JPH02249488A - チトクロムＰ４５０↓ｃ↓２↓１と酵母ＮＡＤＰＨ‐チトクロムＰ４５０還元酵素の融合酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子および該酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はチトクロムＰ４５０　（以下Ｐ４５０と称する
）の有するｌ原子酸素添加活性およびそれに必要なＮＡ
ＤＰＨからの還元力供給能力を同一分子内に有する新規
な酸化酵素、該酸化酵素をコードする遺伝子、該遺伝子
を含む酵母内発現プラスミドおよび該発現プラスミドに
より形質転換された酵母菌株に関する。本発明により得
られるプラスミドにより形質転換された酵母菌体はＰ４
５０Ｃ！　ｌ　と還元酵素から成る融合酵素を生産し、
これに由来する一原子酸素添加活性を有しており、この
菌体自身、あるいは、菌体から取得した融合酵素を医薬
品として有用であるステロイド類の合成のためのバイオ
リアクターとして用いることができる。

〔従来技術および解決すべき課題〕

Ｐ４５０は微生物から哺乳動物にいたるまで広（生物界
に存在するヘム蛋白質であり、広範囲の脂溶性化合物を
基質として２ｉ原子酸素添加反応を触媒する。Ｐ２Ｓ５
の示すこうした広範囲な基質特異性はＰ２Ｓ５の分子多
様性に起因する。Ｐ２Ｓ５には多数の分子種が存在して
いるが、各々のＰ２Ｓ５に電子を供給する糸路は共通で
ありミクロソームでは主として、フラビンアデニンジヌ
クレオチドとフラビンモノヌクレオチドを分子内に補酵
素として含有する還元酵素がＮＡＤＰＨからの電子を基
質を結合したＰ２Ｓ５へ供給する。従って、Ｐ２Ｓ５は
基質と結合し、還元酵素と共役することによりはじめて
１原子酸素添加反応を発揮する。

糖質コルチコイドは、糖質の代謝を支配し肝にグリコー
ゲンを貯蔵させる作用を有しヒトの生命の維持に必須で
ある。さらに、抗炎症、抗アレルギー作用を有するため
医薬品としてリウマチ、湿疹、ぜんそくなどの治療に広
く用いられている。

コルチコイドは医薬品として高価なものが多く、現在は
全合成法あるいは発酵法による多段階反応によって製造
されている。

糖質コルチコイドは、副作用を分離しえないため、低活
性品、高活性品の両方が使われている。低活性品の代表
としてプレドニゾロン（Ｐ　Ｄ　Ｌ）が挙げられる。高
活性品としてはデキサメタシン、ベータメタシンなどが
挙げられるが、いずれもＰＤＬを基本として誘導される
。したがってＰＤＬの需要は、非常に多い、ＰＤＬを合
成する場合、種々の出発材料から種々の方法がとられる
が、いずれも、１１．１７．２１位の水酸化工程を含ん
でいる。例えば、大豆から得たスチグマステロールを原
料として用いる場合プロゲステロン（ＰＧ）、ヒドロコ
ルチゾン（ＨＣ）を経てＰＤＬを得る。

現在、ＰＧからＨＣを得るのに多段階（８段階）の化学
合成過程と１段階の醗酵過程を必要とする。

Ｐ４５０ｃ２．を用いることによりＩ７ヒドロキシＰＧ
→１７−．２１−ジヒドロキシＰＧ（＋１−デオキシコ
ルチゾール）への変換が可能であり、さらに上記醗酵過
程に用いられている１１α水酸化酵素（ＰＧのみならず
１７−．２１−ジヒドロキシＰＧの１１位水酸化反応を
も司る）を用いることによりＨＣの生産が可能である。

すなわち、３段階の醗酵過程によりＰＧ−４−ＨＣへの
変換が可能である。また、上に挙げた例にとどまらず、
ＰＧ、１７−ヒドロキシＰＧあるいはそれらの誘導体の
２１位を特異的に水酸化する。

本発明者らは、ウシ副腎Ｐ４５０Ｃ！　＋遺伝子を酵母
において発現させることに成功している（特願６３−１
８１５７１）が、Ｐ４５０Ｃ！　＋の菌体あたりの発現
量および菌体あたりの活性を上昇させることが望まれて
いる。

〔課題解決の手段〕

本発明者らはＮ末端側にＰ４５０ｃ、　１を、Ｃ末端側
に酵母還元酵素を有する融合酵素を作成し、酵母内にお
ける融合酵素の産生量を上昇させること、電子伝達の効
率を高めることにより２４５０分子あたりの活性が上昇
することを見出した。

産生量は、融合酵素遺伝子が産生ずるｍＲＮＡ量、ｍＲ
ＮＡの翻訳効率、融合酵素の立体構造に基づく酵母内で
の安定性など多くの因子により決定されるが、Ｐ４５０
Ｃ！　ｌのＣ末端側に酵母還元酵素を接合したことによ
り酵母内での安定性がＰ４５０Ｃ！　＋自身よりも増大
したことにより、産生量が上昇したと考えられる。また
、電子伝達の効率もＰ４５０Ｃｔ　ｌ単独発現の場合に
比べ４〜５倍に上昇し両者の効果により菌体あたりの活
性がＰ４５０Ｃ！　ｌ単独発現の場合の約２０倍に上昇
したと考えられる。Ｐ４５０ｃｔ＋のＮ末端側に酵母還
元酵素を接合した場合、産生量が上昇したにもかかわら
ず、菌体あたりの活性は低下した。したがって、本発明
のＰ４５Ｏｃｔ　＋　と酵母還元酵素との融合酵素発現
菌株は、バイオリアクターとしての有用性がきわめて高
いことがわかった。

本発明者らは、ウシ副腎チトクロムＰ４５０Ｃｔ　ｌ遺
伝子の３°末端側に酵母還元酵素遺伝子を接続させるこ
とにより単一の遺伝子とし、Ｐ４５０Ｃ！　＋の有する
１原子酸素添加活性およびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵
素の有するＮＡＤＰＨからの還元力供給能を同一分子内
に併せ持った酸化酸素をコードする融合酵素遺伝子を構
築し、これを酵母的発現ベクターに導入し、発現プラス
ミドを構築した。　本発明の融合酵素遺伝子は、ミクロ
ソーム結合に関与する領域と、Ｐ４５０Ｃ！　ｌ遺伝子
のうち少なくとも基質結合に関与する領域とヘム結合に
関与する領域を含む部分と、酵母還元酵素遺伝子のうち
少なくともフラビンモノヌクレオチドやフラビンアデニ
ンジヌクレオチド結合に関与する領域とＮＡＤＰＨ結合
に関与する領域を含む部分とを接続することにより構築
することができる。ミクロソーム結合に関与する領域は
、Ｐ４５０Ｃ！　ｌあるいは酵母還元酵素由来のものの
他、他のミクロソーム型Ｐ４５０やミクロソーム型タン
パクのＮ末端領域等、ミクロソーム結合能を有するもの
が用いられる。Ｐ４５０Ｃ！　１のミクロソーム膜への
結合、基質の結合およびヘム結合に関与する領域は、そ
れぞれ、Ｎ末端部分、中央部分およびＣ末端側のホモロ
ガス・リージョン−２（ＨＲ２）　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ旦８０７−８１７）領域であることはすでに推定さ
れている。一方、酵母還元酵素のミクロソーム膜への結
合、フラビンモノヌクレオチドやフラビンアデニンジヌ
クレオチド結合およびＮＡＤＰＨ結合に関与する領域は
アミノ末端メチオニンを１番とするとそれぞれ１から５
０番目まで、５０から４６５番目まで、および４６５か
ら６００番目までのアミノ酸であることも推定されてい
る。融合酵素として単一の分子で発現させるため、Ｐ４
５に＊　ｌ遺伝子は翻訳停止コドンに相当する部位を含
まないようにする。また、接続は、両遺伝子のフレーム
がずれないように行えばよい。

両遺伝子の上述の領域を直接、あるいはリンカ−を介し
てフレームがずれないように接続することにより構築で
きる。

発現プラスミド構築に用いたＰ４５０Ｃ！　＋および還
元酵素のコーディング領域に相当するｃＤＮＡは、本発
明の技術分野において用いられる常法により製造するこ
とができる。例えば、ウシ副腎Ｐ４５０Ｃ１＋について
言えば、このｃＤＮＡを含むプラスミドｐＵｃ２１ｃ２
　（特願昭６３−１８１５７１）から、また、還元酵素
遺伝子についてはｐｇＣＹＲ（特願６２−３２５５２７
）から取り出すことが可能である。

本発明の融合酵素を発現するプラスミドは上述の通り構
築した融合酵素遺伝子を適当な発現ベクターのクローニ
ング部位に常法により挿入し、構築することができる。

例えば酵母アルコール脱水素酵素（ＡＤ）１１）遺伝子
のプロモーターおよび同ターミネータ−を保持する酵母
発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄａｔｉｏｎから入手可能。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｌｏ
ｔ　ｐａｒｔ　Ｃ、ｐ１９２−２０１゜Ａｍｍｅｒｅｒ
らの方法により製造できる）などを挙げることができる
がＰＧＫプロモーター、　Ｇ３ＰＤ）Ｉプロモーター、
ＧＡＬＩＯプロモーターを有する発現ベクターなど、宿
主内で効率より機能するプロモータ、ターミネータ−を
有するものであればよく、特に限定されるものではない
。また、発現プラスミドの構造も限定されるものでなく
、酵母内で安定に保持されるものであればよい。

本発明の融合酵素の発現には、酵母、例えばサツカロミ
セス・セレビシェＡＨ２２株、サツカロミセス・セレビ
シェ５ＨＹ３株やサツカロミセス・セレビシェＮＡ３７
−１１Ａ株などが宿主として好都合に使用できる。これ
らの宿主の上記の本発明の融合酵素遺伝子を含む発現プ
ラスミドによる形質転換はアルカリ金属（ＬｉＣ１’）
を用いる方法、プロトプラスト法など公知の方法により
行なうことができる。

このようにして得られた形質転換酵母を培養することに
より本発明の融合酵素を製造することができる。

本発明により得られる形質転換酵母の培養は通常の培養
方法により行なうことができる。

以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明するが、本
発明は実施例に限られるものではなく、通常、本発明分
野で行われている程度の変更を含むものである。

実施例１ 発現プラスミドの構築方法を第１図に示す。

Ｐ４５０Ｃ＊　１遺伝子を含むｐＵｃ２１ｃ　（特願６
３−１８１５７１）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断するこ
とにより１．６　ＫｂのＤＮＡ断片を得て、これをベク
ターｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入しプラスミドｐ
Ｕｃ２１ｃＲを得た。

次にｐＵｃ２１ｃＲを制限酵素Ｎａｅ　ＩとＮｒｕ　Ｉ
で同時消化した後リガーゼ反応を行なった得られたプラ
スミドを制限酵素Ｓｍａ　Ｉ　、　５ａＩＩで同時消化
した後、合成リンカ−ＮｃＬｌ（第２図）を挿入した。

得られたプラスミドをＢａｍ旧、５ａｆＩにより同時消
化し、約１００ｂｐの断片を回収した。ｐＵｃ２１ｃ２
（特願６３−１８１５７１　　）を旧ｎｄｌｌＩ、　Ｂ
ａｍ旧で同時消化して得た約１４００ｂｐの断片および
前述の約ｔｏｏｂｐのＢａｍＨＩ−３ａｊ７　Ｉ断片を
ｐＵｃ１９の旧ｎｄＩＩ［、５ａＩＩ部位に同時に挿入
して得たプラスミドを旧ｎｄＩ［ＩとＳａｉ！Ｉで同時
消化し約１５００ｂｐの断片を得た。

還元酵素遺伝子を含むｐＵＹＲ７１７（Ｂ）　（特願６
３−１７３７６１）から調製した約２１００ｂｐの５ａ
ＩＩ　−Ｈ１ｎｄ■断片および上記約１５００ｂｐの旧
ｎｄＩ［ｒ−３ａｌ　Ｉ断片を同時にベクターｐＡＡｌ
（５の旧ｎｄＩＩＩ部位に挿入し融合酵素発現プラスミ
ドｐＡＦγＲ１を得た。

また、ｐＵＹＲ７１７（［（）（特願６３−１７３７６
１　　）をＰｖｕ■で消化し、５ａｎＩ部位を含む合成
リンカ−Ｎα２（第２図）を挿入し、ＨｉｎｄＩ［ｒ、
５ａｌＩにより同時消化した。得られた約２１００ｂｐ
のＳａｌ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片および上記約１５
００ｂｐの旧ｎｄｌＩ［−３ａｊ＋　１断片を同時にベ
クターｐＡＡＨ５の旧ｎｄＩ［［部位に挿入し、融合酵
素発現プラスミドｐＡＦγＲ２を得た。

実施例２　　〔プラスミドｐＡＦγＲ１，ｐＡＦγＲ２
による酵母の形質転換〕 ＹＰＤ培地（１％Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、　２％
ポリペプトン、２％グルコース）１．〇−にサツカロミ
セス・セレビシェ−Ａ１１２２株を植菌し、３０℃で振
盪し、５Ｘ１０’菌体になった時点で遠心分離により集
菌した。得られた菌体を１．０−の０．２ＭＬｉＣ１溶
液に懸濁した後、再度遠心分離し、得られたベレットに
２０μ！の１ＭＬｉｃｊ７溶液、３０ｕ１の７０％ポリ
エチレングリコール４０００溶液、約１．０μｇのｐＡ
ＦγＲ１あるいはｐＡＦγＲ２を含む１０μｌの溶液を
添加した。十分に混合した後、３０℃で１時間インキュ
ベートし、さらに１４０μｌの滅菌水を加えて攪拌した
。この溶液をＳＤ合成培地プレート（２，０％グルコー
ス、０．６７％窒素源アミノ酸不含、２０ｃｔｌ／ｙｄ
ヒスチジン、２．０％寒天）上にまき３０℃で３日間イ
ンキュベートし、プラスミドｐＡＦγＲ１あるいはｐＡ
ＰγＲ２を保有する形質転換株ＡＨ２２／ｐＡＦγＲ１
，およびＡＨ２２／　　ｐＡＦγＲ２を得た。

［実施例３　］　Ａ）１２２／ｐＡＦγＲ１，ＡＨ２２
／ｐＡＦγＲ２株における融合酵素の定量 ８％グルコース、５．４％窒素源アミノ酸不含、１６０
μｇ／ｄヒスチジンを含む培地でＡＨ２２／ｐＡＦγＲ
１，ＡＨ２２／ｐＡＦγＲ２およびコントロールＡＨ２
２／　ｐＡＡＨ５株を各々２．２　ｘ　１０　’ｃｅｌ
ｌｓ／−まで培養した。各培養液０．９−に０．１−の
２　Ｎ　ＮａＯＨ−８％２−メルカプトエタノール水溶
液を添加し０℃で１０分間インキュベートした。さらに
、０．２４の３０％トリクロロ酢酸水溶液を添加し、０
℃で１０分間インキュベートした後遠心分離した（　１
０．０００　ｘ　ｇ、５分）。得られたベレットをｌ−
アセトンで洗浄した後乾燥し、緩衝液〔１％ＳＤＳ、　
５０ｍ１Ｊ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６，８）　、１０
％　２−メルカプトエタノール、４０％グリセロール、
０．０２％ブロモフェノールブルー〕　５０μｌを添加
して可溶化した。さらに、これを１０％ポリアクリルア
ミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中の蛋白質を緩衝液
［２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ（ｐ）！　８．３　）
、１９２　ｍＭグリシン、２０％メタノール］中で電気
泳動的にニトロセルロースフィルター上にプロットした
。

次に、フィルターをＴＢＳ緩衝液（５ＱｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、２００ｍＭ　ＮａＣ１）に
浸した後、３％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で４０分インキュベートし
、さらに３０μｇの抗−酵母還元酵素抗体、１％ゼラチ
ン、０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳ緩衝液中
で３７℃で２時間インキュベートした。その後、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で
３０分インキュベートする操作を４回繰り返した後、３
％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含む、ＴＢ
Ｓ緩衝液中で２０分間インキュベートした。次に１０μ
ｃｉの（”’　Ｉ）　−Ｐｒｏｔｅｔｎ　Ａ、　　１％
ゼラチン、０゜０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳ緩
衝液中３７℃で６０分インキュベートした後、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で３
０分インキュベートする操作を４回繰り返した。フィル
ターを風乾した後、オートラジオグラフィーを行なった
。ＡＨ２２／ｐＡＡＨ５およびＡＨ２２／　ｐＡＡＨ５
株に酵母還元酵素を５０ｎｇあるいは１１００ｎ添加し
たサンプルにおける酵母還元酵素のバンドの黒化濃度と
、Ａ）１２２／ｐＡＦγＲ１、ＡＨ２２／ｐＡＦγＲ２
株における融合酵素のバンドの黒化濃度の比較から、Ａ
Ｈ２２／ｐＡＦγＲ１、Ａ）１２２／ｐＡＦγＲ２株に
おける融合酵素の発現量は約ｌＯ４分子／菌体と推定さ
れた。これはＡ）１２２／ｐＵｃ２１Ｃ２株におけるＰ
４５０ｃ、　、の発現量の約４〜５倍に相当する。

〔実施例４〕　プロゲステロンおよび１７−ヒドロキシ
プロゲステロン２１位水酸化活性の測定８％グルコース
、５．４％窒素源アミノ酸不含、１６０μｇヒスチジン
を含む培地で約８ＸＩＯ＠菌体／ｄまで培養したＡＨ２
２／ｐＡＦ　７　Ｒ１あるいはＡＨ２２／ｐＡＦ　７　
Ｒ２株培養液５ｄ中に１ｍＭプロゲステロンあるいは１
７−ヒトロキシブロゲステロンーエタノール溶液５０μ
ｌを添加し、終濃度１０μＭとした。　　３０℃で振盪
培養し０．　１．５．　３゜６．１２，１８．２４時間
後に０．５−ずつ分取し培養上清をＨＰＬＣにより以下
の条件で分析した。

１、カラム：　μＢｏｎｄａｐａＫ　Ｃ１８（φ４　Ｘ
　３００ｍｍ。

ウォーターズ社） ２、溶出条件ニアセトニトリル２０−７０％　水溶液直
線濃度勾配／２５分 ３、流速：　２　、　Ｏｄ／ｍ１ｎ ４、温度：５０℃ ５、検　出：　ＵＶ　（２４５ｎｍにおける吸光度）６
、定　量：ビーク面積 （ｉ）プロゲステロン２１位水酸化活性融合酵素発現株
ＡＨ２２／ｐＡＦｙＲ１，ＡＨ２２／ｐＡＦγＲ２なら
びにＰ４５０Ｃ！　＋単独発現株ＡＨ２２／ｐＵｃ２１
ｃ２　（特願６３−１８１５７１）の培養液にプロゲス
テロンを添加した後のプロゲステロンから２１−ヒドロ
キシプロゲステロンへの変換率の経時変化を第４図に示
す。

両融合酵素発現株における１、５時間後の変換率はいず
れも２４％で、Ｐ４５０Ｃ！　＋単独発現量の変換率（
２％）の１２倍であることがわかった。融合酵素発現量
における１２時間後の変換率は９０％以上であり添加し
たプロゲステロンのほとんどすべてが２１−ヒドロキシ
プロゲステロンに変換された。また、Ａｌ１２２／ｐＡ
ＦγＲ２株の方がＡＨ２２／ｐＡＦγＲ１株よりも菌体
あたりの活性が若干高いことがわかった。

（ｉｉ）１７−ヒドロキシプロゲステロン２１位水酸化
活性 融合酵素発現量およびＰ４５０Ｃ！　＋発現量の菌体培
養液に１７−ヒドロキシプロゲステロンを添加した後の
１７−ヒドロキシプロゲステロンから１１−デオキシコ
ルチゾールへの変換率の経時変化を第５図に示す。ＡＨ
２２／ｐＡＦγＲ１，Ａｌ１２２／ｐＡＦγＲ２株にお
ける１、５時間後の変換率はそれぞれ２６％、３６％で
ありＰ４５０Ｃｔ　１発現株の変換率（１，８％）の１
４倍、２０倍であることがわかった。６時間後の変換率
はＡＨ２２／ｐＡＦγＲ１株で８５％、ＡＨ２２／ｐＡ
ＦγＲ２株では９８％に達した。

参考例１ 〔ウシ副腎Ｐ４５０Ｃｔ　ｌ　ｃＤＮＡの取得〕ウシ副
腎からグアニンチオシアネート法によりＲＮＡ画分を抽
出し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにかけポ
リ（Ａ）ＲＮＡを得た。さらにこのポ１バＡ）ＲＮＡ画
分を６５℃で５分間熱処理した後、１Ｏ−３０％のショ
糖密度勾配で超遠心分離（２７０，０００Ｘｇ、　　１
時間）分画した。マーカーの１８３　ｒＲＮＡよりやや
サイズの大きい画分を回収し、アマ−ジャム社製のｃＤ
ＮＡ合成システムを用いてｃＤＮＡを合成したさらにλ
ｇｔｌｌを用いたｃＤＮＡクローニングシステムを用い
てｃＤＮＡライブラリーを作製した。前述、廐報のウシ
副腎Ｐ４５０ｃ２１のｃＤＮＡの構造を元にして以下の
３種類の３６ｍａｒのＤＮＡを合成した。

これらをカイポーション法により（”Ｐ）　−ラベルし
、これをプローブとして前述のｃＤＮＡのライブラリー
約４０．０００プラークについてプラークハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗
浄は５２℃で行った。得られたポジティブクローンから
ファージＤＮＡを調製し、制限酵素ＥｃｏＲ１により切
断したところ、約１．６　Ｋｂ。

０、５５Ｋｂの断片が得られたため、これらをそれぞれ
市販のクローニングベクターｐＵｃ１１９のＥｃｏＲ１
部位に挿入し、プラスミドｐＵｃ２１Ｎ１およびｐＵｃ
２１ｃを得た。次にこれらのプラスミドを用いて、グイ
デオキシ法により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。書
間らの文献のＣＤＮＡ配列とは、翻訳開始上流３３番目
にＧが挿入されている点、および開始下流３９番目から
４２番目ＣＡＧがＡＧＣとなっている点の２つでことな
っているが、チュンらの文献（Ｐｒｏ、　ＮＡＳ、　（
１９８３）、　８３．４２４４）の配列とはすべて一致
した。従ってクローニングした遺伝子はウシ副腎Ｐ４５
０ｃ＊＋の。

ＤＮＡであると考えられる。

〔発現プラスミドｐＵｃ２１ｃ１　、ｐＵｃ２１ｃ２の
構築〕目 上述ｐＵｃ２１Ｎｌを制限酵素Ｎｈｅ　Ｉ　、　）Ｉｉ
ｎｄＩＩＩで同時消化した後、合成リンカ−（４７ｍｅ
ｒ）５’　−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＣＴ
ＧＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＴＴ
ＴＴＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＣＧＡＣＧＡＣ
ＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧ　　　　−３’ ＣＧＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＴＣ とリガーゼ反応を行ない反応混液により大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換した。形質転換株からプラスミドＤＮＡ
を調製し、プラスミドｐＵｃ２ＩＮ２を得た。また、ｐ
Ｕｃ２１ｃをＥｃｏＲＩで部分消化した後ｌ箇所で切断
を受けたＤＮＡ断片を回収し、フィルインした後アルカ
リホスファターゼ処理を施した。さらに市販の旧ｎｄＩ
ＩＩリンカ−（１０ｍｅｒ）とりガーゼ反応を行ない反
応混液によりＪＭ　１０９株を形質転換した。形質転換
株からプラスミドＤＮＡを調製した。ここで目的とする
プラスミドＩ）ＵＣ２１１とｍＲＮＡの安定性を増すた
め３′非翻訳領域を約０．４　Ｋｂ、　Ｂａｌ　３１で
欠失させた後、旧ｎｄＩＩ［リンカ−を挿入したプラス
ミドｐＵｃ２１２を得た。それぞれから、ＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片（ｌ、６にｂおよび１．２　Ｋｂ）
を調製し、ｐＵｃ２ＩＮ２から調製したＥｃｏＲｆ−旧
ｎｄＩ［Ｉ断片およびアルカリホスファターゼ処理を施
したベクターｐＡＡＨ５の旧ｎｄ■消化物とのリガーゼ
反応を行い、ｐＵｃ２１ｃｌおよびｐＵｃ２１ｃ２を得
た。

参考例２ 酵母還元酵素ｃＤＮＡインサートを含むプラスミドｐｇ
ＣＹＲ（特願６２−３２５５２７）を制限酵素ＥｃｏＲ
ｒで切断した。反応混液を低融点アガロースゲル電気泳
動に供し、還元酵素アミノ末端側コーディング領域カル
ボキシル末端側コーディング領域に相当するそれぞれ約
４１０ｂｐ、　１６９０ｂｐの断片を回収した。それぞ
れの断片をプラスミドｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ部位にサ
ブクローニングし、アミノ末端側断片が、挿入されたプ
ラスミドｐＵＹＲ７とカルボキシル末端側断片が挿入さ
れたプラスミドｐｕＹＲ１７を得た。プラスミドｐＵＹ
Ｒ１７を制限酵素ＥｃｏＲｆで部分切断し、市販のＨｉ
ｎｄＩ［［リンカ−を挿入しプラスミドｐＵＹＲ１７（
Ｈ）を得た。一方、上記プラスミドｐＵＹＲ７を制限酵
素ＥｃｏＲｒで切断し、反応混液を低融点アガロースゲ
ル電気泳動に供し、還元酵素アミノ末端側コーディング
領域に相当する約４１０ｂｐの断片を回収した。

この断片を上記プラスミドｐＵＹＲ１７（ｌ（）のＥｃ
ｏＲ１部位に挿入し、プラスミドｐＵＹＲ７１７（Ｈ）
を得た。このプラスミドｐＵＹＲ７１７（Ｈ）を制限酵
素Ｐｖｕ　ＩＩとＨｉｎｄｌｌＩで同時消化した。反応
混液を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、還元酵素
ｃＤＮＡの約２．　Ｏｋｂ断片を回収した。こうして得
られた約２．ＯｋｂのＰｖｕ　ＩＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ断
片と合成リンカ−３Ｌ２−１：（左右両端にそれぞれＢ
ａｍＨＩ、　Ｐｖｕ　Ｉｆ認識部位をもち、内に５ａｌ
ｌ認識部位を有する。）をプラスミドｐＵｃ１８のＢａ
ｍ１（ｌ−Ｂｉｎｄｌ［部位に挿入し、目的とするプラ
スミドｐＵＹＲ７１７（Ｂ　）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｐ４５０ｃ、　ｌ　と酵母還元酵素との融合
酵素発現用プラスミドｐＡＦγＲ１およびｐＡＦγＲ２
の構築方法を示す。 Ｅ、　Ｂ、　Ｓｍ、　Ｓａ、　Ｈ，Ｎａ、　Ｎｒ、　Ｐ
はそれぞれ、制限酵素ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ、　　
ＳｍａＩ、　５ａＩＩ、　Ｈｉｎｄｌｌｌ。 Ｎａｅ　Ｉ、　　Ｎｒｕｒ、　Ｐｖｕ　ＩＩの認識部位
を示す。 第２図は、第１図の構築工程で使用する合成リンカ−の
塩基配列を示す。 第３図はプラスミドｐＡＦγＲ１およびｐＡＦγＲ２が
コードする融合酵素の構造を示す。 ロゲステロンへの変換率を、横軸は培養時間を示す。　
　ｘ−ｘはＡｌ２２／ｐＵＣ２１ｃ２株、　△−△はＡ
Ｈ２２／ｐＡＦγＲ１株、〇−〇はＡＨ２２／ｐＡＦγ
Ｒ２株を示す。 第５図は、各種形質転換株の１７−ヒドロキシプロゲス
テロン２１位水酸化活性を示す。縦軸はｌｌ−デオキシ
コルチゾールへの変換率を、横軸は培養時間を示す。×
−×はＡｌ２２／ｐＵＣ２１ｃ２株、△−△はＡＩ（２
２／ｐＡＦγＲ１株、〇−〇はＡＨ２２／ｐＡＦ　ｒ　
Ｒ２株を示す。 還元酵素部分を示し、番号はそれぞれの酵素のＮ末端ア
ミノ酸を１とした際のアミノ酸残基数を示す。また、両
酵素の間にあるアミノ酸配列（１文字表示）は、合成リ
ンカ−に由来する人工的な配列である。Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ａ
はそれぞれセリン、スレオニン、プロリン、アラニンを
示す。 第４図は、各種形質転換株のプロゲステロン２１位水酸
化活性を示す。縦軸は２１−ヒドロキシプ第１図（その
Ｉ） Ｕｃ２１ｃ ↓　Ｅｃｏ　Ｒ［ 合成リンカ−Ｎｌｌｌ Ｓｍ　　５ａ ７７′ ↓　Ｎａｅｌ、ＮｒｕＴ ↓　ｌｉｇａｔｉｏｎ ↓　Ｓｍａｌ　Ｓ・１ｒ Ｂ５ｍ５ａ −に＝＝５　　　Ｌ−− ＢａｍＨ（、Ｓａｌ　Ｉ ＨＢ　　Ｓａ 第 図 ３′ ＣＴ ＧＧ ＧＡ ＣＧ ＣＡ ＴＧ ＣＣ Ｇ ５′ ＧＡ ＣＣ ＣＴ ＧＣ ＧＴ ＡＣ ＧＧ ＣＡ ＣＴ ３′ ”　ＴＣＧ　ＡＣＧ　ＴＣＧ　Ａ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウシ副腎チトクロムＰ４５０ｃ＿２＿ｉの有する
   １原子酸素添加活性と酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４
   ５０還元酵素の有する還元力供給能を併せ持ち、Ｎ末端
   側にウシ副腎チトクロムＰ４５０ｃ＿２＿ｉを、Ｃ末端
   側に酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素を有
   する酸化酵素をコードする融合酵素遺伝子
2. （２）請求項１に記載の遺伝子を含み、該酸化酵素を発
   現する酵母発現プラスミド
3. （３）酵母発現プラスミドｐＡＦγＲ１
4. （４）酵母発現プラスミドｐＡＦγＲ２
5. （５）請求項２、３または４記載の酵母発現プラスミド
   を保持する形質転換酵母菌株
6. （６）サッカロミセスセレビシェーＡＨ２２（ｐＡＦγ
   Ｒ１）株
7. （７）サッカロミセスセレビシェーＡＨ２２（ｐＡＦγ
   Ｒ２）株
8. （８）ウシ副腎チトクロムＰ４５０ｃ＿２＿ｉの有する
   １原子酸素添加活性と酵母ＮＨＤＰＨ−チトクロムＰ４
   ５０還元酵素の有する還元力供給能を併せ持つ酸化酵素
9. （９）請求項５、６または７記載の形質転換酵母菌株を
   培養することを特徴とする該酸化酵素の製造方法
10. （１０）請求項５、６または７記載の形質転換酵母菌株
    によりプロゲステロンを水酸化することを特徴とする２
    １−ヒドロキシプロゲステロンの製造方法（１１）請求
    項５、６または７記載の形質転換酵母菌株により１７α
    −ヒドロキシプロゲステロンを水酸化することを特徴と
    する１１−デオキシコルチゾールの製造方法