JP4620932B2 - ステロイドを自律的に産生する酵母株 - Google Patents
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Description
et al.,(1998)は遺伝的改変酵母でのプレグネノロンおよびプロゲステロンの合成を記載している。さらにまた特許出願WO99/40203には、酵母株のATF2遺伝子の不活化はこの株によって産生されるステロイドのアセチル化を回避できることが記載されている。
本発明にしたがえば、“単純炭素源”という表現は、酵母の通常の増殖のために当業者が用いることができる炭素源を意味する。前記は、特に種々の同化可能な糖(例えばグルコース、ガラクトースまたはシュクロース)または糖蜜またはこれらの糖の副生成物を示すことを意図している。極めて好ましい単純炭素源はエタノールおよびグリセロールである。
‐選択した微生物に存在する内在性酵素のために観察される可能性がある寄生的反応(parasitic reaction)を排除することが望ましい;
‐合成中間体を改変するために遺伝子を導入し、得られる発現レベルを哺乳類で観察されるレベルに可能なかぎり近づけることが望ましい。したがって、正しい均衡を作り直すことが前記のプロジェクトの成功のために重要な条件である;
‐選択したステロイドの生合成を優先的に指令することを可能にする種々の遺伝子の発現レベルを得ることが望ましい。
ドは、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)で複製する酵母の2−ミクロンレプリコン系プラスミドから選択され、前記低コピープラスミドは、酵母の動原体を含む染色体のARS複製起点をベースにしたプラスミドから選択される。
れら自身の成熟形を得る。
セレビシエ(S. cerevisiae)のNCP1遺伝子座に組み込むことができる。
酵母プラスミドに由来するものが好ましいが、一方、シングルコピープラスミドまたは低コピープラスミドがADRの発現にはむしろ用いられる。ADRのための発現ブロックはまた酵母の染色体に組み込むことができる。これはADRの発現の制御を可能にする。なぜならばあまりに高い発現は所望のscc活性に有害であるように思われるからである。
−FY1679−28c株−(Duport et al.(1998)により報告された)、前記株は以下の遺伝子型を有する(MATα、rho-、ura3−52、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200、GAL2、fen1)。前記株はまたThierry et al.(1990)によって記載された;
−FY1679−18b株、以下の遺伝子型を有する(MATa、rho-、ura3−52、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200、GAL2、fen1)。
前記2つの株は、したがって同一の遺伝子型および反対のサインを有する。
構築のためには、上記で述べたFY1679−28cおよびFY1679−18b酵母株を出発物質として用いる。
プラスミドpPOLYIII内でURA3遺伝子によってYPR1遺伝子が中断されてある構築物(YDR368w)を連続した4つのPCRによって得た。最初に、3つのそれぞれ別個のPCRを実施し、YPR1遺伝子の5’部分(PCR5)、YPR1配列と境を接する機能的URA3遺伝子(PCR6)およびYPR1遺伝子の3’部分(PCR7)を得た。
酵母でP450c21タンパク質を過剰発現させるために、2つのタイプのプロモーター、TEF1(転写伸長因子1)およびTDH3(グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ3)を用いた。全ての事例で、転写ターミネーターはPGKターミネ
ーターである。これらのプラスミドで、SalI、MluIフラグメントはヒトP450c21cDNAを含む。
プラスミドpTG10289は、KpnIおよびMluIでpMAc21(Wu et al.,
1991)を消化し、オリゴヌクレオチドOTG5868(配列識別番号27)を導入することによってpMAc21を改変して得られた。
Maryland, USA)からpc21/3cの名称で得られる。前記は1.6kbのEcoRI−BamHIフラグメントで、種々のプラスミドの構築のためのベースとして用いられた。導入された改変は上記文献および他の文献(Hu et al., 1990)に記載されている。
GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC(配列識別番号9)。
プラスミドpTG12036は4工程でpTG10802から構築された。プラスミドpTG10801(前記からプラスミドpTG10802が得られた)は、一連の制限部位がXhoI部位とXhoI部位との間に挿入されたpUC型のプラスミドである。前記一連の部位にはHindIII、SnabI、ClaIおよびSpeI部位が含まれる。
プラスミドpPOLYIIIのただ1つのSphI部位をオリゴヌクレオチドOTG11975(配列識別番号12)およびOTG11976(配列識別番号13)の相補対を挿入することにより破壊する。
2045は前記のようにして得られる。
プラスミドpTG12010はプラスミドpUC19(Yanisch-Perron et al., 1985)をベースに構築し、一方、プラスミドpTG12011はプラスミドpPOLYIII(Lathe et al., 1987)をベースに構築した。
本プラスミドを用いて、P450c21のための発現カセットを組み込み、同時にGCY1遺伝子を破壊する。本プラスミドはプラスミドpTG12036およびプラスミドpTG10614から構築された。
た。
本プラスミドpTG12048はプラスミドpFL26CD、pTG10925およびpTG10953から構築された。
コロニーは実施例1で述べたスクリーニングで選別する。前記コロニーをTGY212#1と称する。このコロニーを以前に記載したように100μg/mLの17OH−プロゲステロン基質を用いてバイオ変換実験に付し、さらに前記コロニーを必要なアミノ酸およびウラシルを補充した最小培地で増殖させる。
これを実施するために、TGY212#1株を3μgのプラスミドpGT12010#36(SphIおよびEcoRI制限酵素で直鎖化)で形質転換した。27個の形質転換体を、TGY212#1の栄養素要求にあわせて補充した(しかしウラシルは含まない)最少培地で選別した。
前記TGY243#1株を、プラスミドYRp7(1μg)(Parent et al., 1985)および5μgのプラスミドpTG12086(XhoI酵素で直鎖化)で形質転換する。
本株はTGY245をプラスミドpTG12048(LEU2遺伝子座のARH1を過剰発現させる)で形質転換させて構築した。
FY1679−28c株を、Duport et al.(1998)(プラスミド構築および株の入手についての前記文献の技術的内容は参照により本明細書に組み込まれる)が記載したプラスミドpCD62.1で形質転換して、CDR01株を作製した。前記株をプラスミドpCD78(Duport et al.も記載している)で形質転換して、CA03株を得る。
TGY260およびCDR07MATα株を交雑してSB14株を得る。続いて前記株で胞子を形成させ、分離株YCC4およびYCC5を得る(下記もまた参照されたい)。
a)プラスミドpCV29の構築
プラスミドpGT10767、pTG10022およびpCD63を用いて、pCV29を構築した(図3参照)。
1.プラスミドpTG10767の構築
プラスミドpTG10767はヒト由来のP450c11のための発現カセットである。前記は、実際2つの発現カセット(1つはヒト由来のP450c11のためのカセット、他方はアドレノドキシンのためのカセット)を含む。前記2つのタンパク質では、チトクロームCox6p前駆体の誘導配列の存在によってサッカロミセス セレビシエのミトコンドリアで活性を有することが目標とされる。
換された。前記は同時にcDNAの成熟形コード配列の31アミノ酸が除去され、以下のアミノ末端のタンパク質配列(配列識別番号23)を生じる:
ラスミドのNotI制限部位に導入した。前記二重発現カセット(NotIフラグメントに含まれる)は、URA3選別マーカーを囲むウシADXの成熟形の発現カセットおよびウシP450SCCの成熟形の発現カセットを含む。クレノーフラグメントDNAポリメラーゼでNotI末端を充填した後、CYC1プロモーターおよびPGK1ターミネーターの制御下にあるヒトP45011βcDNAを含むチトクロームP45011βのための発現カセットを、前記プラスミドの平滑末端をもつただ1つのPmeI部位に導入した。
プラスミドpCC12(図4参照)は、染色体複製起点、例えばともにサッカロミセス
セレビシエ由来であるARS1およびCEN動原体(酵母にはそれらのうちの16が存在する)をベースにした複製型酵母プラスミドである。前記プラスミドは酵母内で1つまたは2つのコピーとして複製する。
プラスミドpCC12は、2つの発現カセット(1つはウシ由来の3β−HSDH、他方は同様にウシ由来のアドレノドキシンレダクターゼ)を含む。
CDR07株は、FY1679−18bMATa株とDuport et al.(1998)が報告したCA10MATα株との交雑によって得られた。
edited by Ivor H. Evans (1996), Humana Press, Totowa, New Jersey)の記載にしたがって、先ず第一にグリセロールを含む富裕培地で、続いて酢酸カリウム含有培地で単離された。
a)pLIP5の構築
pLIP5は、TRP1遺伝子座でゲノムに組み込むために、またはマルチコピープラスミドとしてサッカロミセス セレビシエで用いることができる。このプラスミドを構築するために用いた基本プラスミドは、Bonneau et al.(1991)(前記文献の内容、特に前記プラスミドの記載は参照により本明細書に組み込まれる)が記載したプラスミドpFL45Sである。
このプラスミドはHIS3遺伝子座の遺伝子間組み込み用プラスミドであった。前記プラスミドは、Duport et al.(1998)が記載したプラスミドpUC−HIS3から構築する。前記プラスミドのただ1つのXhoI制限部位を適切なリンカーを用いてただ1つのNotI制限部位に変換し、同時にXhoI部位を破壊してプラスミドpUC19−HIS3を得る。本プラスミドのただ1つのNotI部位に、pTG10792由来のNotIフラグメントを[欠文]。前記フラグメントは、TDH3プロモーターおよびCOX6チトクローム(Dumas et al.(1996)が記載した酵母チトクロームオキシダーゼサブユニット6)の前駆体の誘導配列と融合させたウシ成熟ADXをコードするcDNAを含む。上記に述べたcDNAを含むプラスミドpTG10350のSalI、MluI制限フラグメントをプラスミドpTG10211に移し、プラスミドpTG10792を作製する。
酢酸カリウムを含む非常に枯渇されている培地(depleted medium)でSB14株(CDR07MATα×TGY260MATa)の胞子を形成させる。続いて、種々の子嚢を以下の生成物を含む最少培地で増殖させる:ウラシル、ヒスチジン、トリプトファンおよびアデニン。
およびカンペステロールの産生並びにそれぞれの胞子について72時間で25、120および42μg/mLの産生効率をもたらす17OH−プロゲステロンから11−デオキシコルチゾルへの変換を基準にして選択する。
UCY2株は機能的なATF2遺伝子を有する。換言すれば、産生されるプレグネノロンの大半は、プレグネノロンアセチルトランスフェラーゼであるATF2pタンパク質によって酢酸プレグネノロンに変換される(前記トランスフェラーゼの天然の状態での機能は不明である(Cauet et al., 1999)。さらに、前記作用は不可逆的で、したがっていったん生成されてしまうと、アセチルプレグネノロンはもはやヒドロコルチゾンに変換できない。したがって、この活性を破壊し、より効率的なヒドロコルチゾンの生成を可能にすることが重要である。
CDR07とTGY260株との交雑によって得られた胞子のスクリーニングによってYCC4およびYCC5株を含むいくつかの株が得られた。上記に記載したように、YCC4株を2つのプラスミド(pLIP5およびpTG12093)で形質転換した。胞子UCY2を続いて選別した(実施例12参照)。同じようにして、YCC5株もまたプラスミドpLIP5およびpTG12093で形質転換し、さらに別の胞子(UCY3と称する)を得た。UCY2と同様に、UCY3はシロイヌナズナ(A. thaliana)のΔレダクターゼの存在および発現を特徴とする(前記はナイスタチン耐性であること、およびリコンビナント酵母の主要ステロールとしてブラシカステロールおよびカンペステロールが存在することによって決定される)。ADXcDNAの存在はオリゴヌクレオチドADX−3およびADX−5(それぞれ配列識別番号35および36)を用いてPCRを実施し、続いてDumas et al.(1996)が記載したようにウェスタンブロットを実施することによって立証される(前記技術に関し前記文献は参照により本明細書に組み込まれる)。
より良好な遺伝的多様性を目的として、UCY2株(実施例12参照)をTGY245株(実施例5参照)とを交雑し、二倍体株YSA2−2nを選別した。前記株を子嚢産生条件下に置き、85個の子嚢を文献にしたがって解体した(“Yeast Protocols in Molecular Biology", Vol.53, p59-67(1996))。単離した胞子は、その栄養素要求性を基準にスクリーングされる。したがって、トリプトファンおよびヒスチジンの非存在下で増殖することができ、さらにアデニンを要求するコロニーをより厳密に選別する。Δレダクターゼの発現は、前記株がナイスタチンに耐性を有すること、およびそれら株の膜にカンペステロールおよびブラシカステロールが存在することを確認することによって立証される。後者の分析は、Duport et al.(1998)が記載したようにこれらの株の全ステロールのガスクロマトグラフィーによって実施される。さらに、P450c17をコードするcDNAおよびADXの存在は、オリゴヌクレオチドC17−3およびC17−5(それぞれ配列識別番号33および34)、並びにオリゴヌクレオチドADX−3およびADX−5(それぞれ配列識別番号35および36)を用いてPCRによって立証される。最後に、これら陽性胞子のGCY1およびYPR1遺伝子の機能性は、PCRによるか、または17OH−プロゲステロンに対する20−α−レダクターゼ活性が存在しないことによる前記2つの方法のどちらかによって立証される。
a)プラスミドpFM10の構築
プラスミドpFM10は4つのタンパク質を酵母で同時に発現させるベクターである。前記は大腸菌のための複製起点を含まず,アンピシリン耐性遺伝子ももたない。このプラスミドは大腸菌で複製できない。前記は2つのプラスミドpFM7およびpCB12を酵母で組換えることによって得られる。これらプラスミドは、プラスミドpFM10と異なり、両者とも大腸菌レプリコンを有するので大腸菌で複製する。プラスミドpFM7はまたサッカロミセス セレビシエでも複製する。なぜならば、前記はまたサッカロミセス セレビシエの2−ミクロン複製起点を含むからである。前記2つのプラスミドはまた、発現カセットおよびまた選別マーカーと境界を接するR1およびR2配列(それぞれ配列識別番号39および40)を有する。前記R1およびR2配列はシロイヌナズナ(A. thaliana)のフォトクロロフィリドオキシドレダクターゼ遺伝子に由来し、各々サイズが約300塩基対である。
ATF2遺伝子のコード配列は、2つの20量体オリゴヌクレオチド(それぞれATF2遺伝子のコード配列の5’および3’部分に一致し、さらにまたクローニング部位を含む)およびマトリックスとしてFY1679−28c株のゲノムDNAを用いPCRによって増幅される。前記PCR生成物を続いてClaIおよびHindIII酵素で消化し、さらにプラスミドpGT10031(Degryse, 1995 #102)のClaIおよびHindIII部位の間でクローン化し、プラスミドpGT10885を得る。前記プラスミドをATF2遺伝子破壊のためのプラスミドを構築する基礎として用いる。URA3遺伝子配列をTGY156株(Cauet et al., 1999;前記文献は参照により本明細書に組み込まれる)のゲノムDNAから増幅させた。前記TGY156株は実際URA3遺伝子によって中断されたATF2遺伝子を有する。したがってオリゴヌクレオチドOTG10842(配列識別番号41)およびOTG10841(配列識別番号42)を、TGY156株のゲノムDNAをマトリックスとして増幅に用い、さらにこの増幅生成物をBstXIおよびStuI制限酵素により消化したプラスミドpGT10885との組換えのイニシエーターとして用いた。
オチドとの間に位置する。
問題のステロイドの生成を改善する目的で、一連の新規な株をUCY5株をベースにして構築した。具体的には、UCY5株はアドレノドキシンレダクターゼを発現しない(レダクターゼはP450SCCによる側鎖切断反応に必須の成分である)。さらにまた、以前に述べたように、ATF2遺伝子は、基質としてプレグネノロンを用いるアセチルトランスフェラーゼをコードし、その破壊は前記の寄生的アセチル化反応を排除し、したがって問題のステロイドの収量を増加させることができる。ついには、外因性生合成経路は内在性ARH1p活性を使用し、後者は酵母の生存に必須である。しかしながら、このミトコンドリア活性(哺乳類のアドレノドキシンレダクターゼの代りとなる)は、ヒドロコルチゾン産生株では限定的であるかもしれない。したがって、問題のステロイドの産生収量を顕著に増加させることができるある種の改変を有する株をUCY5株をベースにして構築した。したがってこの株はATF2活性を欠き、アドレノドキシンレダクターゼタンパク質を過剰産生し、さらにまたARH1タンパク質も過剰に産生する。
スミドpAM3kanaC(実施例13参照)で形質転換することによって実施した。続いて、G418耐性コロニーをプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ活性の有無についてテストする(Caute et al., 1999)。もはやプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ活性をもたないG418耐性コロニーを特に厳密に選別し、この株をUCY24と称する。
a)UCY2およびUCY4のpCV29およびpCC12による形質転換
UCY2およびUCY4株を2つのプラスミドpCV29およびpCC12で上記のように形質転換した(前記株の構造は下記並びに図3および4で再度示される)。
それぞれ、上記で述べたようにミトコンドリアに誘導されるヒト/ウシハイブリッドP45011β、並びにアドレノドキシンおよびP450SCCの成熟形(アミノ末端にメチオニンを有する)のための3つの発現カセット含む。前記3つのタンパク質の発現はCYC1プロモーター(P45011β)およびGAL10/CYC1プロモーター(ADXおよびP450SCCの成熟形)の制御下にある。
これらの株は多くの改変を有し、形質転換が困難であることが判明した。結果として、これらの形質転換のために、Burgers et al.(1987)が記載したようにスフェロプラストの調製を基にしたプロトコルを用いた。UCY16はプラスミドpFM7およびpCB12で前記プロトコルによって形質転換された。pFM7およびpCB12は酵母内でin vivo組換えによりプラスミドpMF10を生じる。上記で述べたように、プラスミドpFM10はマルチコピー酵母プラスミドであり、前記はいずれの細菌配列も含まず、4つの異種タンパク質を発現させる。前記4つの異種タンパク質は,上記で示されたように、チトクロームP45011β、ウシ3β−HSD、成熟ADXおよび成熟チトクロームP450SSCのキメラ形である。
との間を往復させるためのマルチコピープラスミドである。前記はチトクロームP45011β、成熟ADXおよびチトクロームP450SCCをそれぞれCYC1、GAL10/CYC1およびGAL10/CYC1プロモーターの制御下で発現させる(図3参照)。pCC12プラスミドはシングルコピー酵母プラスミドで、それぞれTEF1プロモーターおよびTDH3プロモーターの制御下でウシ成熟ADRおよびウシ3β−HSDを発現させる(図4参照)。
ヒドロコルチゾンの量は12.3μg/mLから29.2μg/mLにそれぞれ増加する。さらに、これらの例では、ヒドロコルチゾンは、総ステロイドの約70%を占める。これらの株ではいずれも4−プレグネン−17,20−ジオール−3−オン夾雑物質を産生しないために、生成されるヒドロコルチゾンの量および質における大きな改善が観察される。特に後者の有利な特性は、ケトンの還元反応に必要な20位のGCY1および/またはYPR1遺伝子によってコードされるタンパク質の欠落によるものである。
上記の株の2つを当業者に周知の技術にしたがって(例えばD. Risenberg et al.(1999)参照)、カッペリの培地で大容積ファーメンターで増殖させた。使用した培養技術は濃縮培養液を用いるフェッドバッチ(fed-batch)である。総容積15リットルのファーメンターは、開始時に6リットルの培養液を有する。培養中にさらに添加される4リットルの濃縮培養液およびpH修正液の連続添加,並びにエターノールの連続添加によって、最終容積は培養終了時に約11.5literとなる。UCY4/pCV29+pCC12およびUCY16/pFM10株を上記のように180時間培養し、ヒドロコルチゾンの産生増加を得ることができた(表3参照)。UCY24/pCV29+pCC12、UCY25/pCV29+pCC12、UCY26/pCV29+pCC12、およびUCY27/pCV29+pCC12株の予想結果は、前記結果から外挿することができる(表3参照)。
ブダペスト条約の規定にしたがって、以下の生物を2001年1月24日に下記のCollection National de Cultures de Microorganismes(CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Franceに寄託した。
‐CDR07MATα株 受託番号I−2616
‐TGY260株 受託番号I−2615
Fy1679−18b=(n)MATa ura3−52 trp1−Δ63 leu2−Δ1 his3−Δ200 fen1 GAL fenS ura- trp- leu- his-
Fy1679−28c=(n)MATα ura3−52 trp1−Δ63 leu2−Δ1 his3−Δ200 fen1 GAL fenS ura-trp- leu-
his-
TGY195#4=Fy1679−18b ypr1::URA3
TGY211−1=Fy1679−18b ypr1::TEF1P::P450c21 [5x?] ura- trp- leu- his-
TGY243−1=TGY212−1 gcy1::URA3 trp- leu- his-
TGY245−2D=TGY243−1 gcy1::TDH3P::P450c21
ura- trp- leu- his-
TGY260−A=TGY245−2D LEU2::CYC1P::ARH1 ura- trp- his-
CDR01=Fy1679−18b MATαLEU2::’b−mat ADR’ ura- trp- his-
CDR07 MATα=MATα ade2::GAL10/CYC1P::Δ7 ura- trp- leu- his- ade-(CA10×Fy1679−28cの胞子)
CDR07 MATa=MATa ade2::GAL10/CYC1P::Δ7 ura- trp- leu- his- ade-(CA10×Fy1679−28cの胞子)
CA03=CDR01 ade2::GAL10/CYC1P::Δ7 ura- tr
p- ade- his-、ナイスタチン耐性(Duport et al., 1998)
CA10=CA03 erg5::PGK1P::hygroR ura- trp- ade- his-、ナイスタチンおよびヒグロマイシン耐性(Duport et al., 1998)
SB14(2n)=TGY260−A×CDR07 Matα
YCC4=(n)MATα ade2::GAL10/CYC1P::Δ7,LEU2::CYC1P::ARH1,ypr1::TEF1P::P450c21,ERG5,fen1(?), ura- trp- ade- his- ナイスタチン耐性、(SB14の胞子)
YCC8=pLIP5で形質転換されたYCC4(TRP1::TEF1P::P450c17::PGK1t)、ナイスタチン耐性
UCY2=pTG12093で形質転換されたYCC8(HIS3::TDH3P::CoxVIpre::matADX::PGK1t):HIS3::TDH3p::CoxVIpre::matADX::PGK1t,ERG5,fen1(?), ura- ade-,ナイスタチン耐性
UCY4=UCY2 atf2−Δ::G418R ura- ade- ナイスタチンおよびG418耐性
YCC5=(n)MATα ade2::GAL10/CYC1P::Δ7レダクターゼ、LEU2::CYC1P::ARH1、gcy1::TDH3P::P450c21、ERG5,fen1(?), ura- trp- ade- his-,(ナイスタチン耐性、SB14の胞子)
YCC9=pLIP5で形質転換されたYCC5(TRP1::TEF1P::P450c17::PGK1t),ura- ade- his-,ナイスタチン耐性
UCY3=pTG12093で形質転換されたYCC9(HIS3::TDH3P::CoxVIpre::matADX::PGK1t):HIS3::TDH3p::CoxVIpre::matADX::PGK1t,ERG5,fen1(?),ura- ade-,(ナイスタチン耐性)
UCY26=UCY3 atf2−Δ::G418R ura- ade- (ナイスタチンおよびG418耐性)
YSA2(2n)=TGY245−2D×UCY2
UCY5=(n)MATα ade2::GAL10/CYC1P::Δ7レダクターゼ、LEU2::CYC1P::ARH1、ypr1::TEF1P::P450c21、ERG5,gcy1::TDH3P::P450c21、fen1(?),ura- trp- his-,ナイスタチン耐性(YSA2の胞子)
UCY6=UCY5 LEU2::TEF1::matADR::PGK1t
UCY16=UCY6 atf2::URA3::atf2
UCY19=UCY5,LEU2::CYC1::ARH1
UCY20=UCY5,LEU2::TEF1::ARH1
UCY25=UCY19 atf2−Δ::G418R (ナイスタチンおよびG418耐性)
UCY27=UCY20 atf2−Δ::G418R (ナイスタチンおよびG418耐性)
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Claims (25)
- 単純炭素源からコレステロール代謝により誘導されるステロイドを自律的に産生する遺伝的に改変された酵母株であって、このステロイドが、プレグネノロン、17α−ヒドロキシプレグネノロン、コルチゾル、コルテキソロン、プロゲステロン、17α−ヒドロキシプロゲステロンおよびこれらのステロイドの誘導体から成る群に含まれており、この酵母株が、内在性遺伝子の破壊または不活化、内在性遺伝子のプロモーターの改変、内在性遺伝子の重複化および発現ブロック内の少なくとも1つの異種遺伝子を1つもしくは2つ以上のコピーとしてエピソームまたは染色体の一部に導入することから成る群から選択される少なくとも1つの遺伝的改変を有し、内在性遺伝子ATF2、GCY1およびYPR1の不活化を有することを特徴とする上記酵母株。
- 酵母株が内在性遺伝子ERG5、ATF2、GCY1およびYPR1の破壊を有することを特徴とする請求項1に記載の酵母株。
- 酵母株が、ADE2、HIS3、TRP1、LEU2、GCY1、ATF2およびYPR1から選択される少なくとも1つの遺伝子座で染色体に組み込まれている、異種遺伝子のための少なくとも1つの発現ブロックを有し、この組み込みが、上記遺伝子座のすぐ近傍の遺伝子内または遺伝子間で実施されることを特徴とする請求項1または2に記載の酵母株。
- 酵母株が、マルチコピープラスミドまたは低コピープラスミドに配置されている、異種遺伝子のための少なくとも1つの発現ブロックを有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の酵母株。
- マルチコピープラスミドが、サッカロミセス セレビシエで複製する酵母2−ミクロンレプリコン系プラスミドから選択されること、および低コピープラスミドが、酵母の動原体を含む染色体ARS複製起点をベースにしたプラスミドから選択されることを特徴とする請求項4に記載の酵母株。
- 酵母株が発現ブロック内に少なくとも1つの異種遺伝子またはcDNAを有し、この遺
伝子またはcDNAが、ステロールΔ7−レダクターゼ、チトクロームP450SCC、アドレノドキシン、アドレノドキシンレダクターゼ、3β−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼイソメラーゼ、チトクロームb5、チトクロームP450レダクターゼ、チトクロームP450C17、チトクロームP450C21およびチトクロームP450C11の遺伝子、並びにこれらのタンパク質をコードする配列から成る群から選択されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の酵母株。 - 少なくとも1つの異種遺伝子またはcDNAが、酵母の内在性プロモーター配列TDH3、TEF1、PGK1、CYC1、GAL10、ATF2、TIR1、ARH1およびADE2、並びにハイブリッドプロモーターGAL10−CYC1から成る群から選択されるプロモーター配列の制御下にあることを特徴とする請求項6に記載の酵母株。
- 発現ブロック内の少なくとも1つの異種遺伝子またはcDNAのターミネーター配列が、内在性遺伝子PGK1、CYC1、ATF2、ADE2およびNCP1のターミネーター配列から選択されることを特徴とする請求項6または7に記載の酵母株。
- 酵母株が、ADE2遺伝子座で染色体に組み込まれているステロールΔ7−レダクターゼ異種発現ブロックを有することを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株が、高コピープラスミドに配置されている、P450SCCの成熟形およびアドレノドキシンの成熟形をコードする遺伝子の発現のための少なくとも1つのカセット含むことを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株が、シングルコピープラスミドまたは低コピープラスミドに配置されているか、または1つもしくは2つ以上の酵母染色体に組み込まれている、P450SCCのためのアドレノドキシンレダクターゼの発現のためのカセットを含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の酵母株。
- アドレノドキシンレダクターゼの発現のためのカセットが、ホスト細胞のサイトゾルにタンパク質が存在することを担保する成分を有することを特徴とする請求項11に記載の酵母株。
- 酵母株が、3β−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼイソメラーゼの発現のためのカセット、チトクロームP450c17の発現のためのカセット、およびチトクロームP450c21の発現のためのカセットから選択される、高コピープラスミドに配置されている少なくとも1つの発現カセットを含むことを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株が、マルチコピープラスミドに配置されている、P45011βのための少なくとも1つの発現カセットを含み、前記生成されたタンパク質がミトコンドリアへの誘導のためのシグナルを有することを特徴とする請求項1〜13のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株が、マルチコピープラスミドに配置され、弱いプロモーターを含む、P45011βのためのアドレノドキシン前駆体のための少なくとも1つの発現カセットを含み、前記生成されたタンパク質がミトコンドリアへの誘導のためのシグナルを有することを特徴とする請求項1〜14のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株が、アドレノドキシンのための少なくとも2つの発現カセットを有し、それによ
り一方のタンパク質がミトコンドリア外で活性を有し、他方がホスト細胞のミトコンドリア内で活性を有することを特徴とする請求項1〜15のいずれか1項に記載の酵母株。 - 酵母株が、NCP1、ATR1および/またはATR2のための少なくとも1つの発現カセットを含み、このカセットがシングルコピープラスミドに配置されているか、または染色体に組み込まれていることを特徴とする請求項1〜16のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株が、生理学的レベルよりも高いレベルでARH1タンパク質を発現することを特徴とする請求項1〜17のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株が、内在性遺伝子の他に、ARH1タンパク質のための第二の発現カセットを有することを特徴とする請求項18に記載の酵母株。
- ARH1タンパク質の発現が、カセット内のCYC1プロモーターの制御下に置かれていることを特徴とする請求項19に記載の酵母株。
- 酵母株が倍数体、二倍体、半数体または異数体であることを特徴とする請求項1〜20のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株がサッカロミセス セレビシエの1株であることを特徴とする請求項1〜21のいずれか1項に記載の酵母株。
- 酵母株が、CNCMにそれぞれ受託番号I−2616およびI−2615で2001年1月24日に寄託されたCDR07Mat−αまたはTGY260株であるか、または、CDR07Mat−αおよびTGY260の交雑並びに場合によって胞子形成および酵母由来のプラスミドによる形質転換後に得られた株、特にUCY2またはUCY4株であることを特徴とする酵母株。
- 酵母株が、産生されたステロイドを培養液中に分泌するために必要な成分を有することを特徴とする請求項1〜23のいずれか1項に記載の酵母株。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の酵母株を単純な炭素源の存在下で発酵させる工程、および前記産生されたステロイドを回収する工程を含むことを特徴とするステロイドの製造方法。
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