(EcoRV、865位)と短
縮されたHMG-CoA還元酵素遺伝子(ClaI、4280位)の双方の
唯一の制限酵素部位は、制限酵素部位の両端のS.セレビ
シエ染色体DNAと相同なDNAと持つ直鎖状プラスミドの精
製のための部位を与えるものである。したがって、プラス
ミドpARC306Eは相同的組み換えによって、いずれかの部
位で染色体に挿入され得る。
【０１２８】EcoRIとHindIII部位の間に位置する、プラ
スミドpUC8の複数の制限酵素部位を、オリゴヌクレオチ
ド: d5'-AGCTTTCGCGAGCTCGAGATCTAGATATCGATG (配列番号:10) 3'-AGCGCTCGAGCTCTAGATCTATAGCTACTTAA-5' (配列番号:11) と置き換えて、制限酵素ClaIの単一の切断部位を持つプ
ラスミドpUC8NLを作製した。
【０１２９】プラスミドpSOC712(実施例2参照)をEcoRI
で消化し、断片をヌクレアーゼS1とバクテリオファージT
4 DNAポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドで処理
して突出している5' EcoRI末端を除去した。この末端に
オリゴヌクレオチド: d5'-CATCGATG-3' d3'-GTAGCTAC-5' を連結し、断片をClaIで処理してClaI制限末端を生じさ
せた。
【０１３０】酵母TRP1遺伝子および2ミクロン複製開始
点を含む、得られた3108塩基対ClaI-ClaI断片は、ゲル電
気泳動によって精製され、ClaIで切断しておいたpUC8NL
に連結し、プラスミドpARC300Aが作製された。
【０１３１】2ミクロン複製開始点を含む2031塩基対の
断片は、PstI処理によってpARC300Aから除かれた。得られ
た、修飾されたプラスミドpARC300AはヌクレアーゼS1お
よびバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼおよびデオ
キシヌクレオチドで署りぃしてPstI部位の突出末端を除
去し、ウシ腸アルカリフォスファターゼで処理してプラ
スミドが再度閉じないようにした。修飾されたpARC300A
をオリゴヌクレオチド: d5'-CATCGATG-3' d3'-GTAGCATC-5' と連結して、TRP1遺伝子の直下流(3'末端側)にClaI部位
を導入してプラスミドを作製し、閉じてpARC306Bを作製
した。TRP1遺伝子は酵母複製開始点から分離され、ClaI制
限酵素部位に結合した。
【０１３２】プラスミドpARC306BをClaIで消化し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、ClaI-ClaI
制限断片を,AccIで切断しておいたプラスミドpUC8に導
入して、プラスミドpARC306Cを作製した。
【０１３３】外来性DNAの酵母染色体への挿入は、相同性
組み換えを用いて行うのが最も適しているので、酵母DNA
の必須な断片が望ましい。このDNAは、何らかの理由でTRP
1での組み換えまたはHMG-CoA還元酵素遺伝子部位での組
み換えがつかえない場合に、相同性組み換えを行わせる
ために使用され得る。この目的で選択された遺伝子はHIS
3遺伝子である。
【０１３４】1800塩基対のBamHI-BamHI制限断片がプラ
スミドYEP6[シュトルール(Struhl)他、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA、76:1035(1979)]から除去され、BamHIで切断
しておいたpARC306Cに導入し、プラスミドpARC306Dを作
製した。プラスミドpSOC725(実施例2参照)をEcoRIで消化
し、短縮されたHMG-CoA還元酵素遺伝子に連結したGAL1-1
0プロモーターを単離し、それをEcoRIで消化したプロモ
ーターpARC306Dに挿入して、プラスミドpARC306Eを作製
した。
【０１３５】
【実施例５】挿入プラスミドpARC300Dの構築 プラスミドpARC300D(実施例6参照)は、短縮されたHMG1遺
伝子をPGKプロモーターの制御下におくために構築され
た。
【０１３６】プロモーターpSOC611は、酵母内で短縮され
たHMG-CoA還元酵素遺伝子の転写を引き起こす因子とし
てマウスのメタロチオネインプロモーターの有効性を決
定するために構築された。pSOC611の構築は、プラスミドp
SOC744(実施例2参照)をEcoRIで切断することから始めら
れ、それからEcoRI末端を埋めるために、クレノーポリメ
ラーゼIとデオキシヌクレオチド3リン酸とで処理した。
得られた約3101塩基対のpSOC744由来2ミクロンおよびTR
P1を含む断片は、HincIIで切断されているpUC118に連結
され、プラスミドpSOC517が作製された。
【０１３７】つぎに、プラスミドpSOC517はKpnIとEcoRI
で切断され、マウスメタロチオネインプロモーターがKpn
I-EcoRI断片として挿入され、プロモーターpSOC518が作
製された。このプロモーター領域はもとはpJYMMT(e)[ハ
マー(Hammer)他、Journal of Applied Molecular Geneti
cs, vol.1:273(1982)]のKpnIからBglIIの断片および、道
の配列を持つ短いBglII、EcoRI DNA断片から構成されて
いる。
【０１３８】短縮されたHMG-CoA還元酵素遺伝子は、pSOC
518に2段階で加えられた。第1に、短縮されたHMG-CoA還元
酵素遺伝子をBamHI制限断片としてpSOC725から除去し
た。つぎに、この断片をBamHIで切断しておいたM13mp7に
連結した。新しく形成されたM13誘導体は、pSOC610と呼ば
れた。短縮されたHMG-CoA還元酵素遺伝子は、EcoRI断片と
してpSOC610から除去され、EcoRIで消化したプラスミドp
SOC518に挿入した。得られたプラスミドはpSOC611と名付
けた。
【０１３９】プラスミドpUC8を部分的に制限酵素HaeII
で切断し、再度連結した。この方法で生じる形質転換体に
関して、プラスミドpUC8にもともと含まれていたlacオペ
ロンの一部を含むHaeII断片を失ったプラスミドを見い
だすためにスクリーニングを行った。この新しいプラス
ミドをpSOC505ARCと名付けた。制限酵素EcoRI、HindIIIお
よびKpnIの制限酵素部位は、オリゴヌクレオチド: d5'-TATCGAATTCAAGCTTGGTACCGA-3' (配列番号:12) 3'- AGCTTAAGTTCGAACCATGGCTAT-5' (配列番号:13) をNdeIで消化されたpSOC505ARCに連結することによっ
て、プラスミドpSOC505ARCのNdeI部位に挿入され、プラス
ミドpARC303Aが作製された。
【０１４０】新しいマルチクローニング部位を作製する
ために、M13mp18に存在する通常のマルチクローニング部
位を、オリゴヌクレオチド: をBamHI-KpnIで消化したM13mp18に挿入することにより
改変した。この改変されたM13ウイルスは、pARC303Bと呼
ばれる。この構造は通常のM13mp18マルチクローニング部
位に見られるKpnIおよびSmaI部位を双方とも欠く構造を
している。新しいマルチクローニング部位は、pARC303Bか
らEcoRI、HindIII制限断片をして除去され、EcoRIとHindI
IIで消化したプラスミドpARC303Aに連結されて、プラス
ミドpARC303Cが作製された。
【０１４１】マルチクローニング部位に含まれる通常の
制限酵素部位の並び方を変化させるだけではなく、別の
小さなマルチクローニング部位が最初のマルチクローニ
ング部位からある程度の距離離れた場所で、ベクターに
導入され、酵母の栄養要求性相補マーカーおよび、より大
きなマルチクローニング部位に挿入され得るコード配列
とプロモーターの近傍にある必要のない別の特徴の独立
した操作を可能にした。新しい制限酵素部位の列は、オリ
ゴヌクレオチド: d5'-CCCGGGATCGATCACGT-3' (配列番号:15) d3'-TGCAGGGCCCTAGCTAG-5' (配列番号:16) をAatIIで切断したpARC303Cに連結することにより導入
してプロモーターpARC300Eを作製し、最初のAatII部位に
クローニング部位であるAatII、SmaI、およびClaI部位を
含むようになった。
【０１４２】酵母TRP1遺伝子は、制限酵素部位ClaIを持
つ、pARC306B(実施例4参照)由来の820塩基対断片として
単離された。820塩基対のClaI-ClaI断片はアガロースゲ
ル電気泳動によって精製され、ClaIで消化されたプラス
ミドpARC300Eに連結され、プラスミドpARC300Bが作製さ
れた。
【０１４３】プラスミドpSOC611はBamHIとSspIで消化さ
れて、短縮されたHMG-CoA還元酵素遺伝子の1667塩基対コ
ード配列を生じ、アガロースゲルで精製された。1667塩基
対断片は、BamHI、HincIIで切断されたプラスミドpARC300
Bに連結され、プラスミドpARC300Cが作製された。
【０１４４】短縮されたHMG-CoA還元酵素遺伝子の転写
を引き起こすのに用いられたGAL1-10プロモーターに対
して、別のプロモーター源が必要とされた。GAL1-10プロ
モーターを使用する場合に、酵母を高価な基質であるガ
ラクトースで培養する必要がある。はるかに安い基質で
あるグルコースの存在下で培養、増殖中に短縮されたHMG
-CoA還元酵素遺伝子の高レベルでの転写を行わせるため
に、S.セレビシテのフォスフォグリセレートキナーゼ(PG
K)遺伝子のプロモーターが単離された。この遺伝子の配
列は文献から入手できる[ヒッツェマン(Hitzeman)他、Nu
cl. Acid Res., 10:7791-7808(1982)]。
【０１４５】既知の配列から、ハイブリダイゼーション
プローブとして用いられる、遺伝子と十分な相補性のあ
るオリゴヌクレオチドプローブが合成された: d5'-ATAAAGACATTGTTTTTAGATCTGTTGTAA-3' (配列番号:17) このプローブは、32P-ATPの存在下でT4 ポリヌクレオチ
ドキナーゼによって標識し、メイナード・オルソン(Mayna
rd Olson)(ワシントン大学医学部、遺伝学科、センントル
イス、Mo.)に供与された酵母ゲノムのバクテリオファー
ジλサブクローンライブラリーをスクリーニングするた
めに用いた。このクローンから遺伝子をEcoRI-HindIII断
片として単離し、M13mp18にサブクローニングし、新しい
ファージmARC127を作製した。
【０１４６】PGKプロモーターを有用なものにするため、
プロモーターの5'末端の制限酵素部位をEcoRI部位に変
え、BglII部位をDNA断片の転写開始部位の3'側に導入し
た。BglII部位はオリゴヌクレオチド: d5'-ATAAAGACATTGTTTTTAGATCTGTTGTAA-3' (配列番号:17) を用いて導入し、クンケル(Kunkel)他、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA、82:4778(1985)の方法により、mARC127に変
異を導入した。この得られたM13ファージをmARC128と名
付けた。
【０１４７】mARC128をHindIIIで切断し、DNAポリメラー
ゼのクレノー断片及び4種のデオキシヌクレオチド3リン
酸で処理し、EcoRI部位を含むオリゴヌクレオチド: d5'-GGAATTCC-3' の存在下で連結反応を行うことにより、プロモーター領
域の5'末端を越えたHindIII部位をEcoRI部位に転換し
た。得られたM13誘導体をpARC306Lと命名した。
【０１４８】プロモーターpARC306LをEcoRIとBglIIで消
化し、PGKプロモーターを含む1500塩基対断片をゲル電気
泳動で精製し、EcoRIとBamHIで切断したpARC300Cに連結
し、プロモーターpARC300Dを作製した。
【０１４９】
【実施例６】挿入プラスミドpARC300SおよびpARC300T プラスミドpARC300S(図６参照)とpARC300T(図７参照)
は、URA3選択マーカーを挿入ベクターに組み込むために
構築したものであり、それにおいて短縮されたHMG1遺伝
子のコード配列はPGKプロモーターの制御下に置かれて
いる。
【０１５０】pARC300SとpARC300Tの唯一の相違は、短縮
された還元酵素をコードする配列の転写を引き起こすPG
Kプロモーターの長さである。URA3中に見いだされる単一
のEcoRV部位によりプラスミドを直鎖状にすることがで
き、染色体のURA3遺伝子に相同的組み換えによって挿入
させることができる。
【０１５１】プラスミドYEP24(ボットシュタイン(Botst
ein)他、Gene、8:17-24(1979))からURA3遺伝子を1127塩基
対のEcoRI-SmaI制限断片として単離し、EcoRIとSmaIで切
断したpUC19に連結して、新しいプラスミドLpARCLH553a
が形成された。LpARCLH553aから1108塩基対のSmaI-HindI
II断片を単離し、SmaI-HindIIIで切断したM13mp19に挿入
して、新しいファージ核酸pARC306Kとした。オリゴヌクレ
オチド: d5'-GATTTATCTTCGTTTCCTGCAAGTTTTTGTTC-3' (配列番号:18) を用いて、クンケル他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:
4778(1985)の方法で変異を導入することによってURA3遺
伝子内の単一のPstI部位を除去し、プラスミドpARC300Z
を作製した。
【０１５２】プラスミドpARC300ZをHindIIIで切断し、末
端をDNAポリメラーゼのクレノー断編とデオキシヌクレ
オチド3リン酸で埋め、修飾したpARC300ZをSmaI部位を含
むオリゴヌクレオチド d5'-CCCCGGGG-3'と連結した。Sma
I制限断片上にURA3遺伝子を含む、この新しいM13誘導体
をプラスミドpARC300Yと名付けた。
【０１５３】プラスミドpARC304Aは、酵母挿入用形質転
換ベクターのコード領域の3'末端に導入される、修飾さ
れたURA3転写終結断片を与えるために構築された。転写
終結因子は、終結配列を持たないか弱い終結配列しか持
たないコード領域を含む挿入ベクターで形質転換した種
のmRNA安定性を向上させるように機能するものである。m
RNAの安定性が向上することにより、コード配列領域にコ
>ードされたタンパク質の活性が上昇することを意味し
得る。選択された終結因子はS.セレビシエのURA3の一部
であり、終結因子として機能する[ヤーガー(Yarger)他、M
olecular and Cellular Biology, 6:1095(1986)]。終結
因子の配列は、4種類のオリゴマー: d5'-AGCTTCGAAGAACGAAGGAAGGAGCACAGACTTAG-3' (配列番号:19) d5'-ATTGGTATATATACGCATATTGCGGCCGCGGTAC-3' (配列番号:20) d5'-CGCGGCCGCAATATGCGTATATATAC-3' (配列番号:21) d5'-CAATCTAAGTCTGTGCTCCTTCCTTCGTTCTTCGA-3' (配列番号:22) を用いて構築された。これらのオリゴマーはそれぞれ、Hi
ndIIIおよびKpnI末端を持つように考案された。修飾され
たURA3転写終結因子は、4種すべてのオリゴマーを互いに
連結することによって結合させ、連結産物をHindIIIとKp
nIで切断して連結可能なHindIII-KpnI制限末端を産生さ
せる。67塩基対断片はポリアクリルアミドゲルで単離さ
れ、ゲル断片からDNAを電気溶出することによって精製
し、HindIII-KpnIで切断したpUC118(ATCC 37462)に連結
した。このように構築された新しいプラスミドをpARC304
Aと名付けた。
【０１５４】URA3転写終結因子を含む67塩基対のHindII
I-KpnI断片はプラスミドpARC304Aから単離され、HindIII
-KpnIで切断したpARC300Eに連結して、プラスミドpARC30
0Mが構築された。短縮されたHMG-CoA還元酵素をコードす
る配列を1667塩基対のpSOC611(実施例5参照)由来のBamH
I-SspI断片として単離し、アガロースゲル電気泳動によ
って精製し、BamHIとHincIIで切断したpARC300Mに連結し
てプラスミドpARC300Rを構築した。
【０１５５】URA3を相補する遺伝子をXmaI制限断片とし
てプラスミドpARC300Yから単離し、pARC300RのXmaI部位
に連結してpARC300Uを作製した。
【０１５６】PGKプロモーターを含むDNA上で、制限酵素
部位の導入が可能な他の改変を行った。完全なPGKプロモ
ーター活性を種召すのに必要な最小DNA領域が決定され
た[スタンウェイ(Stanway)、Nucleci Acids Research,1
5:6855-6873 (1987)]。最小領域に必要な5'側DNAをわず
かに越えた領域で、PGKプロモーターを特定するDNAに新
しいEcoRI部位を付加した。EcoRI部位はオリゴヌクレオ
チド: d5'-CTTTATGAGGGTAACATGAATTCAAGAAGG-3' (配列番号:23) を用いてクンケル他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:4
778(1985)の方法によってmARC1228に変異を導入した。こ
の新しいM13誘導物をpARC306Mと名付けた。
【０１５７】１５００塩基対のフォスフォグリセレート
キナーゼ（ＰＧＫ）をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩの制限酵
素を用いてプラスミドｐＡＲＣ３０６Ｌ（実施例５参
照）から単離した。ＰＧＫプラスミド断片をアガロース
ゲル電気泳動によって単離し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
で切断したｐＡＲＣ３００Ｕに連結し、プラスミドｐＡ
ＲＣ３００Ｓを作製した。
【０１５８】短縮したPGKプラスミド(555塩基対断片)を
EcoRIおよびBglIIで切断したプラスミドpARC306Mから単
離し、EcoRI-BamHIで消化したプラスミドpARC300Uに挿入
してプラスミドpARC300Tを作製した。
【０１５９】プラスミドpARC300TとプラスミドpARC300S
の相違点は、短縮した還元酵素コード配列の転写を行わ
せるPGKプラスミドの長さのみである。URA3遺伝子内に見
いだされた単一のEcoRV部位によりプラスミドを直鎖状
にでき、相同的組み換えにより染色体のURA3遺伝子に挿
入させることが可能である。
【０１６０】
【実施例７】プラスミドpARC304Sの構築 プラスミドpARC304S(図８参照)は、短縮したHMG1遺伝子
をADHプロモーターの制御下におくために構築した。
【０１６１】プラスミドpBR322をEcoRIとBamHIで切断
し、ADH1プロモーターを含む断片を得た。ADH1を含む断片
を、EcoRIとBamHIで切断したプラスミドpARC300U(実施例
6参照)に連結しpARC304Sを作製した。
【０１６２】プラスミドpARC304Sはブダペスト協定に従
い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)
(12301 パークローンドライブ、ロックビル、MD 20852 U.
S.A.)に1990年11月9日に寄託され、寄託番号ATCC 40916
を与えられた。
【０１６３】
【実施例８】変異株S.セレビシエATC0402muの作製 変異株ATC0402muは、ザイモステロール-24-メチルトラン
スフェラーゼおよびエルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノー
ル-22-デヒドロゲナーゼの発現に欠損を持ち、GALおよび
trp1の表現型を持つものとして作製された。これらの酵
素はそれぞれS.セレビシエのerg6およびerg5産物であ
る。
【０１６４】S.セレビシエのerg6欠損変異株、M610-12B
はイースト・ジェネティック・ストック・センター(カリフ
ォルニア大学、バークレー、CA)から入手し、S.セレビシエ
のerg5欠損変異株(レオ・パークス博士、ノースカロライ
ナ州立大学、ラレイ、NCから供与)と掛け合わせ、erg6-erg
5二重変異株,ATC0403muを作製した。
【０１６５】ATC0403muはつぎに、野生型のS.セレビシ
エ、DBY745(イースト・ジェネティック・ストック・センタ
ー)と掛け合わせて、変異株ATC0402muを作製した。
【０１６６】変異株ATC0402muはブダペスト協定にした
がって、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(A
TCC)(12301 パークローンドライブ、ロックビル、MD 2085
2 U.S.A.)に1990年11月9日に寄託され、寄託番号ATCC 74
027を与えられた。
【０１６７】
【実施例９】形質転換体変異株ATC1500cp、ATC1502、ATC1503、ATC1551、
およびATC2401の作製 多様なプロモーターの転写制御下にあるHMG-CoA還元酵
素コード配列を含む多様な発現系(プラスミド)で、実施
例1の方法を用いてATC0402muを形質転換することによ
り、幾つかの変異株を作製した。実施例3の方法により作
製したプラスミドpSOC196ARCをATC0402muに導入するこ
とによりATC1503を作製した。
【０１６８】実施例２の方法により作製したプラスミド
pSOC725ARCをATC0402muに導入することによりATC2401mu
を作製した。
【０１６９】実施例４の方法により作製したプラスミド
pARC306EをATC0402muに導入することによりATC1502を作
製した。
【０１７０】実施例５の方法により作製したプラスミド
pARC300DをATC0402muに導入することによりATC1500cpを
作製した。
【０１７１】ATC1551株の作製には、栄養要求性マーカー
を持たないATC1500cp株のura3誘導体の作製を必要とし
た。ura3誘導体は、モーシェル(Moerschell)他[Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA、85:524-528(1988)]の方法を用いて、
ARC1500cpを変異導入用オリゴヌクレオチドで形質転換
することによって作製した。用いた変異導入用オリゴヌ
クレオチドは:5'-GCCAAGTAGTTTTTACTCTTCAAGACAGATAATT
TGCTGACA-3' (配列番号:24) である。変異を導入した
酵母細胞は、アウスベル(Ausubel)他、編集、Current Prot
ocolsin Molecular Biology、ジョン・ウィリー・アンド・
サンズ社、ニューヨーク、(1989)に述べられているよう
に、5'-フルオロ-オロチン酸(5-FOA)に耐性であることに
よって選択し、ウラシルの非存在下で増殖不能となるこ
とでスクリーニングを行った。得られたura3株はATC0135
rcと名付けた。ATC0135rc株はつぎに、実施例7の方法で作
製されたプラスミドpARC304Sで形質転換し、ATC1551株を
作製した。
【０１７２】本発明のプラスミドpARC304Sで形質転換し
たATC0135rc株は、最も多量のステロールの蓄積を示し
た。さらに、通常の培養条件と比較して、空気交換を制限
した条件下で、形質転換したATC0135rc変異株を培養する
ことにより、スクアレンおよびステロール全体の全蓄積
量が増加したのに加えて、他のステロールと比較してス
クアレンの蓄積が上昇した。
【０１７３】変異株ATC0135rcはブダペスト協定にした
がい、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATC
C)(12301 パークローンドライブ、ロックビル、MD 20852
U.S.A.)に1991年9月16日に寄託され、寄託番号ATCC 7409
0を与えられた。
【０１７４】
【実施例１０】S.セレビシエ変異株ATC6118、ATC0501、およびATC6119の
作製 変異原剤として、誘導可能な“TY1-neo"トランスポゾン
を用いて、変異株を得た[ボーケ(Boeke)他、Science、239:
280-282(1989)]。
【０１７５】S.セレビシエの野生型株JB516を、誘導可能
なGAL:TY1neo発現カセットを含むプラスミドpJEF1105
[ボーケ他、Science、239:280-282(1989)]、および、コント
ロールのGAL:lacZを含むプラスミドpCGS286で形質転換
した。形質転換された酵母をつぎに、2種類のXgal発色源
指示薬を含むペトリ皿、すなわちウラシルを含まない合
成デキストロース(SD)寒天培地およびウラシルを含まな
い合成ガラクトース(SG)培地に広げた。プラスミドpJEF1
105で形質転換された酵母は、デキストロース上では正常
であるが、ガラクトース培地上の形質転換されていない
コントロールの酵母よりは小さかった。
【０１７６】プラスミドpJEF1105の安定性は、大腸菌へ
戻して増幅と制限酵素による分析により確認された。
【０１７７】プラスミドpJEF1105で形質転換した酵母が
有望だとわかった場合には、pJEF1105形質転換体を一枚
のペトリ皿あたり1000形質転換体を越えない程度の密度
でウラシルを含まないSG寒天培地に広げた。ペトリ皿を2
2℃で5日間培養し、その間にプラスミドが持つTY1-neoの
変異原的移動を起こさせた。つぎに、ウラシルを含まない
別のSGプレートで形質転換体のレプリカプレートを作製
し、さらに5日間インキュベートした。ステロール産生を
選択するために100ユニット/mlのナイスタチンを、“ne
o"表現型を選択するためにG418(ネオマイシン類似体)を
100ユニット/ml添加したYEPD寒天プレート上に、生き残
ったこれらのコロニーのレプリカプレートを作成した。
ナイスタチンおよびG418の双方に耐性である形質転換体
に関してステロール含量を測定し、ガスクロマトグラフ
ィーおよびマススペクトログラフィー解析を用いてその
分布を調べ、その変異によって影響された特異的なステ
ロール生合成過程に関して分類を行う。
【０１７８】エピステロール-5-デヒドロゲナーゼ(erg3
遺伝子産物)に欠損を持つ酵母が単離され、ATC6118と命
名された。
【０１７９】ザイモステロール-24-メチルトランスフェ
ラーゼ(erg6)に欠損を持つ酵母が、プラスミドpJEF1105
で変異を起こした酵母DBY745(イースト・ジェネティック
・ストック・センター)から単離され、ATC0501と命名され
た。
【０１８０】ATC0501はATC6118と掛け合わせ、erg3-erg6
二重変異を作成し、ATC6119と命名した。
【０１８１】
【実施例１１】形質転換されたS.セレビシエ変異株ATC2100、ATC2104、お
よびATC2109の作製 実施例１の方法にしたがって、それぞれ実施例6にしたが
って構築したプラスミドpARC300SおよびpARC300TのATC6
119への導入を行い、ATC2100およびATC2104をそれぞれ作
製し、また、プラスミドpARC300SのATC6118への導入によ
りATC2109を作製した。
【０１８２】
【実施例１２】変異体S.セレビシエATC4124の作製 ATC4124(イースト・ジェネティック・ストック・センター)
は、ATC0403muをYNN281(イースト・ジェネティック・スト
ック・センター)と掛け合わせ、望みの変異に関して選択
することにより作製した。得られた分離株は2回バックク
ロスを行った。
【０１８３】得られたATC4124はコレスター5,7,24(28)-
トリエノール-22-デヒドロゲナーゼ(erg5遺伝子産物)に
欠損を持っていた。
【０１８４】
【実施例１３】変異体S.セレビシエATC2107およびATC2108の作製 実施例１の方法にしたがって、実施例４の方法で構築し
たプラスミドpARC306EをATC4124に導入することによっ
てATC2107およびATC2108を作製した。
【０１８５】
【実施例１４】変異体および形質転換体酵母のHMG-CoA還元酵素活性 HMG-CoA還元酵素活性を、形質転換してない、あるいは形
質転換したerg5-erg6変異株酵母で測定した。
【０１８６】約0.2mlの125mM 庶糖、20mM EDTA、および10
0mM KClを含む50mM リン酸カリウム緩衝液、pH6.8を10mM
DTT(新しく調製したもの)、1mM NADPH、酵素調製液およ
び、最終体積を約0.475mLとするための水と混合した。酵
素溶液を37℃で20分間プレインキュベートし、100μl 14
C-HMG-CoA(0.025ml中、60、000dpm)を加えることによりイ
ンキュベーション反応が開始された。5分後、50μlのHCl
(1:1)を加えることによって反応を停止させ、さらに37℃
で30分間インキュベーションを行って、産物を乳酸化し
た。産物であるメバロノーラクトンは陰イオン交換AGI-X
8(バイオラッド社)を用いてHMGから分離し、産物と結合
している放射活性をシンチレーションカウンターで測定
した。結果を下の表5に示す。HMG-CoA還元酵素活性を持つ
ポリペプチドをコードする構造遺伝子のコピー数は、形
質転換法に精通したものには知られている、標準的な方
法で見積もった。
【０１８７】 表５ 変異株 加えた構造遺伝子の HMG-CoA還元酵素の非活性 予測されるコピー数 非形質転換体 ATC0402mu 0 0.52形質転換体 ATC1503 1,2 0.69 ATC1500cp 5,6 1.33 ATC1512 8,9 1.01
【０１８８】
【実施例１５】酵母中のスクアレンおよびステロールの蓄積 スクアレンおよび特異的なステロールの蓄積は、形質転
換されていない、および形質転換された変異体酵母培養
液で決定された。
【０１８９】50から100mgの凍結乾燥した酵母細胞を、20
% (w/v) KOHを含む10mlのエタノール/水(2:1)中で、80℃
で2時間抽出/サポニン化した。抽出液を10mlの1N HClで
部分的に中和し、15mlのn-ヘプタンで2回抽出した。ステ
ロールを含むヘプタン画分をN2蒸気下で乾燥させ、内部
コントロール(5-α-コレスタン)を含むn-ヘプタンで適
当な体積に再懸濁した。
【０１９０】再懸濁した試料について、炎色イオン化検
出とキャミラリーGCによってステロールの蓄積を解析し
た。
【０１９１】表６はステロール生合成経路酵素に単一の
欠損(erg3、erg5)を持つ、形質転換されていない(コント
ロール)、および形質転換された変異株のデータをまとめ
たものである。
【０１９２】表７は、ステロール生合成経路酵素に二重
の欠損(erg3-erg6、erg5-erg69wo持つ、形質転換されてい
ない(コントロール)、および形質転換された変異株のデ
ータをまとめたものである。
【０１９３】表６および表７の双方で、同じerg変異を持
つコントロール変異株を形質転換することによって、す
べての形質転換体が作製された。
【０１９４】ステロールレベルは、乾燥バイオマスの百
分率として示している。
【０１９５】 表６ ERG3変異株 バイオマス百分率 ステロール 非形質転換体 形質転換体 ATC6118 ATC2109 a. スクアレン N.D.* 0.26 b. エルゴスタ-8,22-ジエノール 0.31 1.08 c. エルゴスタ-7,22-ジエノール 0.66 1.64 d. エルゴスタ-8-エノール 0.27 0.42 e. エルゴスタ-7-エノール 0.63 0.72 ERG3変異株 バイオマス百分率 ステロール 非形質転換体 形質転換体 ATC4124 ATC2107 ATC210 8 a. スクアレン N.D.* 1.10 0.49 b. ザイモステロール 0.05 0.25 0.25 c. エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノール およびエルゴスタ-5,7-ジエノール 0.17 1.75 1.19 * 検出限界以下 表７ ERG3-ERG6変異株 バイオマス百分率 ステロール 非形質転換体 形質転換体 ATC6119 ATC2100 ATC2 104 a. ステロール N.D.*** 0.13 0.98 b. ザイモステロール 0.21 1.10 1.80 c. コレスタ-7,24-ジエノール 0.53 1.10 1.50 ERG5-ERG6変異株 バイオマス百分率 ステロール 非形質転換体 形質転換体 ATC0402mu ATC1503 ATC2401mu ATC1502 ATC1500cp ATC1551 (n=4) (n=2) (n=4) (n=2) (n=1) (n=1) a. スクアレン 0.026 0.336 0.947 1.078 0.27 2.992 b. ザイモステロール 1.107 1.358 1.125 2.065 3.746 5.125 c. C5,7,24* 1.542 0.956 1.064 1.354 1.868 2.372 d. C7,24** 0.213 0.362 0.250 0.408 0.564 0.775 * C5,7,24はコレスタ-5,7,24-トリエノール ** C7,24はコレスタ-7,24-ジエノール *** 検出限界以下 n＝測定数 上述のデータは、ステロール生合成経路酵素の発現に単
一の欠損を持つ変異株の形質転換により、スクアレンお
よび特異的なステロールの蓄積が増加したことを示して
いる(表６参照)。
【０１９６】形質転換されていないerg3変異株と比較し
て、本発明で有用なプラスミドベクターで形質転換され
たerg3変異株は、スクアレン、エルゴスタ-8,22-ジエノー
ル、エルゴスタ-7,22-ジエノール、エルゴスタ-8-エノー
ル、およびエルゴスタ-7-エノールを過剰に蓄積した。
【０１９７】形質転換されていないerg5変異株と比較し
て、本発明で有用なプラスミドベクターで形質転換され
たerg5変異株は、スクアレン、ザイモステロール、および
エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノールの混合物、および
エルゴスタ-5,7-ジエノールを過剰に蓄積した。
【０１９８】同様に、ステロール生合成経路酵素に二重
の欠損を持つ変異株の形質転換により、スクアレンおよ
び特異的なステロールが過剰に蓄積した。
【０１９９】形質転換していないerg3-erg6変異株と比
較して、本発明で有用なプラスミドベクターで形質転換
されたerg3-erg6変異株は、スクアレン、ザイモステロー
ル、およびコレスタ-7,24-ジエノールを過剰に蓄積した。
【０２００】形質転換していないerg5-erg6変異株と比
較して、本発明で有用なプラスミドベクターで形質転換
されたerg5-erg6変異株は、スクアレン、ザイモステロー
ル、コレスタ-5,7,24-トリエノール、およびコレスタ-7.2
4-ジエノールを過剰に蓄積した。スクアレンおよび特異
的なステロールの蓄積の最大の増加は、実施例9で述べた
ように、erg5-erg6変異株ATC0315rcをプラスミドベクタ
ーpARC304Sで形質転換した場合(変異株ATC1551)に見ら
れた。さらに、これらのデータは、変異株ATC0315rcの2代
上の株であるATC0402muは、erg5またはerg6の単一の変異
株と比較して、ステロールのレベルが上昇しているのが
見いだされた(表6参照)。
【０２０１】
【実施例１６】酵母形質転換体ATC1551におけるスクアレン蓄積の誘導 一般に、酵母培養で空気交換を制限することにより、ステ
ロールを消費してスクアレンが蓄積されるようになるこ
とが知られている。これは、スクアレンからスクアレンモ
ノエポキシドへの酵素的転換に酸素が必要とされるため
であり、そのかわりにラノステロールまたは他の酵母ス
テロールに転換される。
【０２０２】形質転換体においてスクアレンの高レベル
の蓄積を誘導できるかどうかを決定するために、ATC1551
の培養液を多様な空気交換率、および、多様な体積(した
がって表面積対体積の比)の振盪フラスコ培養液中の増
殖培地で培養し、1日ごとに4日間、スクアレンと全ステロ
ールのアッセイを行った。
【０２０３】50、100、150、および200mlのYEP/2%グルコー
ス培地をそれぞれ入れた250ml容量の振盪フラスコを3本
ずつ、ATC1551の24時間液体培養液2mlを加えてロータリ
ー振盪機(200rpm)で、30℃で培養した。上述の条件下で培
養し、1、2、3、4日後に遠心によって50mlの培養液アリコー
トを回収し、一晩凍結乾燥を行った。
【０２０４】効率よくスクアレンを抽出するために、各
凍結乾燥試料約100mgを、適当な量のグラスビーズと少量
の水を含む15mlのコニカルチューブ内で10分間激しく混
合した。破砕された細胞物質を、10mlの100%エタノールで
3回、激しく振盪しながら約80℃で1時間ずつ抽出した。エ
タノール抽出液を合わせたものを、窒素流下で乾燥させ、
内部コントロールとして5α-コレスタンを含む2mlのヘ
プタンで再溶解させた。スクアレンのGC分析は、上述のよ
うに行った。
【０２０５】全ステロールの解析に関しては、同じ試料
を窒素流下で乾燥させ、0.3M KOHを含む95% エタノール/
水溶液5ml中で、80℃で1時間サポニン化した。等量の水を
加え、試料を10mlのヘプタンで2回、抽出した。ヘプタン抽
出液を合わせたものを適当な体積に減らし、GCによって
解析した。
【０２０６】結果を表8に示す(データは3本の培養液か
らの平均であり、乾燥バイオマスの百分率として示し
た)。
【０２０７】 表８ 培地体積 50ml 100ml 150ml 200ml 回収した時間 乾燥バイオマス 1日 スクアレン 4.25 5.40 3.61 2.63 全ステロール 9.40 9.52 6.81 5.46 2日 スクアレン 4.78 6.43 11.89 8.32 全ステロール 8.29 6.44 3.72 2.98 3日 スクアレン 4.75 8.82 13.54 13.38 全ステロール 7.96 7.65 4.36 4.19 4日 スクアレン 4.03 7.08 15.99 14.72 全ステロール 7.09 8.62 5.10 3.39 これらのデータは、形質転換されたerg5-erg6変異株で
は、通常の培養条件(50ml培養液)と比較して、空気交換が
制限されることにより、全ステロールに対してスクアレ
ンが優先的に、特に1日以上培養した場合に蓄積している
ことを示している。このデータはまた、空気交換のレベル
を制限すること(表面積対体積比を低くすること)によ
り、約2日以上培養すると、スクアレンおよび全ステロー
ルの総量が増加することを示している。
【０２０８】本発明の、一つの望ましい態様について述
べ、それに関する例を示したが、その本質から離れる事な
く多様な改変、修飾、省略、置換が行われ得ることは、本分
野の技術者には容易に理解されるであろう。
【０２０９】表の説明 表９は表９-１から表９-１２までの１２のパネルからな
り、バッソン(Basson)他、Mol. Cell Biol.,8(9):3797-38
08(1988)で報告されたS.セレビシエのヌクレオチド配列
(配列番号:1)および推定されるアミノ酸残基配列(配列
番号:2)を示している。ヌクレオチドは5'から3'方向に番
号がつけられている(左側)。1位は開始メチオニンをコー
ドするATGトリプレットの最初のヌクレオチドに対応す
る。予想されるアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列の下に
示す。アミノ酸残基は開始メチオニンから番号がつけら
れている(右側)。
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
【０２１９】
【０２２０】
【０２２１】
【０２２２】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３３６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 配列を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：121..3282 配列 TTTATTAACT TATTTTTTTC TTCTTTCTAC CCAATTCTAG TCAGGAAAAG ACTAAGGGCT 60 GGAACATAGT GTATCATTGT CTAATTGTTG ATACAAAGTA GATAAATACA TAAAACAAGC 120 ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CTG AAA CAG ATG GCA AAG CCA ATT GCC 168 Met Pro Pro Leu Phe Lys Gly Leu Lys Gln Met Ala Lys Pro Ile Ala 1 5 10 15 TAT GTT TCA AGA TTT TCG GCG AAA CGA CCA ATT CAT ATA ATA CTT TTT 216 Tyr Val Ser Arg Phe Ser Ala Lys Arg Pro Ile His Ile Ile Leu Phe 20 25 30 TCT CTA ATC ATA TCC GCA TTC GCT TAT CTA TCC GTC ATT CAG TAT TAC 264 Ser Leu Ile Ile Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Ser Val Ile Gln Tyr Tyr 35 40 45 TTC AAT GGT TGG CAA CTA GAT TCA AAT AGT GTT TTT GAA ACT GCT CCA 312 Phe Asn Gly Trp Gln Leu Asp Ser Asn Ser Val Phe Glu Thr Ala Pro 50 55 60 AAT AAA GAC TCC AAC ACT CTA TTT CAA GAA TGT TCC CAT TAC TAC AGA 360 Asn Lys Asp Ser Asn Thr Leu Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 GAT TCC TCT CTA GAT GGT TGG GTA TCA ATC ACC GCG CAT GAA GCT AGT 408 Asp Ser Ser Leu Asp Gly Trp Val Ser Ile Thr Ala His Glu Ala Ser 85 90 95 GAG TTA CCA GCC CCA CAC CAT TAC TAT CTA TTA AAC CTG AAC TTC AAT 456 Glu Leu Pro Ala Pro His His Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Asn Phe Asn 100 105 110 AGT CCT AAT GAA ACT GAC TCC ATT CCA GAA CTA GCT AAC ACG GTT TTT 504 Ser Pro Asn Glu Thr Asp Ser Ile Pro Glu Leu Ala Asn Thr Val Phe 115 120 125 GAG AAA GAT AAT ACA AAA TAT ATT CTG CAA GAA GAT CTC AGT GTT TCC 552 Glu Lys Asp Asn Thr Lys Tyr Ile Leu Gln Glu Asp Leu Ser Val Ser 130 135 140 AAA GAA ATT TCT TCT ACT GAT GGA ACG AAA TGG AGG TTA AGA AGT GAC 600 Lys Glu Ile Ser Ser Thr Asp Gly Thr Lys Trp Arg Leu Arg Ser Asp 145 150 155 160 AGA AAA AGT CTT TTC GAC GTA AAG ACG TTA GCA TAT TCT CTC TAC GAT 648 Arg Lys Ser Leu Phe Asp Val Lys Thr Leu Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp 165 170 175 GTA TTT TCA GAA AAT GTA ACC CAA GCA GAC CCG TTT GAC GTC CTT ATT 696 Val Phe Ser Glu Asn Val Thr Gln Ala Asp Pro Phe Asp Val Leu Ile 180 185 190 ATG GTT ACT GCC TAC CTA ATG ATG TTC TAC ACC ATA TTC GGC CTC TTC 744 Met Val Thr Ala Tyr Leu Met Met Phe Tyr Thr Ile Phe Gly Leu Phe 195 200 205 AAT GAC ATG AGG AAG ACC GGG TCA AAT TTT TGG TTG AGC GCC TCT ACA 792 Asn Asp Met Arg Lys Thr Gly Ser Asn Phe Trp Leu Ser Ala Ser Thr 210 215 220 GTG GTC AAT TCT GCA TCA TCA CTT TTC TTA GCA TTG TAT GTC ACC CAA 840 Val Val Asn Ser Ala Ser Ser Leu Phe Leu Ala Leu Tyr Val Thr Gln 225 230 235 240 TGT ATT CTA GGC AAA GAA GTT TCC GCA TTA ACT CTT TTT GAA GGT TTG 888 Cys Ile Leu Gly Lys Glu Val Ser Ala Leu Thr Leu Phe Glu Gly Leu 245 250 255 CCT TTC ATT GTA GTT GTT GTT GGT TTC AAG CAC AAA ATC AAG ATT GCC 936 Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Phe Lys His Lys Ile Lys Ile Ala 260 265 270 CAG TAT GCC CTG GAG AAA TTT GAA AGA GTC GGT TTA TCT AAA AGG ATT 984 Gln Tyr Ala Leu Glu Lys Phe Glu Arg Val Gly Leu Ser Lys Arg Ile 275 280 285 ACT ACC GAT GAA ATC GTT TTT GAA TCC GTG AGC GAA GAG GGT GGT CGT 1032 Thr Thr Asp Glu Ile Val Phe Glu Ser Val Ser Glu Glu Gly Gly Arg 290 295 300 TTG ATT CAA GAC CAT TTG CTT TGT ATT TTT GCC TTT ATC GGA TGC TCT 1080 Leu Ile Gln Asp His Leu Leu Cys Ile Phe Ala Phe Ile Gly Cys Ser 305 310 315 320 ATG TAT GCT CAC CAA TTG AAG ACT TTG ACA AAC TTC TGC ATA TTA TCA 1128 Met Tyr Ala His Gln Leu Lys Thr Leu Thr Asn Phe Cys Ile Leu Ser 325 330 335 GCA TTT ATC CTA ATT TTT GAA TTG ATT TTA ACT CCT ACA TTT TAT TCT 1176 Ala Phe Ile Leu Ile Phe Glu Leu Ile Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Ser 340 345 350 GCT ATC TTA GCG CTT AGA CTG GAA ATG AAT GTT ATC CAC AGA TCT ACT 1224 Ala Ile Leu Ala Leu Arg Leu Glu Met Asn Val Ile His Arg Ser Thr 355 360 365 ATT ATC AAG CAA ACA TTA GAA GAA GAC GGT GTT GTT CCA TCT ACA GCA 1272 Ile Ile Lys Gln Thr Leu Glu Glu Asp Gly Val Val Pro Ser Thr Ala 370 375 380 AGA ATC ATT TCT AAA GCA GAA AAG AAA TCC GTA TCT TCT TTC TTA AAT 1320 Arg Ile Ile Ser Lys Ala Glu Lys Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Asn 385 390 395 400 CTC AGT GTG GTT GTC ATT ATC ATG AAA CTC TCT GTC ATA CTG TTG TTT 1368 Leu Ser Val Val Val Ile Ile Met Lys Leu Ser Val Ile Leu Leu Phe 405 410 415 GTT TTC ATC AAC TTT TAT AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT GCC 1416 Val Phe Ile Asn Phe Tyr Asn Phe Gly Ala Asn Trp Val Asn Asp Ala 420 425 430 TTC AAT TCA TTG TAC TTC GAT AAG GAA CGT GTT TCT CTA CCA GAT TTT 1464 Phe Asn Ser Leu Tyr Phe Asp Lys Glu Arg Val Ser Leu Pro Asp Phe 435 440 445 ATT ACC TCG AAT GCC TCT GAA AAC TTT AAA GAG CAA GCT ATT GTT AGT 1512 Ile Thr Ser Asn Ala Ser Glu Asn Phe Lys Glu Gln Ala Ile Val Ser 450 455 460 GTC ACC CCA TTA TTA TAT TAC AAA CCC ATT AAG TCC TAC CAA CGC ATT 1560 Val Thr Pro Leu Leu Tyr Tyr Lys Pro Ile Lys Ser Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480 GAG GAT ATG GTT CTT CTA TTG CTT CGT AAT GTC AGT GTT GCC ATT CGT 1608 Glu Asp Met Val Leu Leu Leu Leu Arg Asn Val Ser Val Ala Ile Arg 485 490 495 GAT AGG TTC GTC AGT AAA TTA GTT CTT TCC GCC TTA GTA TGC AGT GCT 1656 Asp Arg Phe Val Ser Lys Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Cys Ser Ala 500 505 510 GTC ATC AAT GTG TAT TTA TTG AAT GCT GCT AGA ATT CAT ACC AGT TAT 1704 Val Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Arg Ile His Thr Ser Tyr 515 520 525 ACT GCA GAC CAA TTG GTG AAA ACT GAA GTC ACC AAG AAG TCT TTT ACT 1752 Thr Ala Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe Thr 530 535 540 GCT CCT GTA CAA AAG GCT TCT ACA CCA GTT TTA ACC AAT AAA ACA GTC 1800 Ala Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr Val 545 550 555 560 ATT TCT GGA TCG AAA GTC AAA AGT TTA TCA TCT GCG CAA TCG AGC TCA 1848 Ile Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser 565 570 575 TCA GGA CCT TCA TCA TCT AGT GAG GAA GAT GAT TCC CGC GAT ATT GAA 1896 Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu 580 585 590 AGC TTG GAT AAG AAA ATA CGT CCT TTA GAA GAA TTA GAA GCA TTA TTA 1944 Ser Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu 595 600 605 AGT AGT GGA AAT ACA AAA CAA TTG AAG AAC AAA GAG GTC GCT GCC TTG 1992 Ser Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu 610 615 620 GTT ATT CAC GGT AAG TTA CCT TTG TAC GCT TTG GAG AAA AAA TTA GGT 2040 Val Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly 625 630 635 640 GAT ACT ACG AGA GCG GTT GCG GTA CGT AGG AAG GCT CTT TCA ATT TTG 2088 Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu 645 650 655 GCA GAA GCT CCT GTA TTA GCA TCT GAT CGT TTA CCA TAT AAA AAT TAT 2136 Ala Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr 660 665 670 GAC TAC GAC CGC GTA TTT GGC GCT TGT TGT GAA AAT GTT ATA GGT TAC 2184 Asp Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr 675 680 685 ATG CCT TTG CCC GTT GGT GTT ATA GGC CCC TTG GTT ATC GAT GGT ACA 2232 Met Pro Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly Thr 690 695 700 TCT TAT CAT ATA CCA ATG GCA ACT ACA GAG GGT TGT TTG GTA GCT TCT 2280 Ser Tyr His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser 705 710 715 720 GCC ATG CGT GGC TGT AAG GCA ATC AAT GCT GGC GGT GGT GCA ACA ACT 2328 Ala Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr 725 730 735 GTT TTA ACT AAG GAT GGT ATG ACA AGA GGC CCA GTA GTC CGT TTC CCA 2376 Val Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro 740 745 750 ACT TTG AAA AGA TCT GGT GCC TGT AAG ATA TGG TTA GAC TCA GAA GAG 2424 Thr Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu 755 760 765 GGA CAA AAC GCA ATT AAA AAA GCT TTT AAC TCT ACA TCA AGA TTT GCA 2472 Gly Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala 770 775 780 CGT CTG CAA CAT ATT CAA ACT TGT CTA GCA GGA GAT TTA CTC TTC ATG 2520 Arg Leu Gln His Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met 785 790 795 800 AGA TTT AGA ACA ACT ACT GGT GAC GCA ATG GGT ATG AAT ATG ATT TCT 2568 Arg Phe Arg Thr Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser 805 810 815 AAA GGT GTC GAA TAC TCA TTA AAG CAA ATG GTA GAA GAG TAT GGC TGG 2616 Lys Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp 820 825 830 GAA GAT ATG GAG GTT GTC TCC GTT TCT GGT AAC TAC TG
T ACC GAC AAA 2664Glu Asp Met Glu Val Val Ser Va
l Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys835
840 845 AAA CCA GCT GCC ATC AAC TGG ATC GAA GGT CGT GGT AAG AGT GTC GTC 2712 Lys Pro Ala Ala Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val 850 855 860 GCA GAA GCT ACT ATT CCT GGT GAT GTT GTC AGA AAA GTG TTA AAA AGT 2760 Ala Glu Ala Thr Ile Pro Gly Asp Val Val Arg Lys Val Leu Lys Ser 865 870 875 880 GAT GTT TCC GCA TTG GTT GAG TTG AAC ATT GCT AAG AAT TTG GTT GGA 2808 Asp Val Ser Ala Leu Val Glu Leu Asn Ile Ala Lys Asn Leu Val Gly 885 890 895 TCT GCA ATG GCT GGG TCT GTT GGT GGA TTT AAC GCA CAT GCA GCT AAT 2856 Ser Ala Met Ala Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn 900 905 910 TTA GTG ACA GCT GTT TTC TTG GCA TTA GGA CAA GAT CCT GCA CAA AAT 2904 Leu Val Thr Ala Val Phe Leu Ala Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn 915 920 925 GTT GAA AGT TCC AAC TGT ATA ACA TTG ATG AAA GAA GTG GAC GGT GAT 2952 Val Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Leu Met Lys Glu Val Asp Gly Asp 930 935 940 TTG AGA ATT TCC GTA TCC ATG CCA TCC ATC GAA GTA GGT ACC ATC GGT 3000 Leu Arg Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly 945 950 955 960 GGT GGT ACT GTT CTA GAA CCA CAA GGT GCC ATG TTG GAC TTA TTA GGT 3048 Gly Gly Thr Val Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu Gly 965 970 975 GTA AGA GGC CCG CAT GCT ACC GCT CCT GGT ACC AAC GCA CGT CAA TTA 3096 Val Arg Gly Pro His Ala Thr Ala Pro Gly Thr Asn Ala Arg Gln Leu 980 985 990 GCA AGA ATA GTT GCC TGT GCC GTC TTG GCA GGT GAA TTA TCC TTA TGT 3144 Ala Arg Ile Val Ala Cys Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys 995 1000 1005 GCT GCC CTA GCA GCC GGC CAT TTG GTT CAA AGT CAT ATG ACC CAC AAC 3192 Ala Ala Leu Ala Ala Gly His Leu Val Gln Ser His Met Thr His Asn 1010 1015 1020 AGG AAA CCT GCT GAA CCA ACA AAA CCT AAC AAT TTG GAC GCC ACT GAT 3240 Arg Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys Pro Asn Asn Leu Asp Ala Thr Asp 1025 1030 1035 1040 ATA AAT CGT TTG AAA GAT GGG TCC GTC ACC TGC ATT AAA TCC 3282 Ile Asn Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Thr Cys Ile Lys Ser 1045 1050 TAAACTTAGT CATACGTCAT TGGTATTCTC TTGAAAAAGA AGCACAACAG CACCATGTGT 3342 TACGTAAAAT ATTTACTT 3360 配列番号：２ 配列の長さ：１０５４ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直線状 配列の種類：タンパク質配列 Met Pro Pro Leu Phe Lys Gly Leu Lys Gln Met Ala Lys Pro Ile Ala 1 5 10 15 Tyr Val Ser Arg Phe Ser Ala Lys Arg Pro Ile His Ile Ile Leu Phe 20 25 30 Ser Leu Ile Ile Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Ser Val Ile Gln Tyr Tyr 35 40 45 Phe Asn Gly Trp Gln Leu Asp Ser Asn Ser Val Phe Glu Thr Ala Pro 50 55 60 Asn Lys Asp Ser Asn Thr Leu Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 Asp Ser Ser Leu Asp Gly Trp Val Ser Ile Thr Ala His Glu Ala Ser 85 90 95 Glu Leu Pro Ala Pro His His Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Asn Phe Asn 100 105 110 Ser Pro Asn Glu Thr Asp Ser Ile Pro Glu Leu Ala Asn Thr Val Phe 115 120 125 Glu Lys Asp Asn Thr Lys Tyr Ile Leu Gln Glu Asp Leu Ser Val Ser 130 135 140 Lys Glu Ile Ser Ser Thr Asp Gly Thr Lys Trp Arg Leu Arg Ser Asp 145 150 155 160 Arg Lys Ser Leu Phe Asp Val Lys Thr Leu Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp 165 170 175 Val Phe Ser Glu Asn Val Thr Gln Ala Asp Pro Phe Asp Val Leu Ile 180 185 190 Met Val Thr Ala Tyr Leu Met Met Phe Tyr Thr Ile Phe Gly Leu Phe 195 200 205 Asn Asp Met Arg Lys Thr Gly Ser Asn Phe Trp Leu Ser Ala Ser Thr 210 215 220 Val Val Asn Ser Ala Ser Ser Leu Phe Leu Ala Leu Tyr Val Thr Gln 225 230 235 240 Cys Ile Leu Gly Lys Glu Val Ser Ala Leu Thr Leu Phe Glu Gly Leu 245 250 255 Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Phe Lys His Lys Ile Lys Ile Ala 260 265 270 Gln Tyr Ala Leu Glu Lys Phe Glu Arg Val Gly Leu Ser Lys Arg Ile 275 280 285 Thr Thr Asp Glu Ile Val Phe Glu Ser Val Ser Glu Glu Gly Gly Arg 290 295 300 Leu Ile Gln Asp His Leu Leu Cys Ile Phe Ala Phe Ile Gly Cys Ser 305 310 315 320 Met Tyr Ala His Gln Leu Lys Thr Leu Thr Asn Phe Cys Ile Leu Ser 325 330 335 Ala Phe Ile Leu Ile Phe Glu Leu Ile Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Ser 340 345 350 Ala Ile Leu Ala Leu Arg Leu Glu Met Asn Val Ile His Arg Ser Thr 335 360 365 Ile Ile Lys Gln Thr Leu Glu Glu Asp Gly Val Val Pro Ser Thr Ala 370 375 380 Arg Ile Ile Ser Lys Ala Glu Lys Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Asn 385 390 395 400 Leu Ser Val Val Val Ile Ile Met Lys Leu Ser Val Ile Leu Leu Phe 405 410 415 Val Phe Ile Asn Phe Tyr Asn Phe Gly Ala Asn Trp Val Asn Asp Ala 420 425 430 Phe Asn Ser Leu Tyr Phe Asp Lys Glu Arg Val Ser Leu Pro Asp Phe 435 440 445 Ile Thr Ser Asn Ala Ser Glu Asn Phe Lys Glu Gln Ala Ile Val Ser 450 455 460 Val Thr Pro Leu Leu Tyr Tyr Lys Pro Ile Lys Ser Tyr Gln Arg Ile 465 470 475 480 Glu Asp Met Val Leu Leu Leu Leu Arg Asn Val Ser Val Ala Ile Arg 485 490 495 Asp Arg Phe Val Ser Lys Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Cys Ser Ala 500 505 510 Val Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Arg Ile His Thr Ser Tyr 515 520 525 Thr Ala Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe Thr 530 535 540 Ala Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr Val 545 550 555 560 Ile Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser 565 570 575 Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu 580 585 590 Ser Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu 595 600 605 Ser Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu 610 615 620 Val Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly 625 630 635 640 Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu 645 650 655 Ala Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr 660 665 670 Asp Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr 675 680 685 Met Pro Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly Thr 690 695 700 Ser Tyr His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser 705 710 715 720 Ala Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr 725 730 735 Val Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro 740 745 750 Thr Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu 755 760 765 Gly Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala 770 775 780 Arg Leu Gln His Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met 785 790 795 800 Arg Phe Arg Thr Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser 805 810 815 Lys Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp 820 825 830 Glu Asp Met Glu Val Val Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys 835 840 845 Lys Pro Ala Ala Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val 850 855 860 Ala Glu Ala Thr Ile Pro Gly Asp Val Val Arg Lys Val Leu Lys Ser 865 870 875 880 Asp Val Ser Ala Leu Val Glu Leu Asn Ile Ala Lys Asn Leu Val Gly 885 890 895 Ser Ala Met Ala Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn 900 905 910 Leu Val Thr Ala Val Phe Leu Ala Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn 915 920 925 Val Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Leu Met Lys Glu Val Asp Gly Asp 930 935 940 Leu Arg Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly 945 950 955 960 Gly Gly Thr Val Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu Gly 965 970 975 Val Arg Gly Pro His Ala Thr Ala Pro Gly Thr Asn Ala Arg Gln Leu 980 985 990 Ala Arg Ile Val Ala Cys Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys 995 1000 1005 Ala Ala Leu Ala Ala Gly His Leu Val Gln Ser His Met Thr His Asn 1010 1015 1020 Arg Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys Pro Asn Asn Leu Asp Ala Thr Asp 1025 1030 1035 1040 Ile Asn Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Thr Cys Ile Lys Ser 1045 1050 配列番号：３ 配列の長さ：４７６８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 配列を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：164..2827 配列 TGTATGTCTT GTCTTTCTCC TAAGGGGCGT AGGCTCATTG ATAACTCATG TCCTCACCTT 60 GCACTCCTTT TGGAATTATT TGGTTTGAGT GAAGAAGACC GGACCTTCGA GGTTCGCAAC 120 TTAAACAATA GACTTGTGAG GATCCAGGGA CCGAGTGGCT ACA ATG TTG TCA CGA 175 Met Leu Ser Arg 1 CTT TTC CGT ATG CAT GGC CTC TTT GTG GCC TCC CAT CCC TGG GAA GTT 223 Leu Phe Arg Met His Gly Leu Phe Val Ala Ser His Pro Trp Glu Val 5 10 15 20 ATT GTG GGG ACG GTG ACA CTT ACC ATC TGT ATG ATG TCC ATG AAC ATG 271 Ile Val Gly Thr Val Thr Leu Thr Ile Cys Met Met Ser Met Asn Met 25 30 35 TTC ACT GGC AAC AAC AAG ATC TGT GGT TGG AAT TAC GAG TGC CCA AAA 319 Phe Thr Gly Asn Asn Lys Ile Cys Gly Trp Asn Tyr Glu Cys Pro Lys 40 45 50 TTT GAG GAG GAT GTA TTG AGC AGT GAC ATC ATC ATC CTC ACC ATA ACA 367 Phe Glu Glu Asp Val Leu Ser Ser Asp Ile Ile Ile Leu Thr Ile Thr 55 60 65 CGG TGC ATC GCC ATC CTG TAC ATT TAC TTC CAG TTC CAG AAC TTA CGT 415 Arg Cys Ile Ala Ile Leu Tyr Ile Tyr Phe Gln Phe Gln Asn Leu Arg 70 75 80 CAG CTT GGG TCG AAG TAT ATT TTA GGT ATT GCT GGC CTG TTC ACA ATT 463 Gln Leu Gly Ser Lys Tyr Ile Leu Gly Ile Ala Gly Leu Phe Thr Ile 85 90 95 100 TTC TCA AGT TTT GTC TTT AGT ACA GTC GTC ATT CAC TTC TTA GAC AAA 511 Phe Ser Ser Phe Val Phe Ser Thr Val Val Ile His Phe Leu Asp Lys 105 110 115 GAA CTG ACG GGC TTA AAT GAA GCT TTG CCC TTT TTC CTG CTT TTG ATT 559 Glu Leu Thr Gly Leu Asn Glu Ala Leu Pro Phe Phe Leu Leu Leu Ile 120 125 130 GAC CTT TCT AGA GCG AGT GCA CTA GCA AAG TTT GCC CTA AGT TCA AAC 607 Asp Leu Ser Arg Ala Ser Ala Leu Ala Lys Phe Ala Leu Ser Ser Asn 135 140 145 TCT CAG GAT GAA GTA AGG GAA AAT ATA GCT CGC GGA ATG GCA ATT CTG 655 Ser Gln Asp Glu Val Arg Glu Asn Ile Ala Arg Gly Met Ala Ile Leu 150 155 160 GGC CCC ACA TTC ACC CTT GAT GCT CTT GTG GAA TGT CTT GTA ATT GGA 703 Gly Pro Thr Phe Thr Leu Asp Ala Leu Val Glu Cys Leu Val Ile Gly 165 170 175 180 GTT GGC ACC ATG TCA GGG GTG CGT CAG CTT GAA ATC ATG TGC TGC TTT 751 Val Gly Thr Met Ser Gly Val Arg Gln Leu Glu Ile Met Cys Cys Phe 185 190 195 GGC TGC ATG TCT GTG CTT GCC AAC TAC TTC GTG TTC ATG ACA TTT TTC 799 Gly Cys Met Ser Val Leu Ala Asn Tyr Phe Val Phe Met Thr Phe Phe 200 205 210 CCA GCG TGT GTG TCC CTG GTC CTT GAG CTT TCT CGG GAA AGT CGA GAG 847 Pro Ala Cys Val Ser Leu Val Leu Glu Leu Ser Arg Glu Ser Arg Glu 215 220 225 GGT CGT CCA ATT TGG CAG CTT AGC CAT TTT GCC CGA GTT TTG GAA GAA 895 Gly Arg Pro Ile Trp Gln Leu Ser His Phe Ala Arg Val Leu Glu Glu 230 235 240 GAA GAG AAT AAA CCA AAC CCT GTA ACC CAA AGG GTC AAG ATG ATT ATG 943 Glu Glu Asn Lys Pro Asn Pro Val Thr Gln Arg Val Lys Met Ile Met 245 250 255 260 TCT TTA GGT TTG GTT CTT GTT CAT GCT CAC AGT CGA TGG ATA GCT GAT 991 Ser Leu Gly Leu Val Leu Val His Ala His Ser Arg Trp Ile Ala Asp 265 270 275 CCT TCC CCT CAG AAT AGC ACA ACA GAA CAT TCT AAA GTC TCC TTG GGA 1039 Pro Ser Pro Gln Asn Ser Thr Thr Glu His Ser Lys Val Ser Leu Gly 280 285 290 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Leu Val 390 395 400 GTG GAA ACT GAG AGT GCA AGC AGA GCT ACA TTT GTG CTT GGC GCC TCT 1423 Val Glu Thr Glu Ser Ala Ser Arg Ala Thr Phe Val Leu Gly Ala Ser 405 410 415 420 GGG ACC AGC CCT CCA GTG GCA GCG AGG ACA CAG GAG CTT GAA ATT GAA 1471 Gly Thr Ser Pro Pro Val Ala Ala Arg Thr Gln Glu Leu Glu Ile Glu 425 430 435 CTC CCC AGT GAG CCT CGG CCT AAT GAA GAA TGT CTG CAG ATA CTG GAG 1519 Leu Pro Ser Glu Pro Arg Pro Asn Glu Glu Cys Leu Gln Ile Leu Glu 440 445 450 AGT GCC GAG AAA GGT GCA AAG TTC CTT AGC GAT GCA GAG ATC ATC CAG 1567 Ser Ala Glu Lys Gly Ala Lys Phe Leu Ser Asp Ala Glu Ile Ile Gln 455 460 465 TTG GTC AAT GCC AAG CAC ATC CCA GCC TAC AAA TTG GAA ACC TTA ATG 1615 Leu Val Asn Ala Lys His Ile Pro Ala Tyr Lys Leu Glu Thr Leu Met 470 475 480 GAA ACT CAT GAA CGT GGT GTA TCT ATT CGC CGG CAG CTC CTC TCC ACA 1663 Glu Thr His Glu Arg Gly Val Ser Ile Arg Arg Gln Leu Leu Ser Thr 485 490 495 500 AAG CTT CCA GAG CCT TCT TCT CTG CAG TAC CTG CCT TAC AGA GAT TAT 1711 Lys Leu Pro Glu Pro Ser Ser Leu Gln Tyr Leu Pro Tyr Arg Asp Tyr 505 510 515 AAT TAT TCC CTG GTG ATG GGA GCT TGC TGT GAG AAT GTG ATC GGA TAT 1759 Asn Tyr Ser Leu Val Met Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr 520 525 530 ATG CCC ATC CCT GTC GGA GTA GCA GGG CCT CTG TGC CTG GAT GGT AAA 1807 Met Pro Ile Pro Val Gly Val Ala Gly Pro Leu Cys Leu Asp Gly Lys 535 540 545 GAG TAC CAG GTT CCA ATG GCA ACA ACG GAA GGC TGT CTG GTG GCC AGC 1855 Glu Tyr Gln Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser 550 555 560 ACC AAC AGA GGC TGC AGG GCA ATA GGT CTT GGT GGA GGT GCC AGC AGC 1903 Thr Asn Arg Gly Cys Arg Ala Ile Gly Leu Gly Gly Gly Ala Ser Ser 565 570 575 580 CGG GTC CTT GCA GAT GGG ATG ACC CGG GGC CCA GTG GTG CGT CTT CCT 1951 Arg Val Leu Ala Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Leu Pro 585 590 595 CGT GCT TGT GAT TCT GCA GAA GTG AAG GCC TGG CTT GAA ACA CCC GAA 1999 Arg Ala Cys Asp Ser Ala Glu Val Lys Ala Trp Leu Glu Thr Pro Glu 600 605 610 GGG TTT GCG GTG ATA AAG GAC GCC TTC GAT AGC ACT AGC AGA TTT GCA 2047 Gly Phe Ala 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ATG GCT GGG GAG TTG TCC TTG 2719 Leu Ala Arg Ile Val Cys Gly Thr Val Met Ala Gly Glu Leu Ser Leu 840 845 850 ATG GCA GCA TTG GCA GCA GGA CAT CTT GTT AGA AGT CAC ATG GTT CAT 2767 Met Ala Ala Leu Ala Ala Gly His Leu Val Arg Ser His Met Val His 855 860 865 AAC AGA TCG AAG ATA AAT TTA CAA GAT CTG CAA GGA ACG TGC ACC AAG 2815 Asn Arg Ser Lys Ile Asn Leu Gln Asp Leu Gln Gly Thr Cys Thr Lys 870 875 880 AAG TCA GCT TGAGCAGCCT GACAGTATTG AACTGAAACA CGGGCATTGG 2864 Lys Ser Ala 885 GTTCTCAAGG ACTAACATGA AATCTGTGAA TTAAAAATCT CAATGCAGTG TCTTGTGGAA 2924 GATGAATGAA CGTGATCAGT GAGACGCCTG CTTGGTTTCT GGCTCTTTCA GAGACGTCTG 2984 AGGTCCTTTG CTCGGAGACT CCTCAGATCT GGAAACAGTG TGGTCCTTCC CATGCTGTAT 3044 TCTGAAAAGA TCTCATATGG ATGTTGTGCT CTGAGCACCA CAGATGTGAT CTGCAGCTCG 3104 TTTCTGAAAT GATGGAGTTC ATGGTGATCA GTGTGAGACT GGCCTCTCCC AGCAGGTTAA 3164 AAATGGAGTT TTAAATTATA CTGTAGCTGA CAGTACTTCT GATTTTATAT TTATTTAGTC 3224 TGAGTTGTAG AACTTTGCAA TCTAAGTTTA TTTTTTGTAA CCTAATAATT CATTTGGTGC 3284 TGGTCTATTG ATTTTTGGGG 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Leu Leu Leu 405 410 415 CTG ATC AAC CTT TAT GTT TTC ACA GAT AAG TTA AAT GCT ACA ATA CTA 1416 Leu Ile Asn Leu Tyr Val Phe Thr Asp Lys Leu Asn Ala Thr Ile Leu 420 425 430 AAC ACG GTA TAT TTT GAC TCT ACA ATT TAC TCG TTA CCA AAT TTT ATC 1464 Asn Thr Val Tyr Phe Asp Ser Thr Ile Tyr Ser Leu Pro Asn Phe Ile 435 440 445 AAT TAT AAA GAT ATT GGC AAT CTC AGC AAT CAA GTG ATC ATT TCC GTG 1512 Asn Tyr Lys Asp Ile Gly Asn Leu Ser Asn Gln Val Ile Ile Ser Val 450 455 460 TTG CCA AAG CAA TAT TAT ACT CCG CTG AAA AAA TAC CAT CAG ATC GAA 1560 Leu Pro Lys Gln Tyr Tyr Thr Pro Leu Lys Lys Tyr His Gln Ile Glu 465 470 475 480 GAT TCT GTT CTA CTT ATC ATT GAT TCC GTT AGC AAT GCT ATT CGG GAC 1608 Asp Ser Val Leu Leu Ile Ile Asp Ser Val Ser Asn Ala Ile Arg Asp 485 490 495 CAA TTT ATC AGC AAG TTA CTT TTT TTT GCA TTT GCA GTT AGT ATT TCC 1656 Gln Phe Ile Ser Lys Leu Leu Phe Phe Ala Phe Ala Val Ser Ile Ser 500 505 510 ATC AAT GTC TAC TTA CTG AAT GCT GCA AAA ATT CAC ACA GGA TAC ATG 1704 Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Lys Ile His Thr Gly Tyr Met 515 520 525 AAC TTC CAA CCA CAA TCA AAT AAG ATC GAT GAT CTT GTT GTT CAG CAA 1752 Asn Phe Gln Pro Gln Ser Asn Lys Ile Asp Asp Leu Val Val Gln Gln 530 535 540 AAA TCG GCA ACG ATT GAG TTT TCA GAA ACT CGA AGT ATG CCT GCT TCT 1800 Lys Ser Ala Thr Ile Glu Phe Ser Glu Thr Arg Ser Met Pro Ala Ser 545 550 555 560 TCT GGC CTA GAA ACT CCA GTG ACC GCG AAA GAT ATA ATT ATC TCT GAA 1848 Ser Gly Leu Glu Thr Pro Val Thr Ala Lys Asp Ile Ile Ile Ser Glu 565 570 575 GAA ATC CAG AAT AAC GAA TGC GTC TAT GCT TTG AGT TCC CAG GAC GAG 1896 Glu Ile Gln Asn Asn Glu Cys Val Tyr Ala Leu Ser Ser Gln Asp Glu 580 585 590 CCT ATC CGT CCT TTA TCG AAT TTA GTG GAA CTT ATG GAG AAA GAA CAA 1944 Pro Ile Arg Pro Leu Ser Asn Leu Val Glu Leu Met Glu Lys Glu Gln 595 600 605 TTA AAG AAC ATG AAT AAT ACT GAG GTT TCG AAT CTT GTC GTC AAC GGT 1992 Leu Lys Asn Met Asn Asn Thr Glu Val Ser Asn Leu Val Val Asn Gly 610 615 620 AAA CTG CCA TTA TAT TCC TTA GAG AAA AAA TTA GAG GAC ACA ACT CGT 2040 Lys Leu Pro Leu Tyr Ser Leu Glu Lys Lys Leu Glu Asp Thr Thr Arg 625 630 635 640 GCG GTT TTA GTT AGG AGA AAG GCA CTT TCA ACT TTG GCT GAA TCG CCA 2088 Ala Val Leu Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Thr Leu Ala Glu Ser Pro 645 650 655 ATT TTA GTT TCC GAA AAA TTG CCC TTC AGA AAT TAT GAT TAT GAT CGC 2136 Ile Leu Val Ser Glu Lys Leu Pro Phe Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Arg 660 665 670 GTT TTT GGA GCT TGC TGT GAA AAT GTC ATC GGC TAT ATG CCA ATA CCA 2184 Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr Met Pro Ile Pro 675 680 685 GTT GGT GTA ATT GGT CCA TTA ATT ATT GAT GGA ACA TCT TAT CAC ATA 2232 Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Ile Ile Asp Gly Thr Ser Tyr His Ile 690 695 700 CCA ATG GCA ACC ACG GAA GGT TGT TTA GTG GCT TCA GCT ATG CGT GGT 2280 Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Ala Met Arg Gly 705 710 715 720 TGC AAA GCC ATC AAT GCT GGT GGT GGT GCA ACA ACT GTT TTA ACC AAA 2328 Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Val Leu Thr Lys 725 730 735 GAT GGT ATG ACT AGA GGC CCA GTC GTT CGT TTC CCT ACT TTA ATA AGA 2376 Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro Thr Leu Ile Arg 740 745 750 TCT GGT GCC TGC AAG ATA TGG TTA GAC TCG GAA GAG GGA CAA AAT TCA 2424 Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu Gly Gln Asn Ser 755 760 765 ATT AAA AAA GCT TTT AAT TCT ACA TCA AGG TTT GCA CGT TTG CAA CAT 2472 Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln His 770 775 780 ATT CAA ACC TGT CTA GCA GGC GAT TTG CTT TTT ATG AGA TTT CGG ACA 2520 Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met Arg Phe Arg Thr 785 790 795 800 ACT ACC GGT GAC GCA ATG GGT ATG AAC ATG ATA TCG AAA GGT GTC GAA 2568 Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser Lys Gly Val Glu 805 810 815 TAC TCT TTG AAA CAA ATG GTA GAA GAA TAT GGT TGG GAA GAT ATG GAA 2616 Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp Glu Asp Met Glu 820 825 830 GTT GTC TCC GTA TCT GGT AAC TAT TGT ACT GAT AAG AAA CCT GCC GCA 2664 Val Val Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys Lys Pro Ala Ala 835 840 845 ATC AAT TGG ATT GAA GGT CGT GGT AAA AGT GTC GTA GCT GAA GCT ACT 2712 Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Ala Glu Ala Thr 850 855 860 ATT CCT GGT GAT GTC GTA AAA AGT GTT TTA AAG AGC GAT GTT TCC GCT 2760 Ile Pro Gly Asp Val Val Lys Ser Val Leu Lys Ser Asp Val Ser Ala 865 870 875 880 TTA GTT GAA TTA AAT ATA TCC AAG AAC TTG GTT GGA TCC GCA ATG GCT 2808 Leu Val Glu Leu Asn Ile Ser Lys Asn Leu Val Gly Ser Ala Met Ala 885 890 895 GGA TCT GTT GGT GGT TTC AAC GCG CAC GCA GCT AAT TTG GTC ACT GCA 2856 Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn Leu Val Thr Ala 900 905 910 CTT TTC TTG GCA TTA GGC CAA GAT CCT GCG CAG AAC GTC GAA AGT TCC 2904 Leu Phe Leu Ala Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser 915 920 925 AAC TGT ATA ACT TTG ATG AAG GAA GTT GAT GGT GAT TTA AGG ATC TCT 2952 Asn Cys Ile Thr Leu Met Lys Glu Val Asp Gly Asp Leu Arg Ile Ser 930 935 940 GTT TCC ATG CCA TCT ATT GAA GTT GGT ACG ATT GGC GGG GGT ACT GTT 3000 Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly Gly Gly Thr Val 945 950 955 960 CTG GAG CCT CAG GGC GCC ATG CTT GAT CTT CTC GGC GTT CGT GGT CCT 3048 Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu Gly Val Arg Gly Pro 965 970 975 CAC CCC ACT GAA CCT GGA GCA AAT GCT AGG CAA TTA GCT AGA ATA ATC 3096 His Pro Thr Glu Pro Gly Ala Asn Ala Arg Gln Leu Ala Arg Ile Ile 980 985 990 GCG TGT GCT GTC TTG GCT GGT GAA CTG TCT CTG TGC TCC GCA CTT GCT 3144 Ala Cys Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys Ser Ala Leu Ala 995 1000 1005 GCC GGT CAC CTG GTA CAA AGC CAT ATG ACT CAC AAC CGT AAA ACA AAC 3192 Ala Gly His Leu Val Gln Ser His Met Thr His Asn Arg Lys Thr Asn 1010 1015 1020 AAA GCC AAT GAA CTG CCA CAA CCA AGT AAC AAA GGG CCC CCC TGT AAA 3240 Lys Ala Asn Glu Leu Pro Gln Pro Ser Asn Lys Gly Pro Pro Cys Lys 1025 1030 1035 1040 ACC TCA GCA TTA TTA TAACTCTTGT AGTTTACATG GTGATACTTT ATATCTTTGT 3295 Thr Ser Ala Leu Leu 1045 ATTGTCTAGC TATTCTAAAT CATCTGCATG TAATAAGAAG TTGATCAAAA TGA 3348 配列番号：６ 配列の長さ：１０４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Leu Pro Leu Lys Thr Ile Val His Leu Val Lys Pro Phe Ala 1 5 10 15 Cys Thr Ala Arg Phe Ser Ala Arg Tyr Pro Ile His Val Ile Val Val 20 25 30 Ala Val Leu Leu Ser Ala Ala Ala Tyr Leu Ser Val Thr Gln Ser Tyr 35 40 45 Leu Asn Glu Trp Lys Leu Asp Ser Asn Gln Tyr Ser Thr Tyr Leu Ser 50 55 60 Ile Lys Pro Asp Glu Leu Phe Glu Lys Cys Thr His Tyr Tyr Arg Ser 65 70 75 80 Pro Val Ser Asp Thr Trp Lys Leu Leu Ser Ser Lys Glu Ala Ala Asp 85 90 95 Ile Tyr Thr Pro Phe His Tyr Tyr Leu Ser Thr Ile Ser Phe Gln Ser 100 105 110 Lys Asp Asn Ser Thr Thr Leu Pro Ser Leu Asp Asp Val Ile Tyr Ser 115 120 125 Val Asp His Thr Arg Tyr Leu Leu Ser Glu Glu Pro Lys Ile Pro Thr 130 135 140 Glu Leu Val Ser Glu Asn Gly Thr Lys Trp Arg Leu Arg Asn Asn Ser 145 150 155 160 Asn Phe Ile Leu Asp Leu His Asn Ile Tyr Arg Asn Met Val Lys Gln 165 170 175 Phe Ser Asn Lys Thr Ser Glu Phe Asp Gln Phe Asp Leu Phe Ile Ile 180 185 190 Leu Ala Ala Tyr Leu Thr Leu Phe Tyr Thr Leu Cys Cys Leu Phe Asn 195 200 205 Asp Met Arg Lys Ile Gly Ser Lys Phe Trp Leu Ser Phe Ser Ala Leu 210 215 220 Ser Asn Ser Ala Cys Ala Leu Tyr Leu Ser Leu Tyr Thr Thr His Ser 225 230 235 240 Leu Leu Lys Lys Pro Ala Ser Leu Leu Ser Leu Val Ile Gly Leu Pro 245 250 255 Phe Ile Val Val Ile Ile Gly Phe Lys His Lys Val Arg Leu Ala Ala 260 265 270 Phe Ser Leu Gln Lys Phe His Arg Ile Ser Ile Asp Lys Lys Ile Thr 275 280 285 Val Ser Asn Ile Ile Tyr Glu Ala Met Phe Gln Glu Gly Ala Tyr Leu 290 295 300 Ile Arg Asp Tyr Leu Phe Tyr Ile Ser Ser Phe Ile Gly Cys Ala Ile 305 310 315 320 Tyr Ala Arg His Leu Pro Gly Leu Val Asn Phe Cys Ile Leu Ser Thr 325 330 335 Phe Met Leu Val Phe Asp Leu Leu Leu Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Ala 340 345 350 Ile Leu Ser Met Lys Leu Glu Ile Asn Ile Ile His Arg Ser Thr Val 355 360 365 Ile Arg Gln Thr Leu Glu Glu Asp Gly Val Val Pro Thr Thr Ala Asp 370 375 380 Ile Ile Tyr Lys Asp Glu Thr Ala Ser Glu Pro His Phe Leu Arg Ser 385 390 395 400 Asn Val Ala Ile Ile Leu Gly Lys Ala Ser Val Ile Gly Leu Leu Leu 405 410 415 Leu Ile Asn Leu Tyr Val Phe Thr Asp Lys Leu Asn Ala Thr Ile Leu 420 425 430 Asn Thr Val Tyr Phe Asp Ser Thr Ile Tyr Ser Leu Pro Asn Phe Ile 435 440 445 Asn Tyr Lys Asp Ile Gly Asn Leu Ser Asn Gln Val Ile Ile Ser Val 450 455 460 Leu Pro Lys Gln Tyr Tyr Thr Pro Leu Lys Lys Tyr His Gln Ile Glu 465 470 475 480 Asp Ser Val Leu Leu Ile Ile Asp Ser Val Ser Asn Ala Ile Arg Asp 485 490 495 Gln Phe Ile Ser Lys Leu Leu Phe Phe Ala Phe Ala Val Ser Ile Ser 500 505 510 Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Lys Ile His Thr Gly Tyr Met 515 520 525 Asn Phe Gln Pro Gln Ser Asn Lys Ile Asp Asp Leu Val Val Gln Gln 530 535 540 Lys Ser Ala Thr Ile Glu Phe Ser Glu Thr Arg Ser Met Pro Ala Ser 545 550 555 560 Ser Gly Leu Glu Thr Pro Val Thr Ala Lys Asp Ile Ile Ile Ser Glu 565 570 575 Glu Ile Gln Asn Asn Glu Cys Val Tyr Ala Leu Ser Ser Gln Asp Glu 580 585 590 Pro Ile Arg Pro Leu Ser Asn Leu Val Glu Leu Met Glu Lys Glu Gln 595 600 605 Leu Lys Asn Met Asn Asn Thr Glu Val Ser Asn Leu Val Val Asn Gly 610 615 620 Lys Leu Pro Leu Tyr Ser Leu Glu Lys Lys Leu Glu Asp Thr Thr Arg 625 630 635 640 Ala Val Leu Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Thr Leu Ala Glu Ser Pro 645 650 655 Ile Leu Val Ser Glu Lys Leu Pro Phe Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Arg 660 665 670 Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr Met Pro Ile Pro 675 680 685 Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Ile Ile Asp Gly Thr Ser Tyr His Ile 690 695 700 Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Ala Met Arg Gly 705 710 715 720 Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Val Leu Thr Lys 725 730 735 Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro Thr Leu Ile Arg 740 745 750 Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu Gly Gln Asn Ser 755 760 765 Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln His 770 775 780 Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met Arg Phe Arg Thr 785 790 795 800 Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser Lys Gly Val Glu 805 810 815 Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp Glu Asp Met Glu 820 825 830 Val Val Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys Lys Pro Ala Ala 835 840 845 Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Ala Glu Ala Thr 850 855 860 Ile Pro Gly Asp Val Val Lys Ser Val Leu Lys Ser Asp Val Ser Ala 865 870 875 880 Leu Val Glu Leu Asn Ile Ser Lys Asn Leu Val Gly Ser Ala Met Ala 885 890 895 Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn Leu Val Thr Ala 900 905 910 Leu Phe Leu Ala Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser 915 920 925 Asn Cys Ile Thr Leu Met Lys Glu Val Asp Gly Asp Leu Arg Ile Ser 930 935 940 Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly Gly Gly Thr Val 945 950 955 960 Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu Gly Val Arg Gly Pro 965 970 975 His Pro Thr Glu Pro Gly Ala Asn Ala Arg Gln Leu Ala Arg Ile Ile 980 985 990 Ala Cys Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys Ser Ala Leu Ala 995 1000 1005 Ala Gly His Leu Val Gln Ser His Met Thr His Asn Arg Lys Thr Asn 1010 1015 1020 Lys Ala Asn Glu Leu Pro Gln Pro Ser Asn Lys Gly Pro Pro Cys Lys 1025 1030 1035 1040 Thr Ser Ala Leu Leu 1045 配列番号：７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GATCCGTCGA CGCATGCCTG CA 22 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GGCATGCGTC GACG 14 配列番号：９ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CCGGATCCGG 10 配列番号：１０ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AGCTTTCGCG AGCTCGAGAT CTAGATATCG ATG 33 配列番号：１１ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AATTCATCGA TATCTAGATC TCGAGCTCGC GA 32 配列番号：１２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 TATCGAATTC AAGCTTGGTA CCGA 24 配列番号：１３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 TATCGGTACC AAGCTTGAAT TCGA 24 配列番号：１４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GATCCAGCTG TGTAC 15 配列番号：１５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CCCGGGATCG ATCACGT 17 配列番号：１６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GATCGATCCC GGGACGT 17 配列番号：１７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 ATAAAGACAT TGTTTTTAGA TCTGTTGTAA 30 配列番号：１８ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GATTTATCTT CGTTTCCTGC AAGTTTTTGT TC 32 配列番号：１９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AGCTTCGAAG AACGAAGGAA GGAGCACAGA CTTAG 35 配列番号：２０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 ATTGGTATAT ATACGCATAT TGCGGCCGCG GTAC 34 配列番号：２１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CGCGGCCGCA ATATGCGTAT ATATAC 26 配列番号：２２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CAATCTAAGT CTGTGCTCCT TCCTTCGTTC TTCGA 35 配列番号：２３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CTTTATGAGG GTAACATGAA TTCAAGAAGG 30 配列番号：２４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GCCAAGTAGT TTTTACTCTT CAAGACAGAT AATTTGCTGA CA 42
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、バード(Bard)他、Lipids,12(8):645(197
7)に示されている、ザイモステロールからエルゴステロ
ールへの代謝的転換における多様な転換過程を模式的に
示している。a-eの文字は、各転換過程の触媒を担う5種の
酵素を示している。番号のみ、あるいは“C"のついた番
号、および酵素名は、酵素活性の位置および各酵素の活性
を示唆している。
【図２】図２プラスミドpSOC725ARCは、GAL1-10プロモー
ターの制御下に短縮したHMG-CoA還元酵素のコード配列
をおくように構築された。このプラスミドはTRP-1遺伝子
および酵母2ミクロン複製開始点も含む。制限酵素部位を
円弧につながる線で示し、それぞれの制限酵素の略称を
示した。
【図３】図３はプラスミドpSOC106ARCの物理的構造と遺
伝子構成を模式的に示している。プラスミドpSOC106ARC
は、GAL1-10プロモーターの制御下に完全なHMG-CoA還元
酵素のコード配列をおくように構築された。プラスミドp
SOC106ARCはまた、TRP-1遺伝子と酵母2ミクロン複製開始
点も含む。制限酵素部位は図２と同様に示した。
【図４】図４はプラスミドpARC306Eの物理的構造と遺伝
子構成を模式的に示している。プラスミドpARC306Eは、GA
L1プロモーターの制御下に短縮したHMG-CoA還元酵素の
コード配列をおくように構築された。プラスミドpARC306
Eはまた、TRP-1遺伝子も含む。制限酵素部位は図3と同様
に示した。
【図５】図５はプラスミドpARC300Dの物理的構造と遺伝
子構成を模式的に示している。プラスミドpARC300Dは、PG
Kプロモーターの制御下に短縮したHMG-CoA還元酵素のコ
ード配列をおくように構築された。プラスミドpARC300D
はまた、TRP-1遺伝子も含む。制限酵素部位は図２と同様
に示した。
【図６】図６はプラスミドpARC300Sの物理的構造と遺伝
子構成を模式的に示している。プラスミドpARC300Sは、PG
Kプロモーターの制御下に短縮したHMG-CoA還元酵素のコ
ード配列をおくように構築された。プラスミドpARC300S
はまた、選択マーカーURA3も含む。制限酵素部位は図２と
同様に示した。
【図７】図７はプラスミドpARC300Tの物理的構造と遺伝
子構成を模式的に示している。プラスミドpARC300Tは、PG
Kプロモーターの制御下に短縮したHMG-CoA還元酵素のコ
ード配列をおくように構築された。プラスミドpARC300T
はまた、選択マーカーURA3も含む。制限酵素部位は図２と
同様に示した。
【図８】図８はプラスミドpARC304Sの物理的構造と遺伝
子構成を模式的に示している。プラスミドpARC300Tは、AD
Hプロモーターの制御下に短縮したHMG-CoA還元酵素のコ
ード配列をおくように構築された。プラスミドpARC304S
はまた、選択マーカーURA3も含む。制限酵素部位は図２と
同様に示した。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 インドラニ・ムカージ アメリカ合衆国イリノイ州60201，エヴ ァンストン，セントラル・パーク・アベ ニュー 2300 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 33/00 C12N 1/19 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵母中でスクアレン、ザイモステロー
    ル、コレスタ−７，２４−ジエノールおよびコレスタ−
    ５，７，２４−トリエノールの蓄積を増加させる方法で
    あって、 （ａ） ザイモステロール−２４−メチルトランスフェ
    ラーゼおよびエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリ
    エノール−２２−デヒドロゲナーゼの発現に欠損を持つ
    ことにより上記ステロール類の蓄積を生じさせるサッカ
    ロミセス属又はカンディダ属の酵母変異体を提供するこ
    と； （ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプ
    チドをコードする外来性ＤＮＡ断片と該ポリペプチドを
    発現させるのに適したプロモーターとが機能するように
    連結されたベクターを含む組み換えＤＮＡ分子を用いて
    上記酵母変異体を形質転換して、該ＨＭＧ−ＣｏＡ還元
    酵素の発現レベルを上昇させること；そして （ｃ） 上記ステロール類の蓄積が増加するのに充分な
    期間、適切な培養条件下で上記酵母変異体を育成するこ
    と； を含んでなる方法。
  2. 【請求項２】 ザイモステロール−２４−メチルトラン
    スフェラーゼおよびエルゴスタ５，７，２４（２８）−
    トリエノール−２２−デヒドロゲナーゼの発現に欠損を
    持つことによりスクアレン、ザイモステロール、コレス
    タ−７，２４−ジエノールおよびコレスタ−５，７，２
    ４−トリエノールの蓄積を生じさせる変異体サッカロミ
    セス・セレビシエであって、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の
    触媒領域および少なくとも連結領域の一部を含むが膜結
    合領域を含まない部分をコードする外来性ＤＮＡ断片
    と、該ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を該酵母中で発現させる
    のに適したプロモーターとが機能するように連結された
    ベクターを含む組み換えＤＮＡ分子を用いて形質転換さ
    れた変異体。
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