JPH04135486A - キメラｐ４５０発現プラスミド及び該プラスミドを保持する酵母菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、ラット肝ミトコンドリアＰ４５０Ｃ２５をコ
ードする遺伝子および該酵素を大量生産するための発現
プラスミド、該発現プラスミドを保持する酵母菌株、該
酵母を培養することによる該酵素の生産方法、および該
酵母を用いることによる５β−コレスタン−３α、７α
、１２α、２７−テトロール（以下、ＴｅＨＣと略す３
）およびＩα、２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ、の製造方
法に関する。本発明により得られる酵母菌株は、ラット
Ｐ４５０ｃｚｓを大量に生産している。該酵母菌株によ
り生産した該酵素と、フェレドキシンおよびＮＡＤＰＨ
−フェリトキシン還元酵素とを用い、医薬品として存■
なステロイド類、活性型ビタミンＤ３などを合成できる
。

〈従来技術〉 Ｐ２Ｓ５は微生物から哺乳動物にいたるまで広く生物界
に存在するヘムタンパク質であり、電子伝達系の末端酵
素として種々の脂溶性化合物を基質として１原子酸素添
加反応を触媒する。末端酵素であるＰ４５０分子種が多
様であり、それぞれが異なる基質特異性を示すので、非
常に広範囲の脂溶性化合物を水酸化することができる。

哺乳動物のＰ４５０依存性電子伝達系はその構成酵素か
ら、ミクロソーム型とミトコンドリア型に分けられる。

前者では、フラビンアデニンジヌクレオチドとフラビン
モノヌクレオチドを分子内に補酵素として含有するＮＡ
ＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素（還元酵素）がＮ
ＡＤＰＨからの電子をＰ２Ｓ５へ供給し、後者では、フ
ラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素として分子内に
含有するＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素、および
非ヘム鉄を補酵素として分子内に含有するフェレドキシ
ンがＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給することに
より、種々の脂溶性基質に対して水酸化反応を触媒する
。

本発明者らはすでに、数種のミクロソーム型Ｐ４５０及
び還元酵素を酵母内で生産させ、それらの組換え体酵母
菌株を用いることにより工学的に有用な水酸化反応を行
うことに成功した。すなわち、ラット肝Ｐ４５０ＭＣ遺
伝子、ウシ副腎Ｐ　４５０１７（１！遺伝子やＰ４５０
ｃｓ＋遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺伝子を含む
発現プラスミドを作製し、これら発現プラスミドで酵母
を形質転換することにより、該酵素を産生ずる酵母菌株
を得た（特開昭６１−５６０７２、特開平１−４．７，
３８０、特願昭６３−１８１５７１）。これらの酵母菌
株はそれぞれのＰ４５０分子種に依存したｌ原子酸素添
加活性を示した。

また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵素遺伝子を
単離し、Ｐ４５０還元能を有する該酵素の酵母内発現に
成功した（特開昭６２＝１９０８５、特願昭６３−２０
２７８５）。さらに、発明者らは、Ｐ２Ｓ５と還元酵素
の両酵素を産生ずる酵母菌株（特開昭６２−１０４５８
２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持つ新規モノオキ
シゲナーゼの作出に成功した（特開昭６３−４４８８８
、特願昭６３−１７３７６１、特願平１−７１２５０）
。以上のような技術により、本発明者らはこれらＰ４５
０産生酵母菌株を用いて、医薬品として有用なアセトア
ミノフェンやステロイドホルモン中間体の合成を可能に
した。ラット肝Ｐ４５０□５はミトコンドリア型Ｐ４５
０分子種の一つで、５３３アミノ酸からなる前駆体とし
て細胞質で合成されたのち、そのアミノ末端部分に存在
する移行シグナルが認識され、ミトコンドリア内膜へ取
り込まれ、５０１アミノ酸からなる成熟型（分子量的５
７ｋＤ）になる。ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５遺伝子は、プ
ラスミドｐ　ＬＭＴ　２５　（Ｕｓｕｉｅｔ　ａｔ、、
　（１９９０）　ＦＥＢＳ　２６２．１３５−１３８　
）から単離できる。

〈発明が解決しようとする課題〉 ミトコンドリア型Ｐ４５０依存性の１原子酵素添加活性
を発揮する酵母菌株を創成すると、コレステロールを出
発物質としてこれらのステロイドホルモンの合成を行な
うことが可能になる。また、ミトコンドリア型Ｐ４５０
分子種の関与する生体反応は生理的に重要な化合物、例
えば活性型ビタミンＤ３などの合成反応が多く、ミトコ
ンドリア型Ｐ４５０分子種を産生ずる酵母菌株の創成は
産業上応用可能性が高い。しかし、これまでに活性を示
すミトコンドリア型Ｐ４５０を酵母で発現させた例はな
い。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者らは、酵母菌株で活性型ラット肝Ｐ４５０ｃ２
５を発現させるために誠意努力の結果、本発明を完成す
るに至った。

ラット肝Ｐ　４５０　ｅｚｓ遺伝子を酵母アルコール脱
水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子のプロモーターの下流に結合
し、発現プラスミドを構築した。その結果、このプラス
ミドにより形質転換した、酵母菌株はラット肝Ｐ４５０
ｅ！ｓを産生した。さらに、本発明らは、５３３アミノ
酸からなるラット肝Ｐ４５０ｃ２５前駆体およびラット
肝Ｐ４５０ｃａ５のミトコンドリア内膜に取り込まれる
ために必要な移行シグナル部分を酵母チトクロムＣ酸化
酵素サブユニットＩＶ　（ＣＯＶ■）のものに置換した
ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５改変型１　（以下ラット肝Ｐ４
５０ｃ２ｉ改変型１と記載する３）を酵母で発現させる
プラスミドを構築した。これらのプラスミドにより形質
転換した酵母のヘム含有Ｐ４５０゜２．産生は確認され
た。さらに、これらの形質転換酵母菌株から部分精製し
たＰ４５０ｃ２゜は、ウシ副腎アドレノドキシン（以下
、ＡＤＸと略す）およびウシ副腎ＮＡＤＰＨ−アドレノ
ドキシン還元酵素（以下、ＡＤＨと略す）と共役させる
ことにより、ＴＨＣあるいは１α−ＯＨ−ビタミンＤ３
からＴｅＨＣあるいは１　ａ、２５　　（ＯＨ）２　ビ
タミンＤ３をそれぞれ生成することができた。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明に用いるラット肝Ｐ４５０ｃ＋＋ｓをコードする
ｃＤＮＡはすでに公知であり、通常の操作法でこれを単
離することができる。本発明のＰ４５０ｃ２５を発現す
る発現プラスミドはラット肝Ｐ４５０ｃａｓ遺伝子を酵
母アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ，）遺伝子のプロモー
ターおよび同ターミネータ−を保持する酵母発現ベクタ
ーｐ　Ａ　Ａ　Ｈ５（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、　１０１．　ｐａｒｔＣ，ｐ１９２−２
０１）に挿入することに−８＝ より構築することがてきる。宿主としてサッカロミセス
・セレビシエＡＨ２２株が望ましい。ラット肝Ｐ　４５
０　ｃｔｓ遺伝子を含む発現プラスミドによる宿主酵母
の形質転換は、アルカリ金属（ＬｉＣ１）を用いる方法
、プロトプラスト法なと公知の方法で行うことができる
。このようにして得られた形質転換酵母菌体を培養する
ことによりラット肝Ｐ４５０ｃｚ、を製造することかて
きる。本発明により得られる形質転換酵母の培養は通常
の培養方法により行うことかできる。

〈実施例〉 以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明する。

本発明は実施例のみに限定されるものではな（、本発明
の技術分野における通常の変更をすることかできる。

実施例１　発現プラスミドｐＡＣ２５の構築以下の実施
例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカリホスファ
ターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、Ｄ、ＮＡリガーゼに
よるＤＮＡの結合なとの反応は、特に断らない限り、通
常２０〜２００μｌの反応容積を用いて、これらの酵素
類を市販するメーカー（例えば、宝酒造（株））が製品
に添付した反応条件で実施した。ラット肝Ｐ４５０Ｃ２
５発現プラスミドｐＡＣ２５を第１図に示すように構築
した。

ラット肝Ｐ４５０ｃｘｓ遺伝子を含むプラスミドｐＬＭ
Ｔ　２５　（Ｕｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９９０）
　ＦＢＢＳ　２６２．　１３５−１３８）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩと５ａｃｌで同時消化し、Ｐ２Ｓ５゜２．アミ
ノ末端側の領域を含む約３２０ｂｐのＥｃｏＲＩ−３ａ
ｃＩ断片と、カルボキシ末端側の領域を含む約１５８０
ｂｐの５ａｃｌ−ＥｃｏＲＩ断片を低融点アガロースゲ
ル電気泳動により回収した。これらの断片を市販のベク
タープラスミドｐＵＣ１９のＢｃｏＲＩＳＳａｃＩ部位
にサブクローニングし、それぞれｐＵＣ２５Ｎおよびｐ
ＵＣ２５Ｇを得た。ｐＵＣ２５ＮをＥｃｏＲＩ、Ｎｃｏ
ｌで同時消化して得られる約２８８０ｂｐの断片と合成
リンカ−ＬＣ２５２： ＧＡＣＴＣＴＡＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＧＡＧ
ＣＡＣＡＣＴＡＣＣＣＧＧＴＡＣ５（左右両端にそれぞ
れＥｃｏＲＩ、Ｎｃｏ　Ｔ認識部位を持ち、内側にＨｉ
ｎｄｌｌＩ認識部位を持つ）とのりガーゼ反応を行い、
大腸菌ＨＢ　１０１株を形質転換した。得られた形質転
換体から、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙの方法に従い、
プラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素消化による解析を
行い、合成リンカ−が挿入された目的のプラスミドを得
た。さらに塩基配列を決定することにより、合成リンカ
一部分の配列を確認し、得られたプラスミドをｐＵ０２
５ＮＨとした。

一方、Ｐ４５０ｃｍｇカルボキシ末端側の領域を含むｐ
　Ｕ　Ｃ２５ＣをＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで同時消化して
得られる約４ｋｂの断片と、市販のＨｉｎｄｌ［リンカ
−とのりガーゼ反応を行い、大腸菌ＨＢＩＯ１株を形質
転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
Ｐ２Ｓ５゜、５の３′非翻訳領域にＨｉｎｄＩ１１部位
が作出されたプラスミドをｐＵＣ２５ＯＨとした。

ｐＵＣ２５ＮＨおよびｐＵＣ２５ＣＨをＨｉ　ｎｄ■、
５ａｃｌで同時消化して得られるそれぞれ約２７０ｂｐ
および１３７０ｂｐの断片と、市販のべり一　１１− タープラスミドｐＵｃ１８をＨｉｎｄＩ［［消化しアル
カリホスファターゼ処理を施したものとのりガーゼ反応
を行ったのち、大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換した。形
質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＵＣ２５Ｎ
ＨおよびｐＵＣ２５ＣＨ由来のＤＮＡ断片を一つずつ含
むプラスミドをｐＵＣ２５Ｈとした。ｐＵＣ２５ＨをＨ
ｉｎｄＩ［Ｉ消化し、ラット肝Ｐ４５０　Ｃ２５前駆体
をコードする約１６４０ｂｐのＣＤＮＡ断片を調製し、
この断片と、ＨｉｎｄＩ［［消化後アルカリホスファタ
ーゼ処理を施した酵母発現ベクターｐＡＡＨ５Ｎ　（特
願昭６３−２０２７８５）とのりガーゼ反応を行った後
、大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換した。形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ構造を確認し、ラッ
ト肝Ｐ４５０゜、６遺伝子がＡＤＨプロモーターとター
ミネータ−に対して、順方向に挿入されたプラスミドを
ｐＡＣ２５とした。

−ｌ　２− タンパク質を酵母で発現させる場合に、そのシグナルペ
プチド部分を酵母チトクロムＣ酸化酵素サブユニット■
（以下、Ｃ０ＸＩＶと略す）のものに置換すると発現量
が著しく増加することを見いだしている（特願平２−１
３６４９６）。そこで、酵母ミトコンドリアでラット肝
Ｐ４５０゜２．を安定に高発現させることを目的として
、そのシグナル部分をＣＯＸ■のものに置換したプラス
ミドｐＡＣＣ２５３を第２図に示すように構築した。

ラット肝Ｐ４５０ｏｓｓのアミノ末端側遺伝子を含むプ
ラスミドｐＵＣ２５ＮをＰｓｔｌ、５ａｃＩで同時消化
し、約１５　ｏｂｐの断片を回収した。この断片と合成
リンカ−ＬＣ２５３＋ 実施例２　発現プラスミドｐＡＣＣ２５３の構築ＡＡＧ
ＴＣＧＴＴＴＴＴＧＧＧＣＧＣＴＡＧＧＧ　　５本発明
者らはすでに、ウシ副腎ミトコンドリアの（左右両端に
それぞれＨｉｎｄｌ［、Ｐｓｔｌ認識部位を持つ）およ
び市販のベクターｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩ［［−３ａｃ
Ｉ断片とのりガーゼ反応を行い、大腸菌Ｈ８１０１株を
形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、制限酵素消化により解析し、断片および合成リンカ
−が挿入された目的のプラスミドを得た。さらに、塩基
配列を決定することにより、合成リンカ一部分の配列を
確認し、得られたプラスミドをＩ）ＢＳＣＣ２５３とし
た。このプラスミドと上述のプラスミドｐＵＣ２５ＣＨ
をＨｉｎｄＩ［，５ａｃＩで同時消化し、Ｃ０ＸＩＶの
シグナルペプチドおよびＰ４５０ｃ２５アミノ末端部分
をコードする遺伝予断′片（約２６０ｂＩ））とＰ４５
０Ｃ２６カルポキシ末端部分をコードする遺伝子断片（
約１３７０ｂｐ）をそれぞれ回収した。これらの断片と
市販のベクタープラスミドｐＵｃ１Ｂ−Ｈｉｎｄ■断片
とのトリプルライゲーションを行い、大腸菌Ｈ８１０１
株を形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調製し、制限酵素消化により解析し、両断片が挿入され
たプラスミドｐＵＣＣ２５３Ｈを得た。ｐＵＣＣ２５３
ＨをＨｉｎｄＩＩＩ消化し、約１６３　ｏｂｐのラット
肝Ｐ４５０ｃ２６改変型１ｃＤＮＡ断片を調製し、これ
と、ＨｉｎｄＩ［消化後アルカリホスファターゼ処理を
施した酵母発現ベクターｐＡＡＨ５Ｎ（特願昭６３−２
０２７８５）とのりガーゼ反応を行ったのち、大腸菌Ｈ
８１０１株を形質転換した。形質転換体から調製したプ
ラスミドＤＮＡの構造を制限酵素消化により確認し、ラ
ット肝Ｐ４５０　ｃｓｓ改変改変型造伝子がＡＤＨプロ
モーターとターミネータ−に対して順方向に挿入された
プラスミドをｐＡＣＣ２５３とした。

実施例３　発現プラスミドによる酵母の形質転換サッカ
ロミセス・セレビシエＡＨ，２２（ＡＴＣＣ３８６２６
）　　［００１株（ミトコンドリア様のオルガネラは存
在するが、ミトコンドリアＤＮＡを持たない株）、［ρ
＋］株（正常なミトコンドリアおよび、そのＤＮＡを持
つ）を、５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポ
リペプトン、２％グルコース）中で３０℃、１８時間培
養したのち、１ｍｌの酵母培養液を遠心分離し、集菌し
た。菌体を、　　０２ＭＬｉＣｌ！溶液ｌ−で洗浄した
のち、ＩＭＬｉＣＩ！溶液２０μｌに懸濁した。これに
、７０％ポリエチレングリコール４０００溶液３０μ１
１発現プラスミド溶液１０μｌ（約１μｇＤＮＡ）を添
加して、充分に混合したのち、３０°Ｃで１時間インキ
ュベートした。ついで、１４０μｌの水を加えＳＤ合成
培地プレート（２％グルコース、０．６７％酵母窒素源
アミノ酸不含、２０μｇ　／　ｍｌヒスチジン、２％寒
天）上にまき、３０°Ｃで３日間インキュベートするこ
とにより、プラスミドを保持する形質転換体を得た。プ
ラスミドｐ　Ａ’Ｃ２５、ｐＡＣｏ２５３で形質転換し
た酵母を、それぞれＡＨ２２［ρＯ］（ｐＡＣ２５）株
、ＡＨ２２［ρ＋］　　（ｐＡＣ２５）株、ＡＨ２２［
ρＯＦ　　（ｐＡＣＣ２５３）株、ＡＨ２２［ρ＋コ　
（ｐＡＣｏ　２５３）株とした。

実施例４　　Ｐ４５０ｃｘａの生産 実施例３で得たＡＨ２２［Ｃ０］　　（ｐＡＣＣ５）株
、ＡＨ２２［ρ＋］　　（ｐＡＣ２５）株、ＡＨ２２［
Ｃ０］　　（ｐＡＣＣ２５３）株、ＡＨ２２［ρ＋］（
ｐＡＣＣ２５３）株およびコントロールＡＨ２２［Ｃ０
コ　（ｐＡＡＨ５）株、ＡＨ２２［ρ＋］　　（ｐＡＡ
Ｈ５）株をＳＤ合成培地（２％　グルコース、０．６７
％　アミノ酸不合酵母窒素源、２０μｇ／ｍｌ　　ヒス
チジン）３００１ｎｌでそれぞれ約２Ｘ１０７細胞／　
ｍｌまで培養し、集菌後１００ｍＭ　　リン酸カリウム
（ｐＨ７，０）　で洗浄したのち、１００ｍＭリン酸カ
リウム（ｐＨ７，０）　　２−に懸濁した。

２本のキュベツトに菌懸濁液を１　ｍｌずつ分注し、サ
ンプル側キュベツトに一酸化炭素を吹き込んだのち、両
キュベツトにジチオナイト５〜１０■を添加した。

よく撹拌したのち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを
測定し、Δε（４５０ｎｍ−４９０ｎｍ）　＝　９１　
ｍＭ−’ｃｍｍ１をもとにしてヘム含有Ｐ４５０量を算
出した。その結果、ＡＨ２２［Ｃ０コ、［ρ＋］　（ｐ
ＡＣ２５）株およびＡＨ２２［ρＯコ、［ρ＋］　　（
ｐＡＣＣ２５３）株はいずれも菌体当たり約２Ｘ４０’
分子のヘム含有Ｐ４５０タンパク質を産生ずることが判
明した。それに対して、コントロールＡＨ２２［Ｃ０］
および［ρ＋］　　（ｐＡＡＨ５）株ではヘム含有Ｐ２
Ｓ５の産生は認められなかった。

実施例５　再構成系におけるＰ　４５０　ｃｘ５依存性
酸化活性の測定 ウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲとの再□構成系に
おいて、コントロールＡＨ２２［ρ＋］　　（ｐＡＡＨ
５）株、ＡＨ２２［ρ＋］　　（ｐＡＣ２５）株および
ＡＨ２２［ρ＋］　（ｐＡＣＣ２５３）株から調製した
細胞小器官画分を用いてＰ４５０ｏａｓに依存した水酸
化活性を測定した。

形質転換酵母菌株からの細胞分画は以下の方法に従った
。形質転換体の約２Ｘ１０’菌体／　ｍｌ培養液から約
４Ｘ１０Ｉ０菌体分を集菌し、ザイモリアーゼ溶液（１
０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５〉、２０Ｍソルビトー
ル、０．１ｍＭ　　ジチオスレイトール、０．１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、０．３ｍｇ／　ｍｌザイモリアーゼ１００
Ｔ）に懸濁し、３０℃で１時間インキュベートしてスフ
ェロプラストを調製した。これをソニケーションバッフ
ァー（１０ｍＭ　　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、０．
６５Ｍ　　ソルビトール、０　１ｍＭ　　ジチオスレイ
トール、０．１ｍＭＥＤ　ＴＡＳｌ　ｕ　ｇ／ｍ１　　
ロイペプチン、１１−１　ｇ　／　ｒｎｌペプスタチン
）に懸濁し、テフロンホモジナイザでホモジナイズする
ことにより菌体を破砕した。３ｏｏｏｘｇ、５分間の遠
心分離により、沈澱ｌを取り除き、上清１″を得た。沈
澱ｌをソニケーションバッファーに懸濁し再度ホモジナ
イズしたのち、３０００Ｘｇ、５分間遠心分離し沈澱ｌ
　（未破砕菌体・核画分）および上清１　”を得た。上
溝１′および１″′を併せて上清ｌとし、１０，０００
Ｘｇ、２０分間遠心分離し、沈澱２（ミトコンドリア画
分）と上清２を得た。上清２をさらに１２０．０００Ｘ
ｇ。

７０分間遠心分離し、沈澱３（ミクロソーム画分）と上
清３（細胞質画分）に分けた。ミトコンドリア画分およ
びミクロソーム画分を酸化活性測定に用いる場合は、各
酵母細胞小器官画分に終濃度０．５％のコール酸を加え
、あらかじめミトコンドリアあるいはミクロソーム膜か
らのタンパク質の可溶化を行った。

ＴＨＣ２７位水酸化活水酸化活性の方法で測定した。１
００ｍＭ　　）リス−塩酸（ｐＨ７，８）、０５ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、　　１４　ｎｍｏ　１　　　［”ＨＩ　　
ＴＨＣ，４ｎｍｏｌ　　ウシ副腎ＡＤＸ、Ｏ，ＩＵ　　
ウシ副腎ＡＤＲ，１００ｍＭ　　ＮＡＤＰＨからなる反
応混液に可溶化した各酵母細胞小器官画分（０，３４■
タンパク質を含む）を加え全容を０．５−とし、一定時
間３７℃でインキュベートした。５　ｍｌ酢酸エチルを
加えて反応を停止し、ポルテックスミキサーで１分間撹
拌後遠心し、酢酸エチル層４−を乾固した。これを少量
の酢酸エチルに溶解し、シリカゲル薄層クロマトグラフ
ィー（ＴＬＣ）に供した。ＴＬＣは酢酸エチル：アセト
ン＝７：３を溶媒として展開した。展開後、ＴＬＣプレ
ートの基質および生成物部分の放射活性をスキャナーを
用いて測定した。

再構成系におけるＴＨＣ２７位水酸化活水酸化活性た結
果、ＡＨ２２［ρ＋］　　（ｐＡＡＨ５）株のミトコン
ドリア画分を用いた場合はＴｅ）（Ｃの位置に放射活性
のピークは検出できなかったが、形質転換株の場合には
ＴｅＨＣのピークが検出できた。基質および生成物のピ
ーク面積からＡ）（２２［ρ＋］　　（ｐ２　〇　− ＡＣ２５）株のミトコンドリア画分、ミクロソーム画分
、ＡＨ２２［ρ＋１　　（ｐＡＣＣ２５３）株のミトコ
ンドリア画分およびミクロソーム画分を用いた場合、反
応時間１時間でそれぞれ約２７．１３．２６．２５％の
ＴＨＣがＴｅＨＣに変換されたことが判った。

一方、１α−ＯＨ−ビタミンＤ３２５位水酸化活性は次
のようにして測定した。１００ｍＭ　　トリス塩酸（ｐ
Ｈ７，８）、０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１００１００ｎ
　　ｌα−ＯＨ−ビタミンＤ　　　４ｎｍｏ１　ウシ副
腎ＡＤＸ１０．ＩＵ　　ウシ副腎ＡＤＲ１００ｍＭ　　
ＮＡＤＰＨからなる反応混液に可溶化した各酵母細胞小
器官画分を加え全容を０．５ｒｎｌとし、一定時間３７
°Ｃでインキュベートした。５　ｍｌベンゼンを加えて
反応を停止し、ポルテックスミキサーで１分間撹拌後遠
心し、ベンゼン層４　ｍｌを乾固した。これを少量のイ
ソプロパツールに溶解し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬ
Ｃの条件を以下に示す。

１、カラム：ファインパックシル５（日本分光社製） ２．溶媒；ヘキサン：メタノ ール＝８４：８：８ ３、流速；１．２ｙｉｌ／分 ４、カラム温度：室温 ５、検出波長；２６５ｎｍ ル：イソブロパノ 再構成系における１α−ＯＨ−ビタミンＤ３２５位水酸
化活性を測定したところＡＨ２２［ρ＋］　（ｐＡＡＨ
５）株のミトコンドリア画分は活性を示さなかったが、
形質転換株ではＨＰＬＣ分析により１α、２５　　　（
ＯＨ）２　ビタミンＤ３の位置にピークが検出できた。

ピークの高さから、０．３４■タンパク質を含むＡＨ２
２［ρ＋］　　（ｐＡＣ２５）株のミトコンドリア画分
およびミクロソーム画分のｌα２５　　（ＯＨ）２ビタ
ミンＤ、産生量は、反応時間１時間でそれぞれ約２３ｐ
ｍｏｌおよび１２ｐｍ０１と算出した。また、Ｐ４５０
ｃ２５改変型１産生ＡＨ２２［ρ＋］　　（ｐＡＣＣ２
５３）株のミトコンドリア画分およびミクロソーム画分
も同程度の活性を示した。以上、Ｐ４５０Ｃ２５依存性
水酸化活性測定の結果から、酵母内で産生されたＰ４５
０ｏ２５およびＰ４５０Ｃ２６改変型ｌは活性発現に必
要なヘムを分子内に含有しており、再構成系において、
ウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲと電子伝達系を構
成することによりＰ２Ｓ５゜２５に依存した酸化活性を
発揮できることが判った。また、Ｐ　４５０　Ｃ２５の
ミトコンドリア移行シグナル部分はラット肝酵素由来の
シグナルに限らず酵母Ｃ０ＸＩＶなど酵母内で認識され
るシグナルに置換可能であることも判った。

〈発明の効果〉 本発明により提供される形質転換酵母菌株によって、初
めて分子内にヘムを含有する活性型ミトコンドリア型Ｐ
４５０ｃｚｓあるいはＰ４５０ｃ２５改変型ｌを酵母菌
体で産生ずることが可能になった。さらに、形質転換株
から粗精製したＰ４５０Ｃ２６はウシ副腎ＡＤＸとウシ
副腎ＡＤＲとの再構成系において、ＴＨＣおよび１α−
ＯＨ−ビタミンＤ、からそれぞれＴｅＨＣおよび１　ａ
、２５　　（ＯＨ）ｔ　ビタミンＤ、を生産した。すな
わち、Ｐ４５０ｃ２６はＴＨＣ２７位およびｌα−〇Ｈ
−ビタミンＤ２２５位の両水酸化活性を示した。現在、
ミトコンドリア型Ｐ４５０分子種としてはウシ副腎Ｐ　
４５０　ＳＣＣやＰ４５０１１βなどについて異種細胞
（サル腎由来Ｃ０８１細胞）での発現が試みられている
が、いずれも産生量およびその活性は低い。また、ラッ
ト肝Ｐ４５０ｏ２５について、ＣＯ３１細胞における発
現の報告があるが、ＴＨＣに対する活性しか検出されて
いない。今回、本発明者らはミトコンドリア型Ｐ４５０
としては初めて酵母における機能発現に成功した。

酵母内で産生されたＰ４５０ｏ２５はＴＨＣ２７位およ
び１α−ＯＨ−ビタミンＤ、２５位の両水酸化活性を示
した。

肝臓におけるコレステロールから胆汁酸の生合成には数
種類のＰ２Ｓ５が関与しており、それらのうちＰ４５０
Ｃ２５はＴＨＣからＴｅＨＣへの変換を触媒する。脳鍵
黄色腫症の患者は先天的に本酵素が欠損していることが
明らかにされている。本庁は黄色腫や憎悪性の神経障害
を特徴とし、患者のアキレス鍵部、肺および脳内に黄色
腫が生じ、白内障や知能低下その他の重篤な症状が生じ
てくる。本庁患者血清中にはコレスタノールが正常値の
１０倍から１００倍に増加することが知られており、現
在はこれを利用した診断方法や、放射性同位元素により
標識したＴＨＣを使って本酵素の活性を測定する方法が
用いられている。本発明により得られた形質転換酵母菌
株を培養することによりＰ４５０ｃｘｓの大量生産が可
能になったので、単離、精製した本酵素に対する抗体を
作製すれば、これを用いてＰ４５０Ｃ２５を高感度で検
出できることから脳鍵黄色腫症の診断に有効であると考
えられる。

一方、ビタミンＤ３が活性型になるには、まず２５位の
水酸化、ついで１α位の水酸化が必要である。

食物から取り込まれ、あるいは生体内で生合成されたビ
タミンＤ、は生体内で活性型である１α、２５−　（Ｏ
Ｈ）、ビタミンＤ３になりカルシウムの代謝調節を担う
ホルモンとして、また、細胞の分化促進や細胞性免疫機
能の調節に重要な役割を果たしている。従って、ｌα、
２５　　　（ＯＨ）２　ビタミンＤ。

は骨粗そう症、慢性腎不全、ビタミンＤ抵抗性クル病、
骨軟化症の骨病変および副甲状腺機能低下病などの治療
に有効である。現在、１α、２５−（ＯＨ）２ビタミン
Ｄ３は少量生産でよいことから複雑な化学合成法に依っ
ている。本発明によって、酵母で産生したＰ４５０ｃ２
５とウシ副腎ＡＤＸ、ＡＤＲを結合することによって活
性型ビタミンＤ３生産のバイオリアクターとして利用す
ることができる。また、本発明者らはすでに、ミトコン
ドリア型電子伝達系構成成分の１つであるＡＤＸを酵母
で発現させることに成功した。この酵母菌株から部分精
製したＡ、　ＤＸは、ウシ副腎ＡＤＲ精製標品およびウ
シ副腎Ｐ４５０ＳＣＧ精製標品とともに、コレステロー
ルからプレグネノロンを生成することができた（特願平
２−１３６４９６）。また、ウシ副腎ＡＤＲ遺伝子は公
知であり、その発現も容易である。さらに本発明者らは
Ｐ２Ｓ５とＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素と
を酵母内で同時発現させる技術も開発している（特願昭
６Ｏ−２４２７７２）。従って今後、Ｐ４５０ｃ２５と
ＡＤＸおよびＡＤＲの同時発現株を創製すれば、ステロ
イド化合物酸化反応用バイオリアクターとして利用する
ことにより現在行われている複雑な化学合成法を、より
単純化することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の発現プラスミドｐＡＣ２５の構築工
程を示す。 第２図は、本発明の発言プラスミドｐＡＣ２５３構築工
程を示す。制限酵素部位は、Ｅｃ：Ｅｃ。 Ｉ、Ｎｃ：ＮｃｏＩＳＳｃ：５ａｃＩ、Ｈｄ：Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、Ｎｔ：ＮｏｔＩ、Ｐｓ：ＰｓｔＩを示す。 また、図中の「］はラット肝Ｐ４５０ｏ２５翻訳領域を
、Ｗは酵母チトクロムＣ酸化酵素サブユニット■翻訳領
域を、Ｐ、ＴはそれぞれＡＤＨプロモーター、ターミネ
ータ−を示す。 硯） Ｒ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモータ
   ーの下流にラット肝４５０＿ｃ＿２＿５遺伝子を結合し
   、酵母内でラット肝４５０＿ｃ＿２＿５を発現する発現
   プラスミド（２）下記の制限酵素部位を持つ特許請求の
   範囲第２項記載のプラスミドｐＡＣ２５ ▲数式、化学式、表等があります▼ （３）酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター
   の下流にラット肝４５０＿ｃ＿２＿５遺伝子を結合し、
   酵母内でラット肝Ｐ４５０ｃ＿２＿５改変型１を発現す
   る発現プラスミド （４）下記の制限酵素部位を持つ特許請求の範囲第３項
   記載のプラスミドｐＡＣＣ２５３▲数式、化学式、表等
   があります▼ （５）特許請求の範囲第２項記載の発現プラスミドを保
   持するサッカロミセス・セレビシエＡＨ２２株 （６）プラスミドｐＡＣ２５を保持するサッカロミセス
   ・セレビシエＡＨ２２株 （７）特許請求の範囲第３項記載の発現プラスミドを保
   持するサッカロミセス・セレビシエＡＨ２２株 （８）プラスミドｐＡＣＣ２５３を保持するサッカロミ
   セス・セレビシエＡＨ２２株 （９）特許請求の範囲第５項記載の株を培養することを
   特徴とするラット肝Ｐ４５０＿Ｃ＿２＿５の生産方法 （１０）特許請求の範囲第６項記載の株を培養すること
   を特徴とするラット肝Ｐ４５０＿Ｃ＿２＿５の生産方法 （１１）特許請求の範囲第７項記載の株を培養すること
   を特徴とするラット肝Ｐ４５０＿Ｃ＿２＿５改変型１の
   生産方法 （１２）特許請求の範囲第８項記載の株を培養すること
   を特徴とするラット肝Ｐ４５０＿Ｃ＿２＿５改変型１の
   生産方法 （１３）特許請求の範囲第５項、第６項、第７項あるい
   は８項記載の酵母菌株により５β−コレスタン−３α，
   ７α，１２α−トリオール（およびビタミンＤ＿３１α
   水酸化物（１α−ＯＨ−ビタミンＤ＿３）のそれぞれ２
   ７位および２５位水酸化を特徴とする５β−コレスタン
   −３α，７α，１２α，２７−テトロールおよびビタミ
   ンＤ＿３１α，２５二水酸化物（１α，２５−（ＯＨ）
   ＿２ビタミンＤ＿３）の製造方法