ES2579280T3

ES2579280T3 - Producción de esteroles, que no proceden de levaduras, a partir de una levadura

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Publication number: ES2579280T3
Application number: ES10785033.1T
Authority: ES
Inventors: Hans-Peter Hohmann; Martin Lehmann; Muriel Merkamm; Denis Pompon
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2016-08-09
Anticipated expiration: 2030-11-24
Also published as: BR112012013424B1; EP2507368A1; US20120231495A1; EP2507368B1; US9624521B2; KR20120104588A; CN102639696A; JP2013512663A; BR112012013424A2; WO2011067144A1; JP5889200B2; KR101861387B1

Abstract

Una utilización de la colesterol-C25-hidroxilasa para hidroxilar al ergosterol con el fin de producir el 25-hidroxiergosterol, en donde la producción se realiza en una célula de levadura, en la que el ERG6 y el ERG5 están desactivados, y la levadura expresa también una esterol Δ24-reductasa.

Description

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humano. De manera preferida, la esterol Δ24-reductasa es de un cerdo, un perro, un chimpancé, un Macaca mulata, un ratón, una rata, un caballo, un Gallus gallus, un Xenopus laevis, un Danio rerio o un Ornithorynchus anatinus.

En unas formas de realización particularmente preferidas, éstos son unos ADNs de rata (Rattus norvegicus) o de pez cebra (Danio rerio) y en unas formas de realización más preferidas, ellos han sido optimizados en cuanto a codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. Unos ácidos nucleicos particularmente preferidos son denominados S24R1 (un gen de rata modificado, nucleótidos 10 hasta 1.563 de la SEQ ID NO:1) y S24R2 (un gen de pez cebra modificado, nucleótidos 10 hasta 1.563 de la SEQ ID NO:3).

Otro aspecto de este invento es una secuencia de ácido nucleico de un vertebrado, de manera preferida un ADN, que ha sido optimizada en cuanto a codones, y que codifica una enzima esterol Δ24-reductasa de tal manera que en una célula anfitriona de levadura, la enzima puede convertir: al lanosterol en 3 β-hidroxi-8-lanosta-8-eno, o al dimetil zimosterol en el 4,4-dimetil-colesta-8-enol; al metil zimosterol en el 4α -metil-colesta-8-enol; al zimosterol en el colesta-8-enol; al colesta-7,24-dienol en el latosterol; o al colesta-5,7,24-trienol en el 7-deshidrocolesterol); y el ácido nucleico que codifica la enzima puede hibridarse con S24R1 o S24R2 en condiciones rigurosas, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico de un vertebrado no ha de ser una secuencia de ácido nucleico aislada a partir de un ser humano o de un ratón.

Otro aspecto del invento es un método en el que las enzimas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos precedentemente mencionadas se utilizan dentro de una célula de levadura tal como se describe aquí. Unas enzimas preferidas de este invento son las dadas como SEQ ID NO:2 y 4, y las que muestran una identidad de por lo menos 90 %, y de manera preferida una identidad de 95 %,con la SEQ ID NO:2 o 4, y que también pueden convertir

al lanosterol en el 3 β-hidroxi-8-lanosta-8-eno,

al dimetil zimosterol en el 4,4-dimetil-colesta-8-enol,

al metil zimosterol en el 4 α -metil-colesta-8-enol,

al zimosterol en el colesta-8-enol,

al colesta-7, 24-dienol en el latosterol, o

al colesta-5,7,24-trienol en el 7-deshidrocolesterol dentro del entorno de una célula de levadura.

Otro aspecto de este invento es la utilización de un anfitrión de levadura, que contiene una secuencia de ácido nucleico funcional tal como se ha descrito más arriba, y en particular un anfitrión de levadura tal como S. cerevisiae, que comprende S24R1, S24R2, o una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con S24R1 o S24R2 en condiciones rigurosas, con la condición de que el ácido nucleico no ha de ser una secuencia de un ser humano ni de un ratón. Los anfitriones de levadura tienen desactivados a los ERG5 y ERG6 y expresan también una esterol Δ24reductasa; y en una forma de realización particularmente preferida, el anfitrión de levadura sobreexpresa también una versión truncada del gen HMG1.

Todavía otro aspecto del invento es un método para producir el 3 β-hidroxi-8-lanosta-8-eno, el 4,4-dimetil-colesta-8enol, el 4 α -metil-colesta-8-enol, el colesta-8-enol, el latosterol o el 7-deshidrocolesterol en una célula de levadura, que comprende poner en contacto al lanosterol, al dimetil zimosterol, al metil zimosterol, al zimosterol, al colesta7,24-dienol o al colesta-5,7,24-trienol con una levadura que comprende una secuencia de ácido nucleico que ha sido optimizada en cuanto a codones para la expresión en un anfitrión de levadura, y que codifica una enzima esterol Δ24-reductasa funcional, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no ha de ser una secuencia de ácido nucleico de un ser humano ni de un ratón, y

de que la levadura ha de convertir:

al lanosterol en el 3 β -hidroxi-8-lanosta-8-eno,

al dimetil zimosterol en el 4,4-dimetil-colesta-8-enol,

al metil zimosterol en el 4 α -metil-colesta-8-enol,

al zimosterol en el colesta-8-enol,

al colesta-7, 24-dienol en el lanosterol, o

al colesta-5,7,24-trienol en el 7-deshidrocolesterol. En este método, el ácido nucleico es de manera preferida S24R1, S24R2, o un ácido nucleico que se puede hibridar con S24R1 o S24R2 en condiciones rigurosas, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no ha de ser una secuencia de ácido nucleico de un ser humano ni de un ratón.

Todavía otro aspecto de esta divulgación incluye unos vectores, incluyendo unos plásmidos, que comprenden una secuencia de ácido nucleico funcional que ha sido optimizada en cuanto a codones para la expresión en un anfitrión de levadura, y que codifica una enzima esterol Δ24-reductasa funcional, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no ha de ser una secuencia de ácido nucleico de un ser humano ni de un ratón. De manera preferida, el vector contiene los ácidos nucleicos S24R1, S24R2 o un ácido nucleico que se puede hibridar con S24R1 o S24R2, con la condición de que la secuencia de ácido nucleico de un vertebrado no ha de ser una secuencia de ácido nucleico de un ser humano ni de un ratón. Los vectores pueden contener las secuencias usuales, que se

encuentran habitualmente en plásmidos o en otros vectores que regulan la transcripción, la traducción y/o la integración dentro del cromosoma de la levadura.

Construcciones artificiales de genes

5 Todas las construcciones artificiales de genes de este invento, que codifican una C25-hidroxilasa o una esterol Δ24 reductasa, son típicamente una parte de un casete de expresión, que tiene el gen ajeno bajo el control de unos promotores conocidos, que pueden ser regulados utilizando unos métodos clásicos, tales como el promotor de ADH1, el promotor de TEF1, el promotor de GPD (TDH3) de levadura, el promotor de HXT7 de levadura, el promotor de GAL1/10 de levadura, o el promotor de PGK1 de levadura, que controlan al gen de interés. Adicionalmente, el

10 casete de expresión pueden contener unas secuencias situadas corriente arriba o corriente abajo tales como una secuencia terminadora y/o unos elementos reguladores que están engarzados operativamente con la secuencia codificadora para por lo menos uno de los genes que se han descrito más arriba. Los vectores que llevan las construcciones artificiales de genes pueden ser introducidos en la levadura utilizando unos métodos convencionales.

15 Los siguientes ejemplos son solamente ilustrativos y no han de restringir de ningún modo el ámbito del invento.

Ejemplos

Referencias: Las citas completas para las referencias aparecen al final de los Ejemplos.

20 Medios: Tabla 1: Composición del medio mínimo

Composición: Concentración (peso/volumen)

Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos ni sulfato de amonio (Becton Dickinson and Co., Sparks, MD 21152, EE.UU.): 0.17 %

Casaminoácidos (Becton Dickinson and Co., Sparks, MD 21152, EE.UU.): 1 %

Glucosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, EE.UU.): 2 %

El medio fue esterilizado autoclavando durante 20 minutos a 120 °C antes de su utilización Se añadieron triptófano, 25 uracilo o adenina (b) estériles hasta llegar a una concentración final de 20 mg/l en caso necesario.

Tabla 2: Composición del medio sintético de Kapelli

Composición: Concentración

H3PO4 (85% v/v): 0,33 ml/l

KH2PO4: 2,85 g/l

MgSO4 x 7 H2O: 0,6 g/l

MnSO4 x H2O: 16 mg/l

CuSO4 x 5 H2O: 0,4 mg/l

ZnSO4 x 7 H2O: 15 mg/l

CoCl2 x 6 H2O: 2,8 mg/l

Na2MoO4 x 2 H2O: 2,5 mg/l

H3BO3: 7,5 mg/l

Ácido cítrico x H2O: 0,5 mg/l

KI: 1 mg/l

NiSO4 x 7 H2O: 2,5 mg/l

Citrato de trisodio x 2 H2O: 25 mg/l

Tiamina HCl: 2 mg/l

Piridoxina HCl: 5 mg/l

Ácido nicotínico: 8 mg/l

Biotina: 0,05 mg/l

Pantotenato de calcio: 10 mg/l

mio-Inositol: 80 mg/l

CaCl2 x 2 H2O: 50 mg/l

FeCl3 x 6 H2O: 50 mg/l

Casaminoácidos: 1% (p/v)

Glucosa o galactosa: 2% (p/v)

El medio fue esterilizado mediante filtración a través de una unidad de filtración de 0,2 µm antes de su utilización. Se 30 añadieron triptófano, uracilo o adenina estériles hasta llegar a una concentración de 0,2 mg/ml, en caso necesario.

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SEQ.ID.NO:1:

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La correspondiente secuencia de aminoácidos es: SEQ.ID.NO:2

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10 El gen de la esterol Δ24-reductasa de D. rerio (la secuencia de ADN está disponible con el número de acceso al GenBank NM_001008645 y la secuencia de aminoácidos con el número de acceso al GenBank NP_001008645) se recodificó con el método descrito más arriba. El nuevo gen sintético se denominó S24R2. Su secuencia se da seguidamente:

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Tabla 4: Identidad de aminoácidos entre diferentes colesterol C25-hidroxilasas putativas.

Homo sapiens: Mus musculus Sus scrofa Canis familiaris

Homo sapiens: 100 % 78 % 82 % 70 %

Pan troglodytes: 99 % 78 % 82 % 70 %

Macaca mulata: 94 % 77 % 82 % 70 %

Mus musculus: 78 % 100 % 79 % 70 %

Rattus norvegicus: 80 % 86 % 79 % 72 %

Bos taurus: 84 % 79 % 86 % 70 %

Equus caballus: 83 % 79 % 83 % 73 %

Gallus gallus: 61 % 58 % 59 % 57 %

Ornithorhynchus anatinus: 63 % 62 % 61 % 58 %

El gen de la colesterol C25-hidroxilasa de un cerdo (la secuencia de ADN es accesible con el número de acceso al GenBank AY974088 y la secuencia de aminoácidos lo es con el número de acceso al GenBank Q4G1G8) se recodificó reemplazando veinticinco codones que corresponden a unos codones que son raramente utilizados por la levadura Saccharomyces cerevisiae por unos codones que son frecuentemente utilizados en una levaduras (Zhang y colaboradores, 1991). El nuevo gen sintético se denominó C25H1. Su secuencia se da seguidamente: SEQ.ID.NO:5

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La correspondiente secuencia de aminoácidos es: SEQ.ID.No:6

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Una secuencia alternativa de aminoácidos de una esterol C25-reductasa putativa de un cerdo procedente de la base de datos GENBANK, que muestra cuatro diferencias con la secuencia utilizada, también está a disposición, pero no se utilizó ulteriormente en los experimentos:

20 SEQ ID NO:7

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El gen procedente de Canis familiaris (la secuencia de nucleótidos accesible con el número de acceso al GenBank XM_546596.2 y la secuencia de aminoácidos con el número de acceso al GenBank XP_543596.1), se recodificó con 25 el método de ajuste que se ha descrito en el Ejemplo 1. El nuevo gen sintético se denominó C25H3, y su secuencia de ADN se da seguidamente:

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Tabla 5: Propiedades cromatográficas, espectrales y de fragmentación de masas de los diferentes esteroles

Compuestos: Nombre usual Abreviatura Tiempo de retención Absorción max. de rayos UV m/z

Ergosta 5,7,22-trienol: Ergosterol E5,7,22 11,9 min 282 nm 379

Ergosta 5,7,22,24-tetraenol: / E5,7,22,24 10,0 min 233 nm 377

Colesta 5,7,22,24-tetraenol: / C5,7,22,24 9,2 min 233 nm 363

Colesta 5,7,24-trienol: / C5,7,24 10,3 min 282 nm 365

Colesta 5,7,22-trienol: / C5,7,22 10,8 min 282 nm 365

Colesta 5,7-dienol: 7-deshidrocolesterol (7-DHC) C5,7 11,8min 282 nm 367

Acetato de 25-hidroxi-colesta5,7-dienol: 25OH-7DHC-Ac 25OH-C5,7-Ac 8,5 min 282 nm 365-383

Acetato de 25-hidroxiergosterol: 25OH-ergosterol-Ac 25OH-E5,7,22-Ac 8,7 min 282 nm 377-395

Ejemplo 10Expresión del gen S24R1 procedente del plásmido V51TDH-S24R1 5 en la cepa ERT de S. cerevisiae deficiente en ERG6

El plásmido V51TDH-S24R1 (véase el Ejemplo 3) y el vector vacío V51TDH como testigo se transformaron dentro de la cepa ERT mediante la técnica de litio-PEG (Gietz y colaboradores, 1995). Los transformantes se seleccionaron en un medio mínimo definido sin uracilo. Cuatro transformantes independientes procedentes de cada transformación se

10 analizaron en cuanto a la existencia del plásmido. Uno de los transformantes confirmados se escogió aleatoriamente, se denominó respectivamente ERT/V51TDH y ERT/V51TDH-S24R1 y se utilizó para unos análisis ulteriores.

Las cepas se cultivaron hasta la fase estacionaria en 2 % (p/v) del medio de Kapelli con glucosa (véase la Tabla 2),

15 todos los esteroles se extrajeron tal como se ha descrito en el Ejemplo 8 y se analizaron mediante una HPLC con detecciones por espectrometría de rayos UV y de masas, tal como se ha descrito en el Ejemplo 9. Los esteroles más importantes se identificaron por sus propiedades de tiempo de retención, de masas y espectrales utilizando los respectivos patrones (véase la Tabla 5).

20 Los perfiles de elución en HPLC (detección con rayos UV a 282 nm) se muestran en la Figura 6. El colesta5,7,22,24-tetraenol (RT 9,2 min, m/z = 363, UV max 233 nm) era el principal esterol encontrado en la cepa testigo ERT/V51TDH erg6, correspondientemente a un 70 % de la señal de UV a 282 nm. Un 7 % de los esteroles totales identificados a 282 nm se identificaron como el colesta-5,7,24-trienol (RT 10,3 min, m/z = 365, UV max 282 nm; Figura 6-A).

25 El perfil de esteroles de la cepa ERT/V51TDH-S24R1 (Figura 6-B) que expresa el gen S24R1 reveló la presencia de dos esteroles que no habían sido detectados en la cepa testigo ERT/V51TDH, a saber el colesta 5,7,22-trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV max 282 nm), el principal esterol de esta cepa (60 % de la señal de rayos UV a 282 nm), y el colesta 5,7-dienol, también denominado 7-deshidrocolesterol (RT 11,8, m/z = 367, UV max 282 nm). La presencia

30 del colesta-5,7-dienol y del colesta-5,7,22-trienol generados por reducción del enlace Δ24-25 del colesta 5,7,24-trienol y del colesta 5,7,22,24-tetraenol confirmó la actividad de esterol Δ24-reductasa del gen S24R1 (véase la Figura 13).

Ejemplo 11Expresión del gen S24R2 procedente del plásmido V51TDH-S24R2 35 en la cepa ERT de S. cerevisiae

El plásmido V51TDH-S24R2 (Ejemplo 3), que expresaba constitutivamente el S24R2, se transformó dentro de la cepa ERT utilizando el protocolo con litio-PEG (Gietz y colaboradores, 1995). Los transformantes se seleccionaron en un medio mínimo sin uracilo. Se analizaron cuatro transformantes independientes y mostraron las mismas

40 propiedades. Uno de ellos se denominó ERT/V51TDH-S24R2 y se utilizó para el análisis ulterior.

La cepa era cultivada hasta que ella alcanzó la fase estacionaria en el medio de Kapelli con 2 % de glucosa (véase la Tabla 2) y los esteroles se extrajeron y se analizaron tal como se ha descrito en los Ejemplos 8, 9 y 10. De nuevo, el colesta 5,7,22,24-tetraenol (RT 9,2 min, m/z = 363, UV max 233 nm) y el colesta 5,7,24-trienol (RT 10,3 min, m/z = 45 365, UV max 282 nm) eran los principales esteroles encontrados en la cepa testigo ERT/V51TDH (Figura 6-A), mientras que el principal esterol detectado en la cepa ERT/V51TDH-S24R2, que expresa el S24R2, fue el colesta 5,7,22-trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV max 282 nm) con un 70 % de la señal de rayos UV a 282 nm (Figura 6-C). El colesta 5,7-dienol (7-deshidrocolesterol; RT 11,8, m/z = 367, UV max 282 nm) se encontró en las concentraciones más bajas (13 % de la señal de rayos UV). Estos resultados confirman la actividad de esterol Δ24

50 reductasa del gen S24R2.

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Ejemplo 12Expresión del gen S24R1 procedente del plásmido centromérico pFLAde-S24R1 en la cepa ERT de S. cerevisiae

El plásmido centromérico pFLAde-S24R1 (Ejemplo 5) para la expresión constitutiva del gen S24R1 se transformó dentro de la cepa ERT utilizando el método con litio-PEG (Gietz y colaboradores, 1995). Los transformantes se seleccionaron en un medio definido sin adenina. Cuatro transformantes independientes se analizaron en cuanto a la aparición del plásmido pFLAde-S24R1 y a su patrón de esteroles. Uno de ellos se escogió aleatoriamente, se denominó ERT/pFLAde-S24R1 y se utilizó para la ilustración ulterior de los resultados.

El ERT/pFLAde-S24R1 se cultivó en el medio de Kapelli con 2 % de glucosa (véase la Tabla 2) hasta que alcanzó la fase estacionaria. Los esteroles se extrajeron y se analizaron tal como se ha descrito en los Ejemplos 8 y 9. El nuevo esterol principal en ERT/pFLAde-S24R1, que no estaba presente en el testigo, fue el colesta 5,7,22-trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV max 282 nm) con 60 % de la señal de rayos UV a 282 nm (Figura 6-D). También se detectó una cantidad más pequeña (7 % de la señal de rayos UV) de 7-deshidrocolesterol (RT 11,8, m/z = 367, UV max 282 nm). Aparte de estos nuevos esteroles, el colesta 5,7,22,24-tetraenol (RT 9,2 min, m/z = 363, UV max 233 nm) y el colesta 5,7,24 (RT 10,3 min, m/z = 365, UV max 282 nm), que también están presentes en la cepa testigo ERT (Figura 6-A), se encontraron también en ERT/pFLAde-S24R1. Estos resultados confirman la actividad de esterol Δ24-reductasa del gen S24R1, expresado a partir del plásmido centromérico pFLAde-S24R1.

Ejemplo 13Producción de acetato de 25-hidroxi-7-deshidrocolesterol por expresión concomitantede los genes S24R1 y C25H1 en la cepa ERT de S. cerevisiae

El plásmido V51-C25H1 (Ejemplo 6) para la expresión inducible por galactosa del gen C25H1 y el plásmido V51 como testigo se transformaron dentro de la cepa ERT/pFLAde-S24R1 (descrita en el Ejemplo 12) con el método de litio-PEG (Gietz y colaboradores, 1995). El V51-C25H1 y el pFLAde-S24R1 son unos plásmidos compatibles. Sus diferentes orígenes, el 2 µ y un ARS-CEN, permiten su aparición simultánea en una levadura. Los transformantes se seleccionaron en un medio mínimo sin uracilo ni adenina. Cuatro transformantes independientes procedentes de cada transformación se analizaron y mostraron las mismas propiedades. Un transformante procedente de cada transformación se escogió aleatoriamente, se denominó ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 y ERT/pFLAdeS24R1/V51, respectivamente, y se utilizó para el análisis ulterior.

Las cepas se cultivaron en el medio de Kapelli con 2 % de galactosa (véase la Tabla 2) hasta que ellos alcanzaron la fase estacionaria. Los esteroles se extrajeron y se analizaron por HPLC con detección por espectrometría de rayos UV y de masas tal como se ha descrito en los Ejemplos 8 y 9 en las condiciones que se han descrito en el Ejemplo 10. Tal como se encontró para la cepa testigo ERT/pFLAde-S24R1/V51 (Figura 7-C), el principal esterol en ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 (Figura 7-D) era el colesta 5,7,22-trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV max 282 nm), generado por reducción del esterol final colesta 5,7,22,24-tetraenol por la esterol Δ24-reductasa. Un nuevo compuesto, que no estaba presente en la cepa testigo, se observó en la cepa ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 (Figura 7-D), que era eluido al mismo tiempo que el acetato de 25-hidroxi-7-deshidrocolesterol (25OH-7DHC-Ac) preparado, inyectado como un patrón (RT 8,5 min, Figura 7-B). Este compuesto mostró también un perfil de absorción de rayos UV (Figura 8-C) idéntico al del acetato de 25-hidroxi-7-deshidrocolesterol preparado (Figura 8-B), con el pico doble situado aproximadamente a 282 nm, que es específico para los enlaces dobles conjugados Δ5Δ7 tal como se ha observado también para el patrón de 7-deshidrocolesterol (Figura 8-A). El nuevo compuesto mostró, por lo tanto, un perfil de fragmentación de masas (Figura 9-C) idéntico al del acetato de 25-hidroxi-7deshidrocolesterol (Figura 9-B), tal como se determinó por un análisis de espectrometría de masas en línea (realizado tal como se ha descrito en el Ejemplo 9).

En el caso de los 3β-hidroxiesteroles, el análisis por pulverización electrónica produce una señal principal con un peso molecular de menos diecisiete (protonación (+1) y deshidratación en la posición C3 (-18). La señal principal para el 7-deshidrocolesterol (Figura 9-A) es con la masa m/z de 367 (384 (el 7-deshidrocolesterol PM) + 1 (protonación) -18 (deshidratación del 3β-hidroxiesterol). La señal observada para el acetato de 25-hidroxi-7deshidrocolesterol con la masa m/z de 383 corresponde a la hidroxilación adicional en la posición C-25 (367 + 16 = 383). La señal principal con la masa m/z de 365 corresponde a la deshidratación en la posición C25 (383 -18 = 365) que aparece para una fracción de las moléculas durante la detección dentro del detector de masas. Estos diferentes resultados (el mismo tiempo de retención, el mismo perfil de UV, y la misma fragmentación de masas que el acetato de 25-hidroxi-7-deshidrocolesterol utilizado como patrón) demostraron que el nuevo compuesto producido en la cepa ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 era el acetato de 25-hidroxi-7-deshidrocolesterol.

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min) y el ergosterol (RT 11,9 min) era idéntica a la diferencia de los tiempos de retención entre el acetato de 25hidroxi-7-deshidrocolesterol (RT 8,5 min) y el 7-deshidrocolesterol (RT 11,8).

Todas estas propiedades (el perfil de rayos UV, la fragmentación de masas, el tiempo de retención) son compatibles 5 con la conclusión de que este nuevo compuesto producido por la expresión de C25H1 en W303/V51-C25H1 era el acetato de 25-hidroxi-ergosterol.

La transformación de V51-C25H1 y del vector vacío V51 como testigo dentro de la cepa BY4742 de S. cerevisiae condujo a unos resultados (Figura 10) comparables con los que se obtuvieron para las cepas W303/V51-C25H1 y

10 W303/V51. La señal adicional a 8,7 min era observada de nuevo mediante una HPLC (detección por rayos UV) para el transformante V51-C25H1. El compuesto mostró el mismo perfil de rayos UV (Figura 11) y el mismo perfil de fragmentación de masas (Figura 12) que el compuesto detectado en W303/C25H1 lo que indica manifiestamente que este compuesto es también el acetato de 25-hidroxi-ergosterol.

15 Ejemplo 16Producción de acetato de 25-hidroxi-ergosterol mediante expresión del gen C25H3 en la cepa W303-1B de S. cerevisiae

El plásmido V51-C25H3 (Ejemplo 7) construido para la expresión inducible por galactosa del gen sintético C25H3 se

20 transformó dentro de la cepa W303-1B (tal como se ha descrito en el Ejemplo 8) utilizando el método de litio-PEG (Gietz y colaboradores, 1995). Los transformantes se seleccionaron en un medio mínimo sin uracilo. Cuatro transformantes independientes se analizaron en cuanto a la aparición del V51-C25H3. Un transformante positivo se denominó W303/V51-C25H3 y se utilizó para las investigaciones ulteriores de los esteroles producidos.

25 Las cepas se cultivaron en el medio de Kapelli con 2 % de galactosa (véase la Tabla 2) hasta que alcanzaron la fase estacionaria. Los esteroles se extrajeron a partir de las células cosechadas y se analizaron mediante HPLC con detecciones por espectrometría de rayos UV y de masas, tal como se ha descrito en los Ejemplos 8 y 9, en las condiciones que se han descrito en el Ejemplo 10.

30 El análisis de los extractos de esteroles mediante HPLC (detección con rayos UV a 282 nm), tal como se presenta en la Figura 10-D, mostró que el modelo de esteroles de la cepa W303/V51-C25H3 era muy parecido al modelo de esteroles de la cepa W303/V51-C25H1 (Ejemplo 15), con un nuevo compuesto (RT 8,7 min) producido además del ergosterol (RT 11,9 min) y del ergosta 5,7,22,24-tetraenol (RT 10,0 min). Una detección con PDA de rayos UV en línea (Figura 11) y una espectrometría de masas (Figura 12) mostraron que el nuevo compuesto tenía las mismas

35 propiedades que el compuesto producido por W303/V51-C25H1, por ejemplo el perfil de rayos UV específico para el enlace doble conjugado de Δ5-Δ7, una fragmentación de masas con una señal principal a m/z = 377 y una señal menor a m/z = 395, y un retraso del tiempo de retención en la HPLC que era compatible con un esterol hidroxilado en la posición 25. Todas estas características (el perfil de rayos UV, la fragmentación de masas y el tiempo de retención) indican manifiestamente que este nuevo compuesto es el acetato de 25-hidroxi-ergosterol resultante a

40 partir de la expresión de C25H3.

Ejemplo 17Introducción de C25H1 y C25H3 dentro de la cepa de levadura que produceprincipalmente colesta-5,7,24-trienol

45 El plásmido V51-C25H1 (Ejemplo 6) y el plásmido V51-CH25H3 (Ejemplo 7) para la expresión de los genes inducibles por galactosa C25H1 y C25H3, y el plásmido V51 como testigo, se transformaron dentro de la cepa ERT erg5 erg6 (descrita en el Ejemplo 12; el ERG5 se desactivó mediante integración del gen URA3) con el método de litio-PEG (Gietz y colaboradores, 1995). Los transformantes se seleccionaron en un medio mínimo sin uracilo ni adenina. Cuatro transformantes independientes procedentes de cada transformación se analizaron y mostraron las

50 mismas propiedades. Un transformante de cada transformación se escogió aleatoriamente, se denominó ERT erg5 erg6/V51-C25H1, ERT erg5 erg6/V51-C25H3 y ERT erg5 erg6/V51, respectivamente, y se utilizó para el análisis ulterior.

Las cepas se cultivaron en el medio de Kapelli con 2 % de galactosa (véase la Tabla 2) hasta que alcanzaron la fase

55 estacionaria. Los esteroles se extrajeron y se analizaron por HPLC con detección por espectrometría de rayos UV y de masas, tal como se ha descrito en los Ejemplos 8 y 9, en las condiciones que se describieron en el Ejemplo 10. No se detectó ninguna diferencia en el modelo de los esteroles entre las tres cepas, lo que demuestra que las dos hidroxilasas no eran activas sobre el colesta-5,7,24-trienol.

60

imagen17

SEQ.ID.NO:20 Secuencia de ADN de P. troglodytes CH25OH_HY

imagen18

SEQ.ID.NO:21 Secuencia de aminoácidos de la colesterol 25-hidroxilasa putativa de R. norvegicus

SEQ.ID.NO:22 Secuencia de ADN de R. norvegicus CH25OH_opt 2.0

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imagen20

SEQ.ID.NO:23 Secuencia de ADN de R. norvegicus CH25OH_HY

imagen21

imagen22

SEQ.ID.NO:24 Secuencia de aminoácidos de la colesterol 25-hidroxilasa putativa de E. caballus:

imagen23

SEQ.ID.NO:25 Secuencia de ADN de E. caballus CH25OH_opt 2.0

imagen24

SEQ.ID.NO:26 Secuencia de ADN de E. caballus CH25OH_HY

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Claims

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