JPS6188878A - ラット肝チトクロムＰ−４５０ｍｃ遺伝子の酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＭＣ１の構築 - Google Patents
ラット肝チトクロムＰ−４５０ｍｃ遺伝子の酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＭＣ１の構築Info
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- JPS6188878A JPS6188878A JP59122953A JP12295384A JPS6188878A JP S6188878 A JPS6188878 A JP S6188878A JP 59122953 A JP59122953 A JP 59122953A JP 12295384 A JP12295384 A JP 12295384A JP S6188878 A JPS6188878 A JP S6188878A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ラット肝チトクロムＰ−４５０Ｍｃ遺伝子を
組込んだ岨換えプラスミド及びその艮造方法番こ関する
。
組込んだ岨換えプラスミド及びその艮造方法番こ関する
。
３−メチルコラントレン投与により誘導されるラット肝
チトクロムＰ−４５０ＭＣは還元型で一酸化炭素と結合
し、その差スペクトルが４４７ ｎｍに吸収極大を示す
ヘム蛋白質である。
チトクロムＰ−４５０ＭＣは還元型で一酸化炭素と結合
し、その差スペクトルが４４７ ｎｍに吸収極大を示す
ヘム蛋白質である。
このチトクロムＰ−４５０ＭＣは、ステロイドや脂肪酸
の代謝、外来の脂溶性有機化合物の酸化的代謝反応ある
いは化学変異剤の代謝活性化などに関与している。
の代謝、外来の脂溶性有機化合物の酸化的代謝反応ある
いは化学変異剤の代謝活性化などに関与している。
本発明は、この高い水酸化活性を有し、しかも基質特異
性の幅が広いチトクロムＰ−４５０ＭＣを酵母内で発現
させ、工業的なレベルでの酸化反応過程や、産業排水中
の有機化合物の口上除去等に応用することを可能にする
酵母内発現を目的とした発現プラスミドを提供する。
性の幅が広いチトクロムＰ−４５０ＭＣを酵母内で発現
させ、工業的なレベルでの酸化反応過程や、産業排水中
の有機化合物の口上除去等に応用することを可能にする
酵母内発現を目的とした発現プラスミドを提供する。
近年、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター
や酸性ホスファターゼなどのプロモーターを用い、異種
遺伝子のび母内発現を行った例がいくつか報告されてい
る。例えば、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原を１当り５Ｘ
ｌＯ分子まで発現させた例や、インターフェロンの発現
を行ったものなどである。酵母内異種遺伝子の発現実験
は、大Ｉｋ＃Ｉ菌を宿主とした発現実験に比較してまだ
その例は少ないが、近年益々、増加ろ水酸化活性を司ど
るチトクロムＰ−４５０ＭＣについては、発現を行った
報告はない。
や酸性ホスファターゼなどのプロモーターを用い、異種
遺伝子のび母内発現を行った例がいくつか報告されてい
る。例えば、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原を１当り５Ｘ
ｌＯ分子まで発現させた例や、インターフェロンの発現
を行ったものなどである。酵母内異種遺伝子の発現実験
は、大Ｉｋ＃Ｉ菌を宿主とした発現実験に比較してまだ
その例は少ないが、近年益々、増加ろ水酸化活性を司ど
るチトクロムＰ−４５０ＭＣについては、発現を行った
報告はない。
本発明番らは、チトクロムＰ−４５０ＭＣのａ４内発現
について、種々研究を行ない本発明を完成した。
について、種々研究を行ない本発明を完成した。
本発明の発現用プラスミドｐＡＭｃＩは、ラット肝チト
クロムＰ−４５０ＭＣ蛋白質の全コーディング領域をも
つ組換え体プラスミドｐＡＵ１５７より単離したチトク
ロムＰ−４５０ＭＣ造転子を、アルコール脱水素酵素（
以下ＡＤＨと略す）プロモーターを保持する発現ベクタ
ーｐムムＨ５へ組込むことにより構築することができる
。
クロムＰ−４５０ＭＣ蛋白質の全コーディング領域をも
つ組換え体プラスミドｐＡＵ１５７より単離したチトク
ロムＰ−４５０ＭＣ造転子を、アルコール脱水素酵素（
以下ＡＤＨと略す）プロモーターを保持する発現ベクタ
ーｐムムＨ５へ組込むことにより構築することができる
。
本発明で得られた酵母内発現を目的とした岨換え体プラ
スミドｐＡＭＯ１は、酵母の強力プロモーターであるＡ
Ｄｆｉプロモーターの下流に、高い水酸化活性を示すラ
ット肝のチトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子が連結してい
るうさらにチトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子の後部には
。
スミドｐＡＭＯ１は、酵母の強力プロモーターであるＡ
Ｄｆｉプロモーターの下流に、高い水酸化活性を示すラ
ット肝のチトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子が連結してい
るうさらにチトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子の後部には
。
ＡＤＨ遺伝子の転写終結シグナルが存在しているため、
ｐＡＭｃｌのＤＮＡ構造は、発現用プラスミドとして理
想的なものとなっている。
ｐＡＭｃｌのＤＮＡ構造は、発現用プラスミドとして理
想的なものとなっている。
このような構造をもつｐＡＭｃｌプラスミドを酵母価主
に導入し、大量発現を行うことにより、純粋なラット肝
チトクロムＩ’−４５０ＭＣ酵素を大量に分離、精製す
ることができる。得られたチトクロムＰ−４５０ＭＣ酵
素は、ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酊素とと
もに固定’−ｑ−−゛ を行う酵母菌体として開発し、バイオリアクターとしで
あるいは活性汚泥などと共に排水処理に応用することも
可能である。
に導入し、大量発現を行うことにより、純粋なラット肝
チトクロムＩ’−４５０ＭＣ酵素を大量に分離、精製す
ることができる。得られたチトクロムＰ−４５０ＭＣ酵
素は、ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酊素とと
もに固定’−ｑ−−゛ を行う酵母菌体として開発し、バイオリアクターとしで
あるいは活性汚泥などと共に排水処理に応用することも
可能である。
次に、実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例
ラット肝チトクロムＰ −４５０ＭＣ蛋白質の全コーデ
ィング領域をもつ組換え体プラスミドｐＡＵ１５７ （
Ｎｕｃｆｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １２゜ｐ
２９２９−２９８８ 、 Ｙａｂｕｓａｋｉ らの方
法により、製造することができろう第１ａ〜ＩＣ図参照
〕より、チトクロムＰ−４５０Ｍｃａ転子部分を単離し
、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）プロモーターを保持
する発現ベクターｐ Ａ ＡＨ５（ａｌｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｌ ０ １
、ｐａｒｔ （ｐｌ ９２−２０１−、 Ａｍｍｅ
ｒｅｒらの方法により製造することができる。）に接続
し、酵母自発現用プラスミドｐＡＭｃ１を以下のように
構築した。
ィング領域をもつ組換え体プラスミドｐＡＵ１５７ （
Ｎｕｃｆｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １２゜ｐ
２９２９−２９８８ 、 Ｙａｂｕｓａｋｉ らの方
法により、製造することができろう第１ａ〜ＩＣ図参照
〕より、チトクロムＰ−４５０Ｍｃａ転子部分を単離し
、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）プロモーターを保持
する発現ベクターｐ Ａ ＡＨ５（ａｌｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｌ ０ １
、ｐａｒｔ （ｐｌ ９２−２０１−、 Ａｍｍｅ
ｒｅｒらの方法により製造することができる。）に接続
し、酵母自発現用プラスミドｐＡＭｃ１を以下のように
構築した。
発現用プラスミド構築の第一段階としてチトクロムＦ−
４５０ＭＣ遺伝子の先頭に制限酵素部位５ａｌｌ を持
ち、後尾に制限酵素部位Ｈｉｎｄ １５ を持つ組換
え体プラスミドｐＴＦｌを構築した。第２図にその概要
を示すっ以下、４つのステップに分けて、構築の方法を
述べる ｌ−汀
ｌＯユニットの制限酵素（宝酒造） Ｐｓｔ Ｉを加え
、ｓ ｏ ｔｔｔのＰｓｔ！反応ＰＪ、 （２０ｒｒｍ
Ｔｒｉｓ−１ｌｃｌ 、 （ｐＪ：Ｈ，５） 、 １
０ ｍＷ Ｍ？ｃ！２ 、５０ｍΔ■（ＮＨ４）ｓ＋
８０＋ 、 ０．０１チ ウシ澁清アルブミン〕中で８
７°Ｃ１時間反応させた。反応故を０．１μ９７ｍ１の
臭化エチジウム（アルドリッチ社）を含む０．８％の低
融点アガロースゲル（ペセスダ・リサーチ社）に供し、
１００ｖで９０分電気体動じた。泳動後、紫外線ランプ
下で、ＤＮＡ断片墓（約８８０填基）に相当するゲル部
分を切り出し、エッペンドルフ管にとり、６５°Ｃで５
分間加熱した。ｍＩ！３ｖシたゲルに２倍量のＴＥ緩衝
に！Ｌ（１０ｍｔｈｔトリスー塩基（ｐＨ８，０） 、
０．５ ｍＭＥＤＴム〕 を却え、次にＴＥ緩＃液で
飽和したフェノールを等量加えて、フェノール抽出を行
ったウ ｌ Ｏ，ＯＯＯｒ、ｐ、ｍで５分遠心し、上層
を分取した後、２倍量の冷エタノールを加えて、−８０
°Ｃに１０分放置することによりＤＮＡをエタノール沈
殿した。その後、１０．００１ｐｍで１０分遠心し、約
１μグのＤＮＡ断片ｌを回収し、２０μ！の蒸留水に懸
濁した。
４５０ＭＣ遺伝子の先頭に制限酵素部位５ａｌｌ を持
ち、後尾に制限酵素部位Ｈｉｎｄ １５ を持つ組換
え体プラスミドｐＴＦｌを構築した。第２図にその概要
を示すっ以下、４つのステップに分けて、構築の方法を
述べる ｌ−汀
ｌＯユニットの制限酵素（宝酒造） Ｐｓｔ Ｉを加え
、ｓ ｏ ｔｔｔのＰｓｔ！反応ＰＪ、 （２０ｒｒｍ
Ｔｒｉｓ−１ｌｃｌ 、 （ｐＪ：Ｈ，５） 、 １
０ ｍＷ Ｍ？ｃ！２ 、５０ｍΔ■（ＮＨ４）ｓ＋
８０＋ 、 ０．０１チ ウシ澁清アルブミン〕中で８
７°Ｃ１時間反応させた。反応故を０．１μ９７ｍ１の
臭化エチジウム（アルドリッチ社）を含む０．８％の低
融点アガロースゲル（ペセスダ・リサーチ社）に供し、
１００ｖで９０分電気体動じた。泳動後、紫外線ランプ
下で、ＤＮＡ断片墓（約８８０填基）に相当するゲル部
分を切り出し、エッペンドルフ管にとり、６５°Ｃで５
分間加熱した。ｍＩ！３ｖシたゲルに２倍量のＴＥ緩衝
に！Ｌ（１０ｍｔｈｔトリスー塩基（ｐＨ８，０） 、
０．５ ｍＭＥＤＴム〕 を却え、次にＴＥ緩＃液で
飽和したフェノールを等量加えて、フェノール抽出を行
ったウ ｌ Ｏ，ＯＯＯｒ、ｐ、ｍで５分遠心し、上層
を分取した後、２倍量の冷エタノールを加えて、−８０
°Ｃに１０分放置することによりＤＮＡをエタノール沈
殿した。その後、１０．００１ｐｍで１０分遠心し、約
１μグのＤＮＡ断片ｌを回収し、２０μ！の蒸留水に懸
濁した。
）ｂｌ ：つぎに、調料したｌμｉのＤ Ｎ Ａ断片！
に１ユニツトの制限酵素８ａｕ３Ａｌ（宝酒造）ｋ加え
、６０ｔｔｌの８ａｕ ８ Ａ ｌ 反応液（１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨｃｌＣｐＨ７，５）、７ｍＭＭｐΔＩｓ
＋ ＣＩ ！ 、 １００ｍΔｌ Ｎａｃｌ ）中で８
７℃１時間反応させた後。
に１ユニツトの制限酵素８ａｕ３Ａｌ（宝酒造）ｋ加え
、６０ｔｔｌの８ａｕ ８ Ａ ｌ 反応液（１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨｃｌＣｐＨ７，５）、７ｍＭＭｐΔＩｓ
＋ ＣＩ ！ 、 １００ｍΔｌ Ｎａｃｌ ）中で８
７℃１時間反応させた後。
前述のようにフェノール抽出、エタノール沈殿の操作を
行い１）ＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水ヲこ懸濁しｔ
二。このＤＮＡは、１）ＮＡｉ５ｉ−Ｌバイオケミカル
社）に２ユニフトの゛ａ、ｉ−酵素Ｂａ酵素Ｂａｍ主１
造）および２ユニツトの制限酵素Ｐｓｔｌを加え、５０
ｐｌ ｆ） Ｂａｍ Ｈ１反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ −）Ｉｃｊ （ｐＨ８，０） 、 ７ｍＭ Ｍ
ｐｃｊ ！ 、 ｌｏＯｍＭ Ｎａｃｌ 、
２ｍ＆ｌ ２ − ／ ／レカブトエタノー
ル、０．０１％ウシ血清アルブミン〕中で８７°Ｃ１時
間反応し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、Ｄ
ＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁しｔ二。なも、
−制御 ” ｍ− グが可能である。 −０１，。
行い１）ＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水ヲこ懸濁しｔ
二。このＤＮＡは、１）ＮＡｉ５ｉ−Ｌバイオケミカル
社）に２ユニフトの゛ａ、ｉ−酵素Ｂａ酵素Ｂａｍ主１
造）および２ユニツトの制限酵素Ｐｓｔｌを加え、５０
ｐｌ ｆ） Ｂａｍ Ｈ１反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ −）Ｉｃｊ （ｐＨ８，０） 、 ７ｍＭ Ｍ
ｐｃｊ ！ 、 ｌｏＯｍＭ Ｎａｃｌ 、
２ｍ＆ｌ ２ − ／ ／レカブトエタノー
ル、０．０１％ウシ血清アルブミン〕中で８７°Ｃ１時
間反応し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、Ｄ
ＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁しｔ二。なも、
−制御 ” ｍ− グが可能である。 −０１，。
Ｉｌｌ ： （ｂｌおよび（Ｃ１で得たＤＮ人断片２０
μｌを混合し、５ユニツトのＴａ ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加えて、６０μＩのＴ４ＤＮ人りガーゼ反応液
（５５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｊｉｃ／（ｐＨ７，６） 、
６．６ｍΔＩＭｙｃ／Ｉ Ｑ ｍＷ ｄｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌ 、 ｌ、 Ｑ ｍＲｉＡＴ Ｐ ）中で
１６°Ｃ３時間反応した。反応後、反応液を（△（１ａ
ｃ−ｐｒｏ ） 、 ｔｈｉ 、 ５ｆｒＡ、 ５ｕｐ
Ｅ、 ｅｎｄ人。
μｌを混合し、５ユニツトのＴａ ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加えて、６０μＩのＴ４ＤＮ人りガーゼ反応液
（５５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｊｉｃ／（ｐＨ７，６） 、
６．６ｍΔＩＭｙｃ／Ｉ Ｑ ｍＷ ｄｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌ 、 ｌ、 Ｑ ｍＲｉＡＴ Ｐ ）中で
１６°Ｃ３時間反応した。反応後、反応液を（△（１ａ
ｃ−ｐｒｏ ） 、 ｔｈｉ 、 ５ｆｒＡ、 ５ｕｐ
Ｅ、 ｅｎｄ人。
５ｂｃＢ 、 ｈｓｄ Ｒ−、Ｆ’ｔｒａＤ３５ 、
ｐｒｏＡＪＪ 、 ／ａｃｌｑ。
ｐｒｏＡＪＪ 、 ／ａｃｌｑ。
ｔΔ４５Ｐ−Ｌバイオケミカル社より入手 〕に形式転
換した、 大腸菌の培養にはＬＢ培地（１）当り１０１ホリペプト
ン、５２イーストエキストラクト、５ ｙ Ｎａｃｌを
含む）を用い、ＬＢプレート培地には、ＬＢ培地１ｊに
１２９の寒天を加えｔ二ものを用いたつ以後も同様であ
るＱ （＋−＋−。
換した、 大腸菌の培養にはＬＢ培地（１）当り１０１ホリペプト
ン、５２イーストエキストラクト、５ ｙ Ｎａｃｌを
含む）を用い、ＬＢプレート培地には、ＬＢ培地１ｊに
１２９の寒天を加えｔ二ものを用いたつ以後も同様であ
るＱ （＋−＋−。
（ｆ
目的とするｌ） Ｎ Ａ ｉＱ１片夏＃をクローニジ？
°、！ろ、 ’ｃ＝＝ ため、Ｒｕｔｈｅｒらの方法（Ｍｏｌ 、Ｇｅｎ、 （
Ｊｅｎ４ｔ！、ｃｓ。
°、！ろ、 ’ｃ＝＝ ため、Ｒｕｔｈｅｒらの方法（Ｍｏｌ 、Ｇｅｎ、 （
Ｊｅｎ４ｔ！、ｃｓ。
１７８ ｐ４７５−４７７） に従い、２００゛μ２
Ｎの５−ブロム−４−クロル−３−インドリル−！−Ｄ
−ガラクトシド（牛丼化学）、ン（シグマ社）を含むＬ
１３プレートに、形式転換体を広げ、青色コロニーの中
に出現する白色コロニーを単離した。つぎにＢ ｉ ｒ
ｎｂｏｉｍらの方法（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ、 Ｂｅ
ｓ ７ ｐ１５１３−１５２８）に従って該白色コロニ
ーよりプラスミドＤＮＡを単離し、１μりのプラスミド
ＤＮＡに対し、ｌユニットの制限酵紫ハ」■およびｌユ
ニットの制限酵素Ｐｓｔｌ′！：ｒ：ＩＩＩえて、Ｐｓ
ｔ１反応故中で３７ ’０１時間反応した後で、０．８
襲のアガロース電気原動で分析し、ＤＮＡ断片Ｉを組み
込んだ組換え体プラスミドを辺択し、 ｐＮＦＩとし
た。なお、アガロースは。
Ｎの５−ブロム−４−クロル−３−インドリル−！−Ｄ
−ガラクトシド（牛丼化学）、ン（シグマ社）を含むＬ
１３プレートに、形式転換体を広げ、青色コロニーの中
に出現する白色コロニーを単離した。つぎにＢ ｉ ｒ
ｎｂｏｉｍらの方法（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ、 Ｂｅ
ｓ ７ ｐ１５１３−１５２８）に従って該白色コロニ
ーよりプラスミドＤＮＡを単離し、１μりのプラスミド
ＤＮＡに対し、ｌユニットの制限酵紫ハ」■およびｌユ
ニットの制限酵素Ｐｓｔｌ′！：ｒ：ＩＩＩえて、Ｐｓ
ｔ１反応故中で３７ ’０１時間反応した後で、０．８
襲のアガロース電気原動で分析し、ＤＮＡ断片Ｉを組み
込んだ組換え体プラスミドを辺択し、 ｐＮＦＩとし
た。なお、アガロースは。
和光純薬より１）Ｊ考入したう
ｔｅ＋ ： ｎ述（７） Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ らの方
法に従い％５μ９のｐＮＦＬ １）ＮＡｔ’！Ｉ製し
、５ユニ７ トのＤＩ限酵素士二１（宝酒造）を加えて
、５０μｌのＳｍａｌ 反応Ｋｌ （ｌ Ｑ ｍＭＴ
ｈｉｓ−１）ｃｌ、（ｐｉｆ８．０ ） 、 ７ ｍＡ
Ｉ ｈ１９ｃ！２ 、２ ＱｍＭＮｃｌ、 ７ｍ）Ｅ
２−メルカプトエタノール、０．０１％ウシ皿ｌ＃＃ア
ルブミン）中で３７ ’Ｃ１時間反応し、ＤＮＡを回収
し、２０μｌの蒸留水に懸１蜀した。
法に従い％５μ９のｐＮＦＬ １）ＮＡｔ’！Ｉ製し
、５ユニ７ トのＤＩ限酵素士二１（宝酒造）を加えて
、５０μｌのＳｍａｌ 反応Ｋｌ （ｌ Ｑ ｍＭＴ
ｈｉｓ−１）ｃｌ、（ｐｉｆ８．０ ） 、 ７ ｍＡ
Ｉ ｈ１９ｃ！２ 、２ ＱｍＭＮｃｌ、 ７ｍ）Ｅ
２−メルカプトエタノール、０．０１％ウシ皿ｌ＃＃ア
ルブミン）中で３７ ’Ｃ１時間反応し、ＤＮＡを回収
し、２０μｌの蒸留水に懸１蜀した。
約２ ｔｔＷ Ｉ） コｆ） ｉ） Ｎ ＡＪｒｔｔに
、２μノの８ａ１）リシカー（宝酒造）および１０ユニ
ツトのＴ４υＮ人リガーゼｔｍ、ｔ、６０ ｐｌｆ）Ｔ
４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼで１６°Ｃ８時間反応した。
、２μノの８ａ１）リシカー（宝酒造）および１０ユニ
ツトのＴ４υＮ人リガーゼｔｍ、ｔ、６０ ｐｌｆ）Ｔ
４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼで１６°Ｃ８時間反応した。
つぎに反応欣をＣｏｈｅｎらの方法に従い、大腸ｒｔ４
（ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｌ）ｆｉｌ
（ｆ−、ｒｅｃＡｓ。
（ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｌ）ｆｉｌ
（ｆ−、ｒｅｃＡｓ。
ｅｎｄ Ａｓ 、 ｇｙｒム９５ 、 ｔｈｉ−１、ｈ
ｓｄｌＬ１７ 、５ｕｐＥ４４、λ−凡用大学医学部遺
伝情報施設保存菌株、住友化学工業株式会社宝壕総合研
死所にても保存）に形式転換し、２５μ２／−のアンピ
シリ〉を含むＬＢプレート匡広げた。
ｓｄｌＬ１７ 、５ｕｐＥ４４、λ−凡用大学医学部遺
伝情報施設保存菌株、住友化学工業株式会社宝壕総合研
死所にても保存）に形式転換し、２５μ２／−のアンピ
シリ〉を含むＬＢプレート匡広げた。
得られたコロニよりプラスミドＤＮＡを調製し、１μノ
のプラスミドＤＮＡに対して１ユニ、トの制限酵素８ａ
／ Ｉ （宝酒造）を加え、５０ ｔｔｌ の反応ｆｉ
（ｌ Ｑ ｍＭ ’Ｉ’ｒ ｉ ５−ｋｉｃｌ 。
のプラスミドＤＮＡに対して１ユニ、トの制限酵素８ａ
／ Ｉ （宝酒造）を加え、５０ ｔｔｌ の反応ｆｉ
（ｌ Ｑ ｍＭ ’Ｉ’ｒ ｉ ５−ｋｉｃｌ 。
（ｐＨ７，５） 、 ７ ｎ＋ｍｓＬ ｐｉ シ
ＩｃＩ！ 、 １ ７ ５ ｍＡＩ Ｎａｃ
！ 。
ＩｃＩ！ 、 １ ７ ５ ｍＡＩ Ｎａｃ
！ 。
０．２ｍＭｋ：、υ’ｉ’Ａ、７ｍΔ１２−ｉ／ｌ／カ
プトエタール〕甲で８７°Ｃ１時間反応し、従来通り０
．８％のアカロースγこ気ｖＫ鋤で分析し、制限酵素１
区ｌで切断されるプラスミドを選択し、イむられた″“
Ｅ Ｆｔ”ＰＮｆ ２ ｈＬｔｆ；・ 、７−２−
＋二フトの制限酵素、とｖｕｌｌ（宝酒造）を加え、
５０ ａｔ の反応［（２０ｍＷ Ｔｒｉｓ−ＨＣ／
。
プトエタール〕甲で８７°Ｃ１時間反応し、従来通り０
．８％のアカロースγこ気ｖＫ鋤で分析し、制限酵素１
区ｌで切断されるプラスミドを選択し、イむられた″“
Ｅ Ｆｔ”ＰＮｆ ２ ｈＬｔｆ；・ 、７−２−
＋二フトの制限酵素、とｖｕｌｌ（宝酒造）を加え、
５０ ａｔ の反応［（２０ｍＷ Ｔｒｉｓ−ＨＣ／
。
（ｐＨ７，５） 、 ｌＯｍＭＭｙｃｊｚ 、 ５Ｑｍ
Ｍ（Ｎｆ（４） ！８０４ 、０．０１ ％ ウシ血
清アルブミン〕中で。
Ｍ（Ｎｆ（４） ！８０４ 、０．０１ ％ ウシ血
清アルブミン〕中で。
８７°Ｃ１時間反応させた。反応液を０，８％の低融点
アガロースゲル’ｔｌｌ気泳動で分析し、目的のＤＮＡ
断面酊を前述の方法に従い、単離した。
アガロースゲル’ｔｌｌ気泳動で分析し、目的のＤＮＡ
断面酊を前述の方法に従い、単離した。
（ｂ）：約１ ａｔ９ のＤＮＡ断片頂に１ユニツトの
制限Ｇ素１狂３ＡＸを加え、５０μｊの士！８λ１反応
筬中で、８７°Ｃ，１時間反応させた後、Ｄ Ｎ Ａを
回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。
制限Ｇ素１狂３ＡＸを加え、５０μｊの士！８λ１反応
筬中で、８７°Ｃ，１時間反応させた後、Ｄ Ｎ Ａを
回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。
（Ｃ）ニステップ１ （Ｃ）と同じ操作を行い、制限酵
素Ｂａｍｊ（ｔおよびＰｓｔｌで切断されたクローニン
グベクターｐＵｃ ｇ Ｄ Ｎ Ａ を調製しｔ二。
素Ｂａｍｊ（ｔおよびＰｓｔｌで切断されたクローニン
グベクターｐＵｃ ｇ Ｄ Ｎ Ａ を調製しｔ二。
（ｄｌ ： Ｌｂ）および（Ｃ）で得たＤＮＡ断片２０
μｊ を混合し、５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼをｎ
口えて、６０μｌのＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ反応液中で１
６°Ｃ３時間反応したう反応後、ステ、ブ１ （ｄｌと
同様に、反応Ｆｊ、を大腸菌（ｈＳＣｔｌｅｒｌＣｔｌ
ｌａＣＯ７ａ）１３１）０３株に形質転換し、白色コロ
ニーを選択した。この白色コロニーよりプラスミドＤＮ
Ａを単心し、１μノのプラスミドＤＮＡに対し、ｌユニ
ットの制限酵素ｐｓｔ １およびｌユニットの制限酵素
８ｍａ Ｉを加えて、８７°Ｃで１時間反応し、０．８
％のアガロース電気体動で分析することにより、ＤＮＡ
断片■を組込んだプラスミドを選択し、ｐ（、Ｆｌとし
たう（ｅ） つぎに旧ｒｎｂｏｉｍ らの方法に従
い、５μりのｐｃＦＩ ＤＮＡをムフ製し、５ユニツ
トの制限酵素−助１ａ ｌを加えて５５０ｔｔｌのＳｍ
ａ１反応ｔＴＹ中で３７ ”Ｃ１時間反応し、ＤＮＡを
回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。約２μノのこの
ＤＮＡ溶液に、２μりのＨｉｎｄｌ）ｌ ｊンカー（宝
酒造）および１０ユニツトのｉ”４ＤｋＡリガーゼを加
え、６０μｌのＴ４Ｌ）ＮＡリガーゼ反応液中で１６”
０１時間、反応した。つぎに反応［−大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＪ Ｄａ １に前述と同様の
方法で形質転換し、得られたコロニーよりプラスミドＩ
）ＮＡを調製した。
μｊ を混合し、５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼをｎ
口えて、６０μｌのＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ反応液中で１
６°Ｃ３時間反応したう反応後、ステ、ブ１ （ｄｌと
同様に、反応Ｆｊ、を大腸菌（ｈＳＣｔｌｅｒｌＣｔｌ
ｌａＣＯ７ａ）１３１）０３株に形質転換し、白色コロ
ニーを選択した。この白色コロニーよりプラスミドＤＮ
Ａを単心し、１μノのプラスミドＤＮＡに対し、ｌユニ
ットの制限酵素ｐｓｔ １およびｌユニットの制限酵素
８ｍａ Ｉを加えて、８７°Ｃで１時間反応し、０．８
％のアガロース電気体動で分析することにより、ＤＮＡ
断片■を組込んだプラスミドを選択し、ｐ（、Ｆｌとし
たう（ｅ） つぎに旧ｒｎｂｏｉｍ らの方法に従
い、５μりのｐｃＦＩ ＤＮＡをムフ製し、５ユニツ
トの制限酵素−助１ａ ｌを加えて５５０ｔｔｌのＳｍ
ａ１反応ｔＴＹ中で３７ ”Ｃ１時間反応し、ＤＮＡを
回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。約２μノのこの
ＤＮＡ溶液に、２μりのＨｉｎｄｌ）ｌ ｊンカー（宝
酒造）および１０ユニツトのｉ”４ＤｋＡリガーゼを加
え、６０μｌのＴ４Ｌ）ＮＡリガーゼ反応液中で１６”
０１時間、反応した。つぎに反応［−大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＪ Ｄａ １に前述と同様の
方法で形質転換し、得られたコロニーよりプラスミドＩ
）ＮＡを調製した。
得られた１μノ のプラスミドＤＮＡに対してｌユニッ
トの制限酵素±ｌ／Ｉ を加え、５０μｌのＨｉｎｄｌ
ｌｌ 反応Ｑ ［ｌ ＯｍＭ Ｔｒ １ｓ−１）ｃｌ
。
トの制限酵素±ｌ／Ｉ を加え、５０μｌのＨｉｎｄｌ
ｌｌ 反応Ｑ ［ｌ ＯｍＭ Ｔｒ １ｓ−１）ｃｌ
。
（ｐＨ７，５） 、 ７ｍＭ ｆ’１ｐＯＩｚ 、
６０ｍＡｌ Ｎａｃ１３中で８７°Ｃ１時間反応し、
０．８％アガロース電気泳動で分析し、制限酵素Ｍｉｎ
ｄｆｕｌ で切、析されるプラスミドを選択し、得ら
れたプラスミドをｐＣＦ２とした。
６０ｍＡｌ Ｎａｃ１３中で８７°Ｃ１時間反応し、
０．８％アガロース電気泳動で分析し、制限酵素Ｍｉｎ
ｄｆｕｌ で切、析されるプラスミドを選択し、得ら
れたプラスミドをｐＣＦ２とした。
ステップ８ 組換え体プラスミドｐＮｏ １のＷ ｍ（
ａ）５μｓ１のｐＮｋ”ｌ Ｌ）ＮＡに５ユニツトの制
ＶＨ５，’ｊ素Ｐｓｔｌ および５ユニツトの制限酵素
ｕｉｎｃ１辺を加え％ ５０ ｉ’ｌ （’） １）
ｒ ｎｄ Ｉ［１反応液中で３７°Ｃ１時間反応し、
ＤＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水憂こ懸濁した。
ａ）５μｓ１のｐＮｋ”ｌ Ｌ）ＮＡに５ユニツトの制
ＶＨ５，’ｊ素Ｐｓｔｌ および５ユニツトの制限酵素
ｕｉｎｃ１辺を加え％ ５０ ｉ’ｌ （’） １）
ｒ ｎｄ Ｉ［１反応液中で３７°Ｃ１時間反応し、
ＤＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水憂こ懸濁した。
ｌｂｌ ５．ＩＬｖｐｃＦ２ ＤＮｋｉＣツＬ’ｃ
同様ｆ）操作４行い、ＤＮＡを回収後、０．８％の低融
点アガロースゲル電気泳動で分析り、 、但１−Ｈｌｎ
ｄｌｌｌ の小さい方のＬＩＮＡ断片をゲルより切り
出し、フェノール抽出、エタノール沈殿後、ＤＮＡ断片
を回収し、２０μｊの蒸留水に懸濁した。
同様ｆ）操作４行い、ＤＮＡを回収後、０．８％の低融
点アガロースゲル電気泳動で分析り、 、但１−Ｈｌｎ
ｄｌｌｌ の小さい方のＬＩＮＡ断片をゲルより切り
出し、フェノール抽出、エタノール沈殿後、ＤＮＡ断片
を回収し、２０μｊの蒸留水に懸濁した。
（Ｃ） （ａ）および（ｂ）でｉ？！ｆｉしたＤＮＡ
溶液２０ ｔｉｔを混合し、５ユニツトのＩ’ＡＤＮ人
リガーセリガーゼ６０μｊのＴａＤＮＡリガーゼ反応液
中で１６’０８時間反応した。得られた反応液を従来通
りの方法で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）ＤＩｉｌへ形質転換し、出現コロニーよりプラスミド
ＤＮＡ″に調製した。得られた１μ２ のプラスミドＤ
ＮＡに対して、１ユニツトの制御！ヒ素８ａｚ ｔおよ
びｌユニットの制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ を加え、５
０μｌの且巨ｄｏｌ１反応液中で８７ ’Ｃ１時間反応
し、０．８％のアガロース電気泳動で分析した。目的と
する構造を保持するプラスミドを選択し％ ｐＮＣｌと
したうステップ４ 組換え体プラスミドｐＴＦｌの構築
（ａｌｌμＦのｐＮＣＩ ＤＮＡに対してｌユニット
の制限酵素ｐｓｔ １を加え、５０ μ１ｖ）ｐｓｔ
１反応液中で８７°Ｃ１時間反応し％ＤＮＡを回収し％
２０μｌの蒸留水１こ懸濁した。このＤＮＡｇｉに１
．５ユニツトのアルカリフォスファターゼ（宝酒造）を
加え、１００μｌのアルカリフォスファターゼ反応液（
５０ｍＭＴｒｉｓ −Ｈｃｌ 、 （ｐＨ８，０） ）
中で６０℃６０分反応させｔニウ反応後、フェノール抽
出を２回行い、エタノール沈殿後、ＤＮＡを回収し２０
μｌの蒸留水に懸濁した。
溶液２０ ｔｉｔを混合し、５ユニツトのＩ’ＡＤＮ人
リガーセリガーゼ６０μｊのＴａＤＮＡリガーゼ反応液
中で１６’０８時間反応した。得られた反応液を従来通
りの方法で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）ＤＩｉｌへ形質転換し、出現コロニーよりプラスミド
ＤＮＡ″に調製した。得られた１μ２ のプラスミドＤ
ＮＡに対して、１ユニツトの制御！ヒ素８ａｚ ｔおよ
びｌユニットの制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ を加え、５
０μｌの且巨ｄｏｌ１反応液中で８７ ’Ｃ１時間反応
し、０．８％のアガロース電気泳動で分析した。目的と
する構造を保持するプラスミドを選択し％ ｐＮＣｌと
したうステップ４ 組換え体プラスミドｐＴＦｌの構築
（ａｌｌμＦのｐＮＣＩ ＤＮＡに対してｌユニット
の制限酵素ｐｓｔ １を加え、５０ μ１ｖ）ｐｓｔ
１反応液中で８７°Ｃ１時間反応し％ＤＮＡを回収し％
２０μｌの蒸留水１こ懸濁した。このＤＮＡｇｉに１
．５ユニツトのアルカリフォスファターゼ（宝酒造）を
加え、１００μｌのアルカリフォスファターゼ反応液（
５０ｍＭＴｒｉｓ −Ｈｃｌ 、 （ｐＨ８，０） ）
中で６０℃６０分反応させｔニウ反応後、フェノール抽
出を２回行い、エタノール沈殿後、ＤＮＡを回収し２０
μｌの蒸留水に懸濁した。
（ｂ）ｌｏＩＪｆ！のｐＡＬＪ ｌ ５７ プラスミ
ドＤＮＡにｌＯｌユニット制限酵素ヱ已！を加え、５０
μ１Ｑｐｓｔｌ 反応液中で８７°Ｃ１時間反応させ
、ＤＮＡを回収した。０．８襲の７ガロースゲル電気泳
動を行い、ＤＮＡ断片ｎに相当するゲル部分を切り出し
、ＤＮＡを回収し、２０μ！の蒸留水に懸濁した。
ドＤＮＡにｌＯｌユニット制限酵素ヱ已！を加え、５０
μ１Ｑｐｓｔｌ 反応液中で８７°Ｃ１時間反応させ
、ＤＮＡを回収した。０．８襲の７ガロースゲル電気泳
動を行い、ＤＮＡ断片ｎに相当するゲル部分を切り出し
、ＤＮＡを回収し、２０μ！の蒸留水に懸濁した。
（ｅ） （ａ）および（ｂ）で調製したＤＮＡ溶［２
０＃１を混合し、５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、６０μｌのＴａ１）Ｎムリガーゼ反応液で１６°Ｃ
，８時ｒｍ反応させた。反応後、反応液を大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１株に形質転換
した。
０＃１を混合し、５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、６０μｌのＴａ１）Ｎムリガーゼ反応液で１６°Ｃ
，８時ｒｍ反応させた。反応後、反応液を大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１株に形質転換
した。
（ｄＪ 得られたコロニーよりプラスミドＬ）Ｎ人を
調製し、１μノ のプラスミドＤＮＡに対して１ユニツ
トの制限酵素思１およびｌユニットの制限酵素Ｈｉｎｄ
［ｉｌ を加え、５０μｌのとａｍ反応液中で３７°
Ｃ１時間反応し、０．８茶の７ガロース電気泳動で分析
した。分析したプラスミドのうち、約１．３ Ｋｂ の
ＤＮＡ断片を組み込んだものをまず選択したつＤＮＡ断
片■には、その方向性により２通りの組み込みが考えら
れるので、さらにプラスミドＤＮＡの構造を分析した。
調製し、１μノ のプラスミドＤＮＡに対して１ユニツ
トの制限酵素思１およびｌユニットの制限酵素Ｈｉｎｄ
［ｉｌ を加え、５０μｌのとａｍ反応液中で３７°
Ｃ１時間反応し、０．８茶の７ガロース電気泳動で分析
した。分析したプラスミドのうち、約１．３ Ｋｂ の
ＤＮＡ断片を組み込んだものをまず選択したつＤＮＡ断
片■には、その方向性により２通りの組み込みが考えら
れるので、さらにプラスミドＤＮＡの構造を分析した。
上記のプラスミド１μ）に対して、ｌユニットの制限酵
素旦罰ｄ１）１およびｌユニットの制限酵素１阻１にッ
ポンジーシ）全加え、５０μｌのｓｔｕ １反応液（１
ｏ ｍＭ’ｌ’ｒｉｓ−Ｍｃｔ 、 （ｐＨ７，５）
、 ｌｏ 。
素旦罰ｄ１）１およびｌユニットの制限酵素１阻１にッ
ポンジーシ）全加え、５０μｌのｓｔｕ １反応液（１
ｏ ｍＭ’ｌ’ｒｉｓ−Ｍｃｔ 、 （ｐＨ７，５）
、 ｌｏ 。
ｍＭＮａｃｌ 、 １ｇｍＭΔＬｙｃ１ｇ 、 （ｉ
ｍ旦２−メルカプトエタノール、０．１ ｊｌｙ／−ウ
シ血！１）アルブミシ〕中で８７°Ｃ１時間反応し、０
．８％のアガロースゲル１気泳動で分析した。分析した
プラスミドのうち、１）ＮＡｌｌ造が、ＬＩＮＡＩｆｒ
片ｔ”−ｎ−ｍ’という順方向に接続ものを選択し、ｐ
ＴＦｌ プラスミドとした。
ｍ旦２−メルカプトエタノール、０．１ ｊｌｙ／−ウ
シ血！１）アルブミシ〕中で８７°Ｃ１時間反応し、０
．８％のアガロースゲル１気泳動で分析した。分析した
プラスミドのうち、１）ＮＡｌｌ造が、ＬＩＮＡＩｆｒ
片ｔ”−ｎ−ｍ’という順方向に接続ものを選択し、ｐ
ＴＦｌ プラスミドとした。
■ 発現用プラスミドｐＡΔ［０１の構築Ｉで構築した
ｐＴＦ ｌプラスミドより、ラット肝チトクロムＰ−、
ａｓＯＭｃＪ転子部分を取り出し、ムυＨプロモーター
を保持する酵母発現ベクターｐＡＡＬＬ ５ （Ｗａｓ
ｈｊｇｔｏｎ ＲＪｒａｗｙｃｔ＞ｋ’ｏｕｎ”’ｄａ
ｔｉｏｎより入手、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｃ＋Ｉｎｇｙ。
ｐＴＦ ｌプラスミドより、ラット肝チトクロムＰ−、
ａｓＯＭｃＪ転子部分を取り出し、ムυＨプロモーター
を保持する酵母発現ベクターｐＡＡＬＬ ５ （Ｗａｓ
ｈｊｇｔｏｎ ＲＪｒａｗｙｃｔ＞ｋ’ｏｕｎ”’ｄａ
ｔｉｏｎより入手、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｃ＋Ｉｎｇｙ。
１０１ ｐａｒｔＣｐ １９２−２０１ 、Ａｍｍｅｒ
ｅｒらの方法により、製造することができる。）１こ組
み込み％発現用プラスミドｐＡΔＩＣ１ｋｌ＋（ｉした
う第３図にその概要を示す。以下８つのステップに分け
て（ζ゛１築の方法を述べる。
ｅｒらの方法により、製造することができる。）１こ組
み込み％発現用プラスミドｐＡΔＩＣ１ｋｌ＋（ｉした
う第３図にその概要を示す。以下８つのステップに分け
て（ζ゛１築の方法を述べる。
ステ、ブｌ：ラット肝チトクロム遺伝子を含む１．８Ｋ
ｂのｈｌｉｎｄｌｌ断片の単離ｌａ） ： ｌμ２のｐ
’ｒｋ’ ｌプラスミドに５ユニツトの制限酵素Ｓａｔ
ｓを加え５５０ｓｌのＳａｇ １ 反応液中で８７
°Ｃ１時間反応し％ＤＮ人を回収し、２０μｊの蒸留水
に懸濁した。つぎに、このＤＮＡｇｉに、２ユニツトの
大腸菌ポリメラーゼＩのクルーノ・フラグメントを加え
、５０ａｔ のポリメラーゼ反応液（４０ｍＭＫＰＯ４
（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭＭ９ｃｌ＊ 、１．９ｍＭ
２−）ルカプトエタノール、８８μｊｉｌｄＮＴＦ）
中で３７°Ｃ１時間反応した。反応後、ＤＮＡを回収
し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。得られたＬ）ＮＡ溶
欣２０μ／に、約ｌｔ１りのＨｉｎ ｄ ｍリンカ−お
よび８ユニツトのＴ４ ＤＮＡリガーセを加え、６０μ
ｌのＴ４１）ＮＡリガーゼ反応液中で１６°Ｃ８時間反
応した。反応後、反応液を大腸菌Ｍ １株に形質転換
し、得られたコロニーよりプラスミドＩ）ＮＡを調製し
た。
ｂのｈｌｉｎｄｌｌ断片の単離ｌａ） ： ｌμ２のｐ
’ｒｋ’ ｌプラスミドに５ユニツトの制限酵素Ｓａｔ
ｓを加え５５０ｓｌのＳａｇ １ 反応液中で８７
°Ｃ１時間反応し％ＤＮ人を回収し、２０μｊの蒸留水
に懸濁した。つぎに、このＤＮＡｇｉに、２ユニツトの
大腸菌ポリメラーゼＩのクルーノ・フラグメントを加え
、５０ａｔ のポリメラーゼ反応液（４０ｍＭＫＰＯ４
（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭＭ９ｃｌ＊ 、１．９ｍＭ
２−）ルカプトエタノール、８８μｊｉｌｄＮＴＦ）
中で３７°Ｃ１時間反応した。反応後、ＤＮＡを回収
し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。得られたＬ）ＮＡ溶
欣２０μ／に、約ｌｔ１りのＨｉｎ ｄ ｍリンカ−お
よび８ユニツトのＴ４ ＤＮＡリガーセを加え、６０μ
ｌのＴ４１）ＮＡリガーゼ反応液中で１６°Ｃ８時間反
応した。反応後、反応液を大腸菌Ｍ １株に形質転換
し、得られたコロニーよりプラスミドＩ）ＮＡを調製し
た。
１μノのプラスミドＬ）ＮＡに対してｌユニ。
トの制限酵素ＬＩｉｎｄ瓜 を加え、５０μｌのＨｉｎ
ｄＥＩＩ 反応液中で８７°Ｃ１時間反応させ、反応後
、０．８％の７ガロースゲル電気泳動で分析した。調べ
たプラスミドのうち、約１．８ＫｂのＨｉｎｄ Ｉ断片
を組込んだものを選択し、ＰＴＦ ２とした。
ｄＥＩＩ 反応液中で８７°Ｃ１時間反応させ、反応後
、０．８％の７ガロースゲル電気泳動で分析した。調べ
たプラスミドのうち、約１．８ＫｂのＨｉｎｄ Ｉ断片
を組込んだものを選択し、ＰＴＦ ２とした。
（ｂ） ： ２μｙのｐＴＦ２ ＤＮＡに２ユニツトの
制限酵素見損ｄｉ を加え、５０μｌのＨｉ ｎ ｄ
盟 反応液中で８７°Ｃ２時間させた後、ＤＮＡを回収
した。得られたＤＮＡ溶液を０．８％の低融点アガロー
スゲルに供し、電気泳動後％ １．８Ｋｂ の胆ｄ ！
ｉ ＤＮＡ Ｉｆｒ片をゲルより切り出し、ＤＮＡ１回
収し、２０μｌ の蒸留水に懸濁した。
制限酵素見損ｄｉ を加え、５０μｌのＨｉ ｎ ｄ
盟 反応液中で８７°Ｃ２時間させた後、ＤＮＡを回収
した。得られたＤＮＡ溶液を０．８％の低融点アガロー
スゲルに供し、電気泳動後％ １．８Ｋｂ の胆ｄ ！
ｉ ＤＮＡ Ｉｆｒ片をゲルより切り出し、ＤＮＡ１回
収し、２０μｌ の蒸留水に懸濁した。
（（：ｌ ： ０．５μ２のＡＤｋＬプロモーターを保
持する酵母発現用ペクｐ −ｐＡＡＩｉ ５ （Ｗａｓ
ｈｔｇｔｏｎ 、 −、’１′ Ｒｅｓ区ｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎより入手した＞ ＋
ａ ；−ｔユニットの制限酵素Ｂｉｎｄｌ を加え、５
０．μｌの旦ｉｎｄ ｉｌ１反応液中で、３７°Ｃ１時
間反応し、ＤＮＡを回収後、２０μｌの蒸留水に懸濁し
た。このＤＮム溶肢２０μｊ に２．０ユニツトのアル
カリフォスファターゼを加え、ｉｏ。
持する酵母発現用ペクｐ −ｐＡＡＩｉ ５ （Ｗａｓ
ｈｔｇｔｏｎ 、 −、’１′ Ｒｅｓ区ｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎより入手した＞ ＋
ａ ；−ｔユニットの制限酵素Ｂｉｎｄｌ を加え、５
０．μｌの旦ｉｎｄ ｉｌ１反応液中で、３７°Ｃ１時
間反応し、ＤＮＡを回収後、２０μｌの蒸留水に懸濁し
た。このＤＮム溶肢２０μｊ に２．０ユニツトのアル
カリフォスファターゼを加え、ｉｏ。
μｌのアルカリフォスファターゼ反応液中で６０℃６０
分反応させた。反応後、フェノール抽出を２回行い、エ
タノール沈殿後、ＤＮＡを回収し２０μｔの蒸留水に懸
濁した。
分反応させた。反応後、フェノール抽出を２回行い、エ
タノール沈殿後、ＤＮＡを回収し２０μｔの蒸留水に懸
濁した。
（ｄ） ： （ｂ）およびｔｃ＋で１，１裂したＤ Ｎ
Ａ溶ｆＬ２０μｌを混合し、２ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを加え、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ反応液中で１６
”Ｃ３時間反応させた。反応後、反応液を大腸菌ＬＩＨ
ｌ に形質転換し、得られたコロニーよりプラスミドＬ
）ＮＡをａう１製した。１μ７のプラスミドＤＮＡに対
してｌユニットの制限酵素見立ｄ１ｍｌを加え、５０μ
ｌのＨｉｎｄｌｌ［反応液中で８７ ”０１時間反応さ
せ、反応後、０６８％のアガロースゲル電気泳動で分析
した。分析したプラスミドのうち、約１，３Ｋｂ のＤ
ＮＡ断片を組み込んだものを辺択した。得られたプラス
ミドの中には、ＡＤＩＩプロモーターとは逆向きに１．
Ｂｘｂ の匹堕ｄｆｆｌＤＮＡ断片が接続したものがあ
る。そこで、選択したプラスミドＤＮＡ１μ２ に対し
て、ｌユニットの制限酵素ｓｔｕ １およびｌユニット
の制限酵素互ａｍＨｔを加え、５０μｊのｌジｔｔｉ
反応液中で８７°Ｃ１時間反応した。反応後、反応ａ
を０．８襲のアガロース電気泳動で分析し、発現ベクタ
ーｐＡＡＨ５から生じる１）ＮＡ断片以外に２，７Ｋｂ
ＤＮＡ断片と１．ｌＫｂ のＤ Ｎ Ａ 、ｆｒ片が検
出されるプラスミドを選択した。このプラスミドは、人
Ｄａプロモーターと順方向にチトクロム遺伝子が接続し
ており、ｐＡΔＩＣ１と名付けｔ；。
Ａ溶ｆＬ２０μｌを混合し、２ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを加え、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ反応液中で１６
”Ｃ３時間反応させた。反応後、反応液を大腸菌ＬＩＨ
ｌ に形質転換し、得られたコロニーよりプラスミドＬ
）ＮＡをａう１製した。１μ７のプラスミドＤＮＡに対
してｌユニットの制限酵素見立ｄ１ｍｌを加え、５０μ
ｌのＨｉｎｄｌｌ［反応液中で８７ ”０１時間反応さ
せ、反応後、０６８％のアガロースゲル電気泳動で分析
した。分析したプラスミドのうち、約１，３Ｋｂ のＤ
ＮＡ断片を組み込んだものを辺択した。得られたプラス
ミドの中には、ＡＤＩＩプロモーターとは逆向きに１．
Ｂｘｂ の匹堕ｄｆｆｌＤＮＡ断片が接続したものがあ
る。そこで、選択したプラスミドＤＮＡ１μ２ に対し
て、ｌユニットの制限酵素ｓｔｕ １およびｌユニット
の制限酵素互ａｍＨｔを加え、５０μｊのｌジｔｔｉ
反応液中で８７°Ｃ１時間反応した。反応後、反応ａ
を０．８襲のアガロース電気泳動で分析し、発現ベクタ
ーｐＡＡＨ５から生じる１）ＮＡ断片以外に２，７Ｋｂ
ＤＮＡ断片と１．ｌＫｂ のＤ Ｎ Ａ 、ｆｒ片が検
出されるプラスミドを選択した。このプラスミドは、人
Ｄａプロモーターと順方向にチトクロム遺伝子が接続し
ており、ｐＡΔＩＣ１と名付けｔ；。
溝築した発現用プラスミドｐＡΔｔｃ １を用いて酵母
内でラット肝チトクロムＰ−４５０ｈｑｃの発現を行っ
た。以下にその詳細な方法を述べる。
内でラット肝チトクロムＰ−４５０ｈｑｃの発現を行っ
た。以下にその詳細な方法を述べる。
ステップｌ：酵母形質転換体の単離
酵母内でラット肝チトクロムＰ −４５０：、１ｃを発
現させるため、Ｂｅｇｇｓらの方法（Ｎａｔｕｒｅ。
現させるため、Ｂｅｇｇｓらの方法（Ｎａｔｕｒｅ。
２７５ｍ）１０４−１０９（１９７８））を用いて、組
換え体プラスミドｐＡＭＵｌを、サツカロミセス酵母（
８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
） Ｓ ＨＹ３株（ＡＩＡＴａ 、 ５ｔｅ−ｖｃ９
、 ｕｒａ ８ 、 ｔｒｐｔ ｅｈｉｓ３ 、 Ｉｅ
ｕ ２−８ 、 Ｉｅｕ２−１）２ ＃ ａｄｅｌ ｔ
Ｃａｎｌ （Ｃｉｒ ） （人Ｔｃ０４４７７１）に形
質転換し、Ｌｅｕ の表現型を示すコロニーを選択し
、形質転換体５ａｙ３（ｐＡΔＩＣ１）株を得た。
換え体プラスミドｐＡＭＵｌを、サツカロミセス酵母（
８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
） Ｓ ＨＹ３株（ＡＩＡＴａ 、 ５ｔｅ−ｖｃ９
、 ｕｒａ ８ 、 ｔｒｐｔ ｅｈｉｓ３ 、 Ｉｅ
ｕ ２−８ 、 Ｉｅｕ２−１）２ ＃ ａｄｅｌ ｔ
Ｃａｎｌ （Ｃｉｒ ） （人Ｔｃ０４４７７１）に形
質転換し、Ｌｅｕ の表現型を示すコロニーを選択し
、形質転換体５ａｙ３（ｐＡΔＩＣ１）株を得た。
ｊステップ２ 粗抽出液の調製
発現用プラスミドｐＡＭｃｌを保持する酵母ＳＨＹ ３
（ｐＡＡｌｃ ｌ ）株ｋ ｏ ４ シンを除いた１
０、／の８Ｄ合成培地（０，６７％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａ
ｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗ２Ｏａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ （ｉ）ｉｆｃｏ社）。
（ｐＡＡｌｃ ｌ ）株ｋ ｏ ４ シンを除いた１
０、／の８Ｄ合成培地（０，６７％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａ
ｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗ２Ｏａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ （ｉ）ｉｆｃｏ社）。
２ ％ Ｌ）ｅｘｔｒｏｓｅ 、 ２０ ｘ９／−の
トリプトフアン・２０μｙ／−のヒスチジン、２ｏμｙ
／−のｒｒＲＬｊ１アゾニジ〕中で％ ２ Ｘ ｌｏ７
ｃｔｌ１Ｍ、ｊ トｒ（るまで培養した。培養液１−を
、７．ＯＯＯｒｐｍ３分で迎心し、’Ｊ４ＦＩ４ｄｌ−
の１．２Δ１ソルビトルにＰ＠濁した。再度、遠心し、
０．２−のザイモリエース溶ａ〔ｔ、２Ｍソルビトール
、５０ｒｎ Ｍリン酸カリウム（１）Ｈ７，５）、１４
ｍＡ（２−メルカプトエタノール、４００μ２／−サイ
モリ。エース６０．０００３に懸濁し、８０℃で８０分
インキュベートした。７．ＱＱＱｒ、ｐ、ｍ ３分遠心
することにより、スフェロプラストを集め、０．４−の
緩衝液ム（１，２Ｍソルビトール、 ５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ −Ｈｃｌ （ｐＨ７，５） ）で洗浄後、再度遠心
し、５０μｌの８Ｄ８溶液〔２％ドデシル硫酸ナトリウ
ム−５ＱｍＭＴｒｉｓ −Ｈｃｌ （１）■７．５ ）
）に懸濁した。つぎに、１００℃で５分間熱処理し、
ｔｏ、ｏｏｏｒ、ｐ６ｍで５分間遠心した後、上澄を分
取し、５０μｌのサシプル綴衝液（６２，５ｍ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ −Ｈｃｌ 。
トリプトフアン・２０μｙ／−のヒスチジン、２ｏμｙ
／−のｒｒＲＬｊ１アゾニジ〕中で％ ２ Ｘ ｌｏ７
ｃｔｌ１Ｍ、ｊ トｒ（るまで培養した。培養液１−を
、７．ＯＯＯｒｐｍ３分で迎心し、’Ｊ４ＦＩ４ｄｌ−
の１．２Δ１ソルビトルにＰ＠濁した。再度、遠心し、
０．２−のザイモリエース溶ａ〔ｔ、２Ｍソルビトール
、５０ｒｎ Ｍリン酸カリウム（１）Ｈ７，５）、１４
ｍＡ（２−メルカプトエタノール、４００μ２／−サイ
モリ。エース６０．０００３に懸濁し、８０℃で８０分
インキュベートした。７．ＱＱＱｒ、ｐ、ｍ ３分遠心
することにより、スフェロプラストを集め、０．４−の
緩衝液ム（１，２Ｍソルビトール、 ５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ −Ｈｃｌ （ｐＨ７，５） ）で洗浄後、再度遠心
し、５０μｌの８Ｄ８溶液〔２％ドデシル硫酸ナトリウ
ム−５ＱｍＭＴｒｉｓ −Ｈｃｌ （１）■７．５ ）
）に懸濁した。つぎに、１００℃で５分間熱処理し、
ｔｏ、ｏｏｏｒ、ｐ６ｍで５分間遠心した後、上澄を分
取し、５０μｌのサシプル綴衝液（６２，５ｍ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ −Ｈｃｌ 。
（ｐＨ１６，８） 、 ２ ％ （Ｗ／Ｖ） Ｆテシル
硫Ｊｔ トリウム、５％（Ｖ／Ｖ） ２−メルカプト
エタノール、 ｌＱ ％ （Ｗ／Ｖ） り！Ｊ セ０
−ｉＬｔ 、 ０．００１ラブロムフエノールブルー３
’に加Ｌｔニー。
硫Ｊｔ トリウム、５％（Ｖ／Ｖ） ２−メルカプト
エタノール、 ｌＱ ％ （Ｗ／Ｖ） り！Ｊ セ０
−ｉＬｔ 、 ０．００１ラブロムフエノールブルー３
’に加Ｌｔニー。
ステップ８：発現蛋白の同定
ステップ２で調製した酵母ＳＨＹｇ （ｐＡＭｃｌ ）
株の粗抽出液約１００μｌのうち、２０μｌをＳＤＩＭ
−ポリアクリルアミドゲルに供し。
株の粗抽出液約１００μｌのうち、２０μｌをＳＤＩＭ
−ポリアクリルアミドゲルに供し。
ｌａｅｍｍａｌｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７ ｐ
６８０−□） ６８５）に従って１電気泳動を行った。泳動後、アクリ
ルアミドゲルとニトロセルロースフィルター（５ｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ ｓｔ ｓｃｎ”Ｕ１）社）を重ね、プロ
ッティング用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ −ｈＬｃ／
（ｐＨ８，８） 、 １９２ ｍＭグリシン、２０襲メ
タノール〕中で、３０Ｖの「直圧を約１０時間かけ、蛋
白ｌｋニトロセルロースフィルターへ移行させた。泳動
後、ニトロセルロースフィルターをブロッキング溶液〔
８％ゼラチン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ｋｉｃｌ （ｐ
Ｈ７，５） 、２００ｍＭ Ｎａｃｌ 、 ０．０５
％ Ｔｗｅｅｎ ’ｌ Ｑ ） ニ浸し、８０分間戊拌
°した。つぎに、１μ２／−の抗１’−４５０ｈｑｃ
ＩｇＧ ｋ含むＧａ 液（１％ゼラチン、５０ｍＭＴｒ
ｉｓ −Ｈｃｌ （ｐＨ７，５）％２Ｑ Ｑｍｈ■ｐａ
ｃｌ 、 ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ Ｊ ｔコ
ｆｆｉし、さらに２時ｒＩ１）攪拌した。続いて、ニト
ロセルロース膜を、０．０５俤のＴｗｅｅｎ２Ｑを含む
゛ｒＢｓ溶Ｅｌ （５０ｍＭＴｒｉｓ−１ｌＩｃｌ （
ｐＨ７，５） 、 ２００ ｍΔ１Ｎａｃｊ ）
で４０分づつ、４回洗浄し、再度ブロッキング溶液に浸
した。つぎに、プロフキング溶液を除き、５０−の
夏−ＰｒｏｔｅｉｎＡ溶液（７μＣｉ）に１時間浸し、
０．０５％のＴｗｅｅｎ ’ｌ Ｑを含むＴＢ８！ｆｆ
ｉ’８０分づ）４回洗浄Ｌ、最後壷ζＴＢ８ｇ液で洗浄
した。処理を終ったニトロセルロースフィルターｋ ｉ
Ｐ Ｍ、 ＣＱ 上ｉ’ 屹燥させ、オートラジオグラ
フィを行った。
６８０−□） ６８５）に従って１電気泳動を行った。泳動後、アクリ
ルアミドゲルとニトロセルロースフィルター（５ｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ ｓｔ ｓｃｎ”Ｕ１）社）を重ね、プロ
ッティング用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ −ｈＬｃ／
（ｐＨ８，８） 、 １９２ ｍＭグリシン、２０襲メ
タノール〕中で、３０Ｖの「直圧を約１０時間かけ、蛋
白ｌｋニトロセルロースフィルターへ移行させた。泳動
後、ニトロセルロースフィルターをブロッキング溶液〔
８％ゼラチン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ｋｉｃｌ （ｐ
Ｈ７，５） 、２００ｍＭ Ｎａｃｌ 、 ０．０５
％ Ｔｗｅｅｎ ’ｌ Ｑ ） ニ浸し、８０分間戊拌
°した。つぎに、１μ２／−の抗１’−４５０ｈｑｃ
ＩｇＧ ｋ含むＧａ 液（１％ゼラチン、５０ｍＭＴｒ
ｉｓ −Ｈｃｌ （ｐＨ７，５）％２Ｑ Ｑｍｈ■ｐａ
ｃｌ 、 ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ Ｊ ｔコ
ｆｆｉし、さらに２時ｒＩ１）攪拌した。続いて、ニト
ロセルロース膜を、０．０５俤のＴｗｅｅｎ２Ｑを含む
゛ｒＢｓ溶Ｅｌ （５０ｍＭＴｒｉｓ−１ｌＩｃｌ （
ｐＨ７，５） 、 ２００ ｍΔ１Ｎａｃｊ ）
で４０分づつ、４回洗浄し、再度ブロッキング溶液に浸
した。つぎに、プロフキング溶液を除き、５０−の
夏−ＰｒｏｔｅｉｎＡ溶液（７μＣｉ）に１時間浸し、
０．０５％のＴｗｅｅｎ ’ｌ Ｑを含むＴＢ８！ｆｆ
ｉ’８０分づ）４回洗浄Ｌ、最後壷ζＴＢ８ｇ液で洗浄
した。処理を終ったニトロセルロースフィルターｋ ｉ
Ｐ Ｍ、 ＣＱ 上ｉ’ 屹燥させ、オートラジオグラ
フィを行った。
因４は以上の方法を用いて８ＨＹ３（ｐＡΔ１０１）の
発現蛋白を分析したものである。Ａは対称に用いたｐＡ
ＡＨ５ベクターの結果で、抗Ｐ−４５０ＭＣＩｇＧに認
識される蛋白は検出されなかった。一方、Ｂは発現プラ
スミドｐＡＲＩｃｌヲ用Ｌ ’ ｔ：、 場合テ、抗Ｐ
−４５０ＭｃＩｇＧと反、−−− ′ チトクロムＰ ４５０’、ＭＣ“精製標
品を基準にとり算出すると１細胞当り約４ＸＩＯ分子の
ラット肝チトクロムｌ’−４５０ＭＣ蛋白が産生されて
いた。
発現蛋白を分析したものである。Ａは対称に用いたｐＡ
ＡＨ５ベクターの結果で、抗Ｐ−４５０ＭＣＩｇＧに認
識される蛋白は検出されなかった。一方、Ｂは発現プラ
スミドｐＡＲＩｃｌヲ用Ｌ ’ ｔ：、 場合テ、抗Ｐ
−４５０ＭｃＩｇＧと反、−−− ′ チトクロムＰ ４５０’、ＭＣ“精製標
品を基準にとり算出すると１細胞当り約４ＸＩＯ分子の
ラット肝チトクロムｌ’−４５０ＭＣ蛋白が産生されて
いた。
以上、Ｕ母宿主としてＳＨＹ ８株を用いたが、サツカ
ロミセス酵母ＡＨ２２株（ａ、 ／ｅｕ２−８ 、１ｅ
ｕ２−１）２’、 ｈｉｓ４−５１９ 、Ｃａｎ １（
ｃａｒ ）ｒ ＡＴＣＣ：９８６２６ ）およびＮＡ
８７−１ＩＡ株（α、ｐｈｏ３−１ ＠ ｐｈｏ５−１
。
ロミセス酵母ＡＨ２２株（ａ、 ／ｅｕ２−８ 、１ｅ
ｕ２−１）２’、 ｈｉｓ４−５１９ 、Ｃａｎ １（
ｃａｒ ）ｒ ＡＴＣＣ：９８６２６ ）およびＮＡ
８７−１ＩＡ株（α、ｐｈｏ３−１ ＠ ｐｈｏ５−１
。
ヤｒｐｔ 、 ｈｉｓ３ 、１ｅｕ２ 、 （ｃｔｒ
） ；大阪大学工学部０酵工学科第４研究冨より八手；
住友化学工業株式会社、宝塚総合研究所保存）を宿主と
して、それぞれＬｅｕ 形質転換体、ＡＨ２２（ｐＡ
Ａｌ４Ｃ３株およびＮＡ３７−１）Ａ（ｐ Ａ、ｖｌＣ
１）株を得て、同様に、ラット肝チトクロムＰ−４５Ｑ
ＭＣ蛋白の発現を確認した。
） ；大阪大学工学部０酵工学科第４研究冨より八手；
住友化学工業株式会社、宝塚総合研究所保存）を宿主と
して、それぞれＬｅｕ 形質転換体、ＡＨ２２（ｐＡ
Ａｌ４Ｃ３株およびＮＡ３７−１）Ａ（ｐ Ａ、ｖｌＣ
１）株を得て、同様に、ラット肝チトクロムＰ−４５Ｑ
ＭＣ蛋白の発現を確認した。
【図面の簡単な説明】
第１ａ図〜第１ｅ図は、ｐＡＵ１５７ブラスミドにクロ
ーン化されたラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子
の塩基配列を示す。 第２図は１組換えプラス疋ドｐＴＦ１）ｇ築の概要を示
す。 第８図は、組換えプラス２ドｐＡＭｃｌの横築の概要を
示す。 第４図は、酵母で発現したラット肝チトクロ８ＨＹ８（
ｐＡＭｃｌ）であるう 第１＋図 第１）＋図 第 １ （図 ＰｈｅＧＩｙＬｅｕＶａＩＳｅｒＬｅｕＴｙｒＡ＋ａＬ
ｉＩｕＭｓｒＡｒｇｓｓｓ＋ｒｅ？＋ａ＊＋ｎｕ＋ｒ＋
ｐｒｇｒｒｏ＋ｎｒｕ＋ｙ第１ ＋１図 第３図 第４図 手続補正３（自発） 昭和（０年）月２ｆ日
ーン化されたラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子
の塩基配列を示す。 第２図は１組換えプラス疋ドｐＴＦ１）ｇ築の概要を示
す。 第８図は、組換えプラス２ドｐＡＭｃｌの横築の概要を
示す。 第４図は、酵母で発現したラット肝チトクロ８ＨＹ８（
ｐＡＭｃｌ）であるう 第１＋図 第１）＋図 第 １ （図 ＰｈｅＧＩｙＬｅｕＶａＩＳｅｒＬｅｕＴｙｒＡ＋ａＬ
ｉＩｕＭｓｒＡｒｇｓｓｓ＋ｒｅ？＋ａ＊＋ｎｕ＋ｒ＋
ｐｒｇｒｒｏ＋ｎｒｕ＋ｙ第１ ＋１図 第３図 第４図 手続補正３（自発） 昭和（０年）月２ｆ日
Claims (3)
- （１）ラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子を含み
、酵母内でチトクロムＰ−４５０ＭＣを発現させるプラ
スミド。 - （２）ラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣ蛋白質の全コ
ーディング領域をもつ組換え体プラスミドｐＡＵ１５７
より単離したチトクロム Ｐ−４５０ＭＣ遺伝子を、アルコール脱水素酵素プロモ
ーターを保持する発現ベクター ｐＡＡＨ５へ組込むことにより構築した特許請求の範囲
第１項記載のプラスミド。 - （３）第３図記載のＤＮＡ構造を有する特許請求の範囲
第１項記載の酵母発現用プラスミド ｐＡＭＣＩ。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122953A JPS6188878A (ja) | 1984-06-16 | 1984-06-16 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ｍｃ遺伝子の酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＭＣ１の構築 |
| US06/741,592 US4766068A (en) | 1984-06-16 | 1985-06-05 | Cytochrome P-450MC gene, expression plasmid carrying the said gene, yeasts transformed with the said plasmid and a process for producing cytochrome P-450MC by culturing the said transformant yeasts |
| GB858514971A GB8514971D0 (en) | 1984-06-16 | 1985-06-13 | Cytochrome p-450mc gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122953A JPS6188878A (ja) | 1984-06-16 | 1984-06-16 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ｍｃ遺伝子の酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＭＣ１の構築 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188878A true JPS6188878A (ja) | 1986-05-07 |
| JPH0429352B2 JPH0429352B2 (ja) | 1992-05-18 |
Family
ID=14848707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59122953A Granted JPS6188878A (ja) | 1984-06-16 | 1984-06-16 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ｍｃ遺伝子の酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＭＣ１の構築 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6188878A (ja) |
| GB (1) | GB8514971D0 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6152284A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-14 | Agency Of Ind Science & Technol | ラツト肝チトクロムｐ−４５０遺伝子 |
| JPS6447380A (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Steroid-oxidizing yeast strain |
| JPH0231680A (ja) * | 1988-07-22 | 1990-02-01 | Agency Of Ind Science & Technol | チトクロムＰ４５０ｃ↓２↓１産生酵母菌株 |
-
1984
- 1984-06-16 JP JP59122953A patent/JPS6188878A/ja active Granted
-
1985
- 1985-06-13 GB GB858514971A patent/GB8514971D0/en active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| METHODS IN ENZYMOLOGY=1983 * |
| NUCLEIC ACIDS RESEARCH=1984 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6152284A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-14 | Agency Of Ind Science & Technol | ラツト肝チトクロムｐ−４５０遺伝子 |
| JPH0412953B2 (ja) * | 1984-08-15 | 1992-03-06 | Kogyo Gijutsuin | |
| JPS6447380A (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Steroid-oxidizing yeast strain |
| JPH0542915B2 (ja) * | 1987-08-19 | 1993-06-30 | Kogyo Gijutsuin | |
| JPH0231680A (ja) * | 1988-07-22 | 1990-02-01 | Agency Of Ind Science & Technol | チトクロムＰ４５０ｃ↓２↓１産生酵母菌株 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8514971D0 (en) | 1985-07-17 |
| JPH0429352B2 (ja) | 1992-05-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |