JPH0542915B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ウシ副腎チトクロムｐ−450₁₇α遺伝
子および酵母アルコール脱水素酵素プロモーター
を保持する酵母発現プラスミド、ウシ副腎チトク
ロムｐ−450₁₇αを生産する酵母菌体及び該酵母を
用いることを特徴とする17−ヒドロキシプレグネ
ノロン、１７−ヒドロキシプロゲステロンの製造
方法に関する。ウシ副腎チトクロムｐ−450₁₇αは
本来、プレグネノロン、プロゲステロンに対し、
17α位水酸化活性およびC₁₇，₂₀−リアーゼ活性の
両方を有する酵素である。しかし、酵母内で発現
したチトクロムＰ−450₁₇αは高い17α位水酸化活
性を示すが、C₁₇，₂₀−リアーゼ活性が非常に低
い。この性質を利用することにより高純度の17−
ヒドロキシプレグネノロン、17−ヒドロキシプロ
ゲステロンを製造することが可能である。本発明
により得られるプラスミドにより形質転換された
酵母菌体はＰ−450₁₇αを生産し、これに由来する
一原子酸素添加活性を有しており、この菌体自
体、あるいは菌体から取得したＰ−450₁₇αを医薬
品として有用である前述ステロイド類の合成のた
めのバイオリアクターとして用いることができ
る。

従来技術および問題点 チトクロムＰ−450（以下Ｐ‐450と略称する）
は微生物から哺乳動物にいたるまで広く生物界に
存在するヘムタンパク質であり、機能を発揮する
ためには分子内にヘムを含有することが必須であ
る。チトクロムＰ−450には多くの分子種が存在
し、各々のＰ−450分子種は基質特異性を異にし
ているが、共通して脂溶性基質に対して、一原子
酸素添加反応を触媒する。哺乳動物の副腎にはス
テロイドの生合成に携つている数種のＰ−450分
子種の存在が知られている。この中でＰ−450₁₇α
はプレグネノロン、プロゲステロンの17位水酸化
活性および17−ヒドロキシプレグネノロンおよび
17−ヒドロキシプロゲステロンのC_17-20位側鎖切
断活性を有することが既知である。

ウシ副腎チトクロムｐ−450₁₇αをコードする
cDNAの全構造はすでにM.X.Zuberらによつて報
告されている（J.Biol.Chem.261，2475（1986））。

本発明者らは以前にラツト肝チトクロムＰ−
450MC cDNAを酵母において発現させることを
試み、酵母アルコール脱水素酵素（以下ADHと
略す）プロモーターを用い高い発現レベルでラツ
ト肝チトクロムＰ−450MCを発現することに成
功したが、一方、GAL10プロモーターを用いた
場合にはラツト肝チトクロムＰ−450MCは発現
しなかつた。また、コレステロールの側鎖切断活
性を有するウシ副腎チトクロムｐ−450sccを同様
に酵母で発現させる目的で、ADHプロモーター
を用いた発現ベクターを構築し酵母 サツカロミ
セス・セレビシエーを形質転換し、これはＰ−
450scc蛋白を生産したが、この蛋白はヘムを含有
しなかつた。このように哺乳動物のチトクロムＰ
−450を発現させる場合にはその分子種によつて
全くことなる様相を呈し如何なる場合に活性のあ
るチトクロムＰ−450を発現できるか予測するこ
とはできない。

一方、酵母ADHプロモーターを用いて酵母で
異種遺伝子を発現させた例としてヒトインターフ
エロンα（Nature，293，717−722（1982））を多
量に酵母内で発現させた例が報告されているが、
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（Nature，298，347
−350（1982））やヒトインシユリン（Gene，24，
289−297（1983））などの場合には殆ど発現しない
ことが知られている。一方、Ｂ型肝炎ウイルス表
面抗原やヒトインシユリンの場合にも、他のプロ
モーターを用いた場合にはこれらを発現させるこ
とができることが知られており、発現させる遺伝
子、プロモーター等の選択が重要である。

問題解決の手段 本発明者らは、ウシ副腎チトクロムｐ−450₁₇α
遺伝子を酵母において発現させる発現プラスミド
の構築について誠意研究の結果、この遺伝子を酵
母アルコール脱水素酵素プロモーターを有する酵
母発現ベクターに組み込み構築した酵母発現プラ
スミドにより酵母を形質転換し、ヘムを含有し一
原子酸素添加活性を有するウシ副腎チトクロムｐ
−450₁₇αを発現する酵母菌株を製造することに成
功した。

本発明は酵母アルコール脱水素酵素プロモータ
ーおよびウシ副腎チトクロムｐ−450₁₇α遺伝子を
保有することを特徴とする酵母内発現プラスミ
ド、該酵母内発現プラスミドで形質転換されＰ−
450₁₇αを菌体内で産生する酵母菌株、該酵母菌株
を培養することを特徴とするチトクロムＰ−
450₁₇αの生産方法およびそのように組換酵母菌株
で生産されたチトクロムＰ−450₁₇αおよび該酵母
菌株によりプロゲステロンあるいはプレグネノロ
ンを水酸化することを特徴とする17−ヒドロキシ
プロゲステロンおよび17−ヒドロキシプレグネノ
ロンの製造方法を提供する。

以下、本発明について更に詳細に説明する。

本発明のプラスミドはウシ副腎Ｐ−450₁₇αのタ
ンパク質をコードする遺伝子を酵母アルコール脱
水素酵素遺伝子のプロモーターとターミネーター
を保有する発現ベクター、好ましくは酵母発現ベ
クターpAAH5（Method in Enzymology，
101part Ｃ P192−201の方法により製造でき
る。なお酵母ADH1遺伝子のプロモーターは
Washington Research Fundationの米国特許出
願第299，733に含まれており、米国において工業
的、商業的目的で使用する場合は権利者からの権
利許諾を必要とする。）へ常法により組み込むこ
とにより構築することができる。

ここに用いるウシ副腎ｐ−450₁₇αをコードする
遺伝子については、このウシ副腎ｐ−450₁₇αタン
パク質をコードするcDNAがすでに公知であり前
述の文献記載の方法等の公知方法でこれを単離す
ることができる。本発明の酵母菌体は上述の発現
プラスミドにより、例えばアルカリ金属法、ある
いはプロトプラスト法などで酵母を形質転換する
ことによつて得られる。酵母としてはサツカロミ
セス・セノビシエー、特にサツカロミセス・セレ
ビシエーAH22株を用いることが好適であるがこ
の株に限定されるものではない。

本発明の酵母菌株は、その培養液中にプロゲス
テロンあるいはプログネノロンを添加し、インキ
ユベートすることによつて17−ヒドロキシプロゲ
ステロンおよび17−ヒドロキシプレグネノロンを
生産することが可能である。この際、酵母菌体の
培養は、常法に従つて行うことができる。

前述したようにウシ副腎チトクロムｐ−450₁₇α
は本来、プレグネノロン、プロゲステロンに対
し、17α位水酸化活性およびC₁₇，₂₀−リアーゼ活
性の両方を有する酵素である。実際に、該酵母を
コードする遺伝子をサル腎由来のCOS細胞で発
現させた場合、両活性が発現し、17α位水酸化活
性／C₁₇，₂₀−リアーゼ活性はプログネノロンの場
合、3.80／0.69＝5.5、プロゲステロンの場合
3.92／0.17＝23である。（Science，Vol.234 1258
−1261（1986））しかしながら酵母菌体で該酵素を
発現させた場合、17α位水酸化活性は高いが、
C₁₇，₂₀−リアーゼ活性が非常に低い。これは酵母
菌体における該酵素の存在状態が異なる為と考え
られている。この酸化活性の特異性は、酵母菌体
で該酵素を発現させ、プロゲステロン等を原料と
して糖質コルチコイドを生産する場合、非常に大
きな利点となる。

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明
する。但し、本発明は以下の実施例のみに限定さ
れるものではなく、本発明の技術分野における通
常の変更をすることができる。

実施例 １ ウシ副腎Ｐ−450₁₇αcDNAの取得 ウシ副腎からグアニジンチオシアネート法によ
りRNA画分を抽出しさらにオリゴ（dT）セルロ
ースカラムにかけポリ（Ａ）RNAを得た。さら
にこのポリ（Ａ）RNA画分を65℃で５分間熱処
理した後、10〜30％のシヨ糖密度勾配で超遠心分
離（270000×ｇ，1h）分画した。マーカーの18S
rRNAよりもややサイズの大きい画分を回収し、
アマーシヤム社製のcDNA合成システムを用いて
cDNA合成システムを用いてcDNAを合成した。
さらにλgt11を用いたcDNAクローニングシステ
ムを用いてcDNAライブラリーを作製した。ウシ
副腎ｐ−450₁₇αのcDNAの構造を元にして以下の
３種類の30−merのDNAを合成した。

5′ 3′ GCT CAG AAC CTC CAG GAT GCC ATC
ATT GAC 5′ 3′ CAC AGG GAA TAT GTC TAA CAG
AAC TTC CTT 5′ 3′ TTC CAT GGC TTT GCT GGG GAA
AAT CTT CAG これらをカイネーシヨン法により〔₃₂P〕−ラベ
ルし、これをプローブとして前述のcDNAのライ
ブラリー約25000プラークについてプラークハイ
ブリダイゼーシヨンを行つた。ハイブリダイゼー
シヨン及び洗浄は50℃で行つた。得られたポジテ
イブクローンからフアージDNAを調製し、制限
酵素EcoRIにより切断したところ、約1.4kb、
0.32kbの断片が得られたため、これらをそれぞれ
市販のクローニングベクターpUC18のEcoRI部位
に挿入し、プラスミドを得て、ダイデオキシ法に
より、cDNAの塩基配列を決定し、ウシ副腎ｐ−
450₁₇αのcDNAであることを確認した。

実施例 ２ 発現プラスミドpAα1の構築 Ｐ−450₁₇αのcDNAインサートを含むλgt11フ
アージを制限酵素EcoRIで切断し低融点アガロー
スゲル電気泳動によつて0.32kb、1.41kbのDNA
切断を調製した。EcoRIで切断した後、アルカリ
ホスフアスターゼ処理を施した市販のクローニン
グベクターpUC18と前述の各DNA断片とを混合
しリガーゼ反応を行つた後大腸菌JM109株を形質
転換した。形質転換株からプラスミドDNAを調
製しプラスミドPαNR，PαCを得た（第１図）。
これらのプラスミドをEcoRIで部分切断した後、
フイルイン反応を行ないHind合成リンカー
DNAとのリガーゼ反応の後、反応混液により大
腸菌DH1株を形質転換した。形質転換株からプ
ラスミドDNAを調製しプラスミドpαNR（Ｈ），
pαC（Ｈ）を得た（第１図）。これらのプラスミド
をEcoR，Hindで同時切断することにより
各々0.33kb，1.42kbのDNA断片調製し、これら
DNA断片と、Hind切断後、アルカリホスフア
ターゼ処理を施した酵母内発現ベクターpAAH5
（Washington Research Foundationから入手可
能、Method in Enzymology，101part Ｃ
P192−201の方法により製造できる）とを混合
し、リガーゼ反応を行つた後、大腸菌DH1株を
形質転換した。

形質転換株からプラスミドDNAを調製し、
EcoRI，BamHIで同時切断してDNAの構造を確
認し、第１図に示す構造を有するプラスミドを
pAα1と名付けた。

実施例 ３ プラスミドpAα1による酵母の形質転換 YPD培地（１％ Yeast Extract，２％ポリ
ペプトン，２％グルコース）1.0mlにサツカロミ
セス・セレビシエーAH22株を植菌し、30℃で18
時間振盪した後、遠心分離により集菌した。得ら
れた菌体を1.0mlのLiCl溶液に懸濁した後、再度
遠心分離し、得られたペレツトに20μの1M
LiCl溶液、30μの70％ポリエチレングリコール
4000溶液、約1.0μｇのpAαlを含む10μの溶液を
添加した。

十分に混合した後、30℃で１時間インキユベー
トしさらに140μの滅菌水を加えて攪拌した。
この溶液をSD合成培地プレート（2.0％グルコー
ス、0.67％窒素源アミノ酸不含、20μ／mlヒス
チジン2.0％寒天）上にまき30℃で３日間インキ
ユベートし、プラスミドpAα1を保有する形質転
換菌株AH22（pAα1）を得た。

実施例 ４ ヘムを含有するｐ−450₁₇αの定量 サツカロミセス・セレビシユーAH22（pAα1）
株の培養液（SD合成培地，菌体濃度1.5×10⁷菌
体／ml）200mlを集菌し、10mlの100mMリン酸カ
リウム緩衝液（PH7.0）に懸濁した後、遠心分離
した。得られたペレツトを新たに2.0mlの10mM
リン酸カリウム緩衝液（PH7.0）に懸濁し、２本
のキユベツトに1.0mlずつ分注した。サンプル側
のキユベツトに一酸化炭素を吹きこんだ後、両キ
ユベツト内にジチオナイト５〜10mgを添加し、攪
拌した後、400〜500nmの差スペクトルを測定し、
ｐ−450濃度を算出した。AH22（pAα1）株は菌
体あたり約１・10⁵分子のｐ−450₁₇αを産生して
いることがわかつた。

実施例 ５ 酵母ミクロソーム画分の調製 本発明の酵母はＰ−450₁₇αを産生するがそのほ
とんどが酵母ミクロソーム画分に局在する。従つ
て、ミクロソーム画分を酸化反応に用いることも
可能である。以下にミクロソーム画分調製の実施
例を示す。

2.0×10⁷菌体／mlまで培養したサツカロミセ
ス・セレビシエーAH22（pAα1）株1.8を集菌し
た後、菌体を50mlの緩衝液Ａ〔10mM Tris−HCl
（PH7.5），2Mソルビトール、0.1mM DTT，
0.2mM EDTA〕に懸濁し、100mgザイモリエー
ス100000（Zymolyase）を加え、30℃で60分間イ
ンキユベートした。5000×ｇで10分間遠心分離し
て得られたスフエロプラストを100mlの緩衝液Ａ
に懸濁した後、遠心分離（5000×ｇ，10分間）し
た。同じ遠心分離操作をもう一度繰り返してスフ
エロプラストの洗浄を行つた後、スフエロプラス
トを30mlの緩衝液〔10mM Tris−HCl（PH7.5），
0.65Mソルビトール，0.1mM DTT〕に懸濁し
50Wで５分間超音波破砕した。10000×ｇで20分
間遠心分離して得られた上清を125000×ｇで70分
間遠心分離して沈澱を集め0.1Mリン酸カリウム
緩衝液（PH7.4）2.0mlに懸濁した。

実施例 ６ AH22（pAα1）株 生菌体のプロゲステロン17
位水酸化活性およびプレグネノロン17位水酸化
活性の測定 SD合成培地（2.0％グルコース，0.67％窒素源
アミノ酸不含，20μg／mlヒスチジン）で７×10⁶
菌体／mlまで培養したAH22（pAα1），AH22
（pAAH5）株の培養液を5.0ml中に、10μCiの
〔³H〕−プロゲステロンを含む50μの1mMプロ
ゲステロン−エタノール溶液（あるいは10μCiの
〔³H〕−プログネノロンを含む50μの1mMプロ
グネノロン−エタノール溶液）を添加した。30℃
で振盪培養し、０，２，５，23時間後に1.0mlず
つ分取し遠心分離して得た上清0.8mlに2.0mlジク
ロロメタンを添加し、激しく攪拌した。遠心分離
後、ジクロロメタン層1.0mlを乾燥させ、残渣を
エタノール、酢酸エチル等容量溶液20μに溶解
し、10μを薄層プレートアプライした。25％酢
酸エチルを含むクロロホルム溶液により室温で50
分間展開した後、オートラジオグラフイーを行
い、フイルム上の現れたスポツトに相当する薄層
ゲル部分をかきとり液体シンチレーシヨンカウン
ターにより放射活性を測定した。

その結果、プロゲステロンを添加した場合
AH22（pAα1）株では５時間後に、87％、23時間
後に97％のプロゲステロンが17−ヒドロキシプロ
ゲステロンに変換したことがわかつた。（第２図）
コントロールに用いたAH22（pAAH5）株では、
活性は認められなかつた。

また、AH22（pAα1）株培養液中には、いずれ
の時間においてもC₁₇，₂₀−リアーゼの産物である
アンドロステンジオンは検出されなかつた。検出
限界を考慮に入れると、両活性比は少なくとも、
17α位水酸化活性／C₁₇，₂₀−リアーゼ活性＞100と
表される。

また、プレグネロンを添加した場合、AH22
（pAα1）株では２時間後に28％のプレグネノロン
が17−ヒドロキシプレグネノロンに変換したこと
がわかつた。コントロールAH22（pAAH5）株で
は活性は認められなかつた。

また、AH22（pAα1）株培養液中には、いずれ
の時間においてもC₁₇，₂₀−リアーゼの産物である
デヒドロエピアンドロステロンは検出されなかつ
た。検出限界を考慮に入れると、両活性比は少な
くとも、17α位水酸化活性／C₁₇，₂₀−リアーゼ活
性＞20と表される。

実施例 ７ AH22（pAα1）株菌体から調製したミクロソー
ム画分のプロゲステロン17位水酸化活性の測定 100mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.4）3.6mlと
20mM NADPH水溶液100μを混合し、37℃で
５分間インキユベートした後、AH22（pAα1）株
菌体から調製したミクロソーム画分200μ
（0.28nmolのＰ−450₁₇αを含む）、3μCiの〔³H〕−
プロゲステロンを含む0.1mM（あるいは0.5mM、
あるいは2.5mM）プロゲステロン−エタノール
溶液80μ添加し、37℃で振盪した。（終濃度は
それぞれ２，10，50μMとなる）０，５，10分後
に1.0mlずつ分散し、ジクロロメタン2.0mlを添加
し、激しく攪拌した。遠心分離後、ジクロロメタ
ン層1.0mlを分取し、乾燥させた後、実施例６と
同様の操作を行ない、活性を測定した。その結
果、５分間の反応で、プロゲステロン濃度2μM
の場合88％、10μMの場合、49％、50μMの場合
17％のプロゲステロンが17−ヒドロキシプロゲス
テロンに変換した。（第３図）。

なお、コントロールに用いたAH22（pAAH5）
株では活性は認められなかつた。

発明の効果 本発明により得られる形質転換酵母菌株は、ヘ
ムを含有し一原子酸素添加活性を有するウシ副腎
のチトクロムｐ−450₁₇αを発現し、この菌体自
体、あるいは菌体から取得したＰ−450₁₇αを医薬
品として有用である前述ステロイド類の合成のた
めのバイオリアクターとして用いることができ
る。本発明の酵母菌体は、その培養液中にプロゲ
ステロンを添加し、インキユベートすることによ
つて17−ヒドロキシプロゲステロンを生産するこ
とが可能である。この際、その変換率は95％以上
と非常に高い。17−ヒドロキシプロゲステロンは
菌体内に取り込まれることなく菌体外に分泌され
る。

従つて、遠心分離、濾過などにより酵母菌体を
培養液と分離し培養液から容易に17−ヒドロキシ
プロゲステロを回収することが可能である。ま
た、その酵母菌体は、再使用が可能である。プレ
グネノロンに関しても、同様の操作を行なうこと
により培養液中から17−ヒドロキシプレグネノロ
ンを回収することが可能である。しかし、この場
合、約50％以上が菌体内に取り込まれるので回収
率は前者に比し低下する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドpAα1の構築の概略を示
す。Ｅ，Ｈはそれぞれ制限酵素EcoRl，Hind
の切断部位を示す。□は翻訳領域を示す。第２図
は、AH22（pAα1）株生菌体のプロゲステロン17
位水酸化活性を示す図である。縦軸は17−ヒドロ
キシプロゲステロンへの交換率を横軸は培養時間
を示す。Aα1はAH22（pAα1）株をAAHはAH22
（pAAH5）株を示す。第３図は、AH22（pAα1）
株菌体から調製したミクロソーム画分のプロゲス
テロン17位水酸化活性を示す図である。2μM，
10μM，50μMは基質濃度を示す。縦軸は17−ヒ
ドロキシプロゲステロンへの変換率を、横軸は反
応時間を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵母アルコール脱水素酵素プロモーターおよ
   びウシ副腎のチトクロムｐ−450₁₇α遺伝子を保有
   することを特徴とする酵母内発現プラスミド ２ pAα1と名付けた特許請求の範囲第１項記載
   のプラスミド ３ 酵母アルコール脱水素酵素プロモーターおよ
   びウシ副腎のチトクロムｐ−450₁₇α遺伝子を保有
   することを特徴とする酵母内発現プラスミドで形
   質転換されＰ−450₁₇αを菌体内で産生する酵母菌
   株 ４ プラスミドpAα1によつて形質転換されチト
   クロムＰ−450₁₇αを菌体内で産生することを特徴
   とする特許請求の範囲第３項記載の酵母菌株 ５ サツカロミセス・セレビシエーAH22／
   pAα1と名付けた特許請求の範囲第３項記載の酵
   母菌株 ６ 酵母アルコール脱水素酵素プロモーターおよ
   びウシ副腎のチトクロムｐ−450₁₇α遺伝子を保有
   することを特徴とする酵母内発現プラスミドで形
   質転換されＰ−450₁₇αを菌体内で産生する酵母菌
   株を培養することを特徴とするウシ副腎チトクロ
   ムｐ−450₁₇αの生産方法 ７ 酵母アルコール脱水素酵素プロモーターおよ
   びウシ副腎のチトクロムｐ−450₁₇α遺伝子を保有
   することを特徴とする酵母内発現プラスミドで形
   質転換されＰ−450₁₇αを菌体内で産生する酵母菌
   株によりプロゲステロンあるいはプレグネノロン
   を水酸化することを特徴とする17−ヒドロキシプ
   ロゲステロンおよび17−ヒドロキシプレグネノロ
   ンの製造方法。