JPH0231680A - チトクロムＰ４５０ｃ↓２↓１産生酵母菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ウシ副腎チトクロムＰ４５０Ｃｚ＋遺伝子お
よび酵母アルコール脱水素酵素プロモーターを保持する
酵母発現プラスミド、ウシ副腎チトクロムＰ４５０Ｃ２
１を生産する酵母菌体および該酵母を用いることを特徴
とする２１−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキ
シコルチゾールの製造方法に関する。本発明により得ら
れるプラスミドにより形質転換された酵母菌体はＰ４５
０Ｃ２１を生産し、これに由来する一原子酸素添加活性
を有しており、この菌体自体、あるいは、菌体から取得
したＰ２Ｓ５ことができる。

〔従来技術および問題点〕

チトクロムＰ４５０　（以下Ｐ４５０と略称する）は微
′Ｌ物から哺乳動物にいたるまで広（生物界に存在する
ヘムタンパク質であり、機能を発揮するためには分子内
にヘムを含有することが必須である。チトクロムＰ４５
０には多くの分子種が存在し、各々のＰ４５０分子種は
基質特異性を異にしているが、共通して脂溶性基質に対
して一原子酸素添加反応を触媒する。哺乳動物の副腎に
は、ステロイドの生合成に携っている数種のＰ４５０分
子種の存在が知られている。この中でＰ４５０Ｃ２１　
はプロゲステロンおよび１７α−ヒドロキシプロゲステ
ロンの２１位水酸化活性を有することが既知である。

ウシ副腎チトクロムＰ４５０Ｃ２１　をコードするｃＤ
ＮＡの全構造はすでに書間らによって報告されている。

（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９８６）、２６１．
４１０６）本発明者らは以前にラット肝チトクロムＰ４
５０ＭＣｃＤＮＡ　（時開、　６１−０８８８７８　）
ウシ副腎チトクロムＰ４５０＋ｔ（ｒｃＤＮＡ　（特願
Ｎｏ、６２−２０４１０１　）を酵母において、発現さ
せることを試み、酵母アルコール脱水素酵素（以下ＡＤ
ＩＩと略す）プロモーターを用い高い発現レヘルでＰ４
５０ＭＣおよびＰ２Ｓ５．、αを発現させることに成功
した。

しかし、特ＩＭＮｏ、６２−２０４１０１で記述したよ
うに、哺乳動物のチトクロムＰ４５０でもＰ４５０ＳＣ
Ｃなどの場合、ヘムを含有するＰ４５０ＳＣＣを酵母内
で産生ずることはできず、また、ＡＤＨフ゛ロモーター
を用いた場合においても異種タンパク質を酵母内で大量
に産生できない場合が多い、したがって、酵母内での産
生量は発現させる遺伝子、プロモーターの選択に大きく
依存している。

〔問題解決の手段〕

本発明者らは、ウシ副腎チトクロムＰ４５０ｃｌ＋遺伝
子を酵母において発現させる発現プラスミドの構築につ
いて誠意研究の結果、この遺伝子をＡＤＨプロモーター
を有する酵母発現ベクターに組み込み横築した酵母発現
プラスミｌにより酵母を形質転換し、菌体内で産生され
たＰ４５０Ｃ２１　に依存する一原子酸素添加活性を有
する酵母菌株を製造することに成功した。

本発明は、酵母ＭＤＩ＋プロモーターおよびウシ副腎Ｐ
４５０Ｃ２１遺伝子を保有することを特徴とする酵母内
発現プラスミド、該酵母内発現プラスミドで形質転換さ
れ、Ｐ４５０Ｃ２１を菌体内で産生ずる酵母菌株、該酵
母菌体から取得することを特徴とするＰ４５０Ｃ２１　
の生産方法および、そのように生産されたＰ４５０Ｃ２
１　ならびに、該酵母菌株により、プロゲステロンある
いは１７α−ヒドロキノプロゲステロンの２１位の炭素
原子を水酸化することを特徴とする２１−ヒドロキノプ
ロゲステロンおよび１１−デすキシコルチヅールの製造
方法を提供する。

糖質コルチコイドは、ｔＪ！Ｗの代謝を支配し肝にグリ
コーゲンを貯蔵させる作用を有しヒトの生命の維持に必
須である。さらに、抗炎症、抗アレルギー作用を有する
ため医薬品としてリウマチ、湿疹、ぜんそくなどの治療
に広く用いられている。

副作用を分離しえないため、低活性品、高活性品の両方
が使われている。低活性品の代表としてプレドニゾロン
（ＰＤＬ）が挙げられる。高活性品としてはデキサメタ
シン、ヘータメタゾンなどが挙げられるが、いずれもＰ
ＤＩ、を基本としてＫＡ導される。したがってＰＤＬの
需要は、非常に多い。

ＰＤＬを合成する場合、種々の出発材料から種々の方法
がとられるが、いずれも、１ＬＩ７．２１位の水酸化工
程を含んでいる０例えば、大豆から得たスチグマステロ
ールを原料として用いる場合プロゲステロン（ＰＣ）　
、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）を経てＰＤＬを得る。現在
、ＰＧからＨＣを得るのに多段階（８段階）の化学合成
過程と１段階の醗酵過程を必要とする。

本発明に係わる特許Ｎｏ、６２−２０４１０１に掲載さ
れたＰ４５０＋、α産生酵母および本発明のＰ４５０Ｃ
２１産生酵母菌体を用いることによりＰＧ−１７ヒドロ
キシＰＣ−１７−，２１−ジヒドロキシＰＣ（１１−デ
オキシコルチヅール）への変換が可能であり、さらに上
記醗酵過程に用いられている１１α水酸化株（ＰＣのみ
ならず１７−．２１−ジヒドロキシＰＧの１１位水酸化
反応をも司る。）を用いることによりＨＣの生産が可能
である。すなわち、３段階の醗酵過程のよりＰＧ−＋Ｉ
Ｉｃへの変換が可能である。

また、上に挙げた例にとどまらず、ＰＧ、１７ヒドロキ
ンＰＣあるいはそれらの誘導体の２１位を特異的に水酸
化するプロセスに本発明のＩ’４５０ｃｚ産生酵母を利
用できる。

以下、本発明について更に詳細に説明する。

本発明のプラスミドはウシ副腎Ｐ４５０ｃｚ１　タンパ
ク質をコードする遺伝子を酵母アルコール脱水素酵素遺
伝子のプロモーターとターミネータ−を保有する発現ベ
クター、好ましくは、酵母発現ヘクターｐＡＡＨ５（Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄａｔ
ｉｏｎから入手可能、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｈｏｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　１０１　、　ｐａｒｔＣｌＰ」９２〜２
０１．Ａ−ｅｒｅｒらの方法により製造できる。なお、
酵母へＤＨＩ遺伝子のプロモーターは−ａｓｈｉｎｇｔ
６ｎＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄａｔｉｏｎの米国特許
出願、第２９９，７３３に含まれており、米国において
工業的、商業的目的で使用する場合は権利者からの権利
許諾を必要とする。）ここに用いるウシ副腎Ｐ４５０Ｃ
２１　タンパク質をコードするｃＤＮＡはすでに公知で
あり、前述の文献記載の方法等の公知方法でこれを単離
することができる０本発明の酵母菌体は上述の発現プラ
スミドにより、例えば、アルカリ金属法、あるいは、プ
ロトプラスト法などで酵母を形質転換することによって
得られる。酵母としては、サツカロミセス・セレビシェ
−２特にサツカロミセス・セレビンエーＡ８２２株を用
いることが望ましいが、この株に限定されるものではな
い。

本発明の酵母菌株は、その培養液中にプロゲステロン、
あるいは１７α−ヒドロキシプロゲステロンを添加し、
インキエーヘートすることによって２１−ヒドロキシプ
ロゲステロンあるいは、１１−デオキシコルチヅールを
生産することが可能である。

この際、酵母菌体の項番は、常法に従って行うことがで
きる。

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する。但
し、本発明は、以下の実施例のみに限定されるものでは
なく、本発明の技術分野における通常の変更を行うこと
ができる。

：ｔｌＬ！ 〔ウシ副腎Ｐ４５０Ｃ２１ｃＤＮＡの取得〕ウシ副腎か
らグアニンチオシアネート法によりＲＮＡ　両分を抽出
し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにかけポリ
（Ａ）ＲＮＡを得た。さらにこのポリ（Ａ）ＲＮＡ画分
を６５°Ｃで５分間熱処理した後、１０３０％のショ糖
密度勾配で超遠心分！　（２７０，０００Ｘｇ、１時間
）分画した。マーカーの１８ｓ　ｒＲＮ＾より、ややサ
イズの大きい両分を回収し、アマ−シャｌ、社製のｃＤ
Ｎ＾合成システムを用いてｃＤＮＡを合成した。

さらにλｇｔｌｌを用いたｃＤＮＡクローニングシステ
ムを用い−ｒｃＤＮＡライブラリーを作製した。前述、
既報のウシ副腎Ｐ４５０Ｃ２１のｃＤＮＡの構造を元に
して以下の３種類の３６ｓｅｒのＤＮＡを合成した。

（１）　　５’−ＧＴＡＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣ
ＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣ−３’ （２）　　　５’　−ＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＡ
ＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡ＾−３ （３）５°−ＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣ
ＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴ−３’ これらをカイネーシッン法により（”Ｐ）ラヘルし、こ
れをプローブとして前述のｃＤＮＡのライブラリー約４
０，０００プラークについてプラークハイブリダイゼー
ションを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は
５２℃で行った。得られたポジティブクローンからファ
ージＤＮＡを調製し、制限酵素ヒｃｏＲＩにより切断し
たところ、約１．６にｂ、０．５５Ｋｂの断片が得られ
たため、これらをそれぞれ市販のクローニングヘクター
ｐｔｌｃ１１９のＥｃｏＲ１部位に挿入し、プラスミド
ｐＵｃ２１Ｎ１およびｐｔｌｃ２１ｃを得た。次にこれ
らのプラスミドを用いて、グイデオキシ法により、ｃＤ
ＮＡの塩基配列を決定した。書間らの文献の、ＤＮＡ配
列とは、翻訳開始上流３３番目にＧが挿入されている点
、および開始下？ｊｉＥ３９番目から４２番目ＣＡＧが
ＡＧＣとなっている点の２つでことなっているが、チュ
ンらの文献（Ｐｒｏ、ＮＡＳ、　（１９８３）　、　８
３．４２４４）の配列とはすべて一敗した。従って。

クローニングした遺伝子はウシ副腎Ｐ４５０ｃｇ＋　の
。

０１１＾であると考えられる。

災履拠Ｉ （発現プラスミドｐｔｌｃ２１ｃ１　、　ｐＵｃ２１ｃ
２の構造〕（第１図） 上述ｐＨｃ２１Ｎ１を制限酵素Ｎｈｅ　Ｉ　、　Ｈｉｎ
ｄＩ［ｌで同時消化した後、合成リンカ−（４７ａｖｅ
ｒ）５　’　−ＡＧＣＴＴＡＡ　Ａ　ＡＡ　Ａ　ＡＴＧ
ＧＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣ
ＴＡＡＴ丁ＴＴＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＣＧ
ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧ　　
　　３’ ＣＧＡＣＴＧにＧＡＣＧＡＴＣ とリガーゼ反応を行ない反応混液により大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換した。形質転換株からプラスミドＤＮＡ
を調製し、プラスミドｐＵｃ２１Ｎ２を得た。また、ｐ
Ｕｃ２１ｃをＥｃｏＲＩで部分消化した後ｌ箇所で切断
を受けたＤＮＡ断片を回収し、フィルインした後、アル
カリホスファターゼ処理を施した。さらに市販の旧ｎｄ
ｌｌＩリンカ−（１０ｍｅｒ）　とりガーゼ反応を行な
い反応混液によりＪＭ　１０９株を形質転換した。形質
転換株からプラスミドＤＮＡを調製した。ここで、目的
とするプラスミドｐＵｃ２１１と一１１ＮＡの安定性を
増すため３′非翻訳領域を約０．４　Ｋｂ、　Ｂａｌ　
３１で欠失させた後、ｔｌｉｎｄＩ［ｌリンカ−を挿入
したプラスミドｐＵｃ２１２を得た。それぞれから、Ｅ
ｃｏＲＩ　−ＩＩ　ｉｎｄ　ｍ断片（１，６にｂおよび
１．２にｂ）を調製し、ρＵＣ２１Ｎ２から調製したＥ
ｃｏＲＩ−１１ｉｎｄ　ｍ断片およびアルカリホスファ
ターゼ処理を施したベクターｐＡＡＨ５の旧ｎｄ■消化
物とのりガーゼ反応を行い、ｐＵｃ２１ｃ１およびｐＵ
ｃ２１ｃ２を得た。

裏施桝主 〔プラスミドｐＵｃ２１ｃ１　、　ｐＵｃ２１ｃ２によ
る酵母の形質転換〕 ＹＰＤ培地（１％Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　、２％
ポリペプトン、２％グルコース）１．Ｏｄにサツカロミ
セス・セレビシェ−ＡＨ２２株を殖菌し、３０°Ｃで振
盪し、５Ｘ１０’菌体／ｄになった時点で遠心分離によ
り集菌した。得られた菌体を１．　Ｏｄの０．２　ＭＬ
ｉＣＩ溶液に懸濁した後、再度遠心分離し、得られたペ
レントに２０μｌのＩＭＬｉＣｌ：８液、３０μ２の７
０％ポリエチレングリコール４０００？９［、約１．０
μｇ＋７）ρＵＣ２ｌＣｌあるいはｐＵＣ２１Ｃ２を含
む１０ｕｌの溶液を添加した。十分に混合した後、３０
°Ｃで１時間インキュベートし、さらに１４０．ｆｆｉ
の滅菌水を加えて撹拌した。この溶液をＳＤ合成培地プ
レート（２，０％グルコース、０．６７％窒素源アミノ
酸不含、２０／７ｇ／−ヒスチジン　２．０％寒天）上
にまき３０°Ｃで３日間インキエヘートし、プラスミド
ｐＵｃ２１ｃ１あるいはｐＵｃ２１ｃ２を保有する形質
転換菌株ＡＨ２２／Ｉ）ＵＣ２１ＣＩおよびＡ１１２２
／ＰＩＩＣ２１Ｃ２を得た。（微工研菌寄第１００９３
号） １隻■↓ （ＡＩ１２２／　ｐＵｃ２］ＣＩおよびＡＨ２２／ｐｔ
ｌｃ２１ｃ２株生菌体のプロゲステロン胎生菌体７α−
ヒドロキシプロゲステロン２１位水酸化活性の測定〕 ＳＤ合成培ｉ！！（２，０％グルコース、０．６７％窒
素源アミノ酸不含、２０μｇ／ｄヒスチジン）で７×１
０ｈ菌体／ｌｄまで培養したＡＩ！２２／ｐＵｃ２１ｃ
ｌ　、　ＡＨ２２／ｐＵｃ２１ｃ２および＾Ｈ２２／ｐ
ＡＡＨ５株の培養ｔＬ５ＩＩｉ中に、ｌＯμＣｉの〔３
■〕−プロゲステロンを含む５０μ２の１ｓＭプロゲス
テロンーエタノール？容液（あるいはｌＯμＣｉの［３
１＋〕−１７−ヒドロキシプロゲステロンを含む５０μ
ｌの１ｍＭ１７−ヒトロキシプロゲステンーエタノール
ン容ｌ夜）を添加した。３０°Ｃで振盪培養し、０．２
．５．２３時間後に１．　Ｏｄずつ分取し、遠心分離し
て得た上清０．８　ｄに２．０　ｄジクロロメタンを添
加し、激しく撹拌した。遠心分層後、ジクロロメタン層
１．０　ｄを乾燥させ、残渣をエタノール、酢酸エチル
等容ｉ溶液２０μｌに溶解し、１０μｍを薄層プレート
にアプライした。２５％酢酸エチルを含むクロロホルム
溶液により室温で５０分間展開した後、オートラジオグ
ラフィーを行い、フィルム上の現れたスポットに相当す
るＦｉｔＦ！ゲル部分をかきとり、液体シンチレーショ
ンカウンターにより放射活性を測定した。

その結果、プロゲステロンを添加した場合、ＡＨ２２／
ρＵＣ２１Ｃ１株およびＡｕ２２／　ｐＵｃ２１ｃ２株
では５時間後にそれぞれ１．３％、１．９％、２３時間
後にそれぞれ１８．８％、１８．１％のプロゲステロン
が２１−ヒドロキシプロゲステロンに変換したことがわ
かった（第２図）コントロールに用いた八ＩＩ　２２　
／　ｐ　Ａ　Ａ　Ｉ！　５株では、活性は認められなか
った。

また、１７α−ヒドロキシプロゲステロンを添加した場
合、Ａｌ１２２／ρｕｃ２＋ｃ１株およびＡ）１２２／
　ｐＬＩｃ２ＩＣ２株では５時間後にそれぞれ１．６％
、２．１％、２３時間後にそれぞれ３０．６％、２９．
０％の１７α−ヒドロキシプロゲステロンが１１−デオ
キシコルチゾールに変換したことがわかった（第３図）
コントロールに用いた＾■２２／ρＡＡＨ５株では、活
性は認められなかった。

Ａ１１２２／ｐＵｃ２１ｃ１とＡＨ２２／ｐＵｃ２１ｃ
２では、水酸化活性に差が認められなかった。

〔発明の効果〕

本発明により得られる形質転換酵母菌株は、原子酸素添
加活性を有するウノ副腎チトクロムＰ４５０．２．を産
生し、この菌体自体、あるいは菌体から取得したＰ４５
０Ｃ２１　を、医薬品としてを用である前述ステロイド
類の合成のためのバイオリアクターとして用いることが
できる。本発明の酵母菌株は、その培養液中にプロゲス
テロンあるいは、１７α−ヒドロキシプロゲステロンを
添加し、インキュベートすることにより、２１−ヒドロ
キンプロゲステロン、１１−デオキシコルチゾールを生
産することが可能である。生産物は菌体内に取り込まれ
てしまうことなく、はとんどが培地中に放出されるため
遠心分離、濾過などにより菌体を除いた後の培地から容
易に回収することができる。また、菌体は再使用が可能
である。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＵｃ２１ｃｌおよびｐＵｃ２１ｃ
２０’）構築の概略を示すＥ、Ｈはそれぞれ制限酵素Ｅ
、。 Ｒ１，ｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩの切断部位を示す、＝コは翻
訳領域を示す。 第２図は、４＋１２２／ｐＵｃ２１ｃｌおよび＾８２２
／ｐＵｃ２１ｃ２８２２／ｐＵｃ２１ｃ２ン２１位水酸
化活性を示す図である。 縦軸は、２１−ヒドロキシプロゲステロンへの変換率を
、横軸は、培養時間を示す。ＡＨ２２／ｐＵＣ２１Ｃ１
株（ロ）　、　Ａ１２２／ｐＵｃ２１ｃ１株（０）　、
ＡＨ２２／ｐ＾Ａ）１５株（×） 第３図は、Ａｌ１２２／　ｐＵｃ２１ｃ１およびＡＩ＋
２２／ｐＵｃ２１ｃ２株生菌体の１７α−ヒドロ手生菌
体ゲステロン２１位水酸化活性を示す図である。 縦軸は、１１−デオキシコルチゾールへの変換率を、横
軸は培養時間を示す、ＡＨ２２／　ｐＵｃ２１ｃ１株（
ロ）、Ａ）１２２／ｐＵｃ２１ｃ２株（○）、＾）１２
２／ＰＡＡＨ５（Ｘ　）第２図 培養時間（ｈ）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母アルコール脱水素酵素プロモーターおよびウ
   シ副腎のチトクロムＰ４５０＿Ｃ＿２＿１遺伝子を保有
   することを特徴とする酵母内発現プラスミド
2. （２）ｐＵＣ２１Ｃ１あるいはｐＵＣ２１Ｃ２と名付け
   た特許請求の範囲第１項記載のプラスミド
3. （３）酵母アルコール脱水素酵素プロモーターおよびウ
   シ副腎のチトクロムＰ４５０＿Ｃ＿２＿１遺伝子を保有
   することを特徴とする酵母内発現プラスミドで形質転換
   されＰ４５０＿Ｃ＿２＿１を菌体内で産生する酵母菌株
4. （４）プラスミドｐＵＣ２１Ｃ１あるいはｐＵＣ２１Ｃ
   ２によって形質転換されチトクロムＰ４５０＿Ｃ＿２＿
   １を菌体内で産生することを特徴とする特許請求の範囲
   第３項記載の酵母菌株
5. （５）サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２／ｐＵＣ
   ２１Ｃ１あるいはＡＨ２２／ｐＵＣ２１Ｃ２と名付けた
   特許請求の範囲第３項記載の酵母菌株
6. （６）酵母アルコール脱水素酵素プロモーターおよびウ
   シ副腎のチトクロムＰ４５０＿Ｃ＿２＿１遺伝子を保有
   することを特徴とする酵母内発現プラスミドで形質転換
   されＰ４５０＿Ｃ＿２＿１を菌体内で産生する酵母菌株
   を培養することを特徴とするウシ副腎チトクロムＰ４５
   ０＿Ｃ＿２＿１の生産方法
7. （７）酵母アルコール脱水素酵素プロモーターおよびウ
   シ副腎チトクロムＰ４５０＿Ｃ＿２＿１遺伝子を保有す
   ることを特徴とする酵母内発現プラスミドで形質転換さ
   れ、Ｐ４５０＿Ｃ＿２＿１を菌体内で産生する酵母菌株
   によりプロゲステロンあるいは１７α−ヒドロキシプロ
   ゲステロンを水酸化することを特徴とする２１−ヒドロ
   キシプロゲステロンおよび１１−デオキシコルチゾール
   の製造方法