JP2500543B2 - キメラｐ４５０産生菌株 - Google Patents
キメラｐ４５０産生菌株Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウシ副腎Ｐ４５０ １７
αのＮ末端１５アミノ酸からなるシグナル配列をＮ末端
に有し、５０１アミノ酸残基からなる成熟型のラット肝
Ｐ４５０ Ｃ２５ をＣ末端に有するキメラＰ４５０を酵母
内で発現させるプラスミド、該プラスミドを保持する酵
母菌株、該酵母菌株によって生産されるキメラＰ４５
０、及びウシ副腎Ｐ４５０ １７ αのＮ末端１５アミノ酸
からなるシグナル配列をＮ末端に有し、５０１アミノ酸
残基からなる成熟型のラット肝Ｐ４５０ Ｃ２５ をＣ末端
に有するキメラＰ４５０遺伝子に関する。
αのＮ末端１５アミノ酸からなるシグナル配列をＮ末端
に有し、５０１アミノ酸残基からなる成熟型のラット肝
Ｐ４５０ Ｃ２５ をＣ末端に有するキメラＰ４５０を酵母
内で発現させるプラスミド、該プラスミドを保持する酵
母菌株、該酵母菌株によって生産されるキメラＰ４５
０、及びウシ副腎Ｐ４５０ １７ αのＮ末端１５アミノ酸
からなるシグナル配列をＮ末端に有し、５０１アミノ酸
残基からなる成熟型のラット肝Ｐ４５０ Ｃ２５ をＣ末端
に有するキメラＰ４５０遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】以下、本明細書で用いるキメラＰ４５０
という言葉は、ミクロソームへの局在化シグナル配列を
Ｎ末端に有し、成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０をＣ
末端に有するＰ４５０を意味する。Ｐ４５０は微生物か
ら哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在するヘムタン
パク質であり、電子伝達系の末端酵素として種々の脂溶
性化合物を基質として１原子酸素添加反応を触媒する。
電子伝達系の末端酵素であるＰ４５０は分子種が多様で
あり、それぞれが異なる基質特異性を示すので、非常に
広範囲の脂溶性化合物を水酸化することができる。哺乳
動物のＰ４５０依存性電子伝達系はその構成酵素から、
ミクロソーム型とミトコンドリア型に分けられる。前者
では、フラビンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノ
ヌクレオチドを分子内に補酵素として含有するＮＡＤＰ
Ｈ−チトクロムＰ４５０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤ
ＰＨからの電子をＰ４５０へ供給し、後者では、フラビ
ンアデニンジヌクレオチドを補酵素として分子内に含有
するＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素、および、非
ヘム鉄を補酵素として分子内に含有するフェレドキシン
がＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給することによ
り、種々の脂溶性基質に対して水酸化反応を触媒する。
という言葉は、ミクロソームへの局在化シグナル配列を
Ｎ末端に有し、成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０をＣ
末端に有するＰ４５０を意味する。Ｐ４５０は微生物か
ら哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在するヘムタン
パク質であり、電子伝達系の末端酵素として種々の脂溶
性化合物を基質として１原子酸素添加反応を触媒する。
電子伝達系の末端酵素であるＰ４５０は分子種が多様で
あり、それぞれが異なる基質特異性を示すので、非常に
広範囲の脂溶性化合物を水酸化することができる。哺乳
動物のＰ４５０依存性電子伝達系はその構成酵素から、
ミクロソーム型とミトコンドリア型に分けられる。前者
では、フラビンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノ
ヌクレオチドを分子内に補酵素として含有するＮＡＤＰ
Ｈ−チトクロムＰ４５０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤ
ＰＨからの電子をＰ４５０へ供給し、後者では、フラビ
ンアデニンジヌクレオチドを補酵素として分子内に含有
するＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素、および、非
ヘム鉄を補酵素として分子内に含有するフェレドキシン
がＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給することによ
り、種々の脂溶性基質に対して水酸化反応を触媒する。
【０００３】本発明者らはすでに、数種のミクロソーム
型Ｐ４５０及び還元酵素を酵母内で生産させ、それらの
組換え体酵母菌株を用いることにより、工業的に有用な
水酸化反応を行うことに成功した。すなわち、ラット肝
Ｐ４５０c 遺伝子、ウシ副腎Ｐ４５０17α遺伝子やＰ４
５０C21 遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺伝子を含
む発現プラスミドを作製し、これら発現プラスミドで酵
母を形質転換することにより、該酵素を産生する酵母菌
株を得た（特開昭６１−５６０７２、特開平１−４７３
８０、特開平２−３１６８０）。これらの酵母菌株はそ
れぞれのＰ４５０分子種に依存した１原子酸素添加活性
を示した。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵
素遺伝子を単離し、Ｐ４５０還元能を有する該酵素の酵
母内発現に成功した（特開昭６２−１９０８５、特開平
２−５１５２５）。さらに、発明者らは、Ｐ４５０と還
元酵素の両酵素を産生する酵母菌株（特開昭６２−１０
４５８２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持つ新規モ
ノオキシゲナーゼの作出に成功した（特開昭６３−４４
８８８、特開平２−２３８７０、特願平１−７１２５
０）。こうした技術により、本発明者らはこれらＰ４５
０産生酵母菌株を用いて、医薬品として有用なアセトア
ミノフェンやステロイドホルモン中間体の製造を可能に
した。
型Ｐ４５０及び還元酵素を酵母内で生産させ、それらの
組換え体酵母菌株を用いることにより、工業的に有用な
水酸化反応を行うことに成功した。すなわち、ラット肝
Ｐ４５０c 遺伝子、ウシ副腎Ｐ４５０17α遺伝子やＰ４
５０C21 遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺伝子を含
む発現プラスミドを作製し、これら発現プラスミドで酵
母を形質転換することにより、該酵素を産生する酵母菌
株を得た（特開昭６１−５６０７２、特開平１−４７３
８０、特開平２−３１６８０）。これらの酵母菌株はそ
れぞれのＰ４５０分子種に依存した１原子酸素添加活性
を示した。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵
素遺伝子を単離し、Ｐ４５０還元能を有する該酵素の酵
母内発現に成功した（特開昭６２−１９０８５、特開平
２−５１５２５）。さらに、発明者らは、Ｐ４５０と還
元酵素の両酵素を産生する酵母菌株（特開昭６２−１０
４５８２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持つ新規モ
ノオキシゲナーゼの作出に成功した（特開昭６３−４４
８８８、特開平２−２３８７０、特願平１−７１２５
０）。こうした技術により、本発明者らはこれらＰ４５
０産生酵母菌株を用いて、医薬品として有用なアセトア
ミノフェンやステロイドホルモン中間体の製造を可能に
した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一方、ミトコンドリア
型Ｐ４５０に関しては、ミトコンドリア型Ｐ４５０分子
種であるラット肝Ｐ４５０C25 依存性の１原子酸素添加
活性を発揮する酵母菌株を創製した（特願２−２５８２
６２）。 しかし、ラット肝Ｐ４５０C25 依存性の１原
子酸素添加活性を発揮する酵母菌株におけるＰ４５０
C25 産生量は低く、菌体当たりの活性が低かったため、
本発明者らは、さらに大量にＰ４５０C25 を産生する酵
母菌株を創製することを目的とした。さらに、ラット肝
Ｐ４５０C25 依存性の１原子酸素添加活性発現にはＰ４
５０ C25 の他、ウシ副腎アドレノドキシン（以下、ＡＤ
Ｘと略す）およびウシ副腎アドレノドキシン還元酵素
（以下、ＡＤＲと略す）の２酵素が必要である。そこで
本発明者らは、１ステップの１原子酸素添加活性発現の
バイオリアクターの作出を試みた。
型Ｐ４５０に関しては、ミトコンドリア型Ｐ４５０分子
種であるラット肝Ｐ４５０C25 依存性の１原子酸素添加
活性を発揮する酵母菌株を創製した（特願２−２５８２
６２）。 しかし、ラット肝Ｐ４５０C25 依存性の１原
子酸素添加活性を発揮する酵母菌株におけるＰ４５０
C25 産生量は低く、菌体当たりの活性が低かったため、
本発明者らは、さらに大量にＰ４５０C25 を産生する酵
母菌株を創製することを目的とした。さらに、ラット肝
Ｐ４５０C25 依存性の１原子酸素添加活性発現にはＰ４
５０ C25 の他、ウシ副腎アドレノドキシン（以下、ＡＤ
Ｘと略す）およびウシ副腎アドレノドキシン還元酵素
（以下、ＡＤＲと略す）の２酵素が必要である。そこで
本発明者らは、１ステップの１原子酸素添加活性発現の
バイオリアクターの作出を試みた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５
は、５３３アミノ酸からなる前駆体として細胞質で合成
されたのち、ミトコンドリアに輸送される。その際、ミ
トコンドリアのシグナルとして機能するアミノ末端部分
の３２アミノ酸が除去され、５０１アミノ酸からなる成
熟型Ｐ４５０Ｃ２５（分子量約５７ｋＤ）がミトコンド
リア膜に局在する。一方、Ｐ４５０１７αはウシ副腎ミ
クロソームの酵素で、Ｎ末端の疎水性アミノ酸配列がミ
クロソームへの局在化シグナルとして機能する。そこ
で、本発明者らは、本来ミトコンドリアに存在する酵素
をミクロソームに局在化させることにより酵母内での産
生量を上昇させることを目的として、ラット肝Ｐ４５０
ｃ２５のミトコンドリア移行シグナル部分をミクロソー
ム膜への挿入のためのシグナルと考えられるウシ副腎Ｐ
４５０１７αのＮ末端１５アミノ酸に置換したキメラＰ
４５０Ｃ２５を酵母で発現させるプラスミドを構築し
た。また、キメラＰ４５０ｃ２５、ＡＤＸおよびＡＤＲ
がミクロソーム膜上で電子伝達系を構築し、モノオキシ
ゲナーゼ活性を発揮することを目的としてキメラＰ４５
０ｃ２５、成熟型ＡＤＸおよび成熟型ＡＤＲの３酵素を
同時に発現するプラスミドを構築した。その際、同一の
プロモーター、ターミネーターを用いると酵母の継代培
養中にプラスミド内での組み換えが起こることから、３
酵素を別々のプロモーター、ターミネーターにより発現
させた。
は、５３３アミノ酸からなる前駆体として細胞質で合成
されたのち、ミトコンドリアに輸送される。その際、ミ
トコンドリアのシグナルとして機能するアミノ末端部分
の３２アミノ酸が除去され、５０１アミノ酸からなる成
熟型Ｐ４５０Ｃ２５（分子量約５７ｋＤ）がミトコンド
リア膜に局在する。一方、Ｐ４５０１７αはウシ副腎ミ
クロソームの酵素で、Ｎ末端の疎水性アミノ酸配列がミ
クロソームへの局在化シグナルとして機能する。そこ
で、本発明者らは、本来ミトコンドリアに存在する酵素
をミクロソームに局在化させることにより酵母内での産
生量を上昇させることを目的として、ラット肝Ｐ４５０
ｃ２５のミトコンドリア移行シグナル部分をミクロソー
ム膜への挿入のためのシグナルと考えられるウシ副腎Ｐ
４５０１７αのＮ末端１５アミノ酸に置換したキメラＰ
４５０Ｃ２５を酵母で発現させるプラスミドを構築し
た。また、キメラＰ４５０ｃ２５、ＡＤＸおよびＡＤＲ
がミクロソーム膜上で電子伝達系を構築し、モノオキシ
ゲナーゼ活性を発揮することを目的としてキメラＰ４５
０ｃ２５、成熟型ＡＤＸおよび成熟型ＡＤＲの３酵素を
同時に発現するプラスミドを構築した。その際、同一の
プロモーター、ターミネーターを用いると酵母の継代培
養中にプラスミド内での組み換えが起こることから、３
酵素を別々のプロモーター、ターミネーターにより発現
させた。
【０００６】
【発明の効果】発現された、ほとんどのキメラＰ４５０
C25 はミクロソーム画分に存在した。従って、Ｐ４５０
17α由来のＮ末端１５アミノ酸残基が酵母内でミクロソ
ーム膜へのシグナルの役割を果たし、本来はミトコンド
リアの膜蛋白であるＰ４５０C2 5 を酵母ミクロソームで
発現させることに成功した。また、キメラＰ４５０C25
産生量は菌体当たり約２×１０5 分子であり、シグナル
の置換によりＰ４５０C25 の産生量を約１０倍上昇させ
ることができた。さらに、ミクロソーム画分は、ＡＤＸ
とＡＤＲを添加することにより、ＴＨＣ、ビタミン
Ｄ3 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 に対し、高い水酸
化活性を示した。特に、１α−ビタミンＤ3 に対する水
酸化活性は元の５０１アミノ酸からなる成熟型Ｐ４５０
C25 よりもはるかに高く、１５アミノ酸残基の付加がＰ
４５０C2 5 の膜における存在状態を変化させ、活性を上
昇させたと思われる。また、キメラＰ４５０C25 、ＡＤ
ＸおよびＡＤＲの同時発現株はモノオキシゲナーゼ活性
を発揮しているので、本発明者らは、酵母ミクロソーム
膜上でＡＤＲからＡＤＸを経てキメラＰ４５０C25 とい
う電子伝達系を構築することに成功した。従って、この
菌株をステロイド化合物や活性型ビタミンＤ3 などの水
酸化反応に１ステップで行うことができる簡便なバイオ
リアクターとして利用できる。特に、菌体培養液中に基
質を添加し、一定時間後に有機溶媒等で抽出することに
より容易に反応産物を回収することができるため、バイ
オリアクターとして有用である。
C25 はミクロソーム画分に存在した。従って、Ｐ４５０
17α由来のＮ末端１５アミノ酸残基が酵母内でミクロソ
ーム膜へのシグナルの役割を果たし、本来はミトコンド
リアの膜蛋白であるＰ４５０C2 5 を酵母ミクロソームで
発現させることに成功した。また、キメラＰ４５０C25
産生量は菌体当たり約２×１０5 分子であり、シグナル
の置換によりＰ４５０C25 の産生量を約１０倍上昇させ
ることができた。さらに、ミクロソーム画分は、ＡＤＸ
とＡＤＲを添加することにより、ＴＨＣ、ビタミン
Ｄ3 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 に対し、高い水酸
化活性を示した。特に、１α−ビタミンＤ3 に対する水
酸化活性は元の５０１アミノ酸からなる成熟型Ｐ４５０
C25 よりもはるかに高く、１５アミノ酸残基の付加がＰ
４５０C2 5 の膜における存在状態を変化させ、活性を上
昇させたと思われる。また、キメラＰ４５０C25 、ＡＤ
ＸおよびＡＤＲの同時発現株はモノオキシゲナーゼ活性
を発揮しているので、本発明者らは、酵母ミクロソーム
膜上でＡＤＲからＡＤＸを経てキメラＰ４５０C25 とい
う電子伝達系を構築することに成功した。従って、この
菌株をステロイド化合物や活性型ビタミンＤ3 などの水
酸化反応に１ステップで行うことができる簡便なバイオ
リアクターとして利用できる。特に、菌体培養液中に基
質を添加し、一定時間後に有機溶媒等で抽出することに
より容易に反応産物を回収することができるため、バイ
オリアクターとして有用である。
【０００７】以下、本発明をさらに詳細に説明する。本
発明のキメラＰ４５０がＮ末端に有するミクロソームへ
の移行シグナルとしては、ウシ副腎Ｐ４５０１７ αの移
行シグナルを用いる。さらに、本発明のキメラＰ４５０
がＣ末端に有する成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０と
しては、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ を用いる。また、本発
明のウシ副腎Ｐ４５０１７αおよびラット肝Ｐ４５０
Ｃ２５をコードするｃＤＮＡはすでに公知であり、通常
の操作法でこれを単離することができる。本発明のキメ
ラＰ４５０Ｃ２５を発現する発現プラスミドはウシ副腎
Ｐ４５０１７αのＮ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮ
Ａを合成し、成熟型ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５をコードす
るｃＤＮＡ領域と連結した後、遺伝子を酵母アルコール
脱水素酵素（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝子のプロモー
ターおよび同ターミネーターを保持する酵母発現ベクタ
ーｐＡＡＨ５（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，１０１，ｐａｒｔＣ，ｐ１９２−２０１）に挿
入し構築することができる。また、この発現プラスミド
上に成熟型ＡＤＲおよび成熟型ＡＤＸの発現ユニットを
挿入することにより、３酵素を同時に発現させるための
プラスミドを構築することができる。ただし、プロモー
ターおよびターミネーターはＡＤＨに限定されず、酵母
内で効率的に機能するものであればよい。また、３酵素
を同時に発現させるプラスミドのプロモーターおよびタ
ーミネーターは同一でなく、それぞれ異なっているほう
が好ましい。その理由は、継代培養した場合、プラスミ
ド上での組み換えば起こる可能性が低いからである。ま
た、３酵素の発現ユニットへの挿入位置、挿入方向はそ
れぞれ酵素の発現量にほとんど影響を与えない。宿主と
して酵母を用いることが好ましいが、さらに酵母サッカ
ロミセス・セレビシエＡＨ２２株が、望ましい。キメラ
Ｐ４５０Ｃ２５遺伝子を含む発現プラスミドあるいは３
酵素同時発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換は、
アルカリ金属（ＬｉＣｌ）を用いる方法、プロトプラス
ト法など公知の方法で行うことができる。本発明により
得られる形質転換酵母の培養は通常のグルコース、窒素
源などを含む培地において通常の培養方法により行うこ
とができる。このようにして得られた形質転換酵母菌体
を培養することによりキメラＰ４５０Ｃ２５を製造する
ことができる。
発明のキメラＰ４５０がＮ末端に有するミクロソームへ
の移行シグナルとしては、ウシ副腎Ｐ４５０１７ αの移
行シグナルを用いる。さらに、本発明のキメラＰ４５０
がＣ末端に有する成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０と
しては、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ を用いる。また、本発
明のウシ副腎Ｐ４５０１７αおよびラット肝Ｐ４５０
Ｃ２５をコードするｃＤＮＡはすでに公知であり、通常
の操作法でこれを単離することができる。本発明のキメ
ラＰ４５０Ｃ２５を発現する発現プラスミドはウシ副腎
Ｐ４５０１７αのＮ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮ
Ａを合成し、成熟型ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５をコードす
るｃＤＮＡ領域と連結した後、遺伝子を酵母アルコール
脱水素酵素（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝子のプロモー
ターおよび同ターミネーターを保持する酵母発現ベクタ
ーｐＡＡＨ５（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，１０１，ｐａｒｔＣ，ｐ１９２−２０１）に挿
入し構築することができる。また、この発現プラスミド
上に成熟型ＡＤＲおよび成熟型ＡＤＸの発現ユニットを
挿入することにより、３酵素を同時に発現させるための
プラスミドを構築することができる。ただし、プロモー
ターおよびターミネーターはＡＤＨに限定されず、酵母
内で効率的に機能するものであればよい。また、３酵素
を同時に発現させるプラスミドのプロモーターおよびタ
ーミネーターは同一でなく、それぞれ異なっているほう
が好ましい。その理由は、継代培養した場合、プラスミ
ド上での組み換えば起こる可能性が低いからである。ま
た、３酵素の発現ユニットへの挿入位置、挿入方向はそ
れぞれ酵素の発現量にほとんど影響を与えない。宿主と
して酵母を用いることが好ましいが、さらに酵母サッカ
ロミセス・セレビシエＡＨ２２株が、望ましい。キメラ
Ｐ４５０Ｃ２５遺伝子を含む発現プラスミドあるいは３
酵素同時発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換は、
アルカリ金属（ＬｉＣｌ）を用いる方法、プロトプラス
ト法など公知の方法で行うことができる。本発明により
得られる形質転換酵母の培養は通常のグルコース、窒素
源などを含む培地において通常の培養方法により行うこ
とができる。このようにして得られた形質転換酵母菌体
を培養することによりキメラＰ４５０Ｃ２５を製造する
ことができる。
【０００８】
【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。 実施例１ 発現プラスミドｐＡＭＳ２５および３酵素同
時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は、通常２０〜２
００μｌの反応容積を用いて、これらの酵素類を市販す
るメーカー（例えば、宝酒造（株））が製品に添付した
反応条件で実施した。キメラ体Ｐ４５０ｃ２５発現プラ
スミドｐＡＭＳ２５を図１に従い構築した。ラット肝Ｐ
４５０ｃ２５発現プラスミドｐＡＣ２５（特願平２−２
５８３６２）を構築した際、得られたプラスミドｐＵＣ
２５ＮをＰｓｔＩで部分消化した後ＥｃｏＲＩ消化し、
得られたＤＮＡ断片に合成リンカー（配列番号１に示
す。）を挿入し、得られたプラスミドからＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＳａｃＩ断片を調製した。一方、ｐＵＣ２５ＣＨ
（特願平２−２５８２６２）からＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片を調製し、これら両断片をｐＵＣ１９のＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位に同時に挿入することによりプラスミドｐ
ＵＭＳ２５を得た。次に、ｐＵＭＳ２５から得たＨｉｎ
ｄＩＩＩ断片をベクターｐＡＡＨ５Ｎ（特開平２−５１
５２５）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することにより発
現プラスミドｐＡＭＳ２５を構築した。
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。 実施例１ 発現プラスミドｐＡＭＳ２５および３酵素同
時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は、通常２０〜２
００μｌの反応容積を用いて、これらの酵素類を市販す
るメーカー（例えば、宝酒造（株））が製品に添付した
反応条件で実施した。キメラ体Ｐ４５０ｃ２５発現プラ
スミドｐＡＭＳ２５を図１に従い構築した。ラット肝Ｐ
４５０ｃ２５発現プラスミドｐＡＣ２５（特願平２−２
５８３６２）を構築した際、得られたプラスミドｐＵＣ
２５ＮをＰｓｔＩで部分消化した後ＥｃｏＲＩ消化し、
得られたＤＮＡ断片に合成リンカー（配列番号１に示
す。）を挿入し、得られたプラスミドからＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＳａｃＩ断片を調製した。一方、ｐＵＣ２５ＣＨ
（特願平２−２５８２６２）からＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片を調製し、これら両断片をｐＵＣ１９のＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位に同時に挿入することによりプラスミドｐ
ＵＭＳ２５を得た。次に、ｐＵＭＳ２５から得たＨｉｎ
ｄＩＩＩ断片をベクターｐＡＡＨ５Ｎ（特開平２−５１
５２５）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することにより発
現プラスミドｐＡＭＳ２５を構築した。
【０００９】成熟型ＡＤＸ（特願平２−１３６４９６に
記載）をコードするＨｉｎｄIII 断片をベクターｐＧＡ
ＨＮ（ベクターｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター、タ
ーミネーターのかわりにＰＧＫプロモーター、ターミネ
ーターを含む）のＰＧＫプロモーター、ターミネーター
（特願平２−１３６４９６に記載）の間に挿入すること
により発現プラスミドｐＧＸを得た。また、成熟型ＡＤ
Ｒ（特開昭６３−１１２９８６に記載）をコードするＨ
ｉｎｄIII 断片をベクターｐＰＡＨＮ（ベクターｐＡＡ
Ｈ５ＮのＡＤＨプロモーター、ターミネーターのかわり
にＧＡＰプロモーター、ターミネーター（特開昭６３−
１１２９８６に記載）を含む）のＧＡＰプロモーター、
ターミネーターの間に挿入することによりｐＰＲを得
た。ｐＰＲをＮｏｔＩで部分消化して得られたＤＮＡ断
片とｐＧＸから得られたＮｏｔＩ断片とのリガーゼ反応
を行うことによりＡＤＲ、ＡＤＸ同時発現プラスミドｐ
ＲＸ５を得た。次にｐＲＸ５をＮｏｔＩで部分消化し、
ｐＡＭＳ２５より得たＮｏｔＩ断片（３．７ｋｂ）を連
結することによりキメラＰ４５０C25 、ＡＤＸおよびＡ
ＤＲ同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５を得た。
記載）をコードするＨｉｎｄIII 断片をベクターｐＧＡ
ＨＮ（ベクターｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター、タ
ーミネーターのかわりにＰＧＫプロモーター、ターミネ
ーターを含む）のＰＧＫプロモーター、ターミネーター
（特願平２−１３６４９６に記載）の間に挿入すること
により発現プラスミドｐＧＸを得た。また、成熟型ＡＤ
Ｒ（特開昭６３−１１２９８６に記載）をコードするＨ
ｉｎｄIII 断片をベクターｐＰＡＨＮ（ベクターｐＡＡ
Ｈ５ＮのＡＤＨプロモーター、ターミネーターのかわり
にＧＡＰプロモーター、ターミネーター（特開昭６３−
１１２９８６に記載）を含む）のＧＡＰプロモーター、
ターミネーターの間に挿入することによりｐＰＲを得
た。ｐＰＲをＮｏｔＩで部分消化して得られたＤＮＡ断
片とｐＧＸから得られたＮｏｔＩ断片とのリガーゼ反応
を行うことによりＡＤＲ、ＡＤＸ同時発現プラスミドｐ
ＲＸ５を得た。次にｐＲＸ５をＮｏｔＩで部分消化し、
ｐＡＭＳ２５より得たＮｏｔＩ断片（３．７ｋｂ）を連
結することによりキメラＰ４５０C25 、ＡＤＸおよびＡ
ＤＲ同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５を得た。
【００１０】実施例２ 発現プラスミドによる酵母の形
質転換 サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２（ＡＴＣＣ ３８
６２６）を、５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２
％ポリペプトン、２％グルコース）中で３０℃、１８時
間培養したのち、１ｍｌの酵母培養液を遠心分離し、集
菌した。菌体を、０．２Ｍ ＬｉＣｌ溶液１ｍｌで洗浄
したのち、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液２０μｌに懸濁した。こ
れに、７０％ポリエチレングリコール４０００溶液３０
μｌ、発現プラスミドｐＡＭＳ２５溶液１０μｌ（約１
μｇＤＮＡ）を添加して、充分に混合したのち、３０℃
で１時間インキュベートした。ついで、１４０μｌの水
を加えＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、０．６
７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ｍｌヒスチジ
ン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキュベー
トすることにより、プラスミドを保持する形質転換体を
得た。
質転換 サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２（ＡＴＣＣ ３８
６２６）を、５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２
％ポリペプトン、２％グルコース）中で３０℃、１８時
間培養したのち、１ｍｌの酵母培養液を遠心分離し、集
菌した。菌体を、０．２Ｍ ＬｉＣｌ溶液１ｍｌで洗浄
したのち、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液２０μｌに懸濁した。こ
れに、７０％ポリエチレングリコール４０００溶液３０
μｌ、発現プラスミドｐＡＭＳ２５溶液１０μｌ（約１
μｇＤＮＡ）を添加して、充分に混合したのち、３０℃
で１時間インキュベートした。ついで、１４０μｌの水
を加えＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、０．６
７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ｍｌヒスチジ
ン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキュベー
トすることにより、プラスミドを保持する形質転換体を
得た。
【００１１】実施例３ キメラＰ４５０Ｃ２５の生産 実施例３で得たＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株、ＡＨ２２／
ｐＲＸＭＳ２５株およびコントロールＡＨ２２／ｐＡＡ
Ｈ５株を合成培地（８％ グルコース、５．４％ 酵母
窒素源アミノ酸不含、１６０μｇ／ｍｌ ヒスチジン）
３００ｍｌでそれぞれ約２×１０７細胞／ｍｌまで培養
し、集菌後１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）
で洗浄したのち、同緩衝液２ｍｌに懸濁した。２本のキ
ュベットに菌懸濁液を１ｍｌずつ分注し、サンプル側キ
ュベットに一酸化炭素を吹き込んだのち、両キュベット
にジチオナイト５〜１０ｍｇを添加した。よく攪拌した
のち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを測定し、Δε
（４５０ｎｍ−４９０ｎｍ）＝９１ｍＭ−１ｃｍ−１を
もとにしてヘム含有Ｐ４５０量を算出した。その結果、
ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５および、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ
２５株は、それぞれ菌体あたり２×１０５分子および１
×１０５分子のヘム含有Ｐ４５０を産生することが判明
した。それに対して、コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ
５株ではヘム含有Ｐ４５０の産生は認められなかった。
ｐＲＸＭＳ２５株およびコントロールＡＨ２２／ｐＡＡ
Ｈ５株を合成培地（８％ グルコース、５．４％ 酵母
窒素源アミノ酸不含、１６０μｇ／ｍｌ ヒスチジン）
３００ｍｌでそれぞれ約２×１０７細胞／ｍｌまで培養
し、集菌後１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）
で洗浄したのち、同緩衝液２ｍｌに懸濁した。２本のキ
ュベットに菌懸濁液を１ｍｌずつ分注し、サンプル側キ
ュベットに一酸化炭素を吹き込んだのち、両キュベット
にジチオナイト５〜１０ｍｇを添加した。よく攪拌した
のち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを測定し、Δε
（４５０ｎｍ−４９０ｎｍ）＝９１ｍＭ−１ｃｍ−１を
もとにしてヘム含有Ｐ４５０量を算出した。その結果、
ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５および、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ
２５株は、それぞれ菌体あたり２×１０５分子および１
×１０５分子のヘム含有Ｐ４５０を産生することが判明
した。それに対して、コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ
５株ではヘム含有Ｐ４５０の産生は認められなかった。
【００１２】実施例４ 酵母のミクロソーム画分におけ
るビタミンＤ3 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 ２５位
水酸化活性およびＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株菌体から調製したミクロソー
ム画分を用いて、活性を測定した。形質転換酵母菌株か
らの細胞分画は以下の方法に従った。形質転換体の約２
×１０7 菌体／ｍｌ培養液から約４×１０10菌体分を集
菌し、ザイモリアーゼ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２．０Ｍソルビトール、０．１ｍＭ
ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍ
ｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ）に懸濁し、３０℃で
１時間インキュベートしてスフェロプラストを調製し
た。これをソニケーションバッファー（１０ｍＭ トリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．６５Ｍ ソルビトール、
０．１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ ペプ
スタチン）に懸濁し、テフロンホモジナイザーでホモジ
ナイズすることにより菌体を破砕した。
るビタミンＤ3 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 ２５位
水酸化活性およびＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株菌体から調製したミクロソー
ム画分を用いて、活性を測定した。形質転換酵母菌株か
らの細胞分画は以下の方法に従った。形質転換体の約２
×１０7 菌体／ｍｌ培養液から約４×１０10菌体分を集
菌し、ザイモリアーゼ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２．０Ｍソルビトール、０．１ｍＭ
ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍ
ｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ）に懸濁し、３０℃で
１時間インキュベートしてスフェロプラストを調製し
た。これをソニケーションバッファー（１０ｍＭ トリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．６５Ｍ ソルビトール、
０．１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ ペプ
スタチン）に懸濁し、テフロンホモジナイザーでホモジ
ナイズすることにより菌体を破砕した。
【００１３】３０００×ｇ、５分間の遠心分離により、
沈澱１を取り除き、上清１’を得た。沈澱１をソニケー
ションバッファーに懸濁し再度ホモジナイズしたのち、
３０００×ｇ、５分間遠心分離し沈澱１（未破砕菌体・
核画分）および上清１”を得た。上清１’および１”を
併せて上清１とし、１０，０００×ｇ、２０分間遠心分
離し、沈澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。
上清２をさらに１２０，０００×ｇ、７０分間遠心分離
し、沈澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質画
分）に分けた。各画分の還元型ＣＯ結合差スペクトルを
測定したところ、約８０％のキメラＰ４５０Ｃ２５がミ
クロソーム画分に存在したため、ミクロソーム画分を用
いて活性を測定した。以下に示す反応系（２ｍｌ）のう
ちＮＡＤＰＨ以外を混合し、３７℃で５分間インキュベ
ートした後、ＮＡＤＰＨを添加し、反応を開始した。１
０、３０分後、反応液０．５ｍｌを分取し、５ｍｌのベ
ンゼンを添加し、遠心分離により得られたベンゼン層を
乾固し、以下に示した条件下でＨＰＬＣにより分析し
た。
沈澱１を取り除き、上清１’を得た。沈澱１をソニケー
ションバッファーに懸濁し再度ホモジナイズしたのち、
３０００×ｇ、５分間遠心分離し沈澱１（未破砕菌体・
核画分）および上清１”を得た。上清１’および１”を
併せて上清１とし、１０，０００×ｇ、２０分間遠心分
離し、沈澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。
上清２をさらに１２０，０００×ｇ、７０分間遠心分離
し、沈澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質画
分）に分けた。各画分の還元型ＣＯ結合差スペクトルを
測定したところ、約８０％のキメラＰ４５０Ｃ２５がミ
クロソーム画分に存在したため、ミクロソーム画分を用
いて活性を測定した。以下に示す反応系（２ｍｌ）のう
ちＮＡＤＰＨ以外を混合し、３７℃で５分間インキュベ
ートした後、ＮＡＤＰＨを添加し、反応を開始した。１
０、３０分後、反応液０．５ｍｌを分取し、５ｍｌのベ
ンゼンを添加し、遠心分離により得られたベンゼン層を
乾固し、以下に示した条件下でＨＰＬＣにより分析し
た。
【００１４】 ［反応系］ １．ミクロソーム画分：ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株（0.8 nmol キメラ体P450C25 /5 .3 mg 蛋白質を含む） ＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株 （5.3 mg 蛋白質を含む） ２．ウシ副腎アドレノドキシン還元酵素 0.8 nmol ３．アドレノドキシン 8.0 nmol ４．基質 終濃度 200 μＭ ５．ＮＡＤＰＨ 終濃度 1.0 〜2.0 mM ６．Tris-HCl (pH 7.8) 100.0 mM ７．ＥＤＴＡ 0.5 〜1.0 mM ［ＨＰＬＣ分析条件］ カラム ：μBondapakC18（φ 4 × 300 mm） 検出 ：Ａ265 (ヒ゛タミン D3, 1 α-ヒト゛ロキシヒ゛タミンD3), 放射性検出器 (3H-THC) 流速 ：1.0 ml/min 温度 ：50 ℃ 溶出条件 0〜 5分 80 % 5〜15分 80 % 〜 100 %の直線濃度勾配 15〜25分 100 %
【００１５】ビタミンＤ3 、および１α−ヒドロキシビ
タミンＤ3 を基質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５
株ミクロソーム画分において、２５位水酸化物の産生が
認められた。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では
２５位水酸化物への変換は認められず、ＡＨ２２／ｐＡ
ＭＳ２５株における２５位水酸化活性がキメラ体Ｐ４５
０C25 に依存することが示唆された。ＡＤＲ，ＡＤＸ無
添加の場合、活性を示さないことから、ミクロソーム膜
に存在するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素からは電子が
伝達されないことがわかった。また、ＮＡＤＰＨ無添加
では活性を示さず、ＮＡＤＰＨ、ＡＤＸ、ＡＤＲ添加時
に形成されるＮＡＤＰＨ→ＡＤＲ→ＡＤＸ→キメラ体Ｐ
４５０C25 という電子伝達系の構築にともなって、モノ
オキシゲナーゼ活性が発揮されたと思われる。
タミンＤ3 を基質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５
株ミクロソーム画分において、２５位水酸化物の産生が
認められた。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では
２５位水酸化物への変換は認められず、ＡＨ２２／ｐＡ
ＭＳ２５株における２５位水酸化活性がキメラ体Ｐ４５
０C25 に依存することが示唆された。ＡＤＲ，ＡＤＸ無
添加の場合、活性を示さないことから、ミクロソーム膜
に存在するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素からは電子が
伝達されないことがわかった。また、ＮＡＤＰＨ無添加
では活性を示さず、ＮＡＤＰＨ、ＡＤＸ、ＡＤＲ添加時
に形成されるＮＡＤＰＨ→ＡＤＲ→ＡＤＸ→キメラ体Ｐ
４５０C25 という電子伝達系の構築にともなって、モノ
オキシゲナーゼ活性が発揮されたと思われる。
【００１６】反応時間１０分において算出された代謝回
転速度は７．４ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎであ
り、ＡＨ２２／ｐＡＣ２５株（特願２−２５８２６２）
のミトコンドリア画分において得られた代謝回転速度
０．１４ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎに比べて約５
０倍高いことがわかった。また、ビタミンＤ３に対する
２５位水酸化活性は０．２８ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／
ｍｉｎであった。〔３Ｈ〕−ＴＨＣを基質とした場合、
ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株ミクロソーム画分は、ＴＨＣ
２７位水酸化体（ＴｅＨＣ）への変換が検出された。コ
ントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では活性が認められ
ず、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株における活性がキメラＰ
４５０Ｃ２５に依存することが示唆された。反応時間１
０分において算出されたＴＨＣに対する代謝回転速度は
２３ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎであった。
転速度は７．４ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎであ
り、ＡＨ２２／ｐＡＣ２５株（特願２−２５８２６２）
のミトコンドリア画分において得られた代謝回転速度
０．１４ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎに比べて約５
０倍高いことがわかった。また、ビタミンＤ３に対する
２５位水酸化活性は０．２８ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／
ｍｉｎであった。〔３Ｈ〕−ＴＨＣを基質とした場合、
ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株ミクロソーム画分は、ＴＨＣ
２７位水酸化体（ＴｅＨＣ）への変換が検出された。コ
ントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では活性が認められ
ず、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株における活性がキメラＰ
４５０Ｃ２５に依存することが示唆された。反応時間１
０分において算出されたＴＨＣに対する代謝回転速度は
２３ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎであった。
【００１７】実施例５ ３者同時発現株ＡＨ２２／ｐＲ
ＸＭＳ２５株におけるＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株の培養液 (1.6 × 107菌体
/ml)に終濃度１０μＭになるように［ 3Ｈ］−ＴＨＣを
添加し、１４時間後の培養液１ｍｌを分取し、ジクロロ
メタン２ｍｌにより抽出し、ジクロロメタン層を乾固し
た後８０μｌのアセトニトリルに溶解し、そのうち５０
μｌをＨＰＬＣにより実施例４に記述した条件で分析し
た。但し、検出は放射活性検出装置（パッカード社 Ｔ
ＲＡＣＥ７１４０）を用いた。その結果、添加した基質
ＴＨＣの１９％がＴｅＨＣに変換したことが分かった。
この変換はコントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株には見
られなかったことから、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株に
おいてキメラＰ４５０C25、ＡＤＸおよびＡＤＲが酵母
細胞内で電子伝達系を構成し、モノオキシゲナーゼ活性
を発揮したことが分かった。
ＸＭＳ２５株におけるＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株の培養液 (1.6 × 107菌体
/ml)に終濃度１０μＭになるように［ 3Ｈ］−ＴＨＣを
添加し、１４時間後の培養液１ｍｌを分取し、ジクロロ
メタン２ｍｌにより抽出し、ジクロロメタン層を乾固し
た後８０μｌのアセトニトリルに溶解し、そのうち５０
μｌをＨＰＬＣにより実施例４に記述した条件で分析し
た。但し、検出は放射活性検出装置（パッカード社 Ｔ
ＲＡＣＥ７１４０）を用いた。その結果、添加した基質
ＴＨＣの１９％がＴｅＨＣに変換したことが分かった。
この変換はコントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株には見
られなかったことから、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株に
おいてキメラＰ４５０C25、ＡＤＸおよびＡＤＲが酵母
細胞内で電子伝達系を構成し、モノオキシゲナーゼ活性
を発揮したことが分かった。
【００１８】本発明により提供される形質転換酵母は分
子内にヘムを含有するキメラＰ４５０Ｃ２５を産生す
る。キメラＰ４５０Ｃ２５は酵母のミクロソーム膜に局
在し、ウシ副腎ＡＤＸおよびＡＤＲの添加によりビタミ
ンＤ３および１α−ヒドロキシビタミンＤ３に対して２
５位水酸化活性を示し、ＴＨＣに対し２７位水酸化活性
を示した。本来、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５はミトコンド
リア内膜に存在するタンパク質であるが、ミトコンドリ
アへの輸送シグナルを除去し、ミクロソーム型のウシ副
腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミノ酸残基（ミクロソ
ーム膜へのシグナルとして機能する）を付加することに
より、酵母細胞内局在性をミトコンドリアからミクロソ
ームへ変換することができた。このような膜酵素の局在
性の変換はこれまでに例がない。ウシ副腎Ｐ４５０１７
αのＮ末端１５アミノ酸残基は疎水性が高く、ミクロソ
ーム膜へのシグナルの役割を果たしていると考えられる
が、シグナルとしての特殊性はなく、他のミクロソーム
膜タンパク質のシグナルとの代替も可能である。
子内にヘムを含有するキメラＰ４５０Ｃ２５を産生す
る。キメラＰ４５０Ｃ２５は酵母のミクロソーム膜に局
在し、ウシ副腎ＡＤＸおよびＡＤＲの添加によりビタミ
ンＤ３および１α−ヒドロキシビタミンＤ３に対して２
５位水酸化活性を示し、ＴＨＣに対し２７位水酸化活性
を示した。本来、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５はミトコンド
リア内膜に存在するタンパク質であるが、ミトコンドリ
アへの輸送シグナルを除去し、ミクロソーム型のウシ副
腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミノ酸残基（ミクロソ
ーム膜へのシグナルとして機能する）を付加することに
より、酵母細胞内局在性をミトコンドリアからミクロソ
ームへ変換することができた。このような膜酵素の局在
性の変換はこれまでに例がない。ウシ副腎Ｐ４５０１７
αのＮ末端１５アミノ酸残基は疎水性が高く、ミクロソ
ーム膜へのシグナルの役割を果たしていると考えられる
が、シグナルとしての特殊性はなく、他のミクロソーム
膜タンパク質のシグナルとの代替も可能である。
【００１９】シグナルの置換に基づく膜酵素の局在性を
ミトコンドリアからミクロソームへ変化させることによ
り、酵母菌体あたりのＰ４５０Ｃ２５産生量は約１０倍
に、またＰ４５０分子あたりの１α−ヒドロキシビタミ
ンＤ３２５位水酸化活性を約５０倍に上昇させることが
できた。したがって、菌体あたりの１α−ヒドロキシビ
タミンＤ３２５位水酸化能は約５００倍に上昇したこと
になる。キメラＰ４５０Ｃ２５をバイオリアクターとし
て用いることにより、カルシウムの代謝調節、細胞分化
促進や細胞性免疫機能を調節に重要な役割を果たし、骨
粗そう症、慢性腎不全、ビタミンＤ抵抗性クル病などの
治療に有効である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
３を製造することが可能である。
ミトコンドリアからミクロソームへ変化させることによ
り、酵母菌体あたりのＰ４５０Ｃ２５産生量は約１０倍
に、またＰ４５０分子あたりの１α−ヒドロキシビタミ
ンＤ３２５位水酸化活性を約５０倍に上昇させることが
できた。したがって、菌体あたりの１α−ヒドロキシビ
タミンＤ３２５位水酸化能は約５００倍に上昇したこと
になる。キメラＰ４５０Ｃ２５をバイオリアクターとし
て用いることにより、カルシウムの代謝調節、細胞分化
促進や細胞性免疫機能を調節に重要な役割を果たし、骨
粗そう症、慢性腎不全、ビタミンＤ抵抗性クル病などの
治療に有効である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
３を製造することが可能である。
【００２０】また、キメラＰ４５０Ｃ２５、ＡＤＸおよ
びＡＤＲの同時発現株菌体をバイオリアクターとして用
いることは現在行われている活性型ビタミンＤ３の複雑
な化学合成法を単純化するのに有効な手段であると考え
られる。一方、大量に産生されるキメラＰ４５０Ｃ２５
は容易に精製することができ、これに対する抗体を脳腱
黄色腫症の診断薬として利用することができる。
びＡＤＲの同時発現株菌体をバイオリアクターとして用
いることは現在行われている活性型ビタミンＤ３の複雑
な化学合成法を単純化するのに有効な手段であると考え
られる。一方、大量に産生されるキメラＰ４５０Ｃ２５
は容易に精製することができ、これに対する抗体を脳腱
黄色腫症の診断薬として利用することができる。
【００２１】
【図１】本発明の発現プラスミドｐＡＭＳ２５の構築工
程の説明図である。制限酵素切断部位は、Ｅ：ＥｃｏＲ
Ｉ，Ｎｃ：ＮｃｏＩ，Ｓ：ＳａｃＩ，Ｈ：ＨｉｎｄIII,
Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
程の説明図である。制限酵素切断部位は、Ｅ：ＥｃｏＲ
Ｉ，Ｎｃ：ＮｃｏＩ，Ｓ：ＳａｃＩ，Ｈ：ＨｉｎｄIII,
Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
【図２】発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築工程の説
明図である。制限酵素切断部位は、Ｈ：ＨｉｎｄIII 、
Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
明図である。制限酵素切断部位は、Ｈ：ＨｉｎｄIII 、
Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/02 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (10)
- 【請求項１】ウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミ
ノ酸からなるシグナル配列をＮ末端に有し、５０１アミ
ノ酸残基からなる成熟型のラット肝Ｐ４５０Ｃ２５をＣ
末端に有するキメラＰ４５０を酵母内で発現させるプラ
スミド - 【請求項２】下の制限酵素地図て表されるｐＡＭＳ２５
- 【請求項３】請求項１記載のプラスミドを保持する酵母
菌株 - 【請求項４】請求項２記載のｐＡＭＳ２５を保持する酵
母菌株 - 【請求項５】請求項２記載のｐＡＭＳ２５を保持するサ
ッカロミセス・セレビシエＡＨ２２ - 【請求項６】ウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミ
ノ酸からなるシグナル配列をＮ末端に有し、５０１アミ
ノ酸残基からなる成熟型のラット肝Ｐ４５０Ｃ２５をＣ
末端に有するキメラＰ４５０ - 【請求項７】請求項３記載の酵母菌株により生産される
キメラＰ４５０ - 【請求項８】請求項４記載の酵母菌株により生産される
キメラＰ４５０ - 【請求項９】請求項５記載の酵母菌株により生産される
キメラＰ４５０ - 【請求項１０】ウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５ア
ミノ酸からなるシグナル配列をＮ末端に有し、５０１ア
ミノ酸残基からなる成熟型のラット肝Ｐ４５０Ｃ２５を
Ｃ末端に有するキメラＰ４５０遺伝子
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3120123A JP2500543B2 (ja) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | キメラｐ４５０産生菌株 |
| DE69122016T DE69122016T2 (de) | 1990-09-26 | 1991-09-26 | Mitochondriales P450 |
| EP91116485A EP0477961B1 (en) | 1990-09-26 | 1991-09-26 | Mitochondrial P450 |
| US08/702,795 US5668000A (en) | 1990-09-26 | 1996-08-26 | Mitochondrial P450 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3120123A JP2500543B2 (ja) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | キメラｐ４５０産生菌株 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6190653A Division JP2517894B2 (ja) | 1994-08-12 | 1994-08-12 | フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349887A JPH04349887A (ja) | 1992-12-04 |
| JP2500543B2 true JP2500543B2 (ja) | 1996-05-29 |
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ID=14778537
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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-
1991
- 1991-05-24 JP JP3120123A patent/JP2500543B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH04135486A (ja) * | 1990-09-26 | 1992-05-08 | Sumitomo Chem Co Ltd | キメラｐ４５０発現プラスミド及び該プラスミドを保持する酵母菌株 |
Also Published As
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| JPH04349887A (ja) | 1992-12-04 |
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