JP4864277B2 - 改変された酵母及び特にステロイド誘導体製造のための利用 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、生物学的分野及び医薬分野に関係する。それは、特に、ステロイド化合物の製造に有用な、又はステロイド化合物の(選択的)変換に有用な新規な組成物及び方法に関係する。それは、一層詳細には、新規な酵母株及び遺伝学的方法並びにそれらの製造のための構築物に関係し、ステロイド化合物の合成又は改変のためのそれらの利用に関係する。この発明のこれらの酵母株は、合成の効力を改善すること及びこの方法の選択性又は収率並びに最終生成物の品質を高めることを可能にする。この発明のこれらの株、方法及び化合物は、ヒト又は動物において治療又は予防的活性を有する製品(特に、ステロイド誘導体)の研究、開発及び製造において有用である。
【０００２】
ステロイドを変換する自然の微生物の能力は、広く文献に記載されてきた。この点に関して、それらは、化学合成によって得ることが困難なステロイド誘導体の製造のための有利な別法を代表する。酵母は、その上、オルガネラで活性な酵素をコードするｃＤＮＡの発現のために特に適している。その結果、酵母例えばＳ．セレビシエ(S.cerevisiae)は、ステロイド産生用酵素例えばミクロソーム又はミトコンドリアのＰ４５０をコードするｃＤＮＡを発現させるために広く用いられてきた。その上、ヒドロコルチゾンの生合成経路に含まれる酵素を発現させることを意図した幾つかの研究は、酵母がある種の中間体を効率的に変換することができることを示すことを可能にした。そうして、ステロイドの生合成経路に含まれる一種以上の哺乳動物酵素の発現を可能にするトランスフォームされた酵母の利用が、例えば、ＥＰ３４０８７８、米国特許第５，１３７，８２２号又はDumas等に記載されてきた。同様に、出願人は、Δ５−３β−ヒドロキシステロイド例えばプレグネノロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロン及びＤＨＥＡが酵母によって対応する酢酸エステルに変換されるということを見出した。出願人は又、この変換が、本質的に、ＡＴＦ２遺伝子の産物によって行われるということをも示した(Cauet等、1999)。それ故、酵母は、ステロイド誘導体製造のための工業的視点から、特に有用な生物を代表する。
【０００３】
しかしながら、１７α−ヒドロキシプロゲステロンは、ある条件下で、酵母により還元されて４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オン(Dumas等、1994)となること及びこの副生物の生成が最終生成物の合成収率及び品質に影響を及ぼすということも知られている。しかしながら、今まで、２０α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(２０αＨＳＤ)型のこの反応の原因である酵素活性は、同定されなかった。
【０００４】
本発明は、正確には、ヒドロキシプロゲステロンに作用する酵母の内因性活性の研究から生じるものであり、２０αＨＳＤ型活性を付与された酵素をコードする２つの遺伝子の同定を記載する。一層詳細には、本願は、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子が酵母における２０αＨＳＤ型活性のキャリアーであること、及びこれらの遺伝子産物が、例えば、ヒドロキシプロゲステロンのイン・ビトロでの副生物への変換を可能にすることを示す。その上、本願は、酵母におけるこれらの遺伝子活性の抑制が、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オン型の副生物の生成をかなり減じ又は抑制し且つステロイド誘導体の合成の収率を有意に改善し及び／又はヒドロキシプロゲステロン(又は、その前駆物質)をステロイド誘導体へ一層選択的様式で変換することを可能にするということを示す。それ故、本願は、一層優れた選択性を有するステロイド誘導体の合成に利用できる新規な組成物及び方法を記載する。この発明は、特に、減少した２０αＨＳＤ型活性を有し且つ本質的にヒドロキシプロゲステロンを４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オン型副生物に変換できない新規な酵母株を記載する。この発明は又、かかる生成物の生産を増大させるために利用することもできる(それらの利用又は活性化合物への変換のために)。
【０００５】
この発明の第一の主題は、特に、ステロイド化合物を改変する方法であって、この化合物(又は、その前駆物質)を減少した２０αＨＳＤ活性を有する酵母と、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母と、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母と又はかかる酵母に由来する調製物と接触させることを含む当該方法にある。
【０００６】
この発明は又、減少した２０αＨＳＤ活性を有する酵母の、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母の、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母の又はかかる酵母に由来する調製物の、イン・ビトロ又はエキソ・ビボでの、ステロイド化合物の製造、合成、改変及び／又は改良のための利用にも関係する。
【０００７】
この発明は又、ヒドロキシステロイド化合物から、特にヒドロキシプロゲステロン又はその前駆物質から、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する酵母、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母又はかかる酵母に由来する調製物を利用して、ステロイド誘導体を製造する如何なる方法にも関係する。
【０００８】
この発明は又、１７α−ヒドロキシプロゲステロンを特に１１−デオキシコルチゾールに、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する酵母、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母又はかかる酵母に由来する調製物を利用して変換する方法にも関係する。
【０００９】
この発明の主題は又、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する酵母の、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母の、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母の又はかかる酵母に由来する調製物の、１７α−ヒドロキシプロゲステロンの１１−デオキシコルチゾールへの変換のための利用でもある。
【００１０】
この発明の他の主題は、更に、酵母の２０αＨＳＤ型活性の改変方法であって、該酵母のＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子の活性の改変を含む当該改変方法にある。それは、一層詳細には、該酵母のＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子の(好ましくは、遺伝子破壊による)不活性化(一層好ましくは、サッカロミセス属の酵母)を含む、酵母の２０αＨＳＤ活性を減じ又は阻害する方法を含む。
【００１１】
本発明の主題は、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する特定の酵母株でもある。一層好ましくは、これは、非機能的ＹＰＲ１遺伝子を有する酵母、非機能的ＧＣＹ１遺伝子及びＹＰＲ１遺伝子を有する酵母、又は非機能的ＧＣＹ１遺伝子を有するある種の酵母を包含する。
【００１２】
この発明は又、上記の酵母に由来する如何なる無細胞調製物にも関係し、特に、細胞溶解物、細胞ホモジェネート、培養上清、又は誘導された富化若しくは(予備)精製溶液などに関係する。
【００１３】
上記のように、本発明は、先ず、低下した又は検出不能な２０αＨＳＤ型活性を有する酵母株(即ち細胞又は培養物)、及び誘導された調製物を記載する。この発明は、実際、この活性を有する酵母遺伝子の同定、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子を記載し、且つこれらの遺伝子が、特に遺伝子組換え技術によって、これらの細胞の成長又は生存能力を害することなく又はトランスフォームし若しくはステロイド化合物を変換するそれらの能力を害することなく、特異的に改変されうることを示す。従って、この発明は、先ず、ステロイド化合物の、有利な酵母を利用する合成、生成、改変及び／又は変換のための方法を提供する。
【００１４】
それ故、この発明の主題は、一層詳細には、酵母株(即ち細胞又は培養物)の利用であって、ステロイド化合物の製造のための遺伝子改変を有すること及び減少した２０αＨＳＤ活性を有することを特徴とする当該利用にある。本発明は、一層詳細には、下記を有することを特徴とする酵母株を利用する：
− ＧＣＹ１遺伝子の遺伝子改変、又は
− ＹＰＲ１遺伝子の遺伝子改変、又は
− ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の遺伝子改変。
【００１５】
一層好ましくは、この発明の酵母中に存在する遺伝子改変は、不活性化する改変、即ち、その遺伝子又は対応するタンパク質の活性の喪失へと導く改変である。この発明による不活性化する遺伝子改変の最も好適な型は、遺伝子破壊であり、この明細書の残りの部分において詳述する。
【００１６】
従って、一層詳細には、この発明は、下記を特徴とする酵母の利用にある：
ステロイド化合物の製造につき、
− ＧＣＹ１遺伝子が、非機能的であり、
− ＹＰＲ１遺伝子が、非機能的であり、又は
− ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子が、非機能的である。
【００１７】
かかる酵母は、減少した又は検出不能な２０αＨＳＤ活性を有し、それ故、ステロイド化合物の製造又は改変又は変換に特に有利である。
【００１８】
この発明の好適具体例によれば、これらの酵母は、一層好ましくは、サッカロミセス属(特に、S.cerevisiae)に属する。従って、一層特別の具体例において、本発明は、非機能的な(好ましくは、破壊された)ＧＣＹ１遺伝子及び／又はＹＰＲ１遺伝子を含むＳ．セレビシエ酵母の細胞(即ち、株又は培養物)の方法又は利用にある。
【００１９】
しかしながら、実施例が、一層詳細にサッカロミセス・セレビシエ酵母に関係していても、この発明の教示は、この特定の種類の酵母に限定されず、本質的に自然の２０αＨＳＤ型活性を有するか又はＧＣＹ１若しくはＹＰＲ１遺伝子を含む任意の酵母に拡張しうるということは、理解される。この関係において、特に、酵母サッカロミセス、Kluyveromyces(特に、Ｋ．ラクチス)、シゾサッカロミセス、ハンセヌラ・ピチア(特に、Ｐ．パストリス)、カンジダ(特に、Ｃ．マルトーサ)などを挙げることができ、そのファーメンター中での培養及び遺伝子改変は、従来技術に記載されている。
【００２０】
その上、この発明の目的につき、発現ＧＣＹ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにレファレンスＸ９６７４０で記載されたＳ．セレビシエＧＣＹ１遺伝子(Bandlow等、Gene 90(1), 1990, 105-114)並びに酵母細胞内に存在するその任意の機能的変異体又は同族体を意味すると理解される。同様に、ＹＰＲ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにレファレンスＸ８０６４２で記載されたＳ．セレビシエＹＰＲ１(又は、ＹＤＲ３６８ｗ)遺伝子並びに酵母細胞内に存在するその任意の機能的な変異体又は同族体を意味する。これらの遺伝子の配列は又、酵母Ｓ．セレビシエのゲノムの完全な配列が記載されている他のバンク(スタンフォード大学、ＭＩＰＳ等)から得ることもできる。機能的同族体を、配列相同性の検索により、又はＳ．セレビシエＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子から得られたプローブを利用するハイブリダイゼーションクローニングにより、慣用の分子生物学的技術によって同定することができる。
【００２１】
示したように、本発明は、２０αＨＳＤ活性に関与する少なくとも一つの遺伝子(特に、ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子)の遺伝子改変を示し、好ましくは減少した又は抑制された２０αＨＳＤ活性を有する酵母の方法又は利用にある。
【００２２】
この発明の目的につき、用語「遺伝子改変」は、任意の可能な方法例えば突然変異誘発剤の利用及び／又は遺伝的若しくは組換え経路による改変の生成により得られる細胞のゲノムの任意の変化を意味する。好ましくは、遺伝子改変は、少なくとも一つの遺伝子の配列の改変であって、その遺伝子の活性の変化、特に該遺伝子の刺激又は好ましくは不活性化を生じる改変である。遺伝子の不活性化、又は遺伝子の非機能的特性は、タンパク質の発現の非存在により、突然変異、欠失、置換、挿入などによるタンパク質の非機能的形態の発現により、又は十分な活性を与えない低レベルのタンパク質の発現によって明らかとなりうる。その結果、遺伝子の遺伝子改変は、特に、該遺伝子のコード領域又は該遺伝子の調節領域(プロモーターなど)の全部又は部分に影響を与えうる。
【００２３】
好ましくは、この発明による遺伝子改変は、注目している遺伝子の調節領域又はコード領域内の少なくとも一つの塩基対の少なくとも一つの突然変異、置換、欠失及び／又は挿入を含む。尚一層好ましくは、それは、注目している遺伝子の全部又は部分の欠失による改変を含み。これは、遺伝子破壊(又は「遺伝子置換」)技術によって、外来配列により置換されうる。欠失及び／又は挿入による遺伝子改変は、本発明の実施に好適である(何故なら、それらは、注目している遺伝子に対して選択的であり且つ時間経過中安定であるから)。それ故、一層好ましくは、この遺伝子改変は、注目している遺伝子の少なくとも部分の外来配列による置換にある。この改変は、実施例に記載したように、酵母のゲノム中に二重相同組換えによって導入することのできる改変された遺伝子をイン・ビトロで調製することにある公知の技術によって達成することができる(Baudin等、Nucleic Acids Res. 21(14)(1993)3329も参照されたい)。
【００２４】
従って、この発明の好適な主題は、ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子の全部又は部分が外来配列により、例えばマーカー遺伝子(抗生物質耐性をコードするもの)により置換された酵母の方法又は利用にある。一層詳細には、遺伝子破壊のためには、選択した外来配列を注目している遺伝子の隣接する又は隣接しない領域と相同な配列と両端で接して含む組換え核酸をイン・ビトロで調製する。この外来配列は、例えば、マーカー遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子、発現ユニットなどであってよい。一層詳細には、この外来配列は、宿主酵母株における栄養要求を相補する栄養要求性選択遺伝子、例えばＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子又はＡＤＥ２遺伝子；優性選択遺伝子例えば抗生物質(Ｇ４１８、フレオマイシン、ヒグロマイシンＢなど)の耐性遺伝子；又はレポーター遺伝子(β−ガラクトシダーゼなど)であってよい。それは又、例えば、転写ターミネーター例えばＣＹＣ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１又はＰＧＫから選択する特定の酵母ターミネーターを含む発現中断ユニットであってもよい。この遺伝子の発現の条件及び／又はコードされるタンパク質の実際の構造を変えることのできる任意の他の外来配列(即ち、注目している遺伝子において、自然には、この形態では存在しない配列)を、本発明の関連において利用することができるということは理解される。そうして調製された核酸を、次いで、慣用の技術(リチウム、プロトプラストなど)によって酵母に導入し、これは、この外来配列の酵母ゲノム中への二重相同組換えによる挿入(注目している遺伝子の配列内)へと導く(適宜、その一領域の置換として)。
【００２５】
任意の他の遺伝子改変技術例えば位置指定突然変異誘発法、トランスポゾンの利用などを、本発明の関連において利用することができるということは理解される。
【００２６】
遺伝子破壊により不活性化されたＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母の特別の例は、特に：
− ＴＧＹ１７０細胞(ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２)：ＴＧＹ１７０細胞中では、ＧＣＹ１遺伝子の一部分は、組換え体の選択を可能にするＬＥＵ２タンパク質をコードする核酸により置換されている。
− ＴＧＹ１９７細胞(ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２、ｙｄｒ３６８ｗ：：ＵＲＡ３)：ＴＧＹ１９７細胞は、ＴＧＹ１７０細胞に関して、ＹＰＲ１(ＹＤＲ３６８ｗとも呼ばれる)遺伝子に影響を与える更なる遺伝子改変を含み、一部分は、選択遺伝子ＵＲＡ３により置換されている。
− ＴＧＹ１９５細胞(ｙｄｒ３６８ｗ：：ＵＲＡ３)：ＴＧＹ１９５細胞は、ＹＰＲ１(ＹＤＲ３６８Ｗとも呼ばれる)遺伝子に影響を与える遺伝子改変を含み、一部分は、選択遺伝子ＵＲＡ３により置換されている。
− ＴＧＹ１９４細胞(ｇｃｙ１：：ＵＲＡ３)：ＴＧＹ１９４細胞中では、ＧＣＹ１遺伝子の一部分は、組換え体の選択を可能にするＵＲＡ３タンパク質をコードする核酸により置換されている。
【００２７】
かかる細胞も又、この発明の特別の主題を構成する。特に、この発明は、ＹＰＲ１遺伝子の(又は該遺伝子中に)遺伝子改変(特に、ＹＰＲ１遺伝子の又は該遺伝子中の欠失及び／又は挿入)を含む任意の酵母細胞(即ち、株又は培養物)に関係する。この発明は又、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の(又は、該遺伝子中に)遺伝子改変(特に、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の又は該遺伝子中の欠失及び／又は挿入)を含む任意の酵母細胞(即ち、株又は培養物)にも関係する。この発明は又、かかる酵母から誘導された無細胞調製物にも関係する。
【００２８】
この発明の又はこの発明の方法で用いられるこれらの細胞は、有利に、減少した２０αＨＳＤ型活性を、即ち、遺伝子改変してない株と比較して、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、一層好ましくは少なくとも６０％減少した２０αＨＳＤ型活性を有する。実施例に示したように、この発明は、酵母のＧＣＹ１遺伝子の不活性化が、細胞ホモジェネートの上清中の２０αＨＳＤ型活性の９５％減少へと導くことを示す。得られた結果は又、ＧＣＹ１とＹＰＲ１遺伝子の二重の遺伝子改変が、２０αＨＳＤ型活性の抑制へと導き、その後、それは、細胞ホモジェネートの上清中で検出不能となることをも示している。これらの結果は、これらの遺伝子の役割の実例を与え、ステロイド誘導体の製造の応用のための酵母の特性を改良するためにそれらを改変することの可能性を例証する。
【００２９】
本発明は、様々な医薬用途のためのステロイド化合物の製造のために利用することができる。この点において、この発明は、この発明の酵母を利用してステロイド化合物を製造する方法を記載する。この出願は又、ステロイド化合物を製造するための、減少した２０αＨＳＤ活性を有する酵母を利用する改良された方法にもある。この発明の方法は、有利に、上記の酵母の集団をイン・ビトロでステロイド化合物と接触させてから、合成された化合物を抽出することにより実施される。初期ステロイド化合物は、任意の天然の又は改変された若しくは合成されたステロイドであってよく、特に、任意のヒドロキシステロイド又は前駆体化合物であってよく、特に、コレステロール、プロゲステロン、プレグネノロン又は１７ＯＨ−プロゲステロンであってよい。この発明の方法は、ステロイド誘導体例えば１１−デオキシコルチゾール、コルチゾール、ヒドロコルチゾンなど又はこれらの誘導体の製造のために利用することができる。
【００３０】
本発明の他の面及び利点は、下記の実施例を読むことで明らかとなろう(該実施例は、説明であって制限するものと考えるべきではない)。
【００３１】
図面の説明
図１：Ｒｅｄ１２０−アガロース上でのクロマトグラフィーによる酵母ホモジェネートに由来する２０αＨＳＤ活性の精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。上の矢印は、Ｎ末端配列がＧＣＹ１に対応するバンドを示し、下の矢印は、ＹＰＲ１のＮ末端配列に対応するバンドを示している。レーン１は、分子量マーカーに対応し、レーン２は、２０αＨＳＤ活性の精製画分に対応する。
図２：ガラクトース(ＹＮＢ−ｇａｌ)又はグルコース(ＹＰＤ)培地中で培養された酵母Ｓ．セレビシエによる、０．１ｍｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下での４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成。
図３：ガラクトース(ＹＮＢ−ｇａｌ)又はグルコース(ＹＰＤ)培地中で、０．１ｍｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下で培養した野生型(ｗｔ)又はＧＣＹ１遺伝子の配列が変異した(ｇｃｙ−)酵母Ｓ．セレビシエによる、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成。
図４：ＧＣＹ１遺伝子を破壊するためのプラスミドの構造。このプラスミドを酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで線状化してから、材料と方法の節に記載した方法によって、Ｓ．セレビシエにトランスフォームする。このＧＣＹ１遺伝子の配列の欠失は、プロモーター及び３０６ｂｐのコード配列(翻訳開始コドンを含む)を含む。
図５：ＧＣＹ１遺伝子を破壊するためのプラスミド(プラスミドｐＴＧ１２０１０)の構造。このプラスミドを、酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで線状化してから、材料と方法の節に記載した方法によって、Ｓ．セレビシエにトランスフォームする。ＧＣＹ１のタンパク質配列の欠失は、アミノ酸４７〜２６８を含む。ｐＴＧ１２０１０クローン３６は、同じ構造(ＵＲＡ３遺伝子の５’側にＣｌａＩ部位を有しないが、ＵＲＡ３遺伝子の３’側にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する)を有する。
図６：ＹＰＲ１遺伝子(ＹＤＲ３６８ｗ)を破壊するためのプラスミド(プラスミドｐＴＧ１２０１１)の構造。このプラスミドを、酵素ＸｈｏＩで線状化してから、材料と方法の節に記載した方法によって、Ｓ．セレビシエにトランスフォームする。ＹＰＲ１のタンパク質配列の欠失は、アミノ酸５〜１９８を含む。
【００３２】
材料と方法
化学製品：１７α−ヒドロキシプロゲステロンを、Hoechst Marion Roussel (フランス国、Romainville)から得た。タージトール ノニデットP４０及びチロキサポールをSigma社から得た。
【００３３】
酵素試験：
１７α−ヒドロキシプロゲステロンのイン・ビボでの変換：これらの酵母細胞を、２４時間予備培養物からＡ６００＝０．１で接種したＹＰＤ培地(１０ｍｌ)中で、２８℃で培養した。次いで、１００μｌのタージトールとエタノールの混合物(１／１；ｖ：ｖ)中の１７α−ヒドロキシプロゲステロン溶液(１０ｍｇ／ｍｌ)を、この培養に加えた。培養ブロスのアリコート(２５０μｌ)を様々な間隔で集め、これらのステロイドを、ジクロロメタンを用いて抽出した。次いで、これらのステロイドを、Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ上で、４５％ 水性アセトニトリルの存在下で、１ｍｌ／分の流量で、４５℃で分離した。これらのステロイドを、２４０ｎｍで検出した。
【００３４】
細胞：
大腸菌ＢＪ５１８３株(Hanahan, 1983)を、イン・ビボでの組換えに利用し、Ｃ６００、ｈｓｄＲ株を慣用の連結反応に利用した。
【００３５】
酵母ＦＹ１６７９−２８ｃの親株(ＭＡＴａ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ−６３、ｌｅｕ２−１ｆｅｎ１ ｈｉｓ３−２００ＧＡＬ)(Thierry等、1995)を用いた。株ＴＧＹ１７０、ＴＧＹ１９７、ＴＧＹ１９５、ＴＧＹ１９４、ＴＧＹ２１２、ＴＧＹ２４５及びＦＹ１６７９−２８ｃ／ｐＴＧ１０４９７を、実施例に記載のようにして構築した。
【００３６】
分子生物学の並びに大腸菌及び酵母におけるイン・ビボでの組換えの慣用の方法を、Sambrook等(1989)又はDegryse等(1995, 1996)に記載されたように利用した。
【００３７】
酵母の培養：
これらの酵母を、全体的に、栄養供給物(１００μｇ／ｍｌ)を補った合成最少培地(Sherman, 1991)上で培養した。Ｓ．セレビシエのトランスフォーメーションのために、それらの細胞を、ＹＰＤ培地(Sherman, 1991)上で生育させた後で、酢酸リチウム技術(Ito等、1983)によってコンピテントにした。
【００３８】
結果
１７α−ヒドロキシプロゲステロンの望ましくない反応の原因である酵母における２０αＨＳＤ活性の同定
酵母Ｓ．セレビシエによる１７α−ヒドロキシプロゲステロンのＣ２０におけるＮＡＤＰＨ依存性の４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンへの還元は、以前に記載されている(Dumas等、1994)。この活性は、様々な組織で報告された２０αＨＳＤ活性に類似している。これらの組織から特性決定された酵素は、約３５ｋＤａの分子量を有するモノマーである。酵母における２０αＨＳＤ活性の原因である酵素を同定する目的で、ウシ精巣由来の酵素２０αＨＳＤを用いるホモロジー検索をＳ．セレビシエバンクにおいて行なった。これらの検索は、哺乳動物の酵素と４４〜３２％のアミノ酸配列同一性を示す６つの酵母遺伝子産物を同定することを可能にした。これらの遺伝子を、表Ｉに集めてある。
【００３９】
関係する酵素をより一層特性決定する目的で、酵母２０αＨＳＤ型活性を、イン・ビトロで、１７α−ヒドロキシプロゲステロン及びＮＡＤＰＨを基質として用いて再構成した。Ｓ．セレビシエ酵母培養物に由来する様々な調製物をこの系で試験したところ、細胞ホモジェネートの１００，０００×ｇでの遠心分離後に、活性の上清中への局在性を与えた。この結果は、酵素活性が可溶性であることを示している。次いで、２０αＨＳＤ型活性のＲｅｄ１２０クロマトグラフィーによる部分精製を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、３５ｋＤａ領域に二重線の生成を与えた(図１)。これらのバンドの配列決定は、それらが主としてＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子産物よりなることを示した。これらの２種の酵素は、２０αＨＳＤのウシ同族体の部分を形成する(表Ｉに列記)。ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の完全な配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋにおいて、それぞれ、レファレンスＸ９６７４０及びＸ８０６４２でアクセスすることができる。
【００４０】
ＧＣＹ１は、アルド−ケト−レダクターゼ(ＡＫＲ)として記載されており、その発現は、ガラクトースの存在下で有意に増大することに注意することは有益である(Magdolen等、Gene 90(1), 1990, 105)。ＡＫＲ酵素は、広い基質特異性を有している。それらは、脂肪族アルデヒド、単糖類、プロスタグランジン及びステロイドを含む様々な基質を代謝する。従って、ＧＣＹ１は、優れた潜在的候補を構成し、我々は、この酵素が、１７α−ヒドロキシプロゲステロンからの４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成に関与しうるかどうかを確かめることを決めた。
【００４１】
２０αＨＳＤ活性の誘導性の特徴及び無細胞系での発現
実施した実験は、酵母において２０αＨＳＤ活性がガラクトースによって誘導されうることを示すことを可能にした。従って、１７α−ヒドロキシプロゲステロンの４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンへのイン・ビボでの変換を、様々な炭素源で培養した酵母培養物中で測定した。酵母をグルコースで培養した場合に認められた遅延は、ガラクトースの存在下では認められない(図２)。この観察は、２０αＨＳＤをコードする遺伝子のグルコースによる抑制と一致している。この観察は、グルコースが涸渇してから１６時間後に開始する。１７α−ヒドロキシプロゲステロンの４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンへの変換は、酵母をガラクトースの存在下で培養してから４８時間後に約４倍高い。これらの結果は、更に、ガラクトース又はグルコース培地中で培養した酵母から得た無細胞抽出物において２０αＨＳＤ活性を測定することにより、イン・ビトロで確認された。２０αＨＳＤ特異的活性は、グルコース又はガラクトース培地中で培養した細胞のホモジェネート中で、それぞれ０．０５及び０．７５μＭ／分／ｍｇであった。
【００４２】
それ故、これらの結果は、(ｉ)２０αＨＳＤ活性が、酵母ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の産物によって実行されること、(ii)これらの酵素が、可溶性であること、及び(iii)それらの活性が、ガラクトースの存在下で増大され、グルコースの存在下で抑制されることを示している。
【００４３】
非機能的ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を含む酵母の構築及び特性
Ｇｃｙ１ｐが２０αＨＳＤ活性の原因であるということを確認する目的で、ＯＲＦ ＹＯＲ１２０ｗに対応する遺伝子を酵母のゲノムから欠失(ノックアウト)させた。得られた結果は、得られた株が、野生型株と比較して多いに減じた２０αＨＳＤ活性を有するということを示している。その上、ＹＰＲ１遺伝子だけが欠失した株又はＧＣＹ１と共に欠失した株も又、下記のように、構築してそれらの活性につき試験した。
【００４４】
・ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１欠損酵母の構築
ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１活性の欠損した酵母を、遺伝子破壊によって調製した。一層詳細には、
ＴＧＹ１７０株(ＦＹ１６７９−２８ｃ、ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２)を、ＧＣＹ１遺伝子をプラスミドＰｇｃｙ１：：ＬＥＵ２によって破壊することにより構築した。
【００４５】
ＴＧＹ１９７株(ＦＹ１６７９−２８ｃ、ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２ ｙｄｒ３６８ｗ：：ＵＲＡ３)を、ＹＤＲ３６８ｗ遺伝子(ＹＰＲ１)の更なる破壊によって生成した{プラスミドｐＴＧ１２０１１による、ＡＴＦ２について記載された方法(Cauet等、1999)に従って}。
【００４６】
ＴＧＹ１９５株を、遺伝子ＹＤＲ３６８ｗ(ＹＰＲ１)の破壊によって生成した{プラスミドｐＴＧ１２０１１による、ＡＴＦ２について記載された方法(Cauet等、1999)に従って}。
【００４７】
ＴＧＹ１９４株(ＦＹ１６７９−２８ｃ、ｇｃｙ１：：ＵＲＡ３)を、ＧＣＹ１遺伝子をプラスミドｐＴＧ１２０１０により破壊することにより構築した。
【００４８】
ＦＹ１６７９−２８ｃ／ｐＴＧ１０４９７及びＴＧＹ２４５株を、プラスミドｐＴＧ１０４９７及びｐＴＧ１２０４５によって構築した。
【００４９】
次のプラスミドを用いて、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子を破壊した：ｐｇｃｙ１：：ＬＥＵ２、ｐＴＧ１２０１０、ｐＴＧ１２０１１(図４〜６)、ｐＴＧ１２０８６及びｐＴＧ１２０４５．単一コピーのプラスミドｐＴＧ１０４９７が、Ｐ４５０ｃ２１の発現に利用される。
【００５０】
Magdolen等、Gene 90(1990) 105-114に記載されたプラスミドｐｇｃｙ１：：ＬＥＵ２は、ＧＣＹ１遺伝子を含み、そのコード配列及びプロモーターは、ＬＥＵ２遺伝子をコードする配列により中断されている。一層正確には、ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｃＩＩ制限断片に対応するプロモーター及びコード部分を、ＬＥＵ２遺伝子の２．１７ＫベースのＨｐａＩ断片によって置き換えた。そうして、ＧＣＹ１遺伝子を、そのプロモーター及びコード配列の３０６塩基対について削除した。プラスミドｐｇｃｙ１：：ＬＥＵ２を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩにより線状化して、この破壊された遺伝子を含む３．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ ＢａｍＨＩ断片を、Ｆｙ１６７９−２８ｃ株をトランスフォームするために Gietz RD等(Yeast 1995 Apr 15;11(4):355-60 Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure)により記載されたプロトコールを利用して調製した。コロニーを、ロイシンを含まない培地で選択した。このスクリーニングにおける陽性コロニーを、次いで、Dumas等(Eur J Biochem 1996 Jun 1;238(2):495-504 11 beta-hydroxylase activity in recombinant yeast mitochondria. In vivo conversion of 11-deoxycortisol to hydrocortisone)に記載されたようにして、１７ＯＨプロゲステロンの生物変換の実施のために、高栄養培地で培養した。基質１７ＯＨプロゲステロンの濃度は、１００ｍｇ／ｌであり、炭素源はガラクトースであり、そして初期光学密度は、０．１である。培養物の容積は、１０ｍｌであり、インキュベーションは、３０℃で、４８時間である。４８時間のインキュベーション後に、陽性クローンを、１ｍｌの培地(細胞を含む)を２ｍｌのジクロロメタンで抽出してから有機相を逆相高性能液体クロマトグラフィーにより上記(Dumas等、1996)のように分析することによって評価する。クロマトグラムを、１７，２０−ジヒドロプロゲステロンの存在につき精製製品と比較して分析する。このインキュベーション中に、４ｍｇ／ｌのオーダーの量の１７，２０−ジヒドロプロゲステロン(基質の４％)が培地中に、野生型株(破壊用断片によりトランスフォームされてない)については出現するが、幾つかのトランスフォーマントにおいては、１７，２０−ジヒドロプロゲステロンの存在は、今や、１ｍｇ／ｌだけである。低レベルの１７ＯＨプロゲステロンを１７，２０ＯＨプロゲステロンに変換し且つ野生型株と同じ成長を示すＴＧＹ１７０株を選択する。
【００５１】
２つの新しいプラスミドｐＴＧ１２０１０及びｐＴＧ１２０１１を構築して、選択マーカーＵＲＡ３と結合されたＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子を破壊した。
【００５２】
プラスミドｐＴＧ１２０１０を、プラスミドｐＵＣ１９ベース(Gene 1985;33(1):103-19 Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J)上に構築し、プラスミドｐＴＧ１２０１１を、プラスミドｐＰＯＬＹＩＩＩベース(Lathe, R., Vilotte, J.-L.及びClark, J.A. Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts JOURNAL Gene 57, 193-201(1987))上に構築した。
【００５３】
プラスミドｐＴＧ１２０１０及びｐＴＧ１２０１１の構築
ｐＴＧ１２０１０に達するためにプラスミドｐＵＣ１９中のＵＲＡ３遺伝子によるＧＣＹ１遺伝子の破壊の構築を、４回の連続するＰＣＲ増幅により得た。一方では、ＧＣＹ１遺伝子の５’側部分(ＰＣＲ１)、ＧＣＹ１配列と両端で接する機能的ＵＲＡ３遺伝子(ＰＣＲ２)、ＧＣＹ１遺伝子の３’側部分(ＰＣＲ３)を得るために３つの独立したＰＣＲを行ない；ＧＣＹ１遺伝子の５’及び３’側部分を得るために、ＯＴＧ１１２８５、ＯＴＧ１１２８６及びＯＴＧ１１２８７、ＯＴＧ１１２８９対の助成により、Ｆｙ１６７９−２８ｃ株のゲノムＤＮＡテンプレート上で、ＰＣＲを行なった。これらのオリゴヌクレオチド配列は、次の通りである：
ＯＴＧ１１２８５：GATTCGGTAATCTCCGAACAggtaccAATTATATCAGTTATTACCCGGGA
(SEQ ID NO:１)；
ＯＴＧ１１２８６：AGCCATCTTTCAAAGCGGTT (SEQ ID NO:２)；
ＯＴＧ１１２８７：CCGATCGAATCAAAACGAACAG (SEQ ID NO:３)；
ＯＴＧ１１２８９：TCTAATCAGCTAGTAAGAAC (SEQ ID NO:４)。
【００５４】
ＧＣＹ１配列と隣接したＵＲＡ３遺伝子を、(ＧＣＹ１遺伝子のコード配列の一部分の欠失を得るために)次のオリゴヌクレオチドの助成により増幅する
ＯＴＧ１１３０５(aaccgctttgaaagatggctATCGATTTTCAATTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTTTTTTTTG)、(SEQ ID NO:５)及びＯＴＧ１１３０６(ctgttcgttttgattcgatcgggAAGCTTGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC)(SEQ ID NO:６)(線状化プラスミドｐＴＧ１００５４テンプレートに由来する)(Degryse等、In vivo cloning by homologous recombination in yeast using a two-plasmid-based system. Yeast. 1995 Jun 15; 11(7): 629-40)。この増幅のための緩衝液、テンプレート及びプライマーの濃度に関する条件は、酵素ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの作成者又は製造業者により記載されており、特に、Life Technologies社により開発された酵素エロンガーゼについて記載されている。温度サイクルは、次の通りである:プライマー及びテンプレートを変性させるための６’３０”の第一サイクルとその後の、９３℃で３０秒、５４℃で２分間及び６８℃で３分間の３０サイクル、及び７２℃で５分間の最終サイクル。産物ＰＣＲ１、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３を等モル量で混合し、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１２８５及びＯＴＧ１１２８９の助成により再び増幅した(上記参照)。１．９Ｋベースのサイズを有する最終産物ＰＣＲ４を、次いで、プラスミドｐＴＧ１２０１０を得るために、プラスミドｐＵＣ１９のＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限部位間にサブクローン化した。このプラスミドの構造を、末端の制限プロファイリング及びヌクレオチド配列決定によってチェックした。ｐＴＧ１２０１０のクローニングは、実際は、このプラスミドの２つのバージョンｐＴＧ１２０１０＃４０(ｐＴＧ１２０１０クローン４０)及びｐＴＧ１２０１０＃３６(ｐＴＧ１２０１０クローン３６)を得ることを可能にした。初期の希望は、５’及び３’側にＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＵＲＡ３遺伝子により中断されたＧＣＹ１遺伝子を得ることであった。実際には、２つの異なるプラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６及びｐＴＧ１２０１０＃４０が得られた。これらの２つのプラスミドは、ＵＲＡ３遺伝子の両端のＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の存否だけが異なっている。プラスミドｐＴＧ１２０１０＃４０は、ＵＲＡ３遺伝子の３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するが、５’側にＣｌａ５’を有しない。プラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６は、該遺伝子の３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有しないが、５’末端にＣｌａＩ部位を有する。
【００５５】
この特性を利用して、ＧＣＹ１のコード配列を中断するＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ部位に両端で接したＵＲＡ３遺伝子を有するプラスミドを得る。
【００５６】
プラスミドｐＴＧ１２０３６の構築
プラスミドｐＴＧ１２０３６を、ｐＴＧ１０８０２から４段階で構築した。プラスミドｐＴＧ１０８０１(プラスミドｐＴＧ１０８０２の原因である)は、ｐＵＣ型のプラスミドであり、連続する制限部位がＸｈｏＩ及びＸｈｏＩ部位間に挿入されている。この連続する制限部位は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｎａｂＩ、ＣｌａＩ及びＳｐｅＩ部位を含む。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ間に、プロモーターＴＥＦ１、ヒトｃＤＮＡ ｐ４５０ｃ２１及びＰＧＫターミネーターを含むｐＴＧ１０４７０のＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩカセット(下記)を、ｐＴＧ１０８０１のＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ部位間に挿入してｐＴＧ１０８０２を与えた。次いで、このプラスミドをＸｈｏＩで消化し、それ故、導入したカセットを、ＸｈｏＩ部位に両端で接しているＰＣＲ断片を導入するために削除する。２．５ｋｂのこの断片は、５’側でＣｌａＩ制限部位に接しているＵＲＡ３遺伝子により中断されたＧＣＹ１遺伝子を含むＸｈｏＩに両端で接している断片を得るための、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１８４４(tttgctcgaggttacagaagggc, SEQ ID NO:１３)及びＯＴＧ１１８４５(gattctcgagcaattggctgacta, SEQ ID NO:１４)の対による、プラスミドｐＴＧ１２０１０(＃４０)上での増幅から得られる。この断片を、プラスミドｐＴＧ１２０３５を得るために、プラスミドｐＴＧ１０８０２のＸｈｏＩ部位の間で、クローン化した。欠けたＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するために、プラスミドｐＴＧ１２０１０(＃３６)を利用した。このプラスミドは、本質的に、ｐＴＧ１２０１０(＃４０)と同一であるが、ＨｉｎｄＩＩＩ部位をＵＲＡ３遺伝子の３’側(ＧＣＹ１遺伝子との境界)に有しており且つＣｌａＩ部位をＵＲＡ３遺伝子の５’側(ＧＣＹ１遺伝子との接合点)に有していない。組換えを、ｐＴＧ１２０１０(＃３６)の２．２ｋｂのＮｃｏＩ ＢａｍＨＩ断片(ＵＲＡ３遺伝子の５’〜３’断片を有し且つＧＣＹ１遺伝子の断片の３’側を有する)とプラスミドｐＴＧ１２０３５の一部分(即ち、４．４５ｋｂの大きいＳｔｕＩ、ＡｆｌＩＩ断片)との間で、イン・ビボで、大腸菌内で行なう。得られたプラスミドｐＴＧ１２０３６は、ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれ５’及び３’側の境界とするＵＲＡ３遺伝子により中断されたＧＣＹ１遺伝子を有する。
【００５７】
プラスミドｐＴＧ１２０８６の構築
この断片を、次いで、プラスミドｐＴＧ１２０３６を得るために、プラスミドｐＴＧ１０４６９のＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ２．３３Ｋｂ断片により運ばれるＰ４５０ｃ２１の発現カセット(下記参照)により置き換える。
【００５８】
チトクロームＰ４５０ｃ２１用の発現プラスミドの構築．
このタンパク質の酵母における過剰発現のために、２種類のプロモーター、ＴＥＦ１(「transcription elongation factor 1」)及びＴＤＨ３(「glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3」)を利用した。すべての場合において、転写ターミネーターは、ＰＧＫターミネーターである。
【００５９】
これらのプラスミドにおいて、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ断片は、ヒトＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡを有する。
【００６０】
プラスミドｐＴＧ１０４７０及びｐＴＧ１０４６９の構築．
プラスミドｐＴＧ１０２９８を、ｐＭＡｃ２１を改変すること(Expression and functional study of wild-type and mutant human cytochrome P450c21 in Saccharomyces cerevisiae. Wu DA, Hu MC, Chung BC DNA Cell Biol 1991 Apr; 10(3): 201-9)、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ消化及びオリゴヌクレオチドＯＴＧ５８６８の導入により得た。このプラスミドのｃＤＮＡは、American Type Culture Collectionから、ｐｃ２１/３ｃの名称で得られる。それは、１．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片であり、様々なプラスミドの構築のためのベースとして役立つ。為された改変は、上記の論文及び論文(Expression of human 21-hydroxylase (P450c21) in bacterial and mammalian cells: A system to characterize normal and mutant enzyme Meng-Chun Hu and Bon-chu Chung DNA and Cell Biology 1991 Apr; 10(3) 201-209)に記載されている。
【００６１】
この手順において、Ｐ４５０ｃ２１用の発現カセットを含むプラスミドｐＭＡｃ２１中のＰ４５０ｃ２１の非コード領域を除去し、並びに、その中に存在するＫｐｎＩ部位を除去した。プラスミドｐＴＧ１０２９２を、ヒトｃＤＮＡ(ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ断片)の、プラスミドｐＴＧ１０２９８からプラスミドｐＴＧ１００３１への、ＳａｌＩ及びＭｌｕＩ部位の助成によるトランスファーによって得た。プラスミドｐＴＧ１０４７５を、ＰＣＲ及び組換えによって得た。実際に、プラスミドｐＴＧ１０２９２から出発して、約２５０ヌクレオチドに相当するヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡの断片を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ７４１０(GGAATTCCGTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC, SEQ ID NO: １５)及びＯＴＧ５９２７(CCTCAATGGTCCTCTTGGAGTTCAGCACC, SEQ ID NO:１６)の助成により増幅した。この断片は、オリゴヌクレオチドＯＴＧ７４１０において記載したように、ＳａｌＩ部位と配列AAAAを境界とするヒトＰ４５０ｃ２１のコード配列に相当する。この断片をＳａｌＩで消化してから、ＳａｌＩで消化したｐＴＧ１０２９２の線状化断片に連結し、次いで、組換え実験をＢＪ５１８３株中で行なった。得られたプラスミドｐＴＧ１０４７５は、プラスミドｐＭＡｃ２１と異なる天然のｃＤＮＡと同じコード配列を有するＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡを有する(我々が実験室で使用するベクターと適合性の断片即ちＳａｌＩ及びＭｌｕＩ制限部位を境界とする断片上に)。この断片は、翻訳開始のためのATGコドンの周囲に次の環境を有する GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC(SEQ ID NO:１７)。このプラスミドから、ヒトＰ４５０ｃ２１ ｃＤＮＡを有するＳａｌＩ、ＭｌｕＩ断片を、プラスミドｐＴＧ１０１５８(Degryse等、1996)に、プラスミドｐＴＧ１０４７２を得るために、慣用のクローニングによって、トランスファーした。この同じプラスミドｐＴＧ１０４７２のＳａｌＩ ＭｌｕＩ断片を、次いで、組換えにより、プラスミドｐＴＧ１００８５(Degryse等、1996)中にトランスファーして、プラスミドｐＴＧ１０４６９を与えた。この同じＳａｌＩ及びＭｌｕＩ制限断片上のＰ４５０ｃ２１ ｃＤＮＡを有する断片をプラスミドｐＴＧ１００９２中にトランスファーして、プラスミドｐＴＧ１０４７０(Degryse等、1996)を与えた。それ故、このプラスミドは、ヒトＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡを、ＴＥＦ１プロモーター及びＰＧＫターミネーターの制御下に、ＵＲＡ３−ｄ選択マーカー及びATG開始コドン環境(上記)と共に有する。
【００６２】
プラスミドｐＴＧ１２０８６の構築．
このプラスミドは、Ｐ４５０ｃ２１の発現カセットの組込み及びそれと同時のＧＣＹ１遺伝子の破壊に役立つ。
【００６３】
このプラスミドを、プラスミドｐＴＧ１２０３６及びプラスミドｐＴＧ１０６１４から構築した。
【００６４】
後者のプラスミドを、ＴＤＨ３プロモーター、ＰＧＫターミネーター及びＵＲＡ３−ｄ選択マーカーに基づく酵母発現プラスミドであるｐＴＧ１０２１２(Degryse等、Yeast 11:629-640(1995))から構築した。
【００６５】
大腸菌における相同組換えにより、この選択マーカーを、プラスミドｐＴＧ１００５４(Degryse等、1995)の選択マーカーで置き換え；これを行なうために、組換え配列と隣接したＵＲＡ３マーカーを含む２．１ｋｂのｐＴＧ１００５４のＭｌｕＩ、ＦｓｐＩ断片を、ｐＴＧ１０２１２の大きいＨｉｎｄＩＩＩ断片と組み換えて、ｐＴＧ１０２１２(Degryse等、1995)と同じ特性を有し、ｐＴＧ１００５４と同じ向きのＵＲＡ３マーカーを有するプラスミドｐＴＧ１０６１０を与える。プラスミドｐＴＧ１０４７２のヒトチトクロームＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡを有するＳａｌＩ ＭｌｕＩ断片(上記参照)を、プラスミドｐＴＧ１０６１０中にトランスファーして、プラスミドｐＴＧ１０６１４を与える。５’〜３’のＴＤＨ３プロモーター、ＳａｌＩ及びＭｌｕＩ部位を境界とするヒトＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡ並びにその後ろのＰＧＫターミネーターを含むこのプラスミドのＣｌａＩ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、プラスミドｐＴＧ１２０３６中にトランスファーして、プラスミドｐＴＧ１２０８６(これは、従って、ヒトチトクロームＰ４５０ｃ２１のＴＤＨ３発現カセットにより中断されたＧＣＹ１遺伝子の配列を含む)を与える。
【００６６】
プラスミドｐＴＧ１２０４５の構築．
プラスミドｐＰｏｌｙＩＩＩのユニークなＳｐｈＩ部位を、相補的オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１９７５(AAATCGATAACATG, SEQ ID NO:１８)及びＯＴＧ１１９７６(TTATCGATTTCATG, SEQ ID NO:１９)の対の挿入により破壊する。ｐＰＯＬＹＩＩＩのＳｐｈＩ部位を破壊し、ＣｌａＩ部位により置き換えて、プラスミドｐＴＧ１２０４０を与える。プラスミドｐＴＧ１２０４０中のユニークなＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ部位間に、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１９８１(ATTGATATCGATAAAAAGCACGGCGTTGAG, SEQ ID NO:２０)及びＯＴＧ１１９８２(TCTCGGAATTCAGGTACTGCAGCCAG, SEQ ID NO:２１)を用いる増幅により得られるＹＰＲ１遺伝子の０．７ｋｂの３’部分に対応するＣｌａＩ ＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡ断片を導入して、プラスミドｐＴＧ１２０４１を与える。この２．８４ｋｂのプラスミドｐＴＧ１２０４１に、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４(tacgctcgagACGTTGGTGTCATTGATATTCA, SEQ ID NO:２２)及びＯＴＧ１１９８０(CAACTAAGCTTCATTCAAATAGATAGCCGC, SEQ ID NO:２３)(野生型酵母のゲノムＤＮＡに由来)により増幅したＹＰＲ１遺伝子の５’部分(０．６６ｋｂ)を、ＸｈｏＩ ＨｉｎｄＩＩＩ断片の形態にてクローン化する(プラスミドｐＴＧ１２０４１のＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に)。３．５ｋｂのプラスミドｐＴＧ１２０４２が得られる。このプラスミドは、ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位により中断されたＹＰＲ１遺伝子を有する。これらの部位の間に、チトクロームＰ４５０ｃ２１カセットを、プラスミドｐＴＧ１０４６９から得られる２．３３ｋｂのＣｌａＩ ＨｉｎｄＩＩＩ断片の形態で、クローン化する。こうして、プラスミドｐＴＧ１２０４５が得られる。
【００６７】
プラスミドｐＴＧ１０４９７の構築．
このプラスミドは、低コピー数の(ＡＲＳ ＣＥＮ型の)発現プラスミドであり、ＴＤＨ３プロモーター及びＰＧＫターミネーターの制御下で見出されるヒトチトクロームＰ４５０ｃ２１の発現カセットを含む。このプラスミドを、ＵＲＡ３選択マーカー及びＴＥＦ１プロモーター、ＰＧＫターミネーター及びＡＲＳＨ４／ＣＥＮ６型の酵母複製起点を含むプラスミドｐＴＧ１０４３４(Degryse等、1995)から構築した。
【００６８】
このプラスミドを、マーカーＵＲＡ３及びプロモーターＴＥＦ１の代りに、それぞれ、マーカーＬＥＵ２及びプロモーターＴＤＨ３を含むように改変した。これを行なうために、ＰＧＫターミネーターである組換え断片を境界とするＬＥＵ２マーカー及び複製起点の断片を含むＳｐｅＩ、ＭｌｕＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＴＧ１０４３４のＵＲＡ３領域の代りの組換えによりクローン化して、プラスミドｐＴＧ１０４６６を得る。このプラスミドｐＴＧ１０４６６において、ＴＥＦ１プロモーターは、大腸菌においてｐＴＧ１０２１２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片(Degryse等、1995)(大腸菌の複製起点並びにプロモーター及びターミネーターＴＤＨ３及びＰＧＫをそれぞれ含む)を、ｐＴＧ１０４６６のＭｌｕＩ ＦｓｐＩ断片と組み換えることにより、ＴＤＨ３プロモーターによって置き換えられ、それは、ＬＥＵ２マーカー及びＡＲＳＣＥＮ複製起点(組換え配列を境界とする)を含み;こうしてプラスミドｐＴＧ１０６１２が得られる。このプラスミドのＳａｌＩ及びＭｌｕＩ部位の間に、発現カセットＴＤＨ３：：ヒトＰ４５０ｃ２１チトクローム及びターミネーターを位置させて、プラスミドｐＴＧ１０４９７を与える。
【００６９】
欠損株の構築
ＧＣＹ１活性を欠く株を得るために、株ＦＹ１６７９２８ｃを、酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで線状化したプラスミドｐＴＧ１２０１０により、上記の酢酸リチウム法によってトランスフォームする。これらのトランスフォームしたクローンを、ウラシルを含まない培地上で選択し、次いで、コロニーにつき、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１２８５、ＯＴＧ１１２８９及びＯＴＧ１１２８５、ＯＴＧ１１３０６の対を用いる増幅によるスクリーニング(上記の条件による酵母のゲノムＤＮＡの抽出物又は調製物をテンプレートとして利用する)にかける。それぞれ予想されるサイズ１．９Ｋｂ及び１．４ＫｂのＰＣＲＤＮＡ生成物を示すコロニーを、次いで、栄養豊富な培地で培養して、Dumas等(Eur J Biochem 1996 Jun 1；238(2):495-504 11 beta-hydroxylase activity in recombinant yeast mitochondria. In vivo conversion of 11-deoxycortisol to hydrocortisone)に記載された１７ＯＨプロゲステロンの生物変換を実行する。基質濃度は、１００ｍｇ／ｌであり、炭素源は、ガラクトースであり、そして出発時の光学密度は、０．１である。培養物容積は、１０ｍｌであり、インキュベーションは、３０℃で２４時間である。２４時間のインキュベーション後に、陽性クローンを、上記のように、１ｍｌの培地(細胞を含む)を２ｍｌのジクロロメタンで抽出してから有機相を逆相高性能液体クロマトグラフィーにより分析することにより評価する(Dumas等、1996)。ＴＧＹ１９４＃１０及びＴＧＹ１９４＃１１株は、１７ＯＨプロゲステロンに対する２０ケトレダクターゼ活性を欠いており、ＰＣＲにおいて陽性シグナルを与える。
【００７０】
ｐＴＧ１２０１１へと導くＹＰＲ１(ＹＤＲ３６８ｗ)遺伝子のＵＲＡ３遺伝子による中断のプラスミドｐＰＯＬＹＩＩＩにおける構築を４回の連続するＰＣＲにより得た。一方で、３つの独立したＰＣＲを、ＹＰＲ１遺伝子の５’部分(ＰＣＲ５)、ＹＰＲ１配列を境界とする機能的ＵＲＡ３遺伝子(ＰＣＲ６)、ＹＰＲ１遺伝子の３’部分(ＰＣＲ７)を得るために行なった。このＰＣＲ５を、ゲノムＤＮＡテンプレート上での、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４(tacgctcgagACGTTGGTGTCATTGATATTCA, SEQ ID NO:７)及びＯＴＧ１１３１５(CTTCATTCAAATAGATAGCCG, SEQ ID NO:８)を用いる増幅により得たが、同様に、ＰＣＲ７が、同じテンプレート上での、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１６(TATGGCTAAAAAGCACGGCTT, SEQ ID NO:９)及びＯＴＧ１１３１７(cgatctcgagTTTCTCGTTGTTCAGGTACTG, SEQ ID NO:１０)の助成による増幅により得られる。５’及び３’ＹＰＲ１領域と隣接したＵＲＡ３遺伝子を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１４６３(CGGCTATCTATTTGAATGAAGatcgattttcaattcaattcatcattttttttttattcttttttttg, SEQ ID NO:１１)及びＯＴＧ１１４６４(AACGCCGTGCTTTTTAGCCATAAGCTTgggtaataactgatataattaaattgaactc, SEQ ID NO:１２)の助成により、線状化ｐＴＧ１００５４テンプレート上での増幅により上記のように増幅する。ＰＣＲ５、ＰＣＲ６及びＰＣＲ７生成物を、等モル量で混合してから、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４及びＯＴＧ１１３１７の助成によりＰＣＲにより増幅して、上記のように、１．ＸｋｂのＰＣＲ８の生成物を与えた。このＰＣＲ８生成物を、酵素ＸｈｏＩで消化してから、ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＰＯＬＹＩＩＩ内にサブクローン化した。このプラスミドｐＰＯＬＹＩＩＩ中のインサーションの向きを、酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩでの消化により決定した。
【００７１】
不思議にも、ＣｌａＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在しないことが、それぞれ、プラスミドｐＴＧ１２０１０及びｐＴＧ１２０１１につき注意される。これらのクローニングジャンクションは、ヌクレオチド配列決定によりチェックした。
【００７２】
ＴＧＹ１９５株の構築．
プラスミドｐＴＧ１２０１１を酵素ＸｈｏＩで消化し、その消化生成物を、その後、Ｆｙ１６７９−２８ｃ株を上記の塩化リチウム法を用いてトランスフォームするのに利用する。これらのトランスフォーマントを、ウラシルを含まない培地で選択する。これらのトランスフォーマントを、プラスミドｐＴＧ１２０１１の構築に使用したオリゴヌクレオチドを利用するＰＣＲ増幅により分析する。この試験における陽性クローンを、次いで、１７ＯＨプロゲステロンの生物変換法(上記)により炭素源としてのグルコースの存在下でスクリーニングにかける。クローンＴＧＹ１９５＃４を、新たな特性決定のために選択する。
【００７３】
ＴＧＹ１９７株の構築
減少した２０ケトレダクターゼ活性をこれらの条件下で示すクローンＴＧＹ１９５＃４を、新たなトランスフォーメーション用に、Ｆｙ１６７９−２８ｃ株につき上記したように、プラスミドｐｇｃｙ１：：ＬＥＵ２の助成により選択する。次いで、ロイシンの非存在下で生育しうるクローンを、１７ＯＨプロゲステロンについての新たな生物変換(上記)のためにグルコース又はガラクトースの存在下で選択する。減少した活性を２つの生物変換条件下で示すクローンＴＧＹ１９７＃ａを選択する。従って、最初１２％(１００ｍｇ／ｌの基質で)であった２０ケトレダクターゼ活性は、約０．２％に減じ、即ち、６０倍を超える減少である。
【００７４】
ＴＧＹ２４５株の構築
ＴＧＹ２４５株を、ＴＧＹ１９５＃４株から構築する。ＴＧＹ１９５＃４株から、ＴＧＹ２１２＃１株が最初に得られ、その後、ＴＧＹ２４３＃１株、そして最後にＴＧＹ２４５株が得られる。
【００７５】
ＴＧＹ１９５＃４株を、プラスミドＹＲＰ７(１μｇ)と５μｇのプラスミドｐＴＧ１２０４５(ＮｏｔＩで消化したもの)の両方を利用してトランスフォームする。トランスフォームした株を、トリプトファンを含まない培地上で選択する。コロニー(６７８コロニー)を、トリプトファン含有培地でサブ培養し(プラスミドＹＲＰ７を除くため)、そして、ＧＣＹ１遺伝子を中断するＵＲＡ３遺伝子を失ったコロニーを選択するために、トリプトファン及び５−フルオロオロテート(５ＦＯ)を含む培地でサブ培養する。１つのコロニー、ＴＧＹ２１２＃１が、このスクリーニングから得られる。このコロニーを、１００μｇ／ｍｌの１７ＯＨプロゲステロン基質を用いる生物変換実験(上記)にかけ、この株は、必須アミノ酸とウラシルを補った最少培地で生育する。この株は、１７ＯＨプロゲステロンを１１−デオキシコルチゾールに、４７％のオーダーの効率で、２４時間にわたって、変換することができ、これらの条件下で、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成は低い(＜０．５％)。ある条件(炭素源としてガラクトースを有するKappeli型の限定された栄養豊富な培地、及び高密度での培養開始：ＯＤ６００ｎｍ＝５)の下で、ケトンを減じる能力は、増大して、初期基質の１．５％に減少した生物変換能力を有する初期基質の１１％に達する。これらの条件下で、ＧＣＹ１遺伝子のありそうな存在は、１７ＯＨプロゲステロンの生物変換に負の影響を及ぼす。それ故、我々は、その活性を阻止するために、ＧＣＹ１遺伝子を破壊することを決定した。
【００７６】
これを行なうために、ＴＧＹ２１２＃１株を、制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで線状化した３μｇのプラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６でトランスフォームした。２７のトランスフォーマントを、ＴＧＹ２１２＃１の栄養要求性を満たすように補った最少培地(但し、ウラシルを含まない)で選択した。これらのコロニーを、炭素源としてガラクトースを補った最少培地で生物変換試験にかけた(ガラクトースは、公知のＧＣＹ１のインデューサーであるので)。すべてのＴＧＹ２４３クローンは、結果として、検出可能量の４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンを生成することなく、１７ＯＨプロゲステロンを１１−デオキシコルチゾールに変換する能力を示した。ＵＲＡ３遺伝子の代りに導入するために、ＴＧＹ２４３＃１クローンを選択した(ヒトＰ４５０ｃ２１用の発現カセット)。
【００７７】
このＴＧＹ２４３＃１株を、プラスミドＹＲＰ７(２μｇ)及び酵素ＸｈｏＩで線状化したプラスミドｐＴＧ１２０８６(５μｇ)でトランスフォームする。このｐＴＧ１２０８６トランスフォーミング断片は、ヒトＰ４５０ｃ２１用の発現カセットにより中断されたＧＣＹ１のコード配列(ＴＤＨ３：：ヒトｃＤＮＡＰ４５０ｃ２１：：ＰＧＫ°ターミネーター)を含む。トリプトファンの非存在下で生育するコロニーを選択する。これらの３８１コロニーを、次いで、トリプトファン及び５−フルオロオロテートを含む培地上にトランスファーする。次いで、約１０コロニーを、トリプトファン、ヒスチジン、ロイシン及びウラシルを５０μｇ／ｍｌの濃度で補ったＹＰＧ型の栄養豊富な培地で試験した。次いで、これらの株に、１７ＯＨプロゲステロンを、１００μｇ／ｍｌの濃度で変換させる(０．１のＯＤ６００ｎｍで開始して１６時間行なう)。
【００７８】
これらの１０クローンの内で、クローンＴＧＹ２４５＃１Ｄを、２つの基準に基づいて、特に、１７ＯＨプロゲステロンを１１−デオキシコルチゾールに変換する能力、及び第二に、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの形成のないこと(ＧＣＹ１の破壊を示す)に基づいて選択する。
【００７９】
欠損ＧＣＹ１株の特性：
得られた結果は、ＣＧＹ１の「ノックアウト」が、ガラクトースにより誘導される２０αＨＳＤ活性を排除することを示している。そうして、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの１７α−ヒドロキシプロゲステロン(１００μｇ／ｍｌ)からのイン・ビボ生成を、野生型株及びＴＧＹ１７０株(ｇｃｙ１−Δ：：ＬＥＵ２)の培養(グルコース培地又はガラクトース培地)において試験した(図３)。ガラクトース培地における培養の場合には、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オン生成の、野生型株と比較して約９５％の減少が、変異株につき認められた。グルコース培地において、この減少は一層低く、これは、ＧＣＹ１遺伝子産物がガラクトースにより誘導されうる２０α活性を構成することを示すようである。如何なる炭素源を用いても、残留活性は、変異体ｇｃｙ１１−Δに存在する(これは、実質的に等しい)。
【００８０】
欠損ＧＣＹ１、ＹＲＰ１二重変異体の特性：
Ｇｃｙ１ｐ及びＹｐｒ１ｐが２０αＨＳＤ活性と結合して見出されたという事実(上記参照)、及びＹｐｒ１ｐがＧｃｙ１ｐの最も近い同族体である(６５％ アミノ酸同一性)という事実が与えられれば、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１の二重破壊を行なって、その２０αＨＳＤ型活性につき試験した。得られた結果は、これら２つの遺伝子が欠損した株(ＴＧＹ１９７)が、本質的に、２０αＨＳＤ活性を有しないことを示している。
【００８１】
一層詳細には、ＴＧＹ１９７酵母(ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２、ｙｐｒ１：：ＵＲＡ３)を生成して、それらの２０αＨＳＤ活性につきイン・ビボで試験した。これらの細胞を、グルコース又はガラクトースを炭素源として用いて、１００μｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下で培養した。７２時間後に、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンは、発酵液中で検出不能であり、これは、これら２つの遺伝子の不活性化が検出可能な２０αＨＳＤ活性の抑制へと導くことを示している。
【００８２】
これらの野生型及び変異型株の基質特異性
様々なクラスのレダクターゼ(アルドース−、アルデヒド−及びカルボニル−レダクターゼ)の基質として既に記載された一連の化合物を、野生型ホモジェネートにて及び変異株につき様々な培養条件下で試験した(表ＩＩ)。Ｇｃｙ１ｐ及びＹｐｒ１Ｐは、１７α−ヒドロキシプロゲステロンを基質として受け入れる唯一のアルド−ケト酵母レダクターゼであるということが認められる。
【００８３】
Ｇｃｙ１ｐは、すべての場合にガラクトースによる誘導が活性を増大させるので、試験したすべての基質を利用するようである。グルコース培地において、基礎的活性は、１７α−ヒドロキシプロゲステロンを除き、すべての成分について認められた(Ｇｃｙ１Ｐ及びＹｐｒ１ｐの存在と無関係に)。ガラクトース培地において、試験した２種のアルデヒドに対する一層高い活性が変異株において認められた(もっとも、野生型における程には言明できないが)。これは、Ｇｃｙ１Ｐ以外のアルデヒドに特異的な酵素がガラクトースによって誘導されうるということを示している。
【００８４】
浸透圧ストレス下での酵母の生理学についての最近の報告において、ＧＣＹ１が、反応性であるとして同定された。アスペルギルス・ニガーのグリセロールデヒドロゲナーゼから単離されたペプチドの配列決定は、２つの酵母タンパク質：Ｇｃｙ１ｐ及びＹｐｒ１ｐとの相同性を示した。浸透圧ストレス下でのＧＣＹ１の誘導(ガラクトースによる誘導に加えて)は、ＧＣＹ１が、Norbeck及びBlombergに示唆されたように、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を構成することを示すことができた。しかしながら、かかる活性は、今まで示されていない。
【００８５】
１７α−ヒドロキシプロゲステロンの、Ｓ．セレビシエにおける、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンへの還元は、主に、ＧＣＹ遺伝子の産物のためであり、一層僅かに、ＹＰＲ１遺伝子の産物のためである。Jez等(1997)により提案された命名法によれば、これらの酵素は、ＡＫＲ１Ｃサブファミリーに分類されるべきである。哺乳動物においては、ＨＳＤ(ＡＫＲファミリーに属する)は、ステロイドホルモンの利用可能性を調節することが提案されている。これらの酵素の酵母における生理的役割は、自然環境において酵母はステロイドにさらされうることが支持されていないので、未知のままである。かかる活性の酵母における意義が何であれ、その排除は、酵母による、特にこの発明により遺伝子改変された酵母によるコルチコステロイドの生成の改善に寄与する。
【００８６】
ＧＣＹ１及びＹＰＲ１の存在下及び非存在下での、ヒトＰ４５０ｃ２１による酵母における生物変換の実施例
ＧＣＹ１及びＹＰＲ１の破壊が、酵母Ｓ．セレビシエにおける特異的生物変換を得るために必須であることを示す目的で、我々は、Ｆｙ１６７９−２８ｃ／ｐＴＧ１０４９７（Ｆｙ／ｐＴＧ１０４９７）、ＴＧＹ２１２＃１及びＴＧＹ２４５＃２Ｄ株の１７ＯＨ−プロゲステロンの生物変換の能力を比較した。
【００８７】
Ｆｙ／ｐＴＧ１０４９７株は、２つの野生型遺伝子ＧＣＹ１及びＹＰＲ１並びに単一コピーのＡＲＳＣＥＮ型(「Autonomously Replicating Sequence Centromer」)のプラスミドをヒトＰ４５０ｃ２１の発現のために有する。ヒトＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡは、このプラスミド中で、ＴＥＦ１プロモーターの制御下にある。
【００８８】
ＴＧ２１２＃１株は、ＹＰＲ１座に組み込まれたヒトＰ４５０ｃ２１遺伝子(ＴＥＦ１：：ヒトＰ４５０ｃ２１：：ＰＧＫターミネーター)の発現用カセットを１コピー有し且つＧＣＹ１遺伝子の野生型１コピーを有する。
【００８９】
ＴＧＹ２４５＃２Ｄは、ＹＰＲ１及びＧＣＹ１遺伝子のコピーを有さず、カセットＴＥＦ１：：ヒトＰ４５０ｃ２１の１コピー及びＴＤＨ３：Ｐ４５０ｃ２１の１コピーが各座にそれぞれ組み込まれる。
【００９０】
これらの株を、カザミノ酸を補った最少培地で４８時間培養した。これらの株を、ウラシル、ヒスチジン及びトリプトファンを補った新鮮なKappeli培地中に２００ｍｇ／ｌの１７ＯＨプロゲステロンの存在下で再懸濁させる。７２時間のインキュベーション後に、酵母細胞の存在下で培地を抽出して、上記のように、逆送高性能液体クロマトグラフィーにより分析する。１７ＯＨプロゲステロン、１１−デオキシコルチゾール及び４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの存在を測定する。
【００９１】
これらの結果は、表ＩＩＩに与えてある。各生成物は、全生成物の総和のパーセンテージで表してある。
【００９２】
この実験により、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１の破壊は、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの量を７〜１１％から我々の技術(０．５〜１ｍｇ／ｌの感度)によっては検出できないレベルまで有意に減じるということが明らかである。
【００９３】
【００９４】
【表１】
【００９５】
【表２】
活性は、μＭ／分／ｍｇタンパク質で与えてある。
ｎｄ：未検出
【００９６】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｒｅｄ１２０−アガロース上でのクロマトグラフィーによる酵母ホモジェネートに由来する２０αＨＳＤ活性の精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２】 ガラクトース(ＹＮＢ−ｇａｌ)又はグルコース(ＹＰＤ)培地中で培養された酵母Ｓ．セレビシエによる、０．１ｍｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下での４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成を示す図である。
【図３】 ガラクトース(ＹＮＢ−ｇａｌ)又はグルコース(ＹＰＤ)培地中で、０．１ｍｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下で培養した野生型(ｗｔ)又はＧＣＹ１遺伝子の配列が変異した(ｇｃｙ−)酵母Ｓ．セレビシエによる、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成を示す図である。
【図４】 ＧＣＹ１遺伝子を破壊するためのプラスミドの構造を示す図である。
【図５】 ＧＣＹ１遺伝子を破壊するためのプラスミド(プラスミドｐＴＧ１２０１０)の構造を示す図である。
【図６】 ＹＰＲ１遺伝子(ＹＤＲ３６８ｗ)を破壊するためのプラスミド(プラスミドｐＴＧ１２０１１)の構造を示す図である。
【配列表】
本発明は、生物学的分野及び医薬分野に関係する。それは、特に、ステロイド化合物の製造に有用な、又はステロイド化合物の(選択的)変換に有用な新規な組成物及び方法に関係する。それは、一層詳細には、新規な酵母株及び遺伝学的方法並びにそれらの製造のための構築物に関係し、ステロイド化合物の合成又は改変のためのそれらの利用に関係する。この発明のこれらの酵母株は、合成の効力を改善すること及びこの方法の選択性又は収率並びに最終生成物の品質を高めることを可能にする。この発明のこれらの株、方法及び化合物は、ヒト又は動物において治療又は予防的活性を有する製品(特に、ステロイド誘導体)の研究、開発及び製造において有用である。
【０００２】
ステロイドを変換する自然の微生物の能力は、広く文献に記載されてきた。この点に関して、それらは、化学合成によって得ることが困難なステロイド誘導体の製造のための有利な別法を代表する。酵母は、その上、オルガネラで活性な酵素をコードするｃＤＮＡの発現のために特に適している。その結果、酵母例えばＳ．セレビシエ(S.cerevisiae)は、ステロイド産生用酵素例えばミクロソーム又はミトコンドリアのＰ４５０をコードするｃＤＮＡを発現させるために広く用いられてきた。その上、ヒドロコルチゾンの生合成経路に含まれる酵素を発現させることを意図した幾つかの研究は、酵母がある種の中間体を効率的に変換することができることを示すことを可能にした。そうして、ステロイドの生合成経路に含まれる一種以上の哺乳動物酵素の発現を可能にするトランスフォームされた酵母の利用が、例えば、ＥＰ３４０８７８、米国特許第５，１３７，８２２号又はDumas等に記載されてきた。同様に、出願人は、Δ５−３β−ヒドロキシステロイド例えばプレグネノロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロン及びＤＨＥＡが酵母によって対応する酢酸エステルに変換されるということを見出した。出願人は又、この変換が、本質的に、ＡＴＦ２遺伝子の産物によって行われるということをも示した(Cauet等、1999)。それ故、酵母は、ステロイド誘導体製造のための工業的視点から、特に有用な生物を代表する。
【０００３】
しかしながら、１７α−ヒドロキシプロゲステロンは、ある条件下で、酵母により還元されて４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オン(Dumas等、1994)となること及びこの副生物の生成が最終生成物の合成収率及び品質に影響を及ぼすということも知られている。しかしながら、今まで、２０α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(２０αＨＳＤ)型のこの反応の原因である酵素活性は、同定されなかった。
【０００４】
本発明は、正確には、ヒドロキシプロゲステロンに作用する酵母の内因性活性の研究から生じるものであり、２０αＨＳＤ型活性を付与された酵素をコードする２つの遺伝子の同定を記載する。一層詳細には、本願は、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子が酵母における２０αＨＳＤ型活性のキャリアーであること、及びこれらの遺伝子産物が、例えば、ヒドロキシプロゲステロンのイン・ビトロでの副生物への変換を可能にすることを示す。その上、本願は、酵母におけるこれらの遺伝子活性の抑制が、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オン型の副生物の生成をかなり減じ又は抑制し且つステロイド誘導体の合成の収率を有意に改善し及び／又はヒドロキシプロゲステロン(又は、その前駆物質)をステロイド誘導体へ一層選択的様式で変換することを可能にするということを示す。それ故、本願は、一層優れた選択性を有するステロイド誘導体の合成に利用できる新規な組成物及び方法を記載する。この発明は、特に、減少した２０αＨＳＤ型活性を有し且つ本質的にヒドロキシプロゲステロンを４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オン型副生物に変換できない新規な酵母株を記載する。この発明は又、かかる生成物の生産を増大させるために利用することもできる(それらの利用又は活性化合物への変換のために)。
【０００５】
この発明の第一の主題は、特に、ステロイド化合物を改変する方法であって、この化合物(又は、その前駆物質)を減少した２０αＨＳＤ活性を有する酵母と、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母と、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母と又はかかる酵母に由来する調製物と接触させることを含む当該方法にある。
【０００６】
この発明は又、減少した２０αＨＳＤ活性を有する酵母の、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母の、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母の又はかかる酵母に由来する調製物の、イン・ビトロ又はエキソ・ビボでの、ステロイド化合物の製造、合成、改変及び／又は改良のための利用にも関係する。
【０００７】
この発明は又、ヒドロキシステロイド化合物から、特にヒドロキシプロゲステロン又はその前駆物質から、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する酵母、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母又はかかる酵母に由来する調製物を利用して、ステロイド誘導体を製造する如何なる方法にも関係する。
【０００８】
この発明は又、１７α−ヒドロキシプロゲステロンを特に１１−デオキシコルチゾールに、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する酵母、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母又はかかる酵母に由来する調製物を利用して変換する方法にも関係する。
【０００９】
この発明の主題は又、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する酵母の、特に非機能的な(特に、破壊された)ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母の、一層好ましくはサッカロミセス属の酵母の又はかかる酵母に由来する調製物の、１７α−ヒドロキシプロゲステロンの１１−デオキシコルチゾールへの変換のための利用でもある。
【００１０】
この発明の他の主題は、更に、酵母の２０αＨＳＤ型活性の改変方法であって、該酵母のＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子の活性の改変を含む当該改変方法にある。それは、一層詳細には、該酵母のＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子の(好ましくは、遺伝子破壊による)不活性化(一層好ましくは、サッカロミセス属の酵母)を含む、酵母の２０αＨＳＤ活性を減じ又は阻害する方法を含む。
【００１１】
本発明の主題は、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する特定の酵母株でもある。一層好ましくは、これは、非機能的ＹＰＲ１遺伝子を有する酵母、非機能的ＧＣＹ１遺伝子及びＹＰＲ１遺伝子を有する酵母、又は非機能的ＧＣＹ１遺伝子を有するある種の酵母を包含する。
【００１２】
この発明は又、上記の酵母に由来する如何なる無細胞調製物にも関係し、特に、細胞溶解物、細胞ホモジェネート、培養上清、又は誘導された富化若しくは(予備)精製溶液などに関係する。
【００１３】
上記のように、本発明は、先ず、低下した又は検出不能な２０αＨＳＤ型活性を有する酵母株(即ち細胞又は培養物)、及び誘導された調製物を記載する。この発明は、実際、この活性を有する酵母遺伝子の同定、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子を記載し、且つこれらの遺伝子が、特に遺伝子組換え技術によって、これらの細胞の成長又は生存能力を害することなく又はトランスフォームし若しくはステロイド化合物を変換するそれらの能力を害することなく、特異的に改変されうることを示す。従って、この発明は、先ず、ステロイド化合物の、有利な酵母を利用する合成、生成、改変及び／又は変換のための方法を提供する。
【００１４】
それ故、この発明の主題は、一層詳細には、酵母株(即ち細胞又は培養物)の利用であって、ステロイド化合物の製造のための遺伝子改変を有すること及び減少した２０αＨＳＤ活性を有することを特徴とする当該利用にある。本発明は、一層詳細には、下記を有することを特徴とする酵母株を利用する：
− ＧＣＹ１遺伝子の遺伝子改変、又は
− ＹＰＲ１遺伝子の遺伝子改変、又は
− ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の遺伝子改変。
【００１５】
一層好ましくは、この発明の酵母中に存在する遺伝子改変は、不活性化する改変、即ち、その遺伝子又は対応するタンパク質の活性の喪失へと導く改変である。この発明による不活性化する遺伝子改変の最も好適な型は、遺伝子破壊であり、この明細書の残りの部分において詳述する。
【００１６】
従って、一層詳細には、この発明は、下記を特徴とする酵母の利用にある：
ステロイド化合物の製造につき、
− ＧＣＹ１遺伝子が、非機能的であり、
− ＹＰＲ１遺伝子が、非機能的であり、又は
− ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子が、非機能的である。
【００１７】
かかる酵母は、減少した又は検出不能な２０αＨＳＤ活性を有し、それ故、ステロイド化合物の製造又は改変又は変換に特に有利である。
【００１８】
この発明の好適具体例によれば、これらの酵母は、一層好ましくは、サッカロミセス属(特に、S.cerevisiae)に属する。従って、一層特別の具体例において、本発明は、非機能的な(好ましくは、破壊された)ＧＣＹ１遺伝子及び／又はＹＰＲ１遺伝子を含むＳ．セレビシエ酵母の細胞(即ち、株又は培養物)の方法又は利用にある。
【００１９】
しかしながら、実施例が、一層詳細にサッカロミセス・セレビシエ酵母に関係していても、この発明の教示は、この特定の種類の酵母に限定されず、本質的に自然の２０αＨＳＤ型活性を有するか又はＧＣＹ１若しくはＹＰＲ１遺伝子を含む任意の酵母に拡張しうるということは、理解される。この関係において、特に、酵母サッカロミセス、Kluyveromyces(特に、Ｋ．ラクチス)、シゾサッカロミセス、ハンセヌラ・ピチア(特に、Ｐ．パストリス)、カンジダ(特に、Ｃ．マルトーサ)などを挙げることができ、そのファーメンター中での培養及び遺伝子改変は、従来技術に記載されている。
【００２０】
その上、この発明の目的につき、発現ＧＣＹ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにレファレンスＸ９６７４０で記載されたＳ．セレビシエＧＣＹ１遺伝子(Bandlow等、Gene 90(1), 1990, 105-114)並びに酵母細胞内に存在するその任意の機能的変異体又は同族体を意味すると理解される。同様に、ＹＰＲ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにレファレンスＸ８０６４２で記載されたＳ．セレビシエＹＰＲ１(又は、ＹＤＲ３６８ｗ)遺伝子並びに酵母細胞内に存在するその任意の機能的な変異体又は同族体を意味する。これらの遺伝子の配列は又、酵母Ｓ．セレビシエのゲノムの完全な配列が記載されている他のバンク(スタンフォード大学、ＭＩＰＳ等)から得ることもできる。機能的同族体を、配列相同性の検索により、又はＳ．セレビシエＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子から得られたプローブを利用するハイブリダイゼーションクローニングにより、慣用の分子生物学的技術によって同定することができる。
【００２１】
示したように、本発明は、２０αＨＳＤ活性に関与する少なくとも一つの遺伝子(特に、ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子)の遺伝子改変を示し、好ましくは減少した又は抑制された２０αＨＳＤ活性を有する酵母の方法又は利用にある。
【００２２】
この発明の目的につき、用語「遺伝子改変」は、任意の可能な方法例えば突然変異誘発剤の利用及び／又は遺伝的若しくは組換え経路による改変の生成により得られる細胞のゲノムの任意の変化を意味する。好ましくは、遺伝子改変は、少なくとも一つの遺伝子の配列の改変であって、その遺伝子の活性の変化、特に該遺伝子の刺激又は好ましくは不活性化を生じる改変である。遺伝子の不活性化、又は遺伝子の非機能的特性は、タンパク質の発現の非存在により、突然変異、欠失、置換、挿入などによるタンパク質の非機能的形態の発現により、又は十分な活性を与えない低レベルのタンパク質の発現によって明らかとなりうる。その結果、遺伝子の遺伝子改変は、特に、該遺伝子のコード領域又は該遺伝子の調節領域(プロモーターなど)の全部又は部分に影響を与えうる。
【００２３】
好ましくは、この発明による遺伝子改変は、注目している遺伝子の調節領域又はコード領域内の少なくとも一つの塩基対の少なくとも一つの突然変異、置換、欠失及び／又は挿入を含む。尚一層好ましくは、それは、注目している遺伝子の全部又は部分の欠失による改変を含み。これは、遺伝子破壊(又は「遺伝子置換」)技術によって、外来配列により置換されうる。欠失及び／又は挿入による遺伝子改変は、本発明の実施に好適である(何故なら、それらは、注目している遺伝子に対して選択的であり且つ時間経過中安定であるから)。それ故、一層好ましくは、この遺伝子改変は、注目している遺伝子の少なくとも部分の外来配列による置換にある。この改変は、実施例に記載したように、酵母のゲノム中に二重相同組換えによって導入することのできる改変された遺伝子をイン・ビトロで調製することにある公知の技術によって達成することができる(Baudin等、Nucleic Acids Res. 21(14)(1993)3329も参照されたい)。
【００２４】
従って、この発明の好適な主題は、ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子の全部又は部分が外来配列により、例えばマーカー遺伝子(抗生物質耐性をコードするもの)により置換された酵母の方法又は利用にある。一層詳細には、遺伝子破壊のためには、選択した外来配列を注目している遺伝子の隣接する又は隣接しない領域と相同な配列と両端で接して含む組換え核酸をイン・ビトロで調製する。この外来配列は、例えば、マーカー遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子、発現ユニットなどであってよい。一層詳細には、この外来配列は、宿主酵母株における栄養要求を相補する栄養要求性選択遺伝子、例えばＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子又はＡＤＥ２遺伝子；優性選択遺伝子例えば抗生物質(Ｇ４１８、フレオマイシン、ヒグロマイシンＢなど)の耐性遺伝子；又はレポーター遺伝子(β−ガラクトシダーゼなど)であってよい。それは又、例えば、転写ターミネーター例えばＣＹＣ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１又はＰＧＫから選択する特定の酵母ターミネーターを含む発現中断ユニットであってもよい。この遺伝子の発現の条件及び／又はコードされるタンパク質の実際の構造を変えることのできる任意の他の外来配列(即ち、注目している遺伝子において、自然には、この形態では存在しない配列)を、本発明の関連において利用することができるということは理解される。そうして調製された核酸を、次いで、慣用の技術(リチウム、プロトプラストなど)によって酵母に導入し、これは、この外来配列の酵母ゲノム中への二重相同組換えによる挿入(注目している遺伝子の配列内)へと導く(適宜、その一領域の置換として)。
【００２５】
任意の他の遺伝子改変技術例えば位置指定突然変異誘発法、トランスポゾンの利用などを、本発明の関連において利用することができるということは理解される。
【００２６】
遺伝子破壊により不活性化されたＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を有する酵母の特別の例は、特に：
− ＴＧＹ１７０細胞(ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２)：ＴＧＹ１７０細胞中では、ＧＣＹ１遺伝子の一部分は、組換え体の選択を可能にするＬＥＵ２タンパク質をコードする核酸により置換されている。
− ＴＧＹ１９７細胞(ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２、ｙｄｒ３６８ｗ：：ＵＲＡ３)：ＴＧＹ１９７細胞は、ＴＧＹ１７０細胞に関して、ＹＰＲ１(ＹＤＲ３６８ｗとも呼ばれる)遺伝子に影響を与える更なる遺伝子改変を含み、一部分は、選択遺伝子ＵＲＡ３により置換されている。
− ＴＧＹ１９５細胞(ｙｄｒ３６８ｗ：：ＵＲＡ３)：ＴＧＹ１９５細胞は、ＹＰＲ１(ＹＤＲ３６８Ｗとも呼ばれる)遺伝子に影響を与える遺伝子改変を含み、一部分は、選択遺伝子ＵＲＡ３により置換されている。
− ＴＧＹ１９４細胞(ｇｃｙ１：：ＵＲＡ３)：ＴＧＹ１９４細胞中では、ＧＣＹ１遺伝子の一部分は、組換え体の選択を可能にするＵＲＡ３タンパク質をコードする核酸により置換されている。
【００２７】
かかる細胞も又、この発明の特別の主題を構成する。特に、この発明は、ＹＰＲ１遺伝子の(又は該遺伝子中に)遺伝子改変(特に、ＹＰＲ１遺伝子の又は該遺伝子中の欠失及び／又は挿入)を含む任意の酵母細胞(即ち、株又は培養物)に関係する。この発明は又、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の(又は、該遺伝子中に)遺伝子改変(特に、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の又は該遺伝子中の欠失及び／又は挿入)を含む任意の酵母細胞(即ち、株又は培養物)にも関係する。この発明は又、かかる酵母から誘導された無細胞調製物にも関係する。
【００２８】
この発明の又はこの発明の方法で用いられるこれらの細胞は、有利に、減少した２０αＨＳＤ型活性を、即ち、遺伝子改変してない株と比較して、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、一層好ましくは少なくとも６０％減少した２０αＨＳＤ型活性を有する。実施例に示したように、この発明は、酵母のＧＣＹ１遺伝子の不活性化が、細胞ホモジェネートの上清中の２０αＨＳＤ型活性の９５％減少へと導くことを示す。得られた結果は又、ＧＣＹ１とＹＰＲ１遺伝子の二重の遺伝子改変が、２０αＨＳＤ型活性の抑制へと導き、その後、それは、細胞ホモジェネートの上清中で検出不能となることをも示している。これらの結果は、これらの遺伝子の役割の実例を与え、ステロイド誘導体の製造の応用のための酵母の特性を改良するためにそれらを改変することの可能性を例証する。
【００２９】
本発明は、様々な医薬用途のためのステロイド化合物の製造のために利用することができる。この点において、この発明は、この発明の酵母を利用してステロイド化合物を製造する方法を記載する。この出願は又、ステロイド化合物を製造するための、減少した２０αＨＳＤ活性を有する酵母を利用する改良された方法にもある。この発明の方法は、有利に、上記の酵母の集団をイン・ビトロでステロイド化合物と接触させてから、合成された化合物を抽出することにより実施される。初期ステロイド化合物は、任意の天然の又は改変された若しくは合成されたステロイドであってよく、特に、任意のヒドロキシステロイド又は前駆体化合物であってよく、特に、コレステロール、プロゲステロン、プレグネノロン又は１７ＯＨ−プロゲステロンであってよい。この発明の方法は、ステロイド誘導体例えば１１−デオキシコルチゾール、コルチゾール、ヒドロコルチゾンなど又はこれらの誘導体の製造のために利用することができる。
【００３０】
本発明の他の面及び利点は、下記の実施例を読むことで明らかとなろう(該実施例は、説明であって制限するものと考えるべきではない)。
【００３１】
図面の説明
図１：Ｒｅｄ１２０−アガロース上でのクロマトグラフィーによる酵母ホモジェネートに由来する２０αＨＳＤ活性の精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。上の矢印は、Ｎ末端配列がＧＣＹ１に対応するバンドを示し、下の矢印は、ＹＰＲ１のＮ末端配列に対応するバンドを示している。レーン１は、分子量マーカーに対応し、レーン２は、２０αＨＳＤ活性の精製画分に対応する。
図２：ガラクトース(ＹＮＢ−ｇａｌ)又はグルコース(ＹＰＤ)培地中で培養された酵母Ｓ．セレビシエによる、０．１ｍｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下での４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成。
図３：ガラクトース(ＹＮＢ−ｇａｌ)又はグルコース(ＹＰＤ)培地中で、０．１ｍｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下で培養した野生型(ｗｔ)又はＧＣＹ１遺伝子の配列が変異した(ｇｃｙ−)酵母Ｓ．セレビシエによる、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成。
図４：ＧＣＹ１遺伝子を破壊するためのプラスミドの構造。このプラスミドを酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで線状化してから、材料と方法の節に記載した方法によって、Ｓ．セレビシエにトランスフォームする。このＧＣＹ１遺伝子の配列の欠失は、プロモーター及び３０６ｂｐのコード配列(翻訳開始コドンを含む)を含む。
図５：ＧＣＹ１遺伝子を破壊するためのプラスミド(プラスミドｐＴＧ１２０１０)の構造。このプラスミドを、酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで線状化してから、材料と方法の節に記載した方法によって、Ｓ．セレビシエにトランスフォームする。ＧＣＹ１のタンパク質配列の欠失は、アミノ酸４７〜２６８を含む。ｐＴＧ１２０１０クローン３６は、同じ構造(ＵＲＡ３遺伝子の５’側にＣｌａＩ部位を有しないが、ＵＲＡ３遺伝子の３’側にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する)を有する。
図６：ＹＰＲ１遺伝子(ＹＤＲ３６８ｗ)を破壊するためのプラスミド(プラスミドｐＴＧ１２０１１)の構造。このプラスミドを、酵素ＸｈｏＩで線状化してから、材料と方法の節に記載した方法によって、Ｓ．セレビシエにトランスフォームする。ＹＰＲ１のタンパク質配列の欠失は、アミノ酸５〜１９８を含む。
【００３２】
材料と方法
化学製品：１７α−ヒドロキシプロゲステロンを、Hoechst Marion Roussel (フランス国、Romainville)から得た。タージトール ノニデットP４０及びチロキサポールをSigma社から得た。
【００３３】
酵素試験：
１７α−ヒドロキシプロゲステロンのイン・ビボでの変換：これらの酵母細胞を、２４時間予備培養物からＡ６００＝０．１で接種したＹＰＤ培地(１０ｍｌ)中で、２８℃で培養した。次いで、１００μｌのタージトールとエタノールの混合物(１／１；ｖ：ｖ)中の１７α−ヒドロキシプロゲステロン溶液(１０ｍｇ／ｍｌ)を、この培養に加えた。培養ブロスのアリコート(２５０μｌ)を様々な間隔で集め、これらのステロイドを、ジクロロメタンを用いて抽出した。次いで、これらのステロイドを、Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ上で、４５％ 水性アセトニトリルの存在下で、１ｍｌ／分の流量で、４５℃で分離した。これらのステロイドを、２４０ｎｍで検出した。
【００３４】
細胞：
大腸菌ＢＪ５１８３株(Hanahan, 1983)を、イン・ビボでの組換えに利用し、Ｃ６００、ｈｓｄＲ株を慣用の連結反応に利用した。
【００３５】
酵母ＦＹ１６７９−２８ｃの親株(ＭＡＴａ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ−６３、ｌｅｕ２−１ｆｅｎ１ ｈｉｓ３−２００ＧＡＬ)(Thierry等、1995)を用いた。株ＴＧＹ１７０、ＴＧＹ１９７、ＴＧＹ１９５、ＴＧＹ１９４、ＴＧＹ２１２、ＴＧＹ２４５及びＦＹ１６７９−２８ｃ／ｐＴＧ１０４９７を、実施例に記載のようにして構築した。
【００３６】
分子生物学の並びに大腸菌及び酵母におけるイン・ビボでの組換えの慣用の方法を、Sambrook等(1989)又はDegryse等(1995, 1996)に記載されたように利用した。
【００３７】
酵母の培養：
これらの酵母を、全体的に、栄養供給物(１００μｇ／ｍｌ)を補った合成最少培地(Sherman, 1991)上で培養した。Ｓ．セレビシエのトランスフォーメーションのために、それらの細胞を、ＹＰＤ培地(Sherman, 1991)上で生育させた後で、酢酸リチウム技術(Ito等、1983)によってコンピテントにした。
【００３８】
結果
１７α−ヒドロキシプロゲステロンの望ましくない反応の原因である酵母における２０αＨＳＤ活性の同定
酵母Ｓ．セレビシエによる１７α−ヒドロキシプロゲステロンのＣ２０におけるＮＡＤＰＨ依存性の４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンへの還元は、以前に記載されている(Dumas等、1994)。この活性は、様々な組織で報告された２０αＨＳＤ活性に類似している。これらの組織から特性決定された酵素は、約３５ｋＤａの分子量を有するモノマーである。酵母における２０αＨＳＤ活性の原因である酵素を同定する目的で、ウシ精巣由来の酵素２０αＨＳＤを用いるホモロジー検索をＳ．セレビシエバンクにおいて行なった。これらの検索は、哺乳動物の酵素と４４〜３２％のアミノ酸配列同一性を示す６つの酵母遺伝子産物を同定することを可能にした。これらの遺伝子を、表Ｉに集めてある。
【００３９】
関係する酵素をより一層特性決定する目的で、酵母２０αＨＳＤ型活性を、イン・ビトロで、１７α−ヒドロキシプロゲステロン及びＮＡＤＰＨを基質として用いて再構成した。Ｓ．セレビシエ酵母培養物に由来する様々な調製物をこの系で試験したところ、細胞ホモジェネートの１００，０００×ｇでの遠心分離後に、活性の上清中への局在性を与えた。この結果は、酵素活性が可溶性であることを示している。次いで、２０αＨＳＤ型活性のＲｅｄ１２０クロマトグラフィーによる部分精製を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、３５ｋＤａ領域に二重線の生成を与えた(図１)。これらのバンドの配列決定は、それらが主としてＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子産物よりなることを示した。これらの２種の酵素は、２０αＨＳＤのウシ同族体の部分を形成する(表Ｉに列記)。ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の完全な配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋにおいて、それぞれ、レファレンスＸ９６７４０及びＸ８０６４２でアクセスすることができる。
【００４０】
ＧＣＹ１は、アルド−ケト−レダクターゼ(ＡＫＲ)として記載されており、その発現は、ガラクトースの存在下で有意に増大することに注意することは有益である(Magdolen等、Gene 90(1), 1990, 105)。ＡＫＲ酵素は、広い基質特異性を有している。それらは、脂肪族アルデヒド、単糖類、プロスタグランジン及びステロイドを含む様々な基質を代謝する。従って、ＧＣＹ１は、優れた潜在的候補を構成し、我々は、この酵素が、１７α−ヒドロキシプロゲステロンからの４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成に関与しうるかどうかを確かめることを決めた。
【００４１】
２０αＨＳＤ活性の誘導性の特徴及び無細胞系での発現
実施した実験は、酵母において２０αＨＳＤ活性がガラクトースによって誘導されうることを示すことを可能にした。従って、１７α−ヒドロキシプロゲステロンの４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンへのイン・ビボでの変換を、様々な炭素源で培養した酵母培養物中で測定した。酵母をグルコースで培養した場合に認められた遅延は、ガラクトースの存在下では認められない(図２)。この観察は、２０αＨＳＤをコードする遺伝子のグルコースによる抑制と一致している。この観察は、グルコースが涸渇してから１６時間後に開始する。１７α−ヒドロキシプロゲステロンの４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンへの変換は、酵母をガラクトースの存在下で培養してから４８時間後に約４倍高い。これらの結果は、更に、ガラクトース又はグルコース培地中で培養した酵母から得た無細胞抽出物において２０αＨＳＤ活性を測定することにより、イン・ビトロで確認された。２０αＨＳＤ特異的活性は、グルコース又はガラクトース培地中で培養した細胞のホモジェネート中で、それぞれ０．０５及び０．７５μＭ／分／ｍｇであった。
【００４２】
それ故、これらの結果は、(ｉ)２０αＨＳＤ活性が、酵母ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子の産物によって実行されること、(ii)これらの酵素が、可溶性であること、及び(iii)それらの活性が、ガラクトースの存在下で増大され、グルコースの存在下で抑制されることを示している。
【００４３】
非機能的ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１遺伝子を含む酵母の構築及び特性
Ｇｃｙ１ｐが２０αＨＳＤ活性の原因であるということを確認する目的で、ＯＲＦ ＹＯＲ１２０ｗに対応する遺伝子を酵母のゲノムから欠失(ノックアウト)させた。得られた結果は、得られた株が、野生型株と比較して多いに減じた２０αＨＳＤ活性を有するということを示している。その上、ＹＰＲ１遺伝子だけが欠失した株又はＧＣＹ１と共に欠失した株も又、下記のように、構築してそれらの活性につき試験した。
【００４４】
・ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１欠損酵母の構築
ＧＣＹ１及び／又はＹＰＲ１活性の欠損した酵母を、遺伝子破壊によって調製した。一層詳細には、
ＴＧＹ１７０株(ＦＹ１６７９−２８ｃ、ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２)を、ＧＣＹ１遺伝子をプラスミドＰｇｃｙ１：：ＬＥＵ２によって破壊することにより構築した。
【００４５】
ＴＧＹ１９７株(ＦＹ１６７９−２８ｃ、ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２ ｙｄｒ３６８ｗ：：ＵＲＡ３)を、ＹＤＲ３６８ｗ遺伝子(ＹＰＲ１)の更なる破壊によって生成した{プラスミドｐＴＧ１２０１１による、ＡＴＦ２について記載された方法(Cauet等、1999)に従って}。
【００４６】
ＴＧＹ１９５株を、遺伝子ＹＤＲ３６８ｗ(ＹＰＲ１)の破壊によって生成した{プラスミドｐＴＧ１２０１１による、ＡＴＦ２について記載された方法(Cauet等、1999)に従って}。
【００４７】
ＴＧＹ１９４株(ＦＹ１６７９−２８ｃ、ｇｃｙ１：：ＵＲＡ３)を、ＧＣＹ１遺伝子をプラスミドｐＴＧ１２０１０により破壊することにより構築した。
【００４８】
ＦＹ１６７９−２８ｃ／ｐＴＧ１０４９７及びＴＧＹ２４５株を、プラスミドｐＴＧ１０４９７及びｐＴＧ１２０４５によって構築した。
【００４９】
次のプラスミドを用いて、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子を破壊した：ｐｇｃｙ１：：ＬＥＵ２、ｐＴＧ１２０１０、ｐＴＧ１２０１１(図４〜６)、ｐＴＧ１２０８６及びｐＴＧ１２０４５．単一コピーのプラスミドｐＴＧ１０４９７が、Ｐ４５０ｃ２１の発現に利用される。
【００５０】
Magdolen等、Gene 90(1990) 105-114に記載されたプラスミドｐｇｃｙ１：：ＬＥＵ２は、ＧＣＹ１遺伝子を含み、そのコード配列及びプロモーターは、ＬＥＵ２遺伝子をコードする配列により中断されている。一層正確には、ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｃＩＩ制限断片に対応するプロモーター及びコード部分を、ＬＥＵ２遺伝子の２．１７ＫベースのＨｐａＩ断片によって置き換えた。そうして、ＧＣＹ１遺伝子を、そのプロモーター及びコード配列の３０６塩基対について削除した。プラスミドｐｇｃｙ１：：ＬＥＵ２を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩにより線状化して、この破壊された遺伝子を含む３．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ ＢａｍＨＩ断片を、Ｆｙ１６７９−２８ｃ株をトランスフォームするために Gietz RD等(Yeast 1995 Apr 15;11(4):355-60 Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure)により記載されたプロトコールを利用して調製した。コロニーを、ロイシンを含まない培地で選択した。このスクリーニングにおける陽性コロニーを、次いで、Dumas等(Eur J Biochem 1996 Jun 1;238(2):495-504 11 beta-hydroxylase activity in recombinant yeast mitochondria. In vivo conversion of 11-deoxycortisol to hydrocortisone)に記載されたようにして、１７ＯＨプロゲステロンの生物変換の実施のために、高栄養培地で培養した。基質１７ＯＨプロゲステロンの濃度は、１００ｍｇ／ｌであり、炭素源はガラクトースであり、そして初期光学密度は、０．１である。培養物の容積は、１０ｍｌであり、インキュベーションは、３０℃で、４８時間である。４８時間のインキュベーション後に、陽性クローンを、１ｍｌの培地(細胞を含む)を２ｍｌのジクロロメタンで抽出してから有機相を逆相高性能液体クロマトグラフィーにより上記(Dumas等、1996)のように分析することによって評価する。クロマトグラムを、１７，２０−ジヒドロプロゲステロンの存在につき精製製品と比較して分析する。このインキュベーション中に、４ｍｇ／ｌのオーダーの量の１７，２０−ジヒドロプロゲステロン(基質の４％)が培地中に、野生型株(破壊用断片によりトランスフォームされてない)については出現するが、幾つかのトランスフォーマントにおいては、１７，２０−ジヒドロプロゲステロンの存在は、今や、１ｍｇ／ｌだけである。低レベルの１７ＯＨプロゲステロンを１７，２０ＯＨプロゲステロンに変換し且つ野生型株と同じ成長を示すＴＧＹ１７０株を選択する。
【００５１】
２つの新しいプラスミドｐＴＧ１２０１０及びｐＴＧ１２０１１を構築して、選択マーカーＵＲＡ３と結合されたＧＣＹ１及びＹＰＲ１遺伝子を破壊した。
【００５２】
プラスミドｐＴＧ１２０１０を、プラスミドｐＵＣ１９ベース(Gene 1985;33(1):103-19 Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J)上に構築し、プラスミドｐＴＧ１２０１１を、プラスミドｐＰＯＬＹＩＩＩベース(Lathe, R., Vilotte, J.-L.及びClark, J.A. Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts JOURNAL Gene 57, 193-201(1987))上に構築した。
【００５３】
プラスミドｐＴＧ１２０１０及びｐＴＧ１２０１１の構築
ｐＴＧ１２０１０に達するためにプラスミドｐＵＣ１９中のＵＲＡ３遺伝子によるＧＣＹ１遺伝子の破壊の構築を、４回の連続するＰＣＲ増幅により得た。一方では、ＧＣＹ１遺伝子の５’側部分(ＰＣＲ１)、ＧＣＹ１配列と両端で接する機能的ＵＲＡ３遺伝子(ＰＣＲ２)、ＧＣＹ１遺伝子の３’側部分(ＰＣＲ３)を得るために３つの独立したＰＣＲを行ない；ＧＣＹ１遺伝子の５’及び３’側部分を得るために、ＯＴＧ１１２８５、ＯＴＧ１１２８６及びＯＴＧ１１２８７、ＯＴＧ１１２８９対の助成により、Ｆｙ１６７９−２８ｃ株のゲノムＤＮＡテンプレート上で、ＰＣＲを行なった。これらのオリゴヌクレオチド配列は、次の通りである：
ＯＴＧ１１２８５：GATTCGGTAATCTCCGAACAggtaccAATTATATCAGTTATTACCCGGGA
(SEQ ID NO:１)；
ＯＴＧ１１２８６：AGCCATCTTTCAAAGCGGTT (SEQ ID NO:２)；
ＯＴＧ１１２８７：CCGATCGAATCAAAACGAACAG (SEQ ID NO:３)；
ＯＴＧ１１２８９：TCTAATCAGCTAGTAAGAAC (SEQ ID NO:４)。
【００５４】
ＧＣＹ１配列と隣接したＵＲＡ３遺伝子を、(ＧＣＹ１遺伝子のコード配列の一部分の欠失を得るために)次のオリゴヌクレオチドの助成により増幅する
ＯＴＧ１１３０５(aaccgctttgaaagatggctATCGATTTTCAATTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTTTTTTTTG)、(SEQ ID NO:５)及びＯＴＧ１１３０６(ctgttcgttttgattcgatcgggAAGCTTGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC)(SEQ ID NO:６)(線状化プラスミドｐＴＧ１００５４テンプレートに由来する)(Degryse等、In vivo cloning by homologous recombination in yeast using a two-plasmid-based system. Yeast. 1995 Jun 15; 11(7): 629-40)。この増幅のための緩衝液、テンプレート及びプライマーの濃度に関する条件は、酵素ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの作成者又は製造業者により記載されており、特に、Life Technologies社により開発された酵素エロンガーゼについて記載されている。温度サイクルは、次の通りである:プライマー及びテンプレートを変性させるための６’３０”の第一サイクルとその後の、９３℃で３０秒、５４℃で２分間及び６８℃で３分間の３０サイクル、及び７２℃で５分間の最終サイクル。産物ＰＣＲ１、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３を等モル量で混合し、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１２８５及びＯＴＧ１１２８９の助成により再び増幅した(上記参照)。１．９Ｋベースのサイズを有する最終産物ＰＣＲ４を、次いで、プラスミドｐＴＧ１２０１０を得るために、プラスミドｐＵＣ１９のＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限部位間にサブクローン化した。このプラスミドの構造を、末端の制限プロファイリング及びヌクレオチド配列決定によってチェックした。ｐＴＧ１２０１０のクローニングは、実際は、このプラスミドの２つのバージョンｐＴＧ１２０１０＃４０(ｐＴＧ１２０１０クローン４０)及びｐＴＧ１２０１０＃３６(ｐＴＧ１２０１０クローン３６)を得ることを可能にした。初期の希望は、５’及び３’側にＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＵＲＡ３遺伝子により中断されたＧＣＹ１遺伝子を得ることであった。実際には、２つの異なるプラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６及びｐＴＧ１２０１０＃４０が得られた。これらの２つのプラスミドは、ＵＲＡ３遺伝子の両端のＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の存否だけが異なっている。プラスミドｐＴＧ１２０１０＃４０は、ＵＲＡ３遺伝子の３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するが、５’側にＣｌａ５’を有しない。プラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６は、該遺伝子の３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有しないが、５’末端にＣｌａＩ部位を有する。
【００５５】
この特性を利用して、ＧＣＹ１のコード配列を中断するＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ部位に両端で接したＵＲＡ３遺伝子を有するプラスミドを得る。
【００５６】
プラスミドｐＴＧ１２０３６の構築
プラスミドｐＴＧ１２０３６を、ｐＴＧ１０８０２から４段階で構築した。プラスミドｐＴＧ１０８０１(プラスミドｐＴＧ１０８０２の原因である)は、ｐＵＣ型のプラスミドであり、連続する制限部位がＸｈｏＩ及びＸｈｏＩ部位間に挿入されている。この連続する制限部位は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｎａｂＩ、ＣｌａＩ及びＳｐｅＩ部位を含む。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ間に、プロモーターＴＥＦ１、ヒトｃＤＮＡ ｐ４５０ｃ２１及びＰＧＫターミネーターを含むｐＴＧ１０４７０のＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩカセット(下記)を、ｐＴＧ１０８０１のＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ部位間に挿入してｐＴＧ１０８０２を与えた。次いで、このプラスミドをＸｈｏＩで消化し、それ故、導入したカセットを、ＸｈｏＩ部位に両端で接しているＰＣＲ断片を導入するために削除する。２．５ｋｂのこの断片は、５’側でＣｌａＩ制限部位に接しているＵＲＡ３遺伝子により中断されたＧＣＹ１遺伝子を含むＸｈｏＩに両端で接している断片を得るための、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１８４４(tttgctcgaggttacagaagggc, SEQ ID NO:１３)及びＯＴＧ１１８４５(gattctcgagcaattggctgacta, SEQ ID NO:１４)の対による、プラスミドｐＴＧ１２０１０(＃４０)上での増幅から得られる。この断片を、プラスミドｐＴＧ１２０３５を得るために、プラスミドｐＴＧ１０８０２のＸｈｏＩ部位の間で、クローン化した。欠けたＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するために、プラスミドｐＴＧ１２０１０(＃３６)を利用した。このプラスミドは、本質的に、ｐＴＧ１２０１０(＃４０)と同一であるが、ＨｉｎｄＩＩＩ部位をＵＲＡ３遺伝子の３’側(ＧＣＹ１遺伝子との境界)に有しており且つＣｌａＩ部位をＵＲＡ３遺伝子の５’側(ＧＣＹ１遺伝子との接合点)に有していない。組換えを、ｐＴＧ１２０１０(＃３６)の２．２ｋｂのＮｃｏＩ ＢａｍＨＩ断片(ＵＲＡ３遺伝子の５’〜３’断片を有し且つＧＣＹ１遺伝子の断片の３’側を有する)とプラスミドｐＴＧ１２０３５の一部分(即ち、４．４５ｋｂの大きいＳｔｕＩ、ＡｆｌＩＩ断片)との間で、イン・ビボで、大腸菌内で行なう。得られたプラスミドｐＴＧ１２０３６は、ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれ５’及び３’側の境界とするＵＲＡ３遺伝子により中断されたＧＣＹ１遺伝子を有する。
【００５７】
プラスミドｐＴＧ１２０８６の構築
この断片を、次いで、プラスミドｐＴＧ１２０３６を得るために、プラスミドｐＴＧ１０４６９のＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ２．３３Ｋｂ断片により運ばれるＰ４５０ｃ２１の発現カセット(下記参照)により置き換える。
【００５８】
チトクロームＰ４５０ｃ２１用の発現プラスミドの構築．
このタンパク質の酵母における過剰発現のために、２種類のプロモーター、ＴＥＦ１(「transcription elongation factor 1」)及びＴＤＨ３(「glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3」)を利用した。すべての場合において、転写ターミネーターは、ＰＧＫターミネーターである。
【００５９】
これらのプラスミドにおいて、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ断片は、ヒトＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡを有する。
【００６０】
プラスミドｐＴＧ１０４７０及びｐＴＧ１０４６９の構築．
プラスミドｐＴＧ１０２９８を、ｐＭＡｃ２１を改変すること(Expression and functional study of wild-type and mutant human cytochrome P450c21 in Saccharomyces cerevisiae. Wu DA, Hu MC, Chung BC DNA Cell Biol 1991 Apr; 10(3): 201-9)、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ消化及びオリゴヌクレオチドＯＴＧ５８６８の導入により得た。このプラスミドのｃＤＮＡは、American Type Culture Collectionから、ｐｃ２１/３ｃの名称で得られる。それは、１．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片であり、様々なプラスミドの構築のためのベースとして役立つ。為された改変は、上記の論文及び論文(Expression of human 21-hydroxylase (P450c21) in bacterial and mammalian cells: A system to characterize normal and mutant enzyme Meng-Chun Hu and Bon-chu Chung DNA and Cell Biology 1991 Apr; 10(3) 201-209)に記載されている。
【００６１】
この手順において、Ｐ４５０ｃ２１用の発現カセットを含むプラスミドｐＭＡｃ２１中のＰ４５０ｃ２１の非コード領域を除去し、並びに、その中に存在するＫｐｎＩ部位を除去した。プラスミドｐＴＧ１０２９２を、ヒトｃＤＮＡ(ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ断片)の、プラスミドｐＴＧ１０２９８からプラスミドｐＴＧ１００３１への、ＳａｌＩ及びＭｌｕＩ部位の助成によるトランスファーによって得た。プラスミドｐＴＧ１０４７５を、ＰＣＲ及び組換えによって得た。実際に、プラスミドｐＴＧ１０２９２から出発して、約２５０ヌクレオチドに相当するヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡの断片を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ７４１０(GGAATTCCGTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC, SEQ ID NO: １５)及びＯＴＧ５９２７(CCTCAATGGTCCTCTTGGAGTTCAGCACC, SEQ ID NO:１６)の助成により増幅した。この断片は、オリゴヌクレオチドＯＴＧ７４１０において記載したように、ＳａｌＩ部位と配列AAAAを境界とするヒトＰ４５０ｃ２１のコード配列に相当する。この断片をＳａｌＩで消化してから、ＳａｌＩで消化したｐＴＧ１０２９２の線状化断片に連結し、次いで、組換え実験をＢＪ５１８３株中で行なった。得られたプラスミドｐＴＧ１０４７５は、プラスミドｐＭＡｃ２１と異なる天然のｃＤＮＡと同じコード配列を有するＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡを有する(我々が実験室で使用するベクターと適合性の断片即ちＳａｌＩ及びＭｌｕＩ制限部位を境界とする断片上に)。この断片は、翻訳開始のためのATGコドンの周囲に次の環境を有する GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC(SEQ ID NO:１７)。このプラスミドから、ヒトＰ４５０ｃ２１ ｃＤＮＡを有するＳａｌＩ、ＭｌｕＩ断片を、プラスミドｐＴＧ１０１５８(Degryse等、1996)に、プラスミドｐＴＧ１０４７２を得るために、慣用のクローニングによって、トランスファーした。この同じプラスミドｐＴＧ１０４７２のＳａｌＩ ＭｌｕＩ断片を、次いで、組換えにより、プラスミドｐＴＧ１００８５(Degryse等、1996)中にトランスファーして、プラスミドｐＴＧ１０４６９を与えた。この同じＳａｌＩ及びＭｌｕＩ制限断片上のＰ４５０ｃ２１ ｃＤＮＡを有する断片をプラスミドｐＴＧ１００９２中にトランスファーして、プラスミドｐＴＧ１０４７０(Degryse等、1996)を与えた。それ故、このプラスミドは、ヒトＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡを、ＴＥＦ１プロモーター及びＰＧＫターミネーターの制御下に、ＵＲＡ３−ｄ選択マーカー及びATG開始コドン環境(上記)と共に有する。
【００６２】
プラスミドｐＴＧ１２０８６の構築．
このプラスミドは、Ｐ４５０ｃ２１の発現カセットの組込み及びそれと同時のＧＣＹ１遺伝子の破壊に役立つ。
【００６３】
このプラスミドを、プラスミドｐＴＧ１２０３６及びプラスミドｐＴＧ１０６１４から構築した。
【００６４】
後者のプラスミドを、ＴＤＨ３プロモーター、ＰＧＫターミネーター及びＵＲＡ３−ｄ選択マーカーに基づく酵母発現プラスミドであるｐＴＧ１０２１２(Degryse等、Yeast 11:629-640(1995))から構築した。
【００６５】
大腸菌における相同組換えにより、この選択マーカーを、プラスミドｐＴＧ１００５４(Degryse等、1995)の選択マーカーで置き換え；これを行なうために、組換え配列と隣接したＵＲＡ３マーカーを含む２．１ｋｂのｐＴＧ１００５４のＭｌｕＩ、ＦｓｐＩ断片を、ｐＴＧ１０２１２の大きいＨｉｎｄＩＩＩ断片と組み換えて、ｐＴＧ１０２１２(Degryse等、1995)と同じ特性を有し、ｐＴＧ１００５４と同じ向きのＵＲＡ３マーカーを有するプラスミドｐＴＧ１０６１０を与える。プラスミドｐＴＧ１０４７２のヒトチトクロームＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡを有するＳａｌＩ ＭｌｕＩ断片(上記参照)を、プラスミドｐＴＧ１０６１０中にトランスファーして、プラスミドｐＴＧ１０６１４を与える。５’〜３’のＴＤＨ３プロモーター、ＳａｌＩ及びＭｌｕＩ部位を境界とするヒトＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡ並びにその後ろのＰＧＫターミネーターを含むこのプラスミドのＣｌａＩ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、プラスミドｐＴＧ１２０３６中にトランスファーして、プラスミドｐＴＧ１２０８６(これは、従って、ヒトチトクロームＰ４５０ｃ２１のＴＤＨ３発現カセットにより中断されたＧＣＹ１遺伝子の配列を含む)を与える。
【００６６】
プラスミドｐＴＧ１２０４５の構築．
プラスミドｐＰｏｌｙＩＩＩのユニークなＳｐｈＩ部位を、相補的オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１９７５(AAATCGATAACATG, SEQ ID NO:１８)及びＯＴＧ１１９７６(TTATCGATTTCATG, SEQ ID NO:１９)の対の挿入により破壊する。ｐＰＯＬＹＩＩＩのＳｐｈＩ部位を破壊し、ＣｌａＩ部位により置き換えて、プラスミドｐＴＧ１２０４０を与える。プラスミドｐＴＧ１２０４０中のユニークなＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ部位間に、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１９８１(ATTGATATCGATAAAAAGCACGGCGTTGAG, SEQ ID NO:２０)及びＯＴＧ１１９８２(TCTCGGAATTCAGGTACTGCAGCCAG, SEQ ID NO:２１)を用いる増幅により得られるＹＰＲ１遺伝子の０．７ｋｂの３’部分に対応するＣｌａＩ ＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡ断片を導入して、プラスミドｐＴＧ１２０４１を与える。この２．８４ｋｂのプラスミドｐＴＧ１２０４１に、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４(tacgctcgagACGTTGGTGTCATTGATATTCA, SEQ ID NO:２２)及びＯＴＧ１１９８０(CAACTAAGCTTCATTCAAATAGATAGCCGC, SEQ ID NO:２３)(野生型酵母のゲノムＤＮＡに由来)により増幅したＹＰＲ１遺伝子の５’部分(０．６６ｋｂ)を、ＸｈｏＩ ＨｉｎｄＩＩＩ断片の形態にてクローン化する(プラスミドｐＴＧ１２０４１のＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に)。３．５ｋｂのプラスミドｐＴＧ１２０４２が得られる。このプラスミドは、ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位により中断されたＹＰＲ１遺伝子を有する。これらの部位の間に、チトクロームＰ４５０ｃ２１カセットを、プラスミドｐＴＧ１０４６９から得られる２．３３ｋｂのＣｌａＩ ＨｉｎｄＩＩＩ断片の形態で、クローン化する。こうして、プラスミドｐＴＧ１２０４５が得られる。
【００６７】
プラスミドｐＴＧ１０４９７の構築．
このプラスミドは、低コピー数の(ＡＲＳ ＣＥＮ型の)発現プラスミドであり、ＴＤＨ３プロモーター及びＰＧＫターミネーターの制御下で見出されるヒトチトクロームＰ４５０ｃ２１の発現カセットを含む。このプラスミドを、ＵＲＡ３選択マーカー及びＴＥＦ１プロモーター、ＰＧＫターミネーター及びＡＲＳＨ４／ＣＥＮ６型の酵母複製起点を含むプラスミドｐＴＧ１０４３４(Degryse等、1995)から構築した。
【００６８】
このプラスミドを、マーカーＵＲＡ３及びプロモーターＴＥＦ１の代りに、それぞれ、マーカーＬＥＵ２及びプロモーターＴＤＨ３を含むように改変した。これを行なうために、ＰＧＫターミネーターである組換え断片を境界とするＬＥＵ２マーカー及び複製起点の断片を含むＳｐｅＩ、ＭｌｕＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＴＧ１０４３４のＵＲＡ３領域の代りの組換えによりクローン化して、プラスミドｐＴＧ１０４６６を得る。このプラスミドｐＴＧ１０４６６において、ＴＥＦ１プロモーターは、大腸菌においてｐＴＧ１０２１２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片(Degryse等、1995)(大腸菌の複製起点並びにプロモーター及びターミネーターＴＤＨ３及びＰＧＫをそれぞれ含む)を、ｐＴＧ１０４６６のＭｌｕＩ ＦｓｐＩ断片と組み換えることにより、ＴＤＨ３プロモーターによって置き換えられ、それは、ＬＥＵ２マーカー及びＡＲＳＣＥＮ複製起点(組換え配列を境界とする)を含み;こうしてプラスミドｐＴＧ１０６１２が得られる。このプラスミドのＳａｌＩ及びＭｌｕＩ部位の間に、発現カセットＴＤＨ３：：ヒトＰ４５０ｃ２１チトクローム及びターミネーターを位置させて、プラスミドｐＴＧ１０４９７を与える。
【００６９】
欠損株の構築
ＧＣＹ１活性を欠く株を得るために、株ＦＹ１６７９２８ｃを、酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで線状化したプラスミドｐＴＧ１２０１０により、上記の酢酸リチウム法によってトランスフォームする。これらのトランスフォームしたクローンを、ウラシルを含まない培地上で選択し、次いで、コロニーにつき、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１２８５、ＯＴＧ１１２８９及びＯＴＧ１１２８５、ＯＴＧ１１３０６の対を用いる増幅によるスクリーニング(上記の条件による酵母のゲノムＤＮＡの抽出物又は調製物をテンプレートとして利用する)にかける。それぞれ予想されるサイズ１．９Ｋｂ及び１．４ＫｂのＰＣＲＤＮＡ生成物を示すコロニーを、次いで、栄養豊富な培地で培養して、Dumas等(Eur J Biochem 1996 Jun 1；238(2):495-504 11 beta-hydroxylase activity in recombinant yeast mitochondria. In vivo conversion of 11-deoxycortisol to hydrocortisone)に記載された１７ＯＨプロゲステロンの生物変換を実行する。基質濃度は、１００ｍｇ／ｌであり、炭素源は、ガラクトースであり、そして出発時の光学密度は、０．１である。培養物容積は、１０ｍｌであり、インキュベーションは、３０℃で２４時間である。２４時間のインキュベーション後に、陽性クローンを、上記のように、１ｍｌの培地(細胞を含む)を２ｍｌのジクロロメタンで抽出してから有機相を逆相高性能液体クロマトグラフィーにより分析することにより評価する(Dumas等、1996)。ＴＧＹ１９４＃１０及びＴＧＹ１９４＃１１株は、１７ＯＨプロゲステロンに対する２０ケトレダクターゼ活性を欠いており、ＰＣＲにおいて陽性シグナルを与える。
【００７０】
ｐＴＧ１２０１１へと導くＹＰＲ１(ＹＤＲ３６８ｗ)遺伝子のＵＲＡ３遺伝子による中断のプラスミドｐＰＯＬＹＩＩＩにおける構築を４回の連続するＰＣＲにより得た。一方で、３つの独立したＰＣＲを、ＹＰＲ１遺伝子の５’部分(ＰＣＲ５)、ＹＰＲ１配列を境界とする機能的ＵＲＡ３遺伝子(ＰＣＲ６)、ＹＰＲ１遺伝子の３’部分(ＰＣＲ７)を得るために行なった。このＰＣＲ５を、ゲノムＤＮＡテンプレート上での、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４(tacgctcgagACGTTGGTGTCATTGATATTCA, SEQ ID NO:７)及びＯＴＧ１１３１５(CTTCATTCAAATAGATAGCCG, SEQ ID NO:８)を用いる増幅により得たが、同様に、ＰＣＲ７が、同じテンプレート上での、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１６(TATGGCTAAAAAGCACGGCTT, SEQ ID NO:９)及びＯＴＧ１１３１７(cgatctcgagTTTCTCGTTGTTCAGGTACTG, SEQ ID NO:１０)の助成による増幅により得られる。５’及び３’ＹＰＲ１領域と隣接したＵＲＡ３遺伝子を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１４６３(CGGCTATCTATTTGAATGAAGatcgattttcaattcaattcatcattttttttttattcttttttttg, SEQ ID NO:１１)及びＯＴＧ１１４６４(AACGCCGTGCTTTTTAGCCATAAGCTTgggtaataactgatataattaaattgaactc, SEQ ID NO:１２)の助成により、線状化ｐＴＧ１００５４テンプレート上での増幅により上記のように増幅する。ＰＣＲ５、ＰＣＲ６及びＰＣＲ７生成物を、等モル量で混合してから、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４及びＯＴＧ１１３１７の助成によりＰＣＲにより増幅して、上記のように、１．ＸｋｂのＰＣＲ８の生成物を与えた。このＰＣＲ８生成物を、酵素ＸｈｏＩで消化してから、ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＰＯＬＹＩＩＩ内にサブクローン化した。このプラスミドｐＰＯＬＹＩＩＩ中のインサーションの向きを、酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩでの消化により決定した。
【００７１】
不思議にも、ＣｌａＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在しないことが、それぞれ、プラスミドｐＴＧ１２０１０及びｐＴＧ１２０１１につき注意される。これらのクローニングジャンクションは、ヌクレオチド配列決定によりチェックした。
【００７２】
ＴＧＹ１９５株の構築．
プラスミドｐＴＧ１２０１１を酵素ＸｈｏＩで消化し、その消化生成物を、その後、Ｆｙ１６７９−２８ｃ株を上記の塩化リチウム法を用いてトランスフォームするのに利用する。これらのトランスフォーマントを、ウラシルを含まない培地で選択する。これらのトランスフォーマントを、プラスミドｐＴＧ１２０１１の構築に使用したオリゴヌクレオチドを利用するＰＣＲ増幅により分析する。この試験における陽性クローンを、次いで、１７ＯＨプロゲステロンの生物変換法(上記)により炭素源としてのグルコースの存在下でスクリーニングにかける。クローンＴＧＹ１９５＃４を、新たな特性決定のために選択する。
【００７３】
ＴＧＹ１９７株の構築
減少した２０ケトレダクターゼ活性をこれらの条件下で示すクローンＴＧＹ１９５＃４を、新たなトランスフォーメーション用に、Ｆｙ１６７９−２８ｃ株につき上記したように、プラスミドｐｇｃｙ１：：ＬＥＵ２の助成により選択する。次いで、ロイシンの非存在下で生育しうるクローンを、１７ＯＨプロゲステロンについての新たな生物変換(上記)のためにグルコース又はガラクトースの存在下で選択する。減少した活性を２つの生物変換条件下で示すクローンＴＧＹ１９７＃ａを選択する。従って、最初１２％(１００ｍｇ／ｌの基質で)であった２０ケトレダクターゼ活性は、約０．２％に減じ、即ち、６０倍を超える減少である。
【００７４】
ＴＧＹ２４５株の構築
ＴＧＹ２４５株を、ＴＧＹ１９５＃４株から構築する。ＴＧＹ１９５＃４株から、ＴＧＹ２１２＃１株が最初に得られ、その後、ＴＧＹ２４３＃１株、そして最後にＴＧＹ２４５株が得られる。
【００７５】
ＴＧＹ１９５＃４株を、プラスミドＹＲＰ７(１μｇ)と５μｇのプラスミドｐＴＧ１２０４５(ＮｏｔＩで消化したもの)の両方を利用してトランスフォームする。トランスフォームした株を、トリプトファンを含まない培地上で選択する。コロニー(６７８コロニー)を、トリプトファン含有培地でサブ培養し(プラスミドＹＲＰ７を除くため)、そして、ＧＣＹ１遺伝子を中断するＵＲＡ３遺伝子を失ったコロニーを選択するために、トリプトファン及び５−フルオロオロテート(５ＦＯ)を含む培地でサブ培養する。１つのコロニー、ＴＧＹ２１２＃１が、このスクリーニングから得られる。このコロニーを、１００μｇ／ｍｌの１７ＯＨプロゲステロン基質を用いる生物変換実験(上記)にかけ、この株は、必須アミノ酸とウラシルを補った最少培地で生育する。この株は、１７ＯＨプロゲステロンを１１−デオキシコルチゾールに、４７％のオーダーの効率で、２４時間にわたって、変換することができ、これらの条件下で、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成は低い(＜０．５％)。ある条件(炭素源としてガラクトースを有するKappeli型の限定された栄養豊富な培地、及び高密度での培養開始：ＯＤ６００ｎｍ＝５)の下で、ケトンを減じる能力は、増大して、初期基質の１．５％に減少した生物変換能力を有する初期基質の１１％に達する。これらの条件下で、ＧＣＹ１遺伝子のありそうな存在は、１７ＯＨプロゲステロンの生物変換に負の影響を及ぼす。それ故、我々は、その活性を阻止するために、ＧＣＹ１遺伝子を破壊することを決定した。
【００７６】
これを行なうために、ＴＧＹ２１２＃１株を、制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで線状化した３μｇのプラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６でトランスフォームした。２７のトランスフォーマントを、ＴＧＹ２１２＃１の栄養要求性を満たすように補った最少培地(但し、ウラシルを含まない)で選択した。これらのコロニーを、炭素源としてガラクトースを補った最少培地で生物変換試験にかけた(ガラクトースは、公知のＧＣＹ１のインデューサーであるので)。すべてのＴＧＹ２４３クローンは、結果として、検出可能量の４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンを生成することなく、１７ＯＨプロゲステロンを１１−デオキシコルチゾールに変換する能力を示した。ＵＲＡ３遺伝子の代りに導入するために、ＴＧＹ２４３＃１クローンを選択した(ヒトＰ４５０ｃ２１用の発現カセット)。
【００７７】
このＴＧＹ２４３＃１株を、プラスミドＹＲＰ７(２μｇ)及び酵素ＸｈｏＩで線状化したプラスミドｐＴＧ１２０８６(５μｇ)でトランスフォームする。このｐＴＧ１２０８６トランスフォーミング断片は、ヒトＰ４５０ｃ２１用の発現カセットにより中断されたＧＣＹ１のコード配列(ＴＤＨ３：：ヒトｃＤＮＡＰ４５０ｃ２１：：ＰＧＫ°ターミネーター)を含む。トリプトファンの非存在下で生育するコロニーを選択する。これらの３８１コロニーを、次いで、トリプトファン及び５−フルオロオロテートを含む培地上にトランスファーする。次いで、約１０コロニーを、トリプトファン、ヒスチジン、ロイシン及びウラシルを５０μｇ／ｍｌの濃度で補ったＹＰＧ型の栄養豊富な培地で試験した。次いで、これらの株に、１７ＯＨプロゲステロンを、１００μｇ／ｍｌの濃度で変換させる(０．１のＯＤ６００ｎｍで開始して１６時間行なう)。
【００７８】
これらの１０クローンの内で、クローンＴＧＹ２４５＃１Ｄを、２つの基準に基づいて、特に、１７ＯＨプロゲステロンを１１−デオキシコルチゾールに変換する能力、及び第二に、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの形成のないこと(ＧＣＹ１の破壊を示す)に基づいて選択する。
【００７９】
欠損ＧＣＹ１株の特性：
得られた結果は、ＣＧＹ１の「ノックアウト」が、ガラクトースにより誘導される２０αＨＳＤ活性を排除することを示している。そうして、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの１７α−ヒドロキシプロゲステロン(１００μｇ／ｍｌ)からのイン・ビボ生成を、野生型株及びＴＧＹ１７０株(ｇｃｙ１−Δ：：ＬＥＵ２)の培養(グルコース培地又はガラクトース培地)において試験した(図３)。ガラクトース培地における培養の場合には、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オン生成の、野生型株と比較して約９５％の減少が、変異株につき認められた。グルコース培地において、この減少は一層低く、これは、ＧＣＹ１遺伝子産物がガラクトースにより誘導されうる２０α活性を構成することを示すようである。如何なる炭素源を用いても、残留活性は、変異体ｇｃｙ１１−Δに存在する(これは、実質的に等しい)。
【００８０】
欠損ＧＣＹ１、ＹＲＰ１二重変異体の特性：
Ｇｃｙ１ｐ及びＹｐｒ１ｐが２０αＨＳＤ活性と結合して見出されたという事実(上記参照)、及びＹｐｒ１ｐがＧｃｙ１ｐの最も近い同族体である(６５％ アミノ酸同一性)という事実が与えられれば、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１の二重破壊を行なって、その２０αＨＳＤ型活性につき試験した。得られた結果は、これら２つの遺伝子が欠損した株(ＴＧＹ１９７)が、本質的に、２０αＨＳＤ活性を有しないことを示している。
【００８１】
一層詳細には、ＴＧＹ１９７酵母(ｇｃｙ１：：ＬＥＵ２、ｙｐｒ１：：ＵＲＡ３)を生成して、それらの２０αＨＳＤ活性につきイン・ビボで試験した。これらの細胞を、グルコース又はガラクトースを炭素源として用いて、１００μｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下で培養した。７２時間後に、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンは、発酵液中で検出不能であり、これは、これら２つの遺伝子の不活性化が検出可能な２０αＨＳＤ活性の抑制へと導くことを示している。
【００８２】
これらの野生型及び変異型株の基質特異性
様々なクラスのレダクターゼ(アルドース−、アルデヒド−及びカルボニル−レダクターゼ)の基質として既に記載された一連の化合物を、野生型ホモジェネートにて及び変異株につき様々な培養条件下で試験した(表ＩＩ)。Ｇｃｙ１ｐ及びＹｐｒ１Ｐは、１７α−ヒドロキシプロゲステロンを基質として受け入れる唯一のアルド−ケト酵母レダクターゼであるということが認められる。
【００８３】
Ｇｃｙ１ｐは、すべての場合にガラクトースによる誘導が活性を増大させるので、試験したすべての基質を利用するようである。グルコース培地において、基礎的活性は、１７α−ヒドロキシプロゲステロンを除き、すべての成分について認められた(Ｇｃｙ１Ｐ及びＹｐｒ１ｐの存在と無関係に)。ガラクトース培地において、試験した２種のアルデヒドに対する一層高い活性が変異株において認められた(もっとも、野生型における程には言明できないが)。これは、Ｇｃｙ１Ｐ以外のアルデヒドに特異的な酵素がガラクトースによって誘導されうるということを示している。
【００８４】
浸透圧ストレス下での酵母の生理学についての最近の報告において、ＧＣＹ１が、反応性であるとして同定された。アスペルギルス・ニガーのグリセロールデヒドロゲナーゼから単離されたペプチドの配列決定は、２つの酵母タンパク質：Ｇｃｙ１ｐ及びＹｐｒ１ｐとの相同性を示した。浸透圧ストレス下でのＧＣＹ１の誘導(ガラクトースによる誘導に加えて)は、ＧＣＹ１が、Norbeck及びBlombergに示唆されたように、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を構成することを示すことができた。しかしながら、かかる活性は、今まで示されていない。
【００８５】
１７α−ヒドロキシプロゲステロンの、Ｓ．セレビシエにおける、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンへの還元は、主に、ＧＣＹ遺伝子の産物のためであり、一層僅かに、ＹＰＲ１遺伝子の産物のためである。Jez等(1997)により提案された命名法によれば、これらの酵素は、ＡＫＲ１Ｃサブファミリーに分類されるべきである。哺乳動物においては、ＨＳＤ(ＡＫＲファミリーに属する)は、ステロイドホルモンの利用可能性を調節することが提案されている。これらの酵素の酵母における生理的役割は、自然環境において酵母はステロイドにさらされうることが支持されていないので、未知のままである。かかる活性の酵母における意義が何であれ、その排除は、酵母による、特にこの発明により遺伝子改変された酵母によるコルチコステロイドの生成の改善に寄与する。
【００８６】
ＧＣＹ１及びＹＰＲ１の存在下及び非存在下での、ヒトＰ４５０ｃ２１による酵母における生物変換の実施例
ＧＣＹ１及びＹＰＲ１の破壊が、酵母Ｓ．セレビシエにおける特異的生物変換を得るために必須であることを示す目的で、我々は、Ｆｙ１６７９−２８ｃ／ｐＴＧ１０４９７（Ｆｙ／ｐＴＧ１０４９７）、ＴＧＹ２１２＃１及びＴＧＹ２４５＃２Ｄ株の１７ＯＨ−プロゲステロンの生物変換の能力を比較した。
【００８７】
Ｆｙ／ｐＴＧ１０４９７株は、２つの野生型遺伝子ＧＣＹ１及びＹＰＲ１並びに単一コピーのＡＲＳＣＥＮ型(「Autonomously Replicating Sequence Centromer」)のプラスミドをヒトＰ４５０ｃ２１の発現のために有する。ヒトＰ４５０ｃ２１のｃＤＮＡは、このプラスミド中で、ＴＥＦ１プロモーターの制御下にある。
【００８８】
ＴＧ２１２＃１株は、ＹＰＲ１座に組み込まれたヒトＰ４５０ｃ２１遺伝子(ＴＥＦ１：：ヒトＰ４５０ｃ２１：：ＰＧＫターミネーター)の発現用カセットを１コピー有し且つＧＣＹ１遺伝子の野生型１コピーを有する。
【００８９】
ＴＧＹ２４５＃２Ｄは、ＹＰＲ１及びＧＣＹ１遺伝子のコピーを有さず、カセットＴＥＦ１：：ヒトＰ４５０ｃ２１の１コピー及びＴＤＨ３：Ｐ４５０ｃ２１の１コピーが各座にそれぞれ組み込まれる。
【００９０】
これらの株を、カザミノ酸を補った最少培地で４８時間培養した。これらの株を、ウラシル、ヒスチジン及びトリプトファンを補った新鮮なKappeli培地中に２００ｍｇ／ｌの１７ＯＨプロゲステロンの存在下で再懸濁させる。７２時間のインキュベーション後に、酵母細胞の存在下で培地を抽出して、上記のように、逆送高性能液体クロマトグラフィーにより分析する。１７ＯＨプロゲステロン、１１−デオキシコルチゾール及び４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの存在を測定する。
【００９１】
これらの結果は、表ＩＩＩに与えてある。各生成物は、全生成物の総和のパーセンテージで表してある。
【００９２】
この実験により、ＧＣＹ１及びＹＰＲ１の破壊は、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの量を７〜１１％から我々の技術(０．５〜１ｍｇ／ｌの感度)によっては検出できないレベルまで有意に減じるということが明らかである。
【００９３】
【表１】
【表２】
ｎｄ：未検出
【００９６】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｒｅｄ１２０−アガロース上でのクロマトグラフィーによる酵母ホモジェネートに由来する２０αＨＳＤ活性の精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２】 ガラクトース(ＹＮＢ−ｇａｌ)又はグルコース(ＹＰＤ)培地中で培養された酵母Ｓ．セレビシエによる、０．１ｍｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下での４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成を示す図である。
【図３】 ガラクトース(ＹＮＢ−ｇａｌ)又はグルコース(ＹＰＤ)培地中で、０．１ｍｇ／ｍｌの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの存在下で培養した野生型(ｗｔ)又はＧＣＹ１遺伝子の配列が変異した(ｇｃｙ−)酵母Ｓ．セレビシエによる、４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの生成を示す図である。
【図４】 ＧＣＹ１遺伝子を破壊するためのプラスミドの構造を示す図である。
【図５】 ＧＣＹ１遺伝子を破壊するためのプラスミド(プラスミドｐＴＧ１２０１０)の構造を示す図である。
【図６】 ＹＰＲ１遺伝子(ＹＤＲ３６８ｗ)を破壊するためのプラスミド(プラスミドｐＴＧ１２０１１)の構造を示す図である。
【配列表】
Claims (15)
- 減少した２０αＨＳＤ活性を有する改変されたサッカロミセス・セレビシエ酵母であって、ＹＰＲ１遺伝子及びＧＣＹ１遺伝子の不活性化遺伝子改変を有することを特徴とする、酵母株。
- 前記の遺伝子が、完全に又は部分的に、ＵＲＡ３マーカー遺伝子により置き換えられた、請求項１に記載の酵母株。
- 遺伝子改変が遺伝子破壊である、請求項１又は２に記載の酵母株。
- 非機能的なＧＣＹ１遺伝子及びＹＰＲ１遺伝子を含む請求項１〜３の何れか１つに記載の酵母株。
- 減少した２０αＨＳＤ活性を有する改変されたサッカロミセス・セレビシエ酵母であって、ＹＰＲ１遺伝子及び／又はＧＣＹ１遺伝子の不活性化遺伝子改変を有する酵母、又はかかる酵母から得られた調製物を使用して、１７α−ヒドロキシステロイド化合物を還元することによりステロイド化合物を製造する方法。
- １７α−ヒドロキシステロイド化合物が、１７α−ヒドロキシプロゲステロン又はその前駆体である、請求項５に記載の方法。
- １７α−ヒドロキシプロゲステロンを還元する方法であって、減少した２０αＨＳＤ型活性を有する改変されたサッカロミセス・セレビシエ酵母であって、ＹＰＲ１遺伝子及び／又はＧＣＹ１遺伝子の不活性化遺伝子改変を有する酵母、又はかかる酵母から得られた調製物を使用する当該方法。
- １７α−ヒドロキシプロゲステロンの１１−デオキシコルチゾールへの変換のための請求項７に記載の方法。
- 酵母が、サッカロミセス酵母である、請求項５〜８の何れか１つに記載の方法。
- 酵母が、非機能的なＧＣＹ１遺伝子及びＹＰＲ１遺伝子を含む、請求項５〜９の何れか１つに記載の方法。
- 非機能的遺伝子が、欠失及び／又は挿入を示す、請求項１０に記載の方法。
- 非機能的遺伝子が、破壊されている、請求項１１に記載の方法。
- 請求項１〜４の何れか１つに記載の酵母の、１７α−ヒドロキシステロイド化合物を還元することによるステロイド化合物の製造のための利用。
- 減少した２０αＨＳＤ活性を有する請求項１〜４の何れか１つに記載の酵母又はかかる酵母から得られた調製物の、イン・ビトロ又はエキス・ビボでの、１７α−ヒドロキシステロイド化合物を還元することによるステロイド化合物の生成、製造、合成、改変及び／又は改良のための利用。
- 請求項１〜４の何れか記載の減少した２０αＨＳＤ活性を有する酵母又はかかる酵母から得られた調製物の、１７α−ヒドロキシプロゲステロンの１１−デオキシコルチゾールへの変換のための利用。
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