NO333769B1

NO333769B1 - Genetisk modifisert gjaerstamme som autonomt produserer steroider, fremgangsmate for fremstilling samt farmasoytisk preparat.

Info

Publication number: NO333769B1
Application number: NO20033242A
Authority: NO
Inventors: Denis Pompon; Bruno Dumas; Gilles Cauet; Tilman Achstetter; Roberto Spagnoli; Eric Degryse; Jacques Winter
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2003-07-17
Publication date: 2013-09-16
Also published as: FR2820145A1; FR2820145B1; KR20030082580A; ZA200305772B; US7670829B2; IL157118A0; US20100112634A1; JP4620932B2; CY1111099T1; CA2435096A1; AR033857A1; DK1385980T3; ATE486134T1; US7977065B2; US20040137556A1; BRPI0206809B1; NO20033242D0; WO2002061109A2; EP1385980B1; NZ526381A

Abstract

Det beskrives genetisk modifiserte gjærstammer som autonomt fra en enkel karbonkilde, produserer steroider. Det beskrives videre en fremgangsmåte for å produsere steroider fra slike gjærstammer.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av steroider i mikroorganismer og spesielt

i gjærstammer.

Steroider, særlig kolesterolavledede steroider, er involvert i mange fysiologiske prosesser, blant hvilke kan nevnes regulering av karbohydrat- og kolesterolnivåene i blodstrømmen, opprettholdelse og utvikling av muskelmassen, samt utvikling av sentralnervesystemet.

Blant de mangler som observeres ved en ubalanse av nivåene av sirkulerende steroider, kan nevnes den mulige utløsning av autoimmune sykdommer som lupus, av visse cancer typer, som brystcancer, kardiovaskulære sykdommer som aterosklerose. Problemer med steroidregulering er også under mistanke når det gjelder utløsning av visse neurologiske sykdommer, som Parkinsons sykdom eller Alzheimers sykdom.

Steroider og særlig hydrokortisoner, kan benyttes som terapeutisk middel per se eller som supplement ved andre behandlinger. Således benyttes syntetiske derivater av gluko-kortikoider på grunn av deres antiinflammatoriske og, i høye doser, immunosuppressive virkninger.

Produksjonen av steroider er delvis assosiert med kostbare metoder omfattende ekstra-hering eller syntese. John Warcup Cornforth var den første som utførte den fullstendige syntese av et steroid, kolesterol, ved bruk av en enzymatisk metode. Imidlertid er det viktig å ha en fremgangsmåte for å oppnå steroider av interesse, særlig kolesterol-derivater, til godtagbar pris.

Et visst antall proteiner som er involvert i steroidbiosyntesen, er uttrykt i gjær. Således viser EP 360 361 aktiviteten til proteinene P450 17a og P450c21 i gjæren Kluyvero-myces lactis. På tilsvarende måte er muligheten for in vfvo-konvertering av 11-deoksykortisol til hydrokortison i en genetisk modifisert gjær som uttrykker P450cl 1, beskrevet (Dumas et al., 1986) på samme måte som fremstillingen av 17a-hydroksyprogesteron fra pregnenolon i gjær (Degryse et al., 1999). I tillegg beskriver Duport et al. (Duport et al., 1998) syntese av pregnenolon og progesteron i en genetisk modifisert gjær. Det er også i WO 99/40203 beskrevet at inaktivering av ATF2-genet i en gjærstamme gjør det mulig å unngå acetylering av steroidene som fremstilles av denne stamme.

EP0360361 Al beskriver en prosess for oksidering av stereoider og genetisk modifiserte celler til bruk i nevnte prosess. Oksideringsprosessen gjennomføres fortrinnsvis vha. celler der DNA er innsatt som koder for minst to proteiner involvert i omdannelsen av kolesterol til hydrokortison.

EP0727489 Bl angir en fremstilling av pregnenolon vha. en gjærstamme transformert med minst en vektor som tillater koekspresjon av et protein med delta-5,7sterol, delta-7 reduktase aktivitet og P450SCC og eventuelt aktivitetene til ADR og ADX.

Foreliggende oppfinnelse gjør det mulig å gjennomføre steroidsyntese ved fermentering av genetisk modifiserte gjærstammer i nærvær av en enkelt karbonkilde. Metoden som tilveiebringes ifølge oppfinnelsen gjør det derfor mulig å oppnå en stor mengde av steroider av interesse, til lavpris, fordi metoden benytter fermentering av gjær og tilsetning av en enkelt karbonkilde som er lett tilgjengelig kommersielt.

Definisjoner:

I henhold til oppfinnelsen er uttrykket "enkel karbonkilde" ment å bety karbonkilder som kan benyttes av fagmannen på området for den normale dyrking av en gjær. Uttrykket er spesielt ment å angi de forskjellige assimilerbare sukkere som glukose, galaktose eller sukrose, eller melasser eller biproduktene av disse sukkere. En høyst spesielt foretrukket enkel karbonkilde er etanol og glyserol.

I henhold til oppfinnelsen er uttrykket "steroidderivat" ment å angi en forbindelse som kan oppnås, særlig ved én eller to enzymatiske eller kjemiske reaksjoner, fra nevnte steroider. Det er særlig ment å angi acetylerte eller hydroksylerte steroider eller steroider som bærer en substituent som et halogenert (fluor, jod) derivat eller en metylgruppe.

Det er forskjellige typer problemer som må løses for å være i stand til å fremstille steroider i en mikroorganisme: det er tilrådelig å eliminere de parasittiske reaksjoner som kan observeres på

grunn av nærvær av endogene enzymer i den valgte mikroorganisme,

det er tilrådelig å innføre genene for modifisering av syntesemellomproduktene slik at ekspresjonsnivåene som oppnås, er så nær som mulig de nivåer som

observeres i pattedyr. Således er gjenskapning av den korrekte balanse en viktig betingelse for at et slikt prosjekt skal være vellykket,

det er tilrådelig å oppnå et ekspresjonsnivå for de forskjellige gener som gjør det

mulig fortrinnsvis å styre biosyntesen mot det valgte steroid.

Steroidsyntese er en serie ekstremt komplekse reaksjoner som involverer flere enzymer for å oppnå kortisol fra kolesterol.

20,22-dihydroksykolesterol skulle først fremstilles og så overføres til pregnenolon, dette hydroksylerte til 17a-hydroksypregnenolon. Dette transformeres så til 17a-hydroksyprogesteron som gir deoksykortisol som i sin tur fører til kortisol (hydrokortison).

En alternativ vei omfatter fremstilling av pregnenolon og så av progesteron, transformert til 17oc-hydroksyprogesteron.

Det er vist at pregnenolon kan produseres i gjær fra en enkelt karbonkilde (Dupont et al., 1998, hvortil det vises når det gjelder detaljer). For å gjennomføre dette var det nødvendig å deletere en endogen vei (ved disrupsjon av A22-steroldesaturase(ERG5)-genet av den endogene ergosterolbiosyntesevei) for å oppnå en akkumulering av C-22-mettede produkter. Spesielt skiller den ergosterol som vanligvis produseres av gjær, seg fra kolesterol ved en umettethet ved C-7(8) i B-ringen, en umettethet ved C-22 og en ytterligere metylgruppe ved C-24. Således kan produktene som er mettet ved C-22 og C-7 i B-ringen benyttes som substrater av enzymene i kortisolfremstillingskjeden.

Foreliggende oppfinnelse gjør det mulig å syntetisere steroider og særlig steroider som er lokalisert lengre nedstrøms enn pregnenolon ganske enkelt ved fermentering av genetisk modifiserte gjærstammer i nærvær av en enkel karbonkilde. I en spesiell ut-førelsesform av oppfinnelsen blir de syntetiserte steroider skilt ut i et dyrkingsmedie, noe som forenkler rensingen. Metoden som tilveiebringes ifølge foreliggende oppfinnelse, gjør det derfor mulig å oppnå en stor mengde steroider av interesse, til lavpris, fordi metoden benytter fermentering av gjær og tilsetning av en enkel karbonkilde som er lett tilgjengelig kommersielt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter Genetisk modifisert gjærstamme som fra en enkel karbonkilde autonomt produserer et steroid eller steroidderivat, avledet fra kolesterolmetabolisme, der nevnte steroid eller steroidderivatet er inkludert i gruppen bestående av pregnenolon, 17a-hydroksypregnenolon, kortisol, korteksolon, progesteron, 17a-hydroksyprogesteron og deres acetylerte eller hydroksylerte derivater eller derivater som bærer et halogenert derivat eller en metylgruppe, kjennetegnet ved at den utviser en inaktivering av de endogene ATF2, GCY1 og YPR1 genene.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også fremgangsmåte for fremstilling av et steroid, kjennetegnet ved at den omfatter fermentering av en gjærstamme i følge ett av kravene 1 til 25 ved tilstedeværelse av en enkel karbonkilde og deretter gjenvinne de produserte steroider.

Videre omfatter oppfinnelsen farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter en gjærstamme som angitt i ett av kravene 1 til 25.

Fortrinnsvis er steroidene som kan fremstilles av gjærstammen ifølge oppfinnelsen,

steroider som er inkludert i kortisolsynteseveien som angitt ovenfor. Det er også mulig å fremstille andre typer steroider fra 17oc-hydroksypregnenolon, særlig dihydroepiandro-steron (DHEA), ved innvirkning av enzymet 17a-hydroksylase og lyase, og de avledede steroider (androstendioner, testosteron og så videre). Disse steroider kan fremstilles ved å innføre de egnede enzymer i gjærstammen på samme måte som for stammen som er eksemplifisert ifølge oppfinnelsen.

For å gjennomføre metoden ifølge oppfinnelsen angår foreliggende oppfinnelse også en genetisk modifisert gjærstamme som produserer et steroid eller et steroidderivat og som karakteriseres ved at den tillater autonom produksjon fra en enkel karbonkilde.

Det faktum at produksjonen gjennomføres autonomt betyr at det ikke er noe behov for å tilsette substrater for å oppnå steroidet av interesse, slik at gjæren kan produsere det kun ut fra den enkle karbonutgangskilde. Det er også klart at stammen kan produsere et steroid av den metabolske vei ved bruk av et substrat som er lokalisert oppstrøms i den metabolske vei, i den grad gjærstammen ifølge oppfinnelsen inneholder alle de gener som er nødvendige for å fullføre den metabolske vei for steroidproduksjon.

Fortrinnsvis produserer gjærstammen ifølge oppfinnelsen et steroid eller steroidderivat som er et derivat av kolesterolmetabolisme, det vil si som er en del av den metabolske kolesterolkjede. Kolesterolmetabolisme er vel kjent for fagmannen og er forklart i bio-kjemiske og endokrinologiske publikasjoner.

Således er fortrinnsvis nevnte steroid eller steroidderivat spesielt inkludert i gruppen bestående av 17a-hydroksypregnenolon, kortisol, kortison, korteksolon, 17a-hydroksyprogesteron og derivater av disse steroider.

Det er også mulig å fremstille pregnenolon og progesteron med en gjærstamme ifølge oppfinnelsen.

Således er en gjenstand for oppfinnelsen spesielt en genetisk modifisert gjærstamme

som autonomt, ut fra en enkelt karbonkilde, produserer et steroid eller et steroidderivat, avledet fra kolesterolmetabolisme, og som karakteriseres ved at steroidet eller steroidderivatet er inkludert i gruppen som omfatter 17a-hydroksypregnenolon, hydrokortison, korteksolon, 17a-hydroksyprogesteron og derivater av disse steroider.

Slik det skal forklares senere har gjærstammen ifølge oppfinnelsen minst én genetisk modifikasjon valgt blant en gruppe bestående av disrupsjon eller inaktivering av et endogent gen, modifisering av promoteren for et endogent gen, duplikering av et endogent gen, og innføring av minst ett heterologt gen, i én eller flere kopier, episomalt eller kromosomalt.

Videre er det fordelaktig at gjærstammen ifølge oppfinnelsen har en kombinasjon av nevnte genmodifikasjoner.

Som forklart senere kan gjærstammen ha minst én disrupsjon av et endogent gen valgt fra gruppen bestående av ERG5, ATF2, GCY1, YPR1, ARE1, ARE2, ATF1 og ADE2.

I en foretrukket utførelsesform har gjærstammen ifølge oppfinnelsen en disrupsjon av de endogene gener ERG5, ATF2, GCY1 og YPR1. Som beskrevet senere koder disse gener proteiner som induserer parasittiske reaksjoner i gjæren.

Når det gjelder ADE2-genet kan dette også eventuelt være disruptert, særlig for å integrere et heterologt gen i gjærstammen.

I én utførelsesform har gjærstammen ifølge oppfinnelsen minst ett heterologt gen integrert i kromosomet ved minst én lokasjon valgt blant ADE2, HIS3, TRP1, LEU2, GCY1, ATF2 og YPR1, idet integreringen er gjennomført intragenisk eller intergenisk i umiddelbar nærhet av ett av de angitte loci.

I én utførelsesform av oppfinnelsen har nevnte gjærstamme minst ett heterologt gen lokalisert på et multikopiplasmid eller et lavkopiplasmid, idet multikopiplasmidet er valgt blant gjær 2-mikron-replikonbaserte plasmider som replikerer i Saccharomyces cerevisiae og nevnte lavkopiplasmid er valgt blant plasmider basert på en kromosomal ARS-replikasjonsopprinnelse med en gjærsentromer.

For å implementere en utførelsesform av oppfinnelsen og som beskrevet nærmere nedenfor, har gjærstammen ifølge oppfinnelsen minst ett heterologt gen eller cDNA valgt fra gruppen omfattende genet av sterol A7-reduktase og av cDNA'ene av cytokrom P450 SCC, av adrenodoksin, av adrenodoksinreduktase, av cytokrom b5, av 30-hydrosteroiddehydrogenaseisomerase, av cytokrom P450-reduktase, av cytokrom P450 Cl7, av cytokrom P450 C21 og av cytokrom P450 Cl 1 og av sekvensene som koder disse proteiner.

Disse heterologe gener eller cDNA'er er under kontroll av en promotersekvens valgt fra gruppen bestående av de endogene gjærpromotersekvenser TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GAL 10, ATF2, TIR1, ARH1 og ADE2, og hybridpromoteren GAL10-CYC1.

Det er nødvendig å benytte en terminatorsekvens for et hvilket som helst heterologt gen eller cDNA som innføres, fortrinnsvis valgt blant terminatorsekvensene av de endogene gener PGK1, CYC1, ATF2, ADE2 og NCP1.

Ekspresjonskassetter eller blokker oppnås så bestående av en promoter, det heterologe gen [eller cDNA, eventuelt kodende det mature protein foregått av ATG-kodonet som koder metionin (Met-Mat) eller koder et fusjonsprotein som eventuelt har signaler for å adressere de cellulære rom] og en terminatorsekvens.

I én utførelsesform har gjærstammen ifølge oppfinnelsen den sterol-A7-reduktase-heterologe ekspresjonsblokk integrert i kromosomet ved ADE2-lokus.

I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen omfatter gjærstammen minst én kassett for ekspresjon av gener som koder P450sccog adrenodoksinkofaktor av P450scc, lokalisert på et høykopiplasmid, og det omfatter en kassett for ekspresjon av adrenodoksin-reduktasekofaktor av P450scc, lokalisert på et enkelt kopiplasmid eller et lavkopiplasmid eller integrert i kromosomet. Fortrinnsvis inneholder disse ekspresjonskassetter det mature protein foregått av et metionin, og proteinet er lokalisert i cytosolen.

I én utførelsesform omfatter gjærstammen minst én ekspresjonskassett valgt blant kassettene for ekspresjon av 3p-hydrosteroiddehydrogenaseisomerase, av cytokrom P450cl7 eller cytokrom P450c21, lokalisert på et høykopiplasmid eller et lavkopiplasmid eller integrert i kromosomet.

I en spesiell utførelsesform omfatter gjærstammen ifølge oppfinnelsen minst én ekspresjonskassett for P45011P, lokalisert på et multikopiplasmid, idet proteinet som fremstilles, har et signal for adressering til mitokondria og/eller minst én ekspresjonskassett for adrenodoksinkofaktor av P4501ip, lokalisert på et multikopiplasmid, med en svak promoter (det vil si hvis styrke er relatert til den til CYCl-promoteren), der proteinet som fremstilles, har et signal for adressering til mitokondria. Fortrinnsvis fremstilles proteinene i form av en forløper med et homologt eller heterologt signal for adressering til mitokondria, idet proteinene tar sin mature form i det cellulære rom.

Det er derfor interessant å merke seg at i en spesielt foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir to kopier av genet som koder adrenodoksin, innført i gjærstammen der ett av disse er ment for å uttrykke proteinet i cellens cytosol og det andre fremstilles slik at det mature protein er i mitokondria.

I en spesiell utførelsesform omfatter gjærstammen også minst én ekspresjonskassett (ekspresjonspromoter som nevnt ovenfor med den kodende del av NCP1-, ATR1-og/eller ATR2-genet, med sin egen terminator eller terminator som definert ovenfor) lokalisert på et multikopiplasmid eller et lavkopiplasmid eller integrert i kromosomet. Ekspresjonskassettene for NCP1, ATR1 og ATR2 kan særlig være integrert i NCP1-locus av S. cerevisiae.

I en spesiell utførelsesform uttrykker gjærstammen ifølge oppfinnelsen også ARHlp-proteinet, en proteinhomolog til mammalsk adrenodoksinreduktase i gjær, i et nivå høyere enn det fysiologiske ekspresjonsnivå. Overekspresjon av dette protein kan oppnås ved bruk av teknikker som er velkjente for fagmannen, for eksempel ved innføring av en ny ekspresjonskassett (ekspresjonspromoter, kodende del av ARH1-genet med sin egen terminator eller en terminator som definert ovenfor), i tillegg til det endogene gen, i gjæren. Overraskende har man kunnet påvist at ekspresjonen av ARH1-genet i et nivå høyere enn det fysiologiske ekspresjonsnivå, signifikant øker mengden steroider som fremstilles. Imidlertid bør denne ekspresjonen ikke være for høy til å oppnå den ønskede effekt. Hvis således en ekspresjon av ARH1-proteinet i et nivå høyere enn det fysiologiske nivå er ønskelig, bør man passe på ikke å overuttrykke dette protein for sterkt da det ellers er en risiko for å miste økningen i produksjonen av steroider.

Gjærstammen ifølge oppfinnelsen kan være polyploid, diploid, haploid eller aneuploid av art, uten at dette har noe å si for implementering av oppfinnelsen.

Det er foretrukket en stamme av Saccharomyces cerevisiae, særlig avledet fra én av stammene FY 1679-28c og FY 1679-18b som er sporer av stammen FY 1679, deponert ved ATCC under nummeret 96604.

En gjærstamme som karakteriseres ved at den er stammen CDR07 MAT-oc eller TGY260, er inngitt til CNCM den 24. januar 2001, under de respektive tilgjengelighetsnummer 1-2616 og 1-2615. Det er også mulig å skaffe tilveie en stamme oppnådd etter kryssing av CDR07 Mat-a og TGY260 og eventuelt sporulering og transformering med et plasmid fra gjær, særlig stammene UCY2 og UCY4 og stammene UCY3 og UCY26 som beskrevet ifølge foreliggende oppfinnelse. Videre kan også gjærstammer oppnås etter kryssing av UCY2 og TGY245, og eventuelt sporulering og transformering med minst ett plasmid fra gjær, særlig stammene UCY5, UCY6, UCY16, UCY19, UCY20, UCY24, UCY25 og UCY26, som allerede er beskrevet.

Det er brukbart at gjærstammen ifølge oppfinnelsen har elementene som er nødvendig for å skille ut steroidet produsert i kulturmediet for derved å forenkle rensing av sluttproduktet.

Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for fremstilling av et steroid som karakteriseres ved at den omfatter fermentering av en gjærstamme ifølge oppfinnelsen i nærvær av en enkel karbonkilde og gjenvinning av de produserte steroider.

Til slutt angår oppfinnelsen også et farmasøytisk preparat omfattende en gjærstamme ifølge oppfinnelsen, eventuelt med en farmasøytisk akseptabel eksipient, idet en slik eksipient er vel kjent for fagmannen på området.

Blant gjærstammene ifølge oppfinnelsen som gir et steroid autonomt fra en enkel karbonkilde, er det også mulig å oppnå dette med kolesterol eller en relatert struktur, eller et substrat som allerede er til stede som et kolesterolderivat, for å oppnå produktene lokalisert nedstrøms. Muligheten for å være i stand til å tre inn på et hvilket som helst trinn og særlig ved pregnenolonnivået eller senere i den metabolske vei av det ønskede steroid, gjør det derfor mulig særlig å være i stand til å tilveiebringe gjæren med unaturlige substrater som fører til syntese av unaturlige og substituerte steroider og særlig fluorerte steroider.

Gjærstammen ifølge oppfinnelsen gjør det spesielt mulig å fremstille det ønskede steroid (særlig kortisol) i en mengde større enn rundt 10 mg/l, og fortrinnsvis større enn 50 mg/l, helst 80 mg/l, aller helst 100 mg/l og helt spesielt 200 mg/l.

Steroidet av interesse (fortrinnsvis hydrokortison) kan være til stede i en andel større enn 20 %, helst 25 %, aller helst 30 %, spesielt 35 %, mer spesielt 40 %, mer spesielt 50 % og spesielt foretrukket 65 %, av de totale steroider som produseres av stammen ifølge oppfinnelsen (spesielt syntesemellomproduktene).

For at det skal være mulig for gjærstammen ifølge oppfinnelsen å produsere steroidene av interesse, er det nødvendig å ha genetiske modifikasjoner. Gjærstammen ifølge oppfinnelsen har således minst én genetisk modifikasjon valgt fra gruppen bestående av disrupsjon eller inaktivering av et endogent gen, modifikasjon av promoteren av et endogent gen, duplikering av et endogent gen, og innføring av ett heterologt gen (særlig en ekspresjonsblokk med homolog promoter og/eller terminator og en heterolog kodende del) i én eller flere kopier, episomalt eller kromosomalt.

Fortrinnsvis har gjærstammen ifølge oppfinnelsen flere (minst fire) genetiske modifikasjoner som angitt ovenfor.

Således blir noen endogene gener av gjæren på gunstig måte inaktivert eller disruptert. Genene kan inaktiveres eller disrupteres ved at det i den kodende sekvens innføres et eksogent gen (særlig en ekspresjonsblokk med homolog promoter og/eller terminator og en heterolog kodende del) som beskrevet nedenfor, og/eller en valgbar markør. Det er også mulig å modifisere promoterene til disse gener for å redusere ekspresjonsnivået.

Gjærgenet ATF2 (Cauet et al., 1999) koder en acetyltransferase som benytter pregnenolon som substrat og disruptering av denne gjør det mulig å eliminere denne parasittiske acetyleringsreaksjon hvis produkt ikke kan benyttes, og derved å øke utbyttet av det ønskede steroid. Således kan utbyttene multipliseres med verdier mellom 3 og 7 etter inaktivering av ATF2-genet.

GCY1- og YPR1-genene koder aldo-keto-reduktaser. Disse gener blir fordelaktig inaktivert eller disruptert. Disse to gener er del av en familie på 6 mer eller mindre homologe gener, der alle seks antas å kode aldo-keto-reduktaser. Imidlertid er produktene av disse gener de mest aktive på substratene det her tas sikte på, særlig GCY1, og inaktivering er derfor ekstremt fordelaktig for å oppnå hydrokortison.

Som spesifisert ovenfor er det fordelaktig å inaktivere ERG5-genet for å akkumulere et substrat som har en struktur så nær kolesterolstrukturen som mulig. Imidlertid har det vist at gjæren ifølge oppfinnelsen ikke desto mindre kan produsere steroidene av interesse på tross av aktiviteten av dette gen. For imidlertid å optimalisere utbyttene kan det være nyttig å inaktivere mutering, deletering og/eller innskyting.

Det er også mulig, uten at dette er absolutt essensielt for den totale suksess for steroid-produksjonen med gjæren ifølge oppfinnelsen, å inaktivere andre gener, som ARE1, ARE2, ADE2 eller ATF1. Disse genene koder alle proteiner hvis fravær kan forbedre det totale utbytte av syntesen av det ønskede steroid.

Som beskrevet i artikkelen av Duport et al., supra (Duport et al., 1998), er det antydet at nærværet av en ekspresjonsblokk med homolog promoter og/eller terminator og en sekvens som koder A7-reduktase, er nyttig idet den gjør det mulig å desaturere 7-8 dobbeltbindingen av ergosterol og dennes derivater og derved å oppnå én eller flere forløpere med en struktur nærmere strukturen til kolesterol, utgangssubstratet for fremstillingen av pregnenolon. Således er det fordelaktig at gjærstammen ifølge oppfinnelsen inneholder denne ekspresjonsblokk. I et spesielt tilfelle blir blokken for ekspresjon av A7-reduktase integrert i gjærens genom, fortrinnsvis på lokasjonen for ADE2-genet, ved de samme midler som fører til disrupsjon av ADE2-genet. Promoteren som benyttes for transkripsjon, er en induserbar promoter som GAL10-CYC1, eller en konstitutiv promoter, som GAL10-GAL10-CYCl-promoteren som er disruptert i stammen CA10 som beskrevet av Duport et al., 1998. Proteinet som benyttes, stammer fortrinnsvis fra Arabidopsis thaliana (men kan også avledes fra et pattedyrspesies), idet det angjeldende cDNA er klonet i den native form (komplementær DNA akkurat etter en translasjonsinitieringsmetionin) og under kontroll av en transkripsjonsterminator som er konvensjonell i gjær, som PGK1.

Det skal videre påpekes at aktiviteten av A7-reduktasegenet i gjær har vært beskrevet av Lecain et al., 1996, når det gjelder detaljer, særlig det tekniske innholdet (særlig sekvensene av A7-reduktasegenet og konstruktene og prosedyrene), henvises det dit. Det første trinn er produksjonen av pregnenolon, oppnådd etter innføring i gjæren av enzymene for normal transformering av kolesterol til pregnenolon. I det herværende tilfellet er dette enzymet for spalting av sidekjeden (P450sccfor sidekjedespalting) med to koenzymer (adrenodoksin, ADX, og adrenodoksinreduktase, ADR). Transformer-ingen av gjæren med disse respektive ekspresjonsblokker, er beskrevet i Duport et al., 1998,supra).

Et komplementært DNA som koder de mature proteiner med et metionin satt til den N-terminale ende for å tillate translasjon, benyttes med fordel. Promotere som GAL10-CYCl-hyridpromotere eller TEFl-promoteren benyttes for å sikre transkripsjon av cDNAene. Konvensjonelle terminatorer og særlig PGKl-terminatoren, benyttes.

De forskjellige cDNA'er som koder P450scc-, ADR- eller ADX-proteinene, kan være av vertebrat opprinnelse, for eksempel human eller bovin opprinnelse, men også rotte eller fisk. Genene som koder disse proteiner, plasseres fortrinnsvis på plasmider; for P450sccog ADX, et multikopi-, lavkopi- eller høykopiplasmid, særlig avledet fra et 2 mikron gjærplasmid som foretrukket, mens et enkelt kopiplasmid eller en lavkopiplasmid heller benyttes for ekspresjon av ADR. Ekspresjonsblokken for ADR kan også integreres i kromosomet til gjæren. Dette gjør det mulig å kontrollere ekspresjonen av ADR, fordi det synes som om for mye ekspresjon skader den ønskede scc-aktivitet.

Proteinene uttrykkes fortrinnsvis slik at de er i stand til å utøve sin aktivitet i cytosolen.

Det følgende trinn er konverteringen av pregnenolon til 17a-hydroksyprogesteron, ved den kombinerte innvirkning av 17a-hydroksylase (P450cl7) og 3p-hydroksysteroiddehydrogenase (3p-HSD).

For å uttrykke disse to proteiner benyttes det fortrinnsvis sterke promotere som TEF1, TDH3 eller GAL10-CYC1. Imidlertid kan en svakere promoter som CYC1, også være egnet. De benyttede terminatorer er konvensjonelle og kommer særlig fra PGK1- eller NCP1-genene. De komplementære DNA'er som koder de komplette proteiner, uttrykkes. Opprinnelsesspesies for disse proteiner synes ikke å modifisere de oppnådde resultater og det er derfor mulig å benytte proteiner av human opprinnelse (særlig det ene eller andre av de to isotyper av 3P-HSD), av bovin opprinnelse eller med opprinnelse i andre organismer (særlig fra fisk). For disse to proteiner er det et spørsmål om å oppnå den best mulige ekspresjon og de kan derfor uttrykkes på enkeltkopi- eller multikopi-, lavkopi- eller høykopiplasmider, eller ved å ha ekspresjonsblokkene integrert i minst ett kromosom av gjæren.

Konvertering av 17a-hydroksyprogesteron til deoksykortisol søkes deretter via P450c21 som tillater hydroksylering i posisjon 21. Det er et spørsmål om å uttrykke proteinet fra dets cDNA på den mest mulig effektive måte. For å gjøre dette benyttes en sterk promoter (TEF1, TDH3, GAL10-CYC1, etc.) eller sågar CYCl-promoteren, og en konvensjonell terminator (særlig PGK1) for å sette opp den transkripsjonelle enhet. Denne enhet anbringes på et enkeltkopi- eller multikopi-, lavkopi- eller høykopi-plasmid, eller integreres i gjærens genom. Det skal påpekes at opprinnelsesspesies synes å være viktige i dette tilfellet og at det er foretrukket å benytte P450c21 av human opprinnelse.

Deoksykortisolet konverteres så til kortisol under innvirkning av P450cl 1 -systemet som inneholder P450cl 1 og tillater hydroksylering i 11-P-posisjonen og et adrenodoksin og en adrenodoksinreduktase som kofaktorer.

Foreliggende oppfinnere har vist at resultatene som oppnås, er bedre når dette gjær-system uttrykkes i den indre membran av gjærmitokondria. Således er det fordelaktig å produsere fusjonsproteiner som, som forløper, bærer den mitokondrialadresserende sekvens av gjær-Cox6p-proteinforløperen.

Det cDNA som koder det mature protein, benyttes også med fordel. P450cl 1 -proteinet er således proteinet av human eller bovin opprinnelse eller et humanbovinhybridprotein. Det sist nevnte konstrukt er den foretrukne form for implementering av oppfinnelsen. Genet som benyttes i den transkripsjonelle enhet, er fortrinnsvis under kontroll av CYCl-promoteren. Det er fordelaktig å anbringe et kanin P-globinintron og en terminator av humant veksthormongen i posisjon 3' av den kodende sekvens. Den transkripsjonelle enhet plasseres fortrinnsvis på et multikopiplasmid.

Adrenodoksinet benyttes i sin mature form, anbrakt med en sekvens for adressering til mitokondria, for eksempel valgt fra Cox6p-, Cox4p-, fumarase-, ARHlp- og F9 ATPase-proteiner, og under kontrollen av en promoter særlig valgt fra TDH3, TEF1 og CYC1. Et protein av bovin eller human opprinnelse foretrekkes. En terminator som kan være PGK1, bør plasseres i den transkripsjonelle enhet. Ekspresjonsblokken uttrykkes fortrinnsvis fra et multikopiplasmid.

Proteinet som virker som en adrenodoksinreduktase, er ARHlp-protein, et endogent gjærprotein, som vanligvis uttrykkes i vertens mitokondria. Fortrinnsvis blir imidlertid gjæren transformert på en slik måte at vertsstammen inneholder en naturlig kopi av ARH1-genet og en andre kopi av ARH1-genet under kontroll av CYCl-promoteren. Aktiviteten for dette protein er essensiell for å oppnå den ønskede effekt og det er også observert at inaktivering av genet er letalt for gjæren (Lacour et al., 1998). Det skal påpekes at overekspresjon av dette gen synes å være toksisk for organismen og at promoteren som velges, derfor bør tillate et ekspresjonsnivå som fører til den ønskede 11-P-hydroksylaseaktivitet uten å være skadelig for gjæren. Overraskende er det således påvist at ekspresjonen av ARH1-genet ved et nivå høyere enn det fysiologiske ekspresjonsnivå, signifikant øker mengden av produserte steroider. Som imidlertid nevnt ovenfor bør denne ekspresjon ikke være for stor til å oppnå den ønskede effekt. Hvis således ekspresjonen av ARH1-proteinet ved et nivå større enn et fysiologisk nivå er ønskelig, bør man passe på ikke å overuttrykke dette proteinet for sterkt da det ellers er en risiko for å miste økningen i produksjonen av steroider. Som eksempel gir integrering av ekspresjonskassetten for ARH1, omfattende som promoter CYCl-promoteren, ved LEU2-lokasjonen av S. cerevisiae, tilfredsstillende nivåer av ekspresjon og resultater. På den annen side gir integrering på samme lokasjon av en kassett omfattende TEF1 -promoteren, erkjent som meget sterkere enn CYCl-promoteren, mindre fordelaktige resultater.

Således innføres fortrinnsvis to kopier av en transkripsjonen enhet som koder ADX-koenzymproteinet, der ett har en aktivitet utenfor mitokondria og særlig i cytosolen, og den andre har en aktivitet i vertscellens mitokondria.

Det er også mulig å innføre andre gener, særlig gener som koder proteiner med NADPH P450-reduktaseaktivitet, som NCP1 (gjærreduktase også kalt CPR1), ATR1 eller ATR2 (plantereduktaser) eller human reduktase. Disse proteiner forbedrer P450cl7- og P450c21 -aktivitetene. Enten benyttes den endogene promoter (NCP1) eller DNA'ene som koder proteinene, plasseres under kontroll av promotere som GAL10-CYC1, CYCl,TEFl,etc.

Det er også mulig å innføre TGL1-genet som koder et protein med deforestrings-aktivitet, under kontroll av en sterk promoter som GAL10-CYC1, eller et multikopi-eller enkeltkopiplasmid. Dette gjør det mulig å redusere effekten av parasittiske reaksjoner ved sterolforestringen som kan forbli selv etter inaktivering av ATF2, og særlig de som dannes av produktet av ARE1- og ARE2-genene.

Det er også mulig å tilføye et plasmid som uttrykker cytokrom b5 fra gjær eller andre spesies, som er en kofaktor i flere av de reaksjoner som er definert ovenfor.

Når det er ønskelig å produsere DHEA er det også mulig å innføre et lav- eller høykopi-plasmid som koder desmolase (P450 17a), under kontroll av en promoter som GAL10-CYC1, CYC1 eller TEF1 med en PGK1-terminator.

Det er også mulig å innføre en cDNA som koder cytokrom P450cl7 med lyaseaktivitet, for eksempel den av human opprinnelse, i nærvær av et overskudd av NADPH P-450-reduktase, for eksempel mammal reduktase, NCP1, ATR1 eller ATR2. Disse transkripsjonelle enheter benytter fortrinnsvis en sterk promoter.

Til slutt er det mulig å gjenopprette aktiviteten av de endogene ERG6- og ERG2-gener, inhibert av pregnenolon, ved å anbringe dem under kontroll av en sterk konstitutiv promoter.

Det er også mulig å innføre andre heterologe gener, særlig som koder et protein med 24,25-sterolreduktaseaktivitet, eller HMG1-genet, som er til stede i den syntetiske vei med kolesterol hos mennesker. Det er også fordelaktig å innføre det humane MDR1-genet som koder en pumpe som ikke inhiberes ved akkumulering av de abnormale steroler som opptrer på grunn av inhibering av ERG6-genet på grunn av pregnenolon. Dette gjør det mulig å avvise disse produkter der en for stor akkumulering kan vise seg å være toksisk for vertscellen.

Det er også mulig å overuttrykke gjær-PDR12-genet som vil ha en detoksifiserende effekt for steroidene som kan inhibere gjærveksten.

Det er klart at når man henviser til "gen" ovenfor, er det ment å bety ikke bare det DNA-fragment som koder proteinet med den ønskede aktivitet (og særlig cDNA-fragmentet som representert særlig i de mature former), men også promoterene (særlig TEF1, GAL10-CYC1, CYC1, TDH3) og terminatorene (særlig PGK1). Disse transkripsjonelle enheter innføres fortrinnsvis på lav- eller høykopiplasmider eller integreres i gjærens kromosom.

Det skal også være klart at avhengig av det ønskede formål og særlig steroidet man ønsker å fremstille, er det mulig å innføre kun noen av genene som koder de forskjellige proteiner i hvert trinn og å utstyre gjæren med et intermediat for å oppnå et steroid som er nedstrøms i den metabolske kjede.

Det er også lett ikke å innføre genene for å oppnå produktene lokalisert nedstrøms og derfor å være i stand til å stanse relativt høyt i den metabolske kjede.

Gjæren som benyttes for å implementere oppfinnelsen er fortrinnsvis: FY1679-28c-stammen, beskrevet i Duport et al., 1988, som har genotypen (MATa, rho", ura3-52, trplA63, leu2Al, his3A200, GAL2, fenl). Denne stamme er også beskrevet av Thierry et al., 1990;

FY1679-18b-stammen med genotypen (MATa, rho", ura3-52, tipl A63, leu2Al,

his3A200, GAL2, fenl).

Disse to stammer har derfor en identisk genotype og et motsatt fortegn.

Beskrivelse av figurene

Figur 1: Diagrammatisk representasjon av en biosyntetisk vei for hydrokortison

som kan oppnås ifølge oppfinnelsen.

Figur 2: Diagrammatisk representasjon av konstruksjonen av gjærstammer

eksemplifisert ifølge oppfinnelsen.

Figur 3: Kart for plasmidet pCV29. PGK-term: PGK-terminator. GALI 0/CYC1 -

rom: GALI0/CYC1-promoter. HGH-term: terminator av humanvekst-hormongenet. Intron p-globin: intron av kanin P-globingenet. CYC1-prom: CYC1 -promoter. PGK-term: PGK-terminator S. cerevisiae 2-mikron: 2-mikron replikasjonsopprinnelse av S. cerevisiae. Cox6pre:

presekvens av cytokromoksidasesubenhet 6. Bovin/human P450 11 (3: bovin/humanfusert cDNA av P4501 ip. mat-ADX: matur form av ADX med et NH2-terminalt metionin. E. coli-replikon: E. co/i'-Replikon. Figur 4: Kart for plasmidet pCCl2. CYC1 -prom: CYC1 -promoter. PGK-term: PGK-terminator. ARS CEN: S. cerevisiae kromosomal replikasjonsopprinnelse. E. coli-replikon: E. cø//-Replikon. TDH3-prom: TDH3-

promoter. 3P-HSDH: 3p-hydroksysteroiddehydrogenase cDNA. matADR: matur form av ADR forutgått av et metionin.

Figur 5: Kart over plasmid pFMlO. CYClp: CYC1 -promoter. P4501 ip: bovin/-

humanfusert cDNA av P4501 lp. ADE2: gjær-ADE2-gen. TDH3p: TDH3-promoter. 3P-HSD: 3p-hydroksysteroiddehydrogenase cDNA. RI: rekombinasjonsbase, hvis sekvens er gitt i SEKV.ID. NR. 39. GALlO/CYClp: GALI 0/CYC 1-promoter. matADX: cDNA som koder den mature form av ADX. URA3: gjær URA3-gen. P450scC: cDNA som koder den mature form av P450scc(CYP11 Al). 2-mikronopprinnelse: 2-mikron replikasjonsopprinnelse av S. cerevisiae. R2: rekombinasjonsbase hvis sekvens er gitt i SEKV.ID. NR. 40.

EKSEMPLER

Eksemplene nedenfor beskriver en utførelsesform av oppfinnelsen og skal ikke anses som begrensende for den.

For konstruksjonene benyttes FY1679-28c- og FY1679-18b-gjærstammene som beskrevet ovenfor, som utgangsmaterialer.

Eksempel 1

Disrupsjon av YPRl-genet

Konstruktet omfattende interrupsjon av YPRl-genet (YDR368w) med URA3-genet i plasmidet pPOLYIII, ble oppnådd ved 4 suksessive PCR'er. Først ble tre uavhengige PCR'er gjennomført for å oppnå 5'-delen av YPRl-genet (PCR 5), det funksjonelle URA3-gen kantet av YPR1-sekvenser (PCR 6), og 3'-delen av YPRl-genet (PCR 7).

Dette PCR5-DNA ble oppnådd ved forsterking på en genomisk DNA-matriks med oligonukleotidene OTG11314 (SEKV.ID. NR. 1) og OTG11315 (SEKV.ID. NR. 2) og tilsvarende oppnås PCR7-DNA ved forsterking ved bruk av oligonukleotidene OTG11316 (SEKV.ID. NR. 3) og OTG11317 (SEKV.ID. NR. 4) på den samme matriks.

URA3-genet flankert av 5'- og 3'-YPRl-området forsterkes ved bruk av oligonukleotidene OTG11463 (SEKV.ID. NR. 5) og OTG11464 (SEKV.ID. NR. 6) på en matriks pTG10054 som beskrevet av Degryse et al., 1995, hvortil det vises når det gjelder detaljer hva angår beskrivelsen av dette plasmid.

Produktene av PCR5, PCR6 og PCR7 ble blandet på ekvimolekylær måte og så forsterket ved PCR ved bruk av oligonukleotidene OTG11314 (SEKV.ID. NR. 1) og OTG11317 (SEKV.ID. NR. 4) for å oppnå et produkt av PCR8.

Dette PCR8-produkt ble kuttet med Xhol-enzymet og så subklonet inn i plasmidet pPOLYIII (beskrevet av Lathe et al., 1987, og det henvises dit særlig når det gjelder beskrivelse av plasmidet) kuttet med Xhol for å gi plasmidet pTG12011. Orienteringen av innskuddet i plasmidet pPOLYIII ble bestemt ved kutting med Ncol- og EcoRI-enzymene.

Plasmidet pTG12011 som tillater disrupsjon av det parasittiske YPRl-gen med URA3-genet, kuttes med Xhol-enzymet. Produktet fra restriksjonskuttingen benyttes for å transformere FY1679-18b-stammen ved bruk av den for fagmannen vel kjente litiumkloridmetode. Transformantene velges på et uracilfritt medium. Transformantene analyseres ved PCR-amplifisering ved bruk av oligonukleotidene som ble benyttet for å konstruere plasmidet pTG12011.

Klonene som er positive i denne test, avsøkes så ved den nedenfor beskrevne 170H-progesteron-biokonverteringsmetode i nærvær av glukose, som karbonkilde. Kapasiteten for biokonversjon analyseres ved HPLC som beskrevet av Dumas et al., 1996, og Degryse et al., 1999, og det vises til disse publikasjoner, særlig når det gjelder for-klaringer av biokonverteringsstudiene, eller som beskrevet av Kuronen et al., 1999. En klon, TGY195#4, velges for ytterligere karakterisering. TGY195#4-stammen transformeres ved bruk av både plasmid YRp7 (Parent et al., 1985, og det vises dit når det gjelder særlig beskrivelsen av dette plasmid) (1 ug) og 5 \ ig av plasmid pTG12045 (beskrevet nedenfor) kuttes med Noti. De transformerte stammer selekteres på et tryptofanfritt medium. Kolonier (678 kolonier) subdyrkes på et medium inneholdende tryptofan (for å eliminere plasmid YRp7) og på et medium inneholdende tryptofan og 5-fluororotat (5F0) for å selektere de kolonier som har tapt URA3-genet som interrupterer YPRl-genet.

Eksempel 2

Konstruksjon av forskjellige plasmider

For overekspresjon av P450c21 -proteinet i gjær ble det benyttet to typer promoter, TEF1 (transkripsjonsforlengelsesfaktor 1) ogTDH3 (glyceraldehyd-3-fosfatdehydro-genase 3). I alle tilfeller er transkripsjonsterminatoren PGK-terminatoren. I disse plasmider bærer Sali, Mlul-fragmentet det humane P450c21-cDNA.

a) Konstruksjon av plasmidene pTG10470 og pTG10469

Plasmidet pTG10289 ble oppnådd med modifisering av pMAc21 (Wu et al., 1991) ved

kutting med Kpnl og Mlul og innføring av oligonukleotidet OTG5868 (SEKV.ID. NR. 27).

cDNA'et fra dette plasmidet kommer fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, USA) under betegnelsen pc21/3c. Det er 1,6 Kb EcoRI-BamHI-fragmentet som ble benyttet som en base for å konstruere de forskjellige plasmider. Modifikasjonene som ble innført, er beskrevet i artiklene ovenfor og i artiklene av Hu et al., 1990.

Ved denne prosedyre ble den ikke-kodende del av P450c21 av plasmidet pMAc21 som inneholder ekspresjonskassetten for p450c21, fjernet på samme måte som det der lokaliserte Kpnl-setet.

Plasmidet pTG10292 ble oppnådd ved overføring av human c21-cDNA (Sali, Mlul-fragment) av plasmidet pTG10289 til plasmidet pTG10031 (beskrevet hos Degryse et al., 1995, og det vises dit) ved bruk av Sali- og Mlul-setene.

Plasmidet pTG10475 ble oppnådd ved PCR og rekombinasjon. Ved å benytte plasmidet pTG10292, ble spesifikt et fragment av det humane P450c21-cDNA som representerer rundt 250 nukleotider, forsterket ved bruk av oligonukleotidene OTG7410 (SEKV.ID. NR. 7) og OTG5927 (SEKV.ID. NR. 8). Dette fragmentet representerer den kodende sekvens av human P450c21 av et Sall-sete og av sekvensen AAAA.

Dette fragment ble kuttet med Sali og så ligert på det lineære fragment av pTG10292 kuttet med Sali, og rekombinasjonsforsøket ble så gjennomført i BJ5183-stammen som beskrevet av Degryse et al., 1995.

Det oppnådde plasmid, pTG10475, bærer en P450c21-cDNA med en kodene sekvens identisk den til den naturlige cDNA, til forskjell fra plasmidet pMAc21, på et fragment kompatibelt med vektorene som vanligvis benyttes av oppfinnerne, det vil si et fragment kantet av Sali- og Mull-restriksjonssetene. Dette fragment har den følgende omgivelse rundt ATG-kodonet for translasjonsinitiering:

Ved bruk av dette plasmid ble Sall-MulI-fragmentet som bærer det humane p450c21-cDNA, overført til plasmidet pTG10158 (Degryse et al., 1995) ved konvensjonell kloning for å gi plasmidet pTG10472.

Dette samme Sall-MluI-fragment av plasmidet pTG10472 ble så overført ved konvensjonell kloning til plasmidet pTG10085 (Degryse et al., 1995) for å gi plasmidet pTG10469. Dette plasmid har derfor det humane P450c21-cDNA under kontroll av TEF1-promoteren med PGKl-terminatoren.

Dette samme fragment som bærer P450c21-cDNA på et Sali- og Mlul-restriksjons-fragment, overføres til plasmidet pTG10092 ved rekombinasjon i BJ5183-stammen for å gi plasmidet pTG10470 (Degryse et al., 1996).

Plasmidet pTG10470 bærer derfor det humane P450c21-cDNA under kontroll av TEF1-promoteren og av en PGK1-terminator med en URA3-d-seleksjonsmarkør med om-givelsen for ATG-initiatorkodonet som beskrevet ovenfor.

b) Konstruksjon av plasmidet pTG12036

Plasmidet pTG12036 ble konstruert i 4 trinn fra pTG10802. Plasmidet pTG10801 (som

er opprinnelsen for plasmidet pTG10802) er et plasmid av pUC-typen hvori en serie restriksjonsseter er skutt inn mellom Xhol- og Xhol-setene. Denne serie seter inkluderer Hindlll-, Snabl-, Clal- og Spel-setene.

Mellom Hindlll- og Clal-setene ble Hindlll-Clal-kassetten av pTG10470, omfattende TEF1-promoteren, det humane P450c21-cDNA og PGKl-terminatoren, skutt inn mellom Hindlll- og Clal-setene av pTG10801 for å gi pTG10802.

Dette plasmid ble så kuttet med Xhol og den innførte kassett er derfor deletert for å innføre et PCR-fragment kantet av Xhol-seter. Dette 2,5 Kb fragment kommer fra amplifisering med paret av oligonukleotider OTG11844 (SEKV.ID. NR. 10) og OTG11845 (SEKV.ID. NR. 11) på plasmidet pTG12010#40 (jfr. nedenfor) for å oppnå et fragment kantet av Xhol-seter, inneholdende GCY1-genet avbrutt ved hjelp av URA3-genet kantet i 5'-posisjon av et Clal-restriksjonssete.

Dette fragment ble klonet mellom Xhol-setene av plasmidet pTG10802, for å oppnå plasmid pTG12035. Plasmidet pTG12010#36 ble benyttet for å innføre det manglende Hindlll-setet. Dette plasmid er i det vesentlige identisk med pTG12010#40, men har et Hindlll-sete posisjonert 3' av URA3-genet ved grensen til GCY1-genet, men har ikke noen Clal-sete posisjonert 5' av URA3-genet ved skjøten med GCYl-genet (jfr- nedenfor). Ved rekombinasjon in vivo i E. coli mellom 2,2 Kb Ncol, BamHI-fragmentet som bærer fra 5' til 3' et fragment av URA3-genet, 3'-fragmentet av GCYl-genet og til slutt en del av plasmidet pTG12035, det vil si det store 4,45 Kb StuI-Aflll-fragment.

Plasmidet pTG12036 oppnås.

Det oppnådde plasmid pTG12036 har GCYl-genet avbrutt av URA3-genet kantet av Clal- og Hindlll-seter i 5'- hhv. 3'-posisjon. Dette fragment erstattes så med ekspresjonskassetten for P450c21 båret av 2,33 Kb Clal, Hindlll-rfagmentet på plasmidet pTG10469 (se ovenfor) for å oppnå plasmidet pTG12086.

c) Konstruksjon av plasmidet pTG12045

Det unike Sphl-setet av plasmidet pPOLYIII ødelegges ved innskyting av paret av

komplementære oligonukleotider OTG11975 (SEKV.ID. NR. 12) og OTG11976 (SEKV.ID. NR. 13).

Sphl-setet av pPOLYIII ødelegges og erstattes med et Clal-sete for å gi plasmidet pTG12040. Et Clal, EcoRI-genomisk DNA-fragment tilsvarende 0,7 Kb 3'-delen av YPRl-genet oppnådd ved forsterking med oligonukleotidene OTG11981 (SEKV.ID. NR. 14) og OTG11982 (SEKV.ID. NR. 15), innføres i plasmidet pTG12040 mellom de unike Clal- og EcoRI-seter for å gi plasmidet pTG12041.

I dette 2,84 Kb plasmid pTG12041 klones 5'-delen av YPRl-genet (0,66 Kb) forsterket med oligonukleotidene OTG11314 (SEKV.ID. NR. 1) og OTG11980 (SEKV.ID. NR. 16) fra villtype gjærgenomisk DNA, i form av et Xhol, Hindlll-fragment mellom Sall-og Hindlll-setene av plasmidet pTG12041.

Man oppnår 3,5 Kb-plasmidet pTG12042. Dette plasmid bærer YPRl-genet avbrutt av Clal- og Hindlll-setene. Cytokrom P450c21-kassetten klones mellom disse seter i form av et 2,33 Kb Clal, Hind III-fragment som stammer fra plasmidet pTG10469. På denne måte oppnås plasmidet pTG12045.

d) Konstruksjon av plasmidene pTG12010#36 og #40

Plasmidet pTG 12010 ble konstruert basert på plasmidet pUC19 (Yanisch-Perrron et al.,

1985), mens plasmidet pTG12011 ble konstruert basert på plasmidet pPOLYIII (Lathe et al., 1987).

Konstruktet omfattende disrupsjonen av GCYl-genet med URA3-genet i plasmidet pUC19 ble oppnådd ved fire suksessive PCR-amplifiseringer. Først ble det gjennomført tre uavhengige PCR'er for å oppnå 5'-delen av GCYl-genet (PCR1), det funksjonelle URA3-genet kantet av GCY1-sekvenser (PCR2) og 3'-delen av GCYl-genet (PCR3).

5'- og 3<*->delene av GCYl-genet ved hjelp av parene OTG11285, OTG11286 og OTG11287, OTG11289 (respektivt SEKV.ID. NR. 17 til SEKV.ID. NR. 20) på en matriks av genomisk DNA på FY1679-28c-stammen.

URA3-genet flankert av GCY1 -sekvenser (på en slik måte at man oppnådde en delesjon av del av den kodende sekvens av GCYl-genet) forsterkes ved bruk av oligonukleotidene OTG11305 (SEKV.ID. NR. 21) og OTG11306 (SEKV.ID. NR. 22) fra et linearisert plasmid pTG10054-matrisk (Degryse et al., 1995).

Bufferbetingelsene og matrisk- og primerkonsentrasjonsbetingelsene for amplifiseringen er beskrevet av produsenten av Taq DNA-polymeraseenzymet og særlig for elongaseenzymet utviklet av Life Technologies. Temperatursyklene er som følger: en første syklus på 6'30 for å denaturere primer og matrisk, og så 30 sykler på 30 sekunder ved 93 °C, 2 min ved 54 °C og 3 min ved 68 °C og den siste syklusen i 5 min ved 72 °C. PCR1-, PCR2- og PCR3-produktene blandet på ekvimolekylær måte og forsterkes igjen ved bruk av oligonukleotidene OTG11285 (SEKV.ID. NR. 17) og OTG11289 (SEKV.ID. NR. 20). Sluttproduktet, PCR4, som har en størrelse på 2,9 Kb, subklones så mellom Kpnl- og BamHI-restriksjonssetene av plasmidet pUC19 for å oppnå plasmidet pTG12010.

Strukturen av plasmidet ble verifisert ved restriksjonsprofil og nukleotidsekvensering av endene.

Kloning av pTG12010 gjør det således mulig å oppnå to versjoner av dette plasmid, versjon pTG12010#40 (pTG12040 klon 40) og pTG12010#36. Det opprinnelige ønske var å oppnå GCYl-genet avbrutt av URA3-genet kantet av Clal- og Hindlll-setene respektivt posisjonert 5' og 3' i genet. Det ble imidlertid oppnådd to forskjellige plasmider som kun skiller seg ved nærvær eller fravær av Clal- og Hindlll-seter ved endene av URA3-genet. Plasmidet pTG12010#40 har et Hindlll-restirksjonssete ved 3'-enden av URA3-genet, men intet Clal-sete posisjonert 5'. Plasmidet pTG12010#36 har intet Hindlll-sete ved 3'-enden, men et Clal-sete ved 5'-enden av genet. Denne egenskap benyttes for å oppnå plasmidet som har URA3-genet kantet av Hindlll- og Clal-setene, som avbryter den kodende sekvens av GCY1.

e) Konstruksjon av plasmidet pTG12086

Dette plasmid benyttes for å integrere en ekspresjonskassett for P450c21 og også å

disruptere GCYl-genet samtidig. Dette plasmid ble konstruert fra plasmid pTG12036 og fra plasmidet pTG10614.

Konstruksjonen av plasmidet pTG10614 ble gjennomført som følger. Dette plasmid ble konstruert fra pTG10212 (Deryse et al., 1995) som er et gjærekspresjonsplasmid basert på en TDH3-promoter, en PGK1-terminator og en URA3-d-seleksjonsmarkør.

Seleksjonsmarkøren erstattes med seleksjonsmarkøren av plasmidet pTG10054 (Degryse et al., 1995) ved homolog rekombinasjon i E. coli; for å gjøre dette ble 2,1 Kb Mlul, Fspl-fragmentet av pTG10054 inneholdende URA3-markøren flankert av rekom-binasjonssekvenser rekombinert med det store Hindlll-fragment av pTG10212 for å gi plasmidet pTG10610 som har de samme karakteristika som pTG10212 (Degryse et al., 1995) med en URA3-markør i samme orientering som pTG10054.

Sali, Mlul-fragmentet som bærer det humane cytokrom P450c21-cDNA av plasmidet pTG10472 (jfr. ovenfor), overføres til plasmidet pTG10610 for å gi plasmidet pTG10614.

Clal, Hindlll-rfagmentet av dette plasmid som fra 5' til 3' inneholder TDH3-promoteren, det humane P450c21-cDNA kantet av Sali- og Mlul-seter og så PGKl-terminatoren, overføres til plasmidet pTG12036 for å gi plasmidet pTG12086 som derfor inneholder sekvensen av GCYl-genet avbrutt av TDH3-ekspresjonskassetten for humancytokrom P450c21.

f) Konstruksjon av plasmidet pTG 12048

Plasmidet pTG12048 ble konstruert fra plasmidene pFL26CD, pTG10925 og

pTG10953.

pTG10953 er identisk med plasmidet som er beskrevet hos Lacour et al., 1998, men TEF1-promoteren som bæres av et Clal, Sall-fragment, er erstattet med en CYC1-promoter (Degryse et al., 1995). Ekspresjonskassetten bæres av et Notl-Notl-DNA-fragment.

Plasmidet pTG10925 ble konstruert fra pFL26CD som beskrevet av Duport et al., 1998. Plasmidet inneholder et genomisk fragment av gjær som omfatter LEU2- og NFS1-genene i 5' 3'- og 3' -> 5'-orientering. En ekspresjonskassett for ADR kantet av Notl-seter ble innført i det intergeniske området for å gi plasmidet pTG10925. Denne kassett (TEF1 - matur bovin ADR - PGK1-terminator) ble erstattet med en ny kassett omfattende ARH1-genet under kontroll av CYCl-promoteren og PGKl-terminatoren for å gi plasmidet pTG12048. På dette plasmid er LEU2-genet og ekspresjonskassetten i samme transkripsjonelle orientering.

Eksempel 3

Konstruksjon av TGY212#l-stammen

En koloni velges i den avsøking som er beskrevet i eksempel 1. Den kalles TGY212#1. Denne koloni underkastes et biokonverteirngsforsøk som beskrevet ovenfor, med

100 ug/ml 170H-progesteronsubstrat og stammen tillates å vokse i et minimumsmedium supplert med krevde aminosyrer og uracil.

Denne stamme er i stand til konvertering av 170H-progesteron til 11-deoksykortisol med en effektivitet i størrelsesorden 47 % i løpet av 24 timer med svak produksjon av 4-pregnen-17a,20a-diol-3-on under disse betingelser (< 0,5 %). Under visse betingelser (definert rikt medium av typen Kappeli med galaktose som karbonkilde og kulturer startet ved høy densitet: OD 600 nm = 5) økes kapasiteten for reduksjon av ketonet til å nå 11 % av utgangssubstratet med en kapasitet for biokonvertering redusert til 1,5 % av utgangssubstratet.

Under disse betingelser utgjør det sannsynlige nærvær av GCYl-genet et gen for biokonvertering av 170H-progesteron. Det ble derfor besluttet å disruptere GCYl-genet for å forhindre dets aktivitet.

Eksempel 4

Konstruksjon av TGY243-stammen

For å gjøre dette ble TGY212#1 -stammen transformert med 3 ug av plasmidet pTG12010#36, linearisert med SphI- og EcoRI-restriksjonsenzymene. 27 trans-formanter ble selektert på et minimumsmedium supplert for auxotrofier av TGY212#1, men ikke inneholdende uracil.

Koloniene ble underkastet biokonverteringstester i et minimumsmedium supplert med galaktose som karbonkilde, fordi den sistnevnte er en kjent induserer for GCY1. Alle TGY243-klonene viste en evne til å konvertere 170H-progesteron til 11-deoksykortisol uten imidlertid å produsere detekterbare mengder 4-pregnen-17a,20oc-diol-3-on.

En klon, TGY243#1, ble selektert for i stedet for URA3-genet å innføre en ekspresjonskassett for human P450c21.

Eksempel 5

Konstruksjon av TGY245-stammen

Denne TGY243#1-stamme transformeres med plasmidet YRp7 (1 ug) som beskrevet av Parent et al., 1985, og med plasmidet pTG12086 linearisert med Xhol-enzymet (5 ug).

pTG12086-transformeringsfragmentene inneholder den kodende sekvens for GCY1 avbrutt av en ekspresjonskassett for human P450c21 (TDH3: human P450c21-cDNA:PGKl -terminator).

Koloniene som vokser i fravær av tryptofan, selekteres. Disse 381 kolonier overføres så til et medium inneholdende tryptofan og 5-fluororotat. Rundt ti kolonier testes så i et rikt medium av YPG-typen supplert med tryptofan, histidin, leucin og uracil i en konsentrasjon på 50 ug/ml.

Stammene tillates konvertering til 170H-progesteron i en konsentrasjon av 100 ug/ml, ut fra en OD 600 nm på 0,1, i 16 timer.

Blant disse 10 kloner velges én klon, TGY245#2D, basert på to kriterier: dens evne til å konvertere 170H-progesteron til 11-deoksykortisol og for det andre fraværet av dannelsen av 4-pregnen-17a,20a-diol-3-on, noe som indikerer disrupsjon av GCY1.

Eksempel 6

Konstruksjon av TGY260-stammen

Denne stamme ble konstruert ved transformering av TGY245 med plasmidet pTG12048 som tillater overekspresjon av ARH1 -genet ved LEU2-lokus.

TGY260-stammen ble konstruert fra TGY245-stammen som var transformert med det lineariserte plasmid pTG12048.

Dette plasmid pTG12048 er et intergenisk integreringsplasmid som bærer LEU2-seleksjonsmarkøren. På dette plasmid er en ekspresjonskassett for ARH1-genet (Lacour et al., op. eit.) integrert i området mellom LEU2-genet og NFS 1-genet.

Denne kassett omfatter CYCl-promoteren fulgt av ARH 1-genet og PGKl-terminatoren kantet av Notl-restriksjonssetene. Dette plasmid pTG12048 ble linearisert med Xhol-og Sall-restriksjonsenzymene.

Dette fragment benyttes for å transformere TGY245-stammen ved bruk av en konvensjonell metode for transformering med litiumklorid. De transformante kolonier selekteres så på et medium ikke inneholdende leucin. En stamme, TGY260, ble valgt ut.

TGY260-stammen er deponert hos CNCM [National Collection of Culture in Microorganisms], 24. januar 2001, under nummeret 1-2615.

Eksempel 7

Konstruksjon av CDR07mata-stammen

FY1679-28c-stammen ble transformert med plasmidet pCD62.1, beskrevet hos Duport et al., 1998, hvortil det vises når det gjelder detaljer om konstruering av plasmider og oppnåelse av stammer, for å gi CDR01-stammen. Denne stamme transformere med plasmidet pCD78, også beskrevet hos Duport et al., og CA03-stammen oppnås.

ERG5-genet av CA03-stammen disrupteres med en kassett som gir hygromycinresistens og man oppnår CAlO-stammen.

Denne stamme krysses med en FY1679-18b-opphavsstamme og tillates så sporulering. Sporene isoleres i henhold til kjente teknikker på et minimumsmedium supplert for auxotrofier, det vil si uracil, tryptofan, leucin og histidin.

Sporene screenes basert på to kriterier som er nystatinresistens (12 ug/ml i minimumsmedium) og hygromycinresistens (100-150 \ ig/ m\ i rikt medium). Sporene som er resistente mot disse to produkter, analyseres så ved gasskromatografi med henblikk på nærvær av kampesterol som hovedmembransterol. Nærværet av kampesterol i stam-menes membraner, kombinert med fraværet av ergosta-5,22-dienol, indikerer at A7-reduktasen funksjonerer korrekt. En CDR07-MATa-spore selekteres basert på kriteriene ovenfor.

CDR07-MATa-stammen ble deponert med CNCM den 24. januar 2001, under nummeret 1-2616.

Eksempel 8

Konstruksjon av UCY2- og UCY4-stammene

TGY260- og CDR07-MATa-stammene krysses for å oppnå SB14-stammen. Denne stammen tillates så å sporulere og de segregerende stammer YCC4 og YCC5 oppnås (se nedenfor).

Disse stammer transformeres med plasmidet pLIP5 (se nedenfor) og man oppnår YCC8- og YCC9-stammene.

Disse stammer transformeres med plasmidet pTG12093 for derved å oppnå UCY2- og UC Y3 -stammene.

ATF2-genet inaktiveres i UCY2-stammen ved bruk av et plasmid og en seleksjon med G418 og man oppnår så stammen UCY4.

Eksempel 9

Konstruksjon av plasmidene for transformering av UCY2-, UCY3- og UCY4-stammene

a) Konstruksjon av plasmid pCV29

Plasmidene pTG10767, pTG10022 og pCD63 ble benyttet for å konstruere pCV29 (jfr.

Figur 3).

1. Konstruksjon av plasmid pTG10767

Plasmidet pTG10767 er et ekspresjonsplasmid for P450cl 1 av human opprinnelse. Det inneholder således to ekspresjonskassetter, én for P450cl 1 av human opprinnelse og den andre for adrenodoksin. Disse to proteiner er tatt sikte på å skulle være aktive i mitokondria hos gjæren S. cerevisiae ved nærvær av adresserende sekvenser av cytokrom Cox6p-forløperen.

Denne ekspresjonskassett for P450cl 1 av human opprinnelse kantes av to Notl-restriksjonsseter som gjør det mulig å transportere den i forskjellige vektorer som beskrevet av Degryse et al., 1995. Fra 5' til 3' omfatter CYCl-promoteren som beskrevet i publikasjonen ovenfor, og så det modifiserte, humane P450cl 1-cDNA som beskrevet ovenfor, og til slutt en ikke-kodende del fra en høyere eukaryot.

Det humane P450cl 1-cDNA er det som er beskrevet av Chua et al., 1987, med de følgende modifikasjoner.

Delen som koder signalpeptidet i den opprinnelige cDNA, ble fjernet opp til Bglll-restriksjonssetet og erstattet. Dette fjerner på samme tid 31 aminosyrer av den kodende sekvens av den mature form av cDNA og gir den følgende NH2-terminale protein-sekvens (SEKV.ID. NR. 23): MLSMIFmPVimTLLRAiæGAYHATIU. TmTFIQSRKYGTRGAAAVKAVLVFEA MPRCPGNKWMRMLO IWREOGYEDLHLEVHQTFOELGPIFRYDLGGAGMVC VMLPEDVEKLOOVDSLHPHRMSLEPWVAYROH

På den forutgående linje tilsvarer delen i kursiv aminosyresekvensen til den adresserende sekvens av forløperen av gjærcytokromoksidasesubenhet VI (COX6), delen i bold tilsvarer NH2-terminaldelen av bovin P450cl 1 (Dumas et al., 1996). Den under-strekede delen tilsvarer begynnelsen av sekvensen identisk med den som er publisert for human P4501 ipi-cDNA (Kawamoto et al., 1990).

Notl-kassetten som bærer CYCl-promoteren og det kimære cDNA av P4501 ipi, inneholder også en ikke-kodende del lokalisert 3' av denne cDNA. Denne ikke-kodende del består av 3 elementer, en ikke-kodende del som stammer fra den naturlige cDNA og en ikke-kodende del som stammer fra plasmidet pCMV4 hvis sekvens er deponert hos Genbank under nummeret AF239248 (Andersson et al., 1989). I tillegg er den eneste ikke-kodende del som stammer fra pCMV4, terminator i det humane veksthormongen og kanin P-globingenintronet bevart i den endelige vektor pCV29.

Til slutt inneholder et DNA-fragment som bærer Notl-restriksjonssetene fra 5' til 3', CYCl-promoteren, og en kimær cDNA kantet av Sali- og Mlul-seter inneholdende en del som koder for nærværet av cytokromoksidase fusert til et fragment av bovin P450np opp til delen tilsvarende restriksjonssetet, så enden av det cDNA som tilsvarer det humane P450npi-cDNA. Den ikke-kodende del består av tre av mammal opprinnelse.

Denne Notl-kassett overføres til plasmidet pTG10359 som stammer fra plasmidet pTG10350 (Dumas et al., 1996) kuttet med Clal- og PvuII-restriksjonsenzymene og religert på seg selv.

Dette plasmid pTG10359 har også et unikt Notl-restriksjonssete. Plasmidet pCV29 er et 3-kassettplasmid som inneholder ekspresjonskassettene for den mature form av ADX og den mature form av P450sccog for et humant CYPl 1B1 innsiktet mot mitokondria.

Plasmidet pTG10022 er beskrevet i publikasjonen av Degryse et al., 1995, hvortil det vises når det gjelder detaljer og inneholder en 2-mikron replikasjonsopprinnelse for gjæren S. cerevisiae og også for elementene for kloning i E. coli.

Restriksjonssetene for dette plasmid ble modifisert med oligonukleotidene OLIP 174 og OLIP 175 (respektivt SEKV.ID. NR. 28 og 29) for å integrere Ascl- og Pmel-restriksjonene deri.

En dobbelt ekspresjonskassett for plasmidet pCD63, beskrevet av Duport et al., 1998, ble innført ved Notl-restriksjonssetet i dette plasmid. Denne doble ekspresjonskassett inneholdt på et Notl-fragment, inneholder en ekspresjonskassett i matur form av bovin ADX og en ekspresjonskassett i matur form av bovin P450sccsom omrammer en URA3-seleksjonsmarkør. Ekspresjonskassetten for cytokrom P4501ip inneholdende human P4501 ip-cDNA under kontroll av CYCl-promoteren og PGKl-terminatoren, ble innført i det unike stumpendede Pmel-setet av dette plasmid etter fylling av Notl-endene med DNA-polymerase-Klenow-fragment.

Ett av de oppnådde plasmider, pCV29, inneholder tre ekspresjonskassetter for ADX, P450scc(begge i moden form) og også en form av human P4501 ip innsiktet mot mito kondria. I tillegg bærer dette plasmid som markør, URA3-genet omrammet av to ekspresjonskassetter.

b) Konstruksjon av plasmidet pCC12

Plasmidet pCC12 (jfr. Figur 4) er et replikativt gjærplasmid basert på den kromosomale

replikasjonsopprinnelse som ARS1- og en CEN-centromer (det er 16 av dem i gjær), begge fra S. cerevisiae. Dette plasmid replikerer i form av én eller to kopier i gjær.

Den ble konstruert fra pFL38C2, som stammer fra pFL38 (Bonneaud et al., 1991), hvortil det vises når det gjelder detaljer, særlig når det gjelder beskrivelsen av plasmidene. Et oligonukleotid som inneholder gjenkjennelsessekvensen for Noti-, Pacl-og Ascl-setene (OLIP FL SEKV.ID. NR. 24), ble innført i dette plasmid på Hindlll-setet. Orienteringen av polylinkeren ble verifisert ved sekvensering. Dette plasmid bærer en URA3-seleksjonsmarkør kantet av Bglll-seter.

URA3-genet ble erstattet med et 2,7 Kb ADE2-gen oppnådd ved PCR-amplifisering på genomet av FY1679-28c ved bruk av oligonukleotidene 5'ADE2090 (SEKV.ID. NR.

37, CGATTCGGATCCACTAGTAACGCCGTATCGTGATTAACG) OG 3<*>ADE2089

(SEKV.ID. NR. 38,

CCTCAAGGATCCTCCTGACGTAGCGCTATCCTCGGTTCTG).

For å gjøre dette ble plasmidet pFL38C2 kuttet med Bglll-enzymet og URA3-BglII-fragmentet ble erstattet med 2,7 Kb-fragmentet inneholdende ADE2-genet. Dette oppnådde plasmid, pAMl, tjener som basis for konstruksjon av plasmidet pCC12.

Konstruksjon av plasmidet fra plasmidet pAMl:

Plasmidet pCC12 inneholder to ekspresjonskassetter, ett for 3P-HSDH av bovin opprinnelse, den andre for adrenodoksinreduktase, også av bovin opprinnelse.

Bovin 3 P-HSDH-cDNA ble reklonet ved PCR fra et bovint adrenalkjertel-cDNA-bibliotek. Den kodende sekvens med denne cDNA publisert av Zhao et al., 1989, ble ikke modifisert.

De to oligonukleotider føyer til et Sall-sete og 4 adeniner i front av ATG, og gir sekvensen GTCGACAAAAATG (SEKV.ID. NR. 25). Mlul-setet er lokalisert til høyre rett etter termineringskodonet for den bovine 3p-HSDH-cDNA, for å gj sekvensen: enden av cDNA TGACCTGGAGTGACAATGACGCGT (SEKV.ID. NR. 26). Sekvensen som gjenkjennes av Mlul-enzymet, er ACGCGT.

Denne cDNA overføres i form av et Sali, Mlul-fragment i plasmidet pTG10212, og gir plasmidet pCC4. Dette plasmid har derfor et Noti-fragment inneholdende 3P-HSDH-cDNA kantet av både en TDH3-promoter og en PGK1-terminator, posisjonert 5' hhv. 3'. Denne ekspresjonskassett overføres så til plasmidet pTG12018 og kassetten er således nå kantet i 5'-posisjonen av et Notl-sete og i 3'-posisjonen av et Ascl-sete. Dette fragment klones så inn i gjærekspresjonsplasmidet pAMl i Noti- og Ascl-setene og gir plasmidet pCCll.

Inn i Notl-setet av dette plasmid innføres så Notl-fragmentet som bærer TEF1-promoteren, cDNA av den mature form av adrenodoksinreduktase av bovin opprinnelse, og PGKl-gjærterminatoren, respektivt i denne rekkefølge, med opprinnelse i plasmidet pTG10361.

Dette plasmidet bærer den samme cDNA som er beskrevet hos Dumas et al., 1996 (hvortil det vises når det gjelder detaljer og særlig når det gjelder beskrivelsene av plasmidene), bortsett fra at den adresserende sekvens av cytokromoksidaseforløperen er erstattet med en metioninkodon. Denne cDNA koder derfor en matur form av den angjeldende adrenodoksinreduktase-cDNA.

Eksempel 10

Konstruksjon av CDR07-stammen

CDR07-stammen ble oppnådd ved kryssing mellom FY1679-18b MAT-stammen og CA10 MATcc-stammen, beskrevet av Duport et al., 1998.

Disse to stammer ble aller først isolert på et rikt medium inneholdende glyserol og så et medium i et mediuminneholdende kaliumacetat som beskrevet i "Yeast Protocols Methods in Cell and Molecular Biology, utgitt av Ivor H Evans i 1996, Humana Press Totowa, New Jersey".

Etter sporulering ble tetradene kuttet med zymolyase 100T i 30 min ved 37 °C. Flere seleksjonssykler ble gjennomført for å oppnå en klon som gir kampesterol som hovedsterol, men som har mistet alle de andre karakteristika fra CA10.

Sporene selekteres først på et minimumsmedium inneholdende nystatin med supple-menter (adenin, leucin, tryptofan, uracil, histidin). Klonene som er resistente mot nystatin og auxotrofisk for adenin og leucin, subdyrkes så på rikt medium inneholdende adenin og hygromycin (200 ug/ml) for å detektere delesjon av ERG5-genet på grunn av hygromycinresistensgenet.

Kloner som er auxotrofiske for adenin og leucin (og uracil og tryptofan) og også hygromycinresistente og nystatinresistente, analyseres med henblikk på sterolprofilen. To kloner av motsatte tilpasningstypetegn som produserer kampesterol som hovedsterol, selekteres.

Disse kalles CDR07 MAT a og CDR07 MAT a.

Eksempel 11

Konstruksjon av integrasjonsplasmidene pTG12093 og pLIP5 respektivt for HIS3-og TRPl-loci

a) Konstruksjon av pLIP5

pLIP5 er et plasmid som kan benyttes for genomiske integrasjoner på TRPl-lokus eller

som et multikopiplasmid i gjæren S. cerevisiae. Basisplasmidet som ble benyttet for å konstruere dette plasmid, er plasmidet pFL45S, beskrevet av Bonneaud et al., 1991, hvortil det vises når det gjelder detaljer og særlig når det gjelder beskrivelsene av plasmidene.

Et genomisk DNA-fragment tilsvarende 5'-delen oppstrøms TRP1-promoteren, ble først klonet ved bruk av oligonukleotidene OLIP21 og OLIP22 (henholdsvis SEKV.ID. NR.

30 og 31) for å gjennomføre en PCR- amplifisering.

PCR-produktet ble først subklonet inn i pCR-Script AmpSK(+) (stratagene, La Jolla, California, USA). OLIP21- og OLIP22-endene har således et Narl-sete i 5'-posisjonen og et Hindlll-sete i 3-posisjonen. Dette Narl, Hindlll-rfagmentet erstattet multippel-kloningssetene av plasmidet pFL45S som beskrevet ovenfor.

Det oppnådde plasmid, pLIP3, modifiseres ytterligere ved bruk av oligonukleotidet OLIP20 (SEKV.ID. NR. 32) som benyttes for å erstatte det unike Hindlll-setet med det unike Notl-setet. Et fragment som fra 5' til 3' inneholder TEF1-promoteren, cytokrom P-450cl7a-cDNA og så PGKl-terminatoren som beskrevet av Degryse et al., 1999, hvortil det vises når det gjelder detaljer, innføres i dette Notl-setet.

Det endelige plasmid pLIP5 kan benyttes både som multikopiplasmid basert på TRP1-markøren når 2-mikrondelen er fjernet, og som et plasmid for integrering på TRP1-lokuset. Kassetten er således integrert 5' av TRP1-genet.

b) Konstruksjon av plasmidet pTG12093

Dette plasmid var et plasmid for intergenisk integrasjon på HIS3-lokus. Dette plasmid

konstrueres fra plasmidet pUC-HIS3 som beskrevet av Duport et al., 1998. Det unike Xhol-restriksjonssetet av dette plasmid ble transformert til et unikt Notl-restriksjonssete ved bruk av en egnet linker, mens det samtidig ødela Xhol-setet, og ga plasmidet pUC19-HIS3. Inn i dette unike Notl-setet av dette plasmid, ble det innsatt et Notl-fragment som stammet fra pTG10792. Dette fragment inneholder TDH3-promoteren og det cDNA som koder matur bovin ADX fusert til den adresserende sekvens av foreløperen av COX6-cytokromet (av den gjærcytokromoe oksidasesubenhet 6 som beskrevet av Dumas et al., 1996. Sali, MluI-restriksjonsfragmentet av plasmid pTG10350 inneholdende den tidligere beskrevne cDNA, ble overført til plasmidet pTG10211 for å gi plasmidet pTG10792.

Dette plasmid har derfor et 1,6 kilobasefragment inneholdende TDH3-promoteren, den angjeldende cDNA fusert mellom matur bovin ADX og gjær COX6-presekvensen og PGKl-terminatoren, sett fra 5' til 3'. Dette Notl-Notl-fragment skytes inn i plasmidet pTG12093. HIS3 og ekspresjonskassetten transkriberes i samme retning.

Eksempel 12

Kryssing av CDR07 MATa med TGY260 MATa

SB14-stammen (CDR07MATa X TGY260 MATa) tillates å sporulere i et meget utarmet medium inneholdende kaliumacetat. De forskjellige asci tillates så å vokse i et minimumsmedium inneholdende de følgende produkter: uracil, histidin, tryptofan og adenin.

Sporene selekteres så på et korrekt supplert minimumsmedium inneholdende fra 8 til 12 ug/ml nystatin. De positive sporer selekteres så basert på nærværet av det humane P450-c21-cDNA. For å gjøre dette screenes klonene i Kappeli medium (M. Arreguin de Lorencez, O. J. Kappeli, 1987) med 2 % etanol (og 0,1 % glukose) som karbonkilde i nærvær av 300 mg/ml 170H-progesteron.

Biokonversjonen inkuberes i opp til 72 timer. Kapasiteten for biokonversjon analyseres ved HPLC som beskrevet av Dumas et al., 1996 og Degryse et al., 1999, hvortil det vises når det gjelder detaljer og særlig forklaringen av biokonversjonsstudiene.

Disse kloner analyseres også med henblikk på sterolprofilen ved gasskromatografi som beskrevet av Duport et al, 1998, hvortil det også vises når det gjelder detaljer og særlig forklaringene når det gjelder biokonversjonsstudiene, for derved å detektere kampesterol og ergosta-5,22-dienol.

Tre sporer YCC3, YCC4 og YCC5, selekteres på basis av at de produserer ergosta-5,22-dienol og kampesterol og at de konverterer 170H-progesteron til 11-deoksykortisol med en produksjonseffektivitet på 25,120 henholdsvis 42 ug/ml i løpet av 72 timer.

YCC4 og YCC5 selekteres så for to ytterligere suksessive transformasjoner med plasmidene pLIP5 og pTG12093, linearisert henholdsvis med ApaLl- og EcoRl-enzymene. Plasmidene pLIP5 og pTG12093 er intergeniske ekspresjonsplasmider for bovin P450cl7 henholdsvis mitokondrialbovin ADX.

pTG12093 er et plasmid for integrering i det intergeniske området i posisjon 3' av HIS3-lokus, mens pLIP5 er et plasmid for integrering i det intergeniske området i posisjon 5' av TRPl-lokus. I tillegg bærer disse to plasmider et unikt Notl-sete som tillater integrering av en ekspresjonskassett som i denne rekkefølge inneholder: TEF1-promoter, bovin P450cl7-cDNA, PGK1-terminator for pLIP5 og i denne rekkefølge: TDH3-promoter, COXVIpre: .mat bovin ADX-cDNA, PGK1-terminator for pTG12093.

YCC4-stammen transformeres suksessivt med plasmidene pLIP5 og pTG12093 som er linearisert (med ApaLI- og EcoRI-restriksjonsenzymer).

I den første transformering blir transformantklonene aller først selektert på et medium som ikke inneholder tryptofan. Klonene som vokser i fråvær av tryptofan, selekteres så ved PCR med nukleotidene Cl7-3 og Cl7-5 (henholdsvis SEKV.ID. NR. 33 og SEKV.ID. NR. 34).

En klon, YCC8, selekteres for en ytterligere transformering med det lineariserte plasmid pTG12093. På samme måte blir klonene som vokser i fravær av histidin, selektert og nærværet av ADX-cDNA verifiseres ved PCR ved bruk av oligonukleotidene ADX-3 og ADX-5 (henholdsvis SEKV.ID. NR. 35 og SEKV.ID. NR. 36).

En klon, UCY2, velges; dets tilpasningstypeangivelse er MATa.

Eksempel 13

Konstruksjon av UCY4-stammen

UCY2-stammen har et funksjonelt ATF2-gen, det vil si at mesteparten av det produserte pregnenolon transformeres til pregnenolonacetat av ATF2p-proteinet som er en pregnenolonacetyltransferase, den naturlige funksjon i gjæren er ukjent (Cauet et al., 1999). I tillegg er denne reaksjon irreversibel og når den derfor først er fremstilt kan acetylpregnenolon ikke lenger transformeres til hydrokortison. Det synes derfor viktig å ødelegge denne aktivitet for å tillate mer effektiv produksjon av hydrokortison.

ATF2-genet ble deretter disruptert ved bruk av et G418-resistensgen. For å gjøre dette ble det konstruert et disrupsjonsplasmid, pAM3kanaC, som tillater innføring av en G418-resistensmarkør i ATF2-genet.

Dette plasmid ble konstruert fra plasmidet pAMl (hvis konstruksjon er beskrevet ovenfor) og fra plasmidet pTG12002, som er et ekspresjonsplasmid for ATF2-genet.

pTG12002 er et ekspresjonsplasmid for ATF2 basert på plasmidet pTG10260 (Degryse et al., 1995), hvori Xbal-restriksjonssetet av 2-mikron replikasjonsopprinnelsen er inaktivert. Dette plasmid omfatter derfor en ekspresjonskassett for ATF2-genet (Cauet et al., 1999) omfattende CYCl-promoteren, ATF2-genet (omrammet av Sali- og Mlul-restriksjonssetene) og PGKl-terminatoren. Denne kassett ble modifisert ved PCR for å inneholde det fullstendige ATF2-gen omfattende promoteren av ATF2-genet, kodings-sekvensen for ATF2-genet og terminatoren for ATF2-genet, på et Kpnl, Notl-restrik-sjonsfragment. Dette Kpnl, Notl-fragment innføres på Kpnl-Notl-setene i plasmidet pAMl for å gi plasmidet pAM3.

I dette plasmid pAM3 innføres ekspresjonskassetten for G418-resistens i ATF2-genet og gir inaktivering av dette.

For å gjøre dette kuttes plasmidet pAM3 med Accl-restriksjonsenzymet og så partielt med Sacl-restriksjonsenzymet. Et bånd på ca. 7 500 bp renses på en gel. Plasmidet pFA6a kanMX4 (Wach et al., "Methods in Microbiology", Vol 26, "Yeast Gene Analysis", kapittel 5, "PCR-based Gene Targeting in Saccharomyces cerevisiae") kuttes med SacI og AccI, og båndet på 1 500 bp renses på en gel. De to fragmenter ligeres og transformeres. Det oppnås et plasmid, pAM3kanaC. pAM3kanaC kuttes med PvuII og Noti, og båndet på 2 215 bp renses på en gel og transformeres så inn i UCY2, som bringes på plate på skåler med rikt medium inneholdende 130 ug/ml G418. Rundt 600 kloner subdyrkes på dette medium inneholdende G418 og to kloner er resistente mot G418. En klon som ikke inneholder plasmidet pAM3, bevares.

Denne metode for genaktivering er velkjent for fagmannen.

En enkelt klon som er oppnådd på denne måte, tillates å gå gjennom biokonversjon med 100 ug/ml pregnenolon i Kappeli medium.

Etter 24 timer verifiseres fraværet av pregnenolonacetat ved ekstraherings- og gasskromatografi som beskrevet av Cauet et al., 1999. Dette fenomen indikerer at ATF2-genet som er ansvarlig for acetyleringen av pregnenolon, klart er disruptert og ikke lenger funksjonelt. Stammen kalles UCY4.

Eksempel 14

Konstruksjon av UCY3- og UCY26-stammene

Screening av sporene oppnådd ved krysning av CDR07- og TGY260-stammene, ga forskjellige stammer, inkludert YCC4- og YCC5-stammene. Som beskrevet ovenfor ble YCC4-stammen transformert med en serie av 2 plasmider: pLIP5 og pTG12093. En spore, UCY2, ble så selektert (jfr. eksempel 12). På samme måte ble YCC5-stammen også transformert med plasmidene pLIP5 og pTG12093 og en ytterligere spore, nemlig UCY3, ble oppnådd. På samme måte som UCY2, ble UCY3karakterisert vednærvær og ekspresjon av A. thaliana A7-reduktase målt ved nystatinresistens og nærvær av brassikasterol og kampesterol som hovedsterol i disse rekombinante gjærer. Nærværet av ADX-cDNA verifiseres ved PCR ved bruk av oligonukleotidene ADX-3 og ADX-5 ( henholdsvis SEKV.ID. NR. 35 og SEKV.ID. NR. 36) og så ved Western blot som beskrevet av Dumas et al., 1996, hvortil det vises når det gjelder detaljer.

Aktiviteten for progesteronhydroksyleringen på posisjon 17 og posisjon 21 verifiseres ved biokonversjon av progesteron til 170H-progesteron og 11-deoksykortisol. For å gjøre dette inkuberes stammen i nærvær av 200 mg/l progesteron som beskrevet av Dumas et al., 1996, og Degyse et al., 1999. UCY3 er i stand til å produsere 11-deoksykortisol fra progesteron, noe som indikerer nærværet av P450cl7- og P450c21-aktivitetene. Nærværet av 4-pregnen-17a,20a-diol-3-on detekteres også, noe som indikerer at minst én av de to aktiviteter som kodes av GCY1 eller YPRl, er til stede i stammen. For å unngå akkumulering av pregnenolonacetat elimineres pregnenolon-acetyleringsaktiviteten som kodes av ATF2-genet. Med dette mål ble plasmidet pAM3kanaC (jfr. eksempel 13) benyttet for å transformere UCY3-stammen. pAM3kanaC ble først kuttet med PvuII og Noti, båndet ved 2 215 bp renset på en gel og så transformert inn i UCY3, som ble brakt på plate på skåler med rikt medium inneholdende 130 ug/ml G418. Kolonier som er resistente mot G418-antibiotika og som ikke lenger er i stand til transformering av pregnenolon til pregnenolonacetat, isoleres; en koloni, UCY26, ble mer spesielt valgt for ytterligere transformering og for å teste dets produksjon av hydrokortison.

Eksempel 15

Konstruksjon av UCY5-stammen

Med det ønske om å ha bedre genetisk variabilitet ble UCY2-stammen (jfr. eksempel 12) krysset med TGY245-stammen (jfr. eksempel 5) og en diploidstamme, YSA2-2n, ble således selektert. Denne stamme ble brakt under betingelser for produksjon av asci og 85 asci ble dissekert (som beskrevet i "Yeast Protocols in Molecular Biology", Vol 53, s. 59-67,1996). De isolerte sporer screenes på basis av de auxotrofiske egenskaper. Således ble det mer spesielt selektert kloner i stand til å vokse i fravær av tryptofan og histidin og som krever adenin. Ekspresjon av A7-reduktase verifiseres ved å sikre at stammen er resistent mot nystatin og at kampesterol og brassikasterol er til stede i membranene i disse stammer. Den sist nevnte analyse gjennomføres ved gasskromatografi av de totale steroler av disse stammer som beskrevet i Duport et al., 1998.1 tillegg verifiseres nærværet av cDNA'er som koder P450cl7 og ADX ved PCR ved bruk av oligonukleotidene C17-3 og C17-5 (respektivt SEKV.ID. NR. 33 og SEKV.ID. NR. 34) og oligonukleotidene ADX-3 og ADX-5 (respektivt SEKV.ID. NR. 35 og SEKV.ID. NR. 36). Til slutt verifiseres funksjonaliteten av GCY1- og YPRl-genene i disse positive sporer på to måter: enten ved PCR eller ved fravær av 20-alfa-reduktase-aktivitetpå 170H-progesteron.

Disrupsjon av YPRl-genet på grunn av ekspresjonskassetten for human P450c21 i Saccharomyces cerevisiae, inneholdende TEF1-promoteren, det humane P450c21-cDNA og PGK-terminatoren, detekteres ved PCR ved bruk av paret av oligonukleotider X1TEF1 ogX2C21 (respektivt SEKV.ID. NR. 47 og SEKV.ID. NR. 48). Disrupsjon av GCYl-genet med ekspresjonskassetten for human P450c21 i S. cerevisiae, innholdende TDH3-promoteren, det humane P450c21-cDNA og PGK-terminatoren, detekteres også ved PCR ved bruk av paret av oligonukleotider X3TDH3 og X2C21 (respektivt

SEKV.ID. NR. 49 og SEKV.ID. NR. 48).

Forsvinningen av de to GCY1- og YPRl-aktiviteter og nærvær av aktiviteten tilsvarende P450cl7- og P450c21 -aktiviteten, verifiseres til slutt ved biokonversjon av

progesteron til 11-deoksykortisol under de betingelser som er beskrevet av Dumas et al., 1996, modifisert av Degryse et al., 1999. De rekombinante gjærer inkuberes ved 30 °C i nærvær av 200 mg/l progesteron med en celletetthet på 5 i et kulturmedium av Kappeli-typen inneholdende 2 % galaktose eller 2 % glukose som karbonkilde, i et volum på 10 ml. Etter inkubering i 48 timer ekstraheres kulturmediet av disse gjærer som beskrevet tidligere, og mengden 170H-progesteron og 11-deoksykortisol som produseres spesielt, måles ved HPLC. Den selekterte spore produserer ikke lenger noen detekterbar mengde 4-pregnen-17a,20a-diol-3-on, men produserer 170H-progesteron og 11-deoksykortisol ved bruk av de to karbonkilder. Den valgte klon produserer den største mengde 11-deoksykortisol.

En stamme som positivt tilfredsstiller alle disse kriterier, blir mer spesielt selektert for ytterligere transformasjoner, denne stamme er gitt betegnelsen UCY5.

Eksempel 16

Konstruksjon av plasmidene pFMlO og pTG 10897

a) Konstruksjon av plasmidet pFMlO

Plasmidet pFMlO er en vektor som tillater samtidig ekspresjon av 4 proteiner i gjæren.

Den inneholder ingen replikasjonsopprinnelse for E. coli og heller intet ampicillin-resistensgen; dette plasmid kan ikke replikere i E. coli. Det oppnås ved rekombinasjon i gjær av to plasmider: pFM7 og pCB12. Disse plasmider replikerer, til forskjell fra plasmidet pFMlO, begge i E. coli fordi de har den nødvendige E. co/i-replikon. Plasmidet pFM7 replikerer også i S. cerevisiae, fordi den også omfatter 2-mikronreplikasjonsopprinnelsen av gjæren S. cerevisiae. Disse to plasmider har også RI- og R2-sekvensene (respektivt SEKV.ID. NR. 39 og SEKV.ID. NR. 40) som omkanter ekspresjonskassettene og også seleksjonsmarkørene. RI- og R2-sekvensene kommer fra A. £Aa//awa-fotoklorofyllidoksidoreduktasegenet og er begge ca. 300 basepar store.

De to sekvenser RI og R2 klones i reversorientering inn i plasmidene pFM7 og pCB12. Således inneholder plasmidet pFM7, mellom RI - og R2-sekvensene, i følgende rekke-følge: 2-mikronreplikasjonsopprinnelsen inneholdt i 2-mikronfragmentet (fragment kantet av EcoRI-setene som beskrevet av Urban et al., 1994), et fragment kantet av Notl-setene som stammer fra plasmidet pCD63 beskrevet av Duport et al., 1998, inneholdende to ekspresjonskassetter for den mature form av P450sccog den mature form av ADX separert av det funksjonelle gjær-URA3-gen, og så R2-sekvensen. På tilsvarende måte inneholder plasmidet pCB12 RI- og R2-sekvensene, men de er klonet i en retning motsatt den i plasmidet pFM7. Mellom R2- og RI-sekvensene er således ekspresjonskassetten for P450np, ADE2-seleksjonsmarkøren og ekspresjonskassetten for 3P-HSD av bovin opprinnelse. Ekspresjonskassetten for P450np kommer fra plasmidet pCV29 og inneholder CYCl-promoteren, en hybrid cDNA som koder P450up og en PGK-terminator. ADE2-genet kommer fra plasmidet pAMl; det er Bglll-Bglll-fragmentet. På tilsvarende måte kom ekspresjonskassetten for bovin 3P-HSD, det vil si TDH3-promoteren, bovin 3p-HSD-cDNA og PGK-terminatoren, fra plasmidet pCC12; det er Clal-AscI-rfagmentet.

b) Konstruksjon av plasmidet pTG10897

Den kodende sekvens for ATF2-genet forsterkes ved PCR ved bruk av to 20mer oligonukleotider respektivt tilsvarende 5'- og 3'-delen av den kodende sekvens av ATF2-genet (og også omfattende kloningssetene) og ved som matriks å benytte genomisk DNA fra FY1679-28c-stammen. Dette PCR-produkt kuttes så med Clal- og Hindlll-enzymer og klones mellom Clal- og Hindlll-setene av plasmidet pTG10031 (Degryse, 1995 #102) for å gi plasmidet pTG10885. Dette plasmid benyttes som en basis for konstruksjonen av et plasmid for disruptering av ATF2-genet. Sekvensen for URA3-genet ble forsterket fra det genomiske DNA av TGY156-stammen (beskrevet hos Cauet et al., 1999 og det vises dit hen når det gjelder detaljer); denne stamme har således et ATF2-gen avbrutt av URA3-genet. Oligonukleotidene OTG10842 (SEKV.ID. NR. 41) og OTG10841 (SEKV.ID. NR. 42) ble derfor benyttet for amplifisering på en matriks av genomisk DNA fra TGY156-stammen og amplifiseringsproduktet ble benyttet som en initiator for rekombinering med plasmidet pTG10885 kuttet med BstXI- og Stul-restriksjonsenzymene.

Plasmidet pTG10897 inneholdende den kodende sekvens av ATF2-genet avbrutt av URA3-genet, ble oppnådd på denne måte. Spesifikt er det funksjonelle URA3-gen lokalisert mellom 509 nukleotider av 5'-delen av den kodende sekvens av ATF2 og 444 nukleotider av 3'-delen av denne kodende sekvens.

Eksempel 17

Konstruksjon av UCY6-, UCY16-, UCY16-pFM10-, UCY19-, UCY20-, UCY24-, UCY25- og UCY27-stammene

Det ble konstruert en serie nye stammer basert på UCY5-stammen med det formål å forbedre produksjonen av det ønskede steroid. Spesifikt uttrykker UCY5-stammen ikke adrenodoksinreduktase som er en essensiell komponent for reaksjonen for sidekjedespalting med P450scc- Videre og slik det er beskrevet tidligere, koder ATF2-genet en acetyltransferase som benytter pregnenolon som substrat og disrupsjonen av denne gjør det mulig å eliminere denne parasittiske acetyleringsreaksjon og derved øke utbytte av det ønskede steroid. Til slutt benytter den eksogene biosyntetiske vei den endogene ARHlp-aktivitet, idet denne sist nevnte er vesentlig for gjæroverlevelse. Imidlertid kan denne mitokondriale aktivitet som erstatter mammal adrenodoksinreduktase, være begrensende i stammene som produserer hydrokortison. En stamme med visse modifikasjoner som har gjort det mulig betydelig å øke utbytte av produksjonen av steroid av interesse, ble derfor konstruert basert på UCY5-stammen. Således mangler denne stamme ATF2-aktivitet, overproduserer adrenodoksinreduktaseproteinet og overproduserer derfor ARH 1-proteinet.

For å tillate ADR å uttrykkes i UCY5-stammen, ble den sist nevnte transformert med vektoren pTG10925 (jfr. eksempel 2f) som, når den transformeres i gjær i lineær form, tillater integrering av LEU2-lokuset og ekspresjon av ADR under kontroll av TEF1-promoteren. Ekspresjonen av ADR ble verifisert ved Western blotting som beskrevet hos Dumas et al., 1996. En klonuttrykkende ADR, kalt UCY6, ble mer spesielt benyttet for de etterfølgende transformasjoner.

Med det formål å eliminere den parasittiske acetyleringsreaksjon som transformerer pregnenolon til pregnenolonacetat katalysert av ATF2-enzymet, ble ATF2-genet som koder dette enzym, disruptert. Spesifikt ble genet avbrutt med URA3-markøren; for å gjøre dette benyttet man Notl-fragmentet av plasmidet pTG10897 som inneholder den sekvens av ATF2-genet som er avbrutt av det funksjonelle gjær-URA3-gen. Dette fragment benyttes for å transformere UCY6-stammen. Koloniene som er i stand til å vokse i fravær av uracil, selekteres og deretter måles kapasiteten for disse kloner til å transformere pregnenolon til pregnenolonacetat, målt som beskrevet av Cauet et al., 1999. Mer spesielt ble en klon, i stand til å vokse i fravær av uracil og ikke i stand til å transformere pregnenolon til pregnenolonacetat, isolert. Denne klon kalles UCY16.

Fordi denne stamme ikke kan transformeres med plasmider som kun bærer URA3-markøren, ble to nye plasmider konstruert; plasmidene pCB12 og pFM7. Disse to plasmider gjør det mulig, når de kombineres, å oppnå plasmidet pFMlO basert på URA3- og/eller ADE2-markørene (jfr. ovenfor og figur 5). For således å oppnå plasmidet pFMlO lineariseres plasmidet pFM7 med Aatll-restriksjonsenzymet og det tilsvarende DNA-fragment isoleres på en gel. Plasmidet pCB12 er for sin del kuttet med BamHl og båndet på 9 300 basepar isoleres i henhold til konvensjonelle molekylærbiologiteknikker. Ca. 5 ug av pCB12- og pFM7-fragmentene blandes og benyttes for å transformere UCY16-stammen. Noen UCY16-pFM10-kloner, i stand til å vokse i minimumsmedium (uten uracil og aminosyrer), isoleres og de tilsvarende stammer testes på nivå av steroidproduksjon i henhold til protokollen beskrevet nedenfor.

Alternativt og med det formål å være i stand til deretter å benytte plasmidene av pCV29-stypen basert på en URA3-markør, ble disrupsjon av ATF2-genet i UCY6-stammen også oppnådd ved å transformere denne stamme med et lineariserte plasmid pAM3kanaC (jfr. eksempel 13). De G418-resistente kolonier testes deretter på fravær eller nærvær av pregnenolonacetyltransferaseaktivitet som beskrevet av Cauet et al., 1999. Nærmere bestemt ble en G418-resistent koloni som ikke lenger har pregnenolonacetyltransferaseaktivitet, selektert. Denne stamme kalles UCY24.

For å øke ARH 1-aktiviteten i en stamme inneholdende en eksogen vei for fremstilling av hydrokortison, ble UCY5-stammen transformert med plasmidene pTG12048 eller pTG12050, linearisert på forhånd med henholdsvis Xhol og Sapl. Plasmidet pTG12048 som er beskrevet ovenfor, tillater overekspresjon av ARH 1-genet ved LEU2-lokus under kontroll av CYCl-promoteren. Plasmidet pTG12050 skiller seg fra plasmidet pTG12048 kun i det at CYCl-promoteren som kontrollerer ekspresjonen av ARHl-genet, er erstattet med TEF1-promoteren som beskrevet av Degryse et al., 1995, og Dumas et al., 1996. UCY5 ble transformert med linearisert pTG12048 eller pTG12050. I hvert av disse to tilfeller ble kolonier, i stand til å vokse i fravær av leucin, selektert. I tillegg ble nærværet av ekspresjonskassettene for ARH 1-genet verifisert ved PCR. Spesifikt gjør to par av oligonukleotider det mulig å verifisere nærværet av en ytter ligere kopi av ARH 1-genet (under kontroll av CYC1- eller TEF1-promoteren). For det første gjør paret arhlD (SEKV.ID. NR. 43) og nfslR (SEKV.ID. NR. 44) det mulig å verifisere nærværet av skjøten mellom ARH 1-genet og NFS 1-genet. For det andre gjør paret leu2D (SEKV.ID. NR. 45) og arhlR (SEKV.ID. NR. 46) det mulig å verifisere forbindelsen mellom LEU2-genet og ARH 1-genet.

Ved siden av nærværet av ekspresjonskassetter for ARH 1-genet som koder ARH1-aktivitet, ble ekspresjonen av ARHlp-proteinet også testet i de oppnådde kloner. Det er imidlertid ikke lett å detektere overekspresjon av ARHlp. Dette skyldes det naturlige nærvær av ARHlp-proteinet ved et lavt nivå i Sl cerevisiae- stammer. Western blotting gjennomført som beskrevet hos Dumas et al., 1996, gjør det imidlertid mulig å bekrefte en økning i mengden av ARHlp. I tillegg til Western blotting-forsøkene som viser seg å være kompliserte, kan nærværet av en økt mengde av ARHlp også verifiseres ved eksperimenter som består av cytokrom C-reduksjon eller av 1 ip-hydroksylering av 11-dioksykortisol, hvilke forsøk er rekonstituert in vitro med renset mitokondria fra rekombinant gjær som beskrevet hos Lacour et al., 1998 og Dumas et al., 1996. Nærmere bestemt ble to kloner, UCY19 og UCY20, respektivt transformert med pTG12048 og pTG12050 og som overuttrykker ARH1, selektert. ATF2-genet ble så disruptert i disse stammer som beskrevet ovenfor. Kort sagt ble plasmidet pAM3kanaC linearisert og så benyttet for å transformere UCY19- og UCY20-stammene. Klonene ble så selektert på basis av egenskapen G418-resistens og fraværet av pregnenolonacetyltransferaseaktivitet som beskrevet av Cauet et al., 1999. Mer spesielt ble to kloner avledet fra UCY19 og UCY20, selektert. Disse er respektivt UCY25- og UCY27-stammene (jfr. figur 2).

Eksempel 18

Fremstilling av steroider ved stammer ifølge oppfinnelsen

a) Transformering av UCY2 og UCY4 med pCV29 og pCC12

UCY2- og UCY4-stammene ble transformert med to plasmider pCV29 og pCC12,

beskrevet ovenfor, og hvis strukturer er inngitt nedenfor og i figurene 3 og 4.

Plasmidet pCV29 bærer en 2-mikron replikasjonsopprinnelse for replikering i gjær. I tillegg bærer dette plasmid 3 ekspresjonskassetter respektivt for hybrid human/bovin P45011 p innsiktet mot mitokondria som beskrevet ovenfor, og de mature former (med et metionin ved NH2-terminalenden) av adrenodoksin og av P450scc. Ekspresjonen av disse tre proteiner er under kontroll av CYCl-promoteren (P4501ip) og GAL10/CYC1-promoteren (ADX og P450scci matur form).

Plasmidet pCC12 er et lavkopiplasmid som bærer en ekspresjonskassett for matur form av bovin adrenodoksinreduktase under kontroll av TEF1-promoteren og også en ekspresjonskassett for bovin 3P-HSD under kontroll av TDH3-promoteren.

Disse stammer tillates å vokse under konvensjonelle fermenteringsbetingelser i Kappeli-medium med glukose som karbonkilde. Ved slutten av fermenteringen (180 timer) ble steroidene ekstrahert som beskrevet tidligere, ogkarakterisert vedHPLC.

Identiteten for produktene ble verifisert ved gasskromatografi og ved reversfase- og væskefase-HPLC, eventuelt koblet med massespektrometri og kjernemagnetisk resonans (jfr. tabell 1).

b) Transformasjon av UCY24-, UCY25-, UCY26- og UCY27-stammene med pCV29 og pCC12 og transformering av UCYl6-stammen med pFMlO

Disse stammer har mange modifikasjoner og viser seg å være vanskelige å transformere. Som en konsekvens ble det benyttet en protokoll basert på fremstilling av sferoplaster for disse transformeringer som beskrevet av Burgers et al., 1987. UCY16 ble transformert i henhold til denne protokoll med plasmidene pFM7 og pCB12, i det det sist nevnte gir plasmidet pMFlO ved rekombinasjon in vivo i gjær. Som beskrevet ovenfor er plasmidet pFMlO et multikopigjærplasmid som ikke inneholder noen bakterielle sekvenser og tillater ekspresjon av 4 heterologe proteiner. Disse fire proteiner er, slik det er vist ovenfor; en kimer form av cytokrom P450np, bovin 3P-HSD, matur ADX og matur cytokrom P450scc- De tilsvarende cDNA'er plasseres respektivt under kontroll av CYC1-, TDH3-, GAL10/CYC1- og GALI 0/CYC 1-promoterene. Transformantene selekteres på et minimumsmedium uten noe tilsetning. Seleksjonen gjennomføres kun på basis av ADE2-markøren (vekt i fravær av adenin); nærværet av et funksjonelt URA3-gen i genomet, og som benyttes for å inaktivere ATF2-genet, gjør det ikke mulig å selektere på basis av URA3-genet. Det er derfor nødvendig å screene flere kolonier for å være sikker på å ha et plasmid pFMl 0 som er funksjonelt i UCY16-stammen.

UCY24-, UCY25-, UCY26- og UCY27-stammene ble transformert med plasmidene pCV29 og pCC12 i henhold til den protokoll som ble benyttet for fremstilling av sfero-plastere. Som beskrevet ovenfor er plasmidet pCV29 et multikopiplasmid for shuttel-virksomhet mellom E. coli og S. cerevisiae. Det tillater ekspresjonen av cytokrom P450np, matur ADX og cytokrom P450scC, respektivt under kontroll av CYC1-, GAL10/CYC1- og GALlO/CYCl-promoterene (jfr. figur 3). pCC12-plasmidet er et enkelt kopigjærplasmid som tillater ekspresjon av matur bovin ADR og bovin 3P-HSD under kontroll av TEF1- henholdsvis TDH3-promoterene Ofr- figur 4).

Alle disse stammer tillates å vokse i en Erlenmeyer kolbe (100 ml volum og inneholdende 30 ml kulturmedium) under konvensjonelle fermenteringsbetingelser i Kappeli-medium med 2 % etanol og 0,1 % glukose som karbonkilde. Etter dyrking i 168 timer ekstraheres 500 ul kulturmedium (celler + medium) med 2 x 4 ml dikloretan. Den organiske fase slås sammen og separeres så i to for tørking under en nitrogenstrøm. Det tørre ekstrakt resuspenderes i 100 ul acetonitrilrvann i volumforholdet 50:50 eller 100 ul dikloretan. Ekstraktene som var resuspendert i acetonitril:vann, prosesseres ved HPLC og dette tillater analyse av sammensetningen av de forskjellige steroider (hydrokortison, korteksolon, kortikosteron, 170H-progesteron, 4-pregnen-17ct,20a-diol-3-on) som beskrevet av Valvo et al., 1994. Ekstraktene som var resuspendert i dikloretan, analyseres ved gasskromatografi som beskrevet hos Duport et al., 1998, idet den sist nevnte analyse gjør det mulig å måle mengden pregnenolon og av progesteron i prøvene. For hver av de transformerte prøver måles således en steroid produktivitet på rundt ti kloner. Resultatene som er presentert nedenfor, gir resultatene av de beste av de ti kloner testet for hver av UCY24-, UCY25-, UCY26- og UCY27-stammene transformert med pCV29 og pCC12, og UCY16-stammen transformert med pFMlO. Stammene UCY16 pFMlO, UCY24 pCV29+pCC12, UCY25 pCV29+pCC12, UCY26 pCV29+pCC12 og UCY27 pCV29+pCC12, som presentert ovenfor, er derfor i stand til å produsere mengder av hydrokortison som er større enn de som produseres av UCY4/pCV29+pCC12-stammen. Den totale mengde steroider økes således fra

21,2 ug/ml i UCY4/pCV29+pCC12-stammen til 43,3 ug/ml i UCY25pCV29+pCC12-stammen, mens mengden hydrokortison øker fra 12,3 (J.g/ml til 29,2 ug/ml. I tillegg representerer i disse eksempler, hydrokortison opp til rundet 70 % av de totale steroider. En stor økning i mengde og kvalitet av hydrokortisonet som produseres, observeres derved fordi ingen av disse stammer produserer 4-pregnen-17,20-diol-3-on samtidig. Dette sist nevnte spesielt fordelaktige karakteristikum skyldes fraværet av proteinene som er kodet av GCY1- og/eller YPRl-genene som er ansvarlige for produksjons-reaksjonen av ketonet i posisjon 20.

Det er også interessant å merke seg at den kontrollerte overproduksjon av ARHlp under kontroll av CYCl-promoteren uventet signifikant økte mengden totale steroider som ble produsert og også produksjonen av hydrokortison (jfr. UCY24 pCV29+ pCC12 versus UCY25 pCV29+ pCC12). Imidlertid bør denne ekspresjon ikke være for stor for å oppnå den ønskede effekt. Hvis således ekspresjonen av ARH 1-proteinet i et nivå større enn et fysiologisk nivå er ønsket, bør man passe på ikke å overekspresjonere dette protein for sterkt, da det ellers er en risiko for å minste økningen av produksjonen av steroider. Således gir TEF1-promoteren som er erkjent å være meget sterkere enn CYC1 (Nacken et al., 1996), utilfredsstillende resultater (jfr. UCY25 pCV29+pCC12 versus UCY27 pCV29+pCC12). Som en konklusjon har UCY25/pCV29+pCC12-stammen et estimert potensiale til å produsere 200 mg/l hydrokortison i en fermenter med en enkel hoved-kontaminant (kortikosteron).

c) Eksempel på storvolumproduksjon av stammene ifølge oppfinnelsen

To av de ovenfor nevnte stammer ble tillatt å vokse i en storvolumfermenter i Kappeli-medium i henhold til velkjente teknikker for fagmannen (jfr- for eksempel D. Risenberg et al., 1999). Dyrkingsteknikken som benyttes, er matingssats med konsentrert medium. Fermenteren med et totalvolum på 15 liter, inneholder 6 liter medium ved begynnelsen. Den kontinuerlige tilsetning av 4 liter ytterligere konsentrert medium under fermenteringen og også pH-korrigeringsvæsker og kontinuerlig tilsetning av etanol, bringer sluttvolumet til rundet 11,5 liter ved slutten av dyrkingen. UCY4 pCV29+pCC12 og UCY16 pFMlO-stammene ble dyrket på denne måte i 180 timer og det kunne således oppnås en øket produksjon av hydrokortison (jfr. tabell 3). Resultatene som kunne tas sikte på for UCY24 pCV29+pCC12-, UCY25 pCV29+pCC12-, UCY26 pCV29+pCC12- og UCY27 pCV29+pCC12-stammene, ble ekstrapolert fra disse resultater (jfr. tabell 3).

Deponering av biologisk materiale

De følgende organismer ble deponert 24. januar 2001 ved "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM) (nasjonal samling for kulturer og mikroorganismer), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, i henhold til forskriftene ifølge Budapest-avtalen.

- CDR07 MATcc-stamme Aksessnummer 1-2616

- TGY260-stamme Aksessnummer 1-2615

Liste over stammer beskrevet i foreliggende søknad

Pyl679-18b = (n) MATa ura3- 52 trpl- A63 Ieu2- Al his3- A200

fenl GAL fens ura" trp" leu" his"

Pyl679-28c = { n) MATa ura3- 52 trpl- A63 Ieu2- Al his3- A200

fenl GAL fens ura" trp" leu" his"

TGY195#4 = Fyl679-18b yprl::URA3

TGY212-1 = Fyl679-18b yprl:: TEF1P: : P450c21 [5x?] ura" trp"

leu" his"

TGY243-1 = TGY212-1 gcyl: : URA3 trp" leu" his"

TGY245-2D = TGY243-1 gcyl:: TDH3P: : P450c21 ura" trp" leu"

his"

TGY260-A = TGY245-2D LEU2: : CYC1P: : ARH1 ura" trp" his"

CDR01 = Fyl679-18b MATCCLEU2: :' b-mat ADR' ura" trp" his"

CDR07 MATa = MATa ade2: : GAL10/ CYC1P: : A7 ura" trp" leu" his"

ade" (spore av CA10 x Fyl679-28c)

CDR07 MATa = MATa ade2: : GAL10/ CYC1P: :A<7>ura" trp" leu" his"

ade" (spore av CA10 x Fyl679-28c)

CA03 = CDR01 ade2: : GALI 0/ CYC lp: :A7 ura" trp" ade" his",

resistent mot nystatin(Duport et al., 1998)

CA10 = CA03 erg5:: PGK1P: :hygroR ura" trp" ade" his",

resistent mot nystatin og hygromycin(Duport et al., 1998)

SB14 (2n) = TGY260-A x CDR07 Mata

YCC4 = (n) MATa ade2: : GÅL10/ CYC1P: :A<7>, LEU2: : CYC1P: : ARH1, yprl: :TEF1P: :P450c21, ERG5, fenl( ?), ura" trp" ade"

his"', resistent mot nystatin (spore av SB14)

YCC8 = YCC4 transformert med pLIP5 { TRP1::

TEF1P: : P450cl7 : : PGKlt) , ura" ade" his", resistent mot nystatin UCY2 = YCC8transformert med pTG12093 ( HIS3: : TDH3P: :CoxVIpre: : mat ADX: : PGKlt) :HIS3: : TDH3P: :CoxVIpre: : matADX: : PGKlt, ERG5, fenl ( ?), ura" ade", resistent mot nystatin

UCY4 = UCY2 atf2- A: :G418R ura" ade", resistent mot nystatin og mot G418.

YCC5 = (n) MATa ade2:: GAL10/ CYC1P: : A7-reduktase,

LEU2: : CYC1P: : ARH1, gcyl: : TDH3P: : P450c21, ERG5, fenl ( ?), ura"

trp" ade" his", (resistent mot nystatin, spore av SB14).

YCC9 =YCC5 transformert med pLIP5 ( TRP1:: TEF1P: : P450cl7 : : PGKlt) , ura" ade" his", resistent mot nystatin.

UCY3 = YCC9 transformert med pTG12093 ( HIS3: :

TDH3P: :CoxVIpre: :matADX: : PGKlt) :HIS3: : TDH3P: :CoxVIpre: :

matADX: : PGKlt, ERG5, fenl (?), ura" ade, (resistent mot nystatin).

UCY26 = UCY3 atf2- A: :G418R ura" ade", (resistent mot nystatin og mot G418).

YSA2 (2n) = TGY245-2D x UCY2.

UCY5 = (n) MATa ade2: : GAL10/ CYC1P: : A7-reduktase,

LEU2: :CYC1P: : ARH1, yprl: : TEF1P: :P450c21, ERG5,

gcyl: : TDH3P: : P450c21 fenl( l), ura" trp" his", resistent mot nystatin (spore av YSA2).

UCY6 = UCY5 LEU2: : TEF1: : mat ADR: : PGKltf.

UCY16 = UCY6, atf2::URA3::atf2.

UCY19 = UCY5, LEU2: : CYC1: : ARH1.

UCY20 - rTrv, T

UCY20 - UCY5, LEU2::TEF1::ARH1.

og mot G418). røl9' att2' A--^ resistent mot nystatin

UCY27= [JPY9n

UCY20,atf2-A::G418* (reaiat*ni- . og mot G418). resistent mot nystatin

= rirv<-

i-tesiatent mot nv^af,' mot G418). nystatin og

Bibliografi:

Andersson S. et al., Cloning, structure, and expression of the mitochondrial cytochrome P-450 sterol 26-hydroxylase, a bile acid biosynthetic enzyme. J. Biol, Chem. 1989. 264 (14) : p. 8222-8229.

Arreguin de Lorencez M and Kappeli 0 J, Regulation of gluconeogenic enzymes during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae growing in a chemostat. Gen Microbiol, 1987. 133

(Pt 9): p. 2517-22.

Bonneaud N. et al., A family of low and high copy replicative, integrative and single-stranded S. cerevisiae/ E.

coli shuttle vectors. Yeast, 1991 Aug-Sep; 7(6): p. 609-15

Burgers P.M. and Percival K.J., Transformation of yeast spheroplasts without cell fusion. Anal Biochem, 1987. 163(2): p. 391-7.

Cauet G. et al., Pregnenolone esterification in Saccharomyces cerevisiae. A potential detoxification mechanism. Eur J

Biochem, 1999. 261(1): p. 317-24.

Chua SC. et al., Cloning of cDNA encoding steroid 11 beta-hydroxylase (P450cll). Proe Nati Acad Sei USA, 1987. Oet; 84 (20): p. 7193-7.

Degryse E. et al., In vivo cloning by homologous recombination in yeast using a two-plasmid-based system.

Yeast, 1995. 11(7): p. 629-40.

Degryse E., In vivo intermolecular recombination in Escherichia coli: application to plasmid constructions. Gene,

1996. 170 (1) : p. 45-50.

Degryse E. et al., Pregnenolone metabolized to 17alpha-hydroxyprogesterone in yeast: biochemical analysis of a metabolic pathway. J Steroid Biochem Mol Biol, 1999. 71(5-6): p. 239-46.

Dumas B. et al., 11 beta-hydroxylase activity in recombinant yeast mitochondria. In vivo conversion of 11-deoxycortisol to hydrocortisone. Eur J Biochem, 1996. 238(2): p. 495-504.

Duport C. et al., Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast. Nat Biotechnol, 1998. 16(2): p. 186-9.

Hu MC. and Chung BC, Expression of human 21-hydroxylase (P450c21) in bacterial and mammalian cells: a system to characterize normal and mutant enzymes. Mol Endocrinol., 1990. 4(6): p. 893-8.

Kawamoto T. et al., Cloning of cDNA and genomic DNA for human cytochrome P-450 11 beta. FEBS Lett, 1990. 269(2): p. 345-9.

Kuronen P. et al., Reversed-phase liquid chromatographic separation and simultaneous profiling of steroidal glycoalkaloids and their aglycones. J Chromatogr A, 1999.

863 (1) : p. 25-35.

Lacour T., T. Achstetter, and B. Dumas, Characterization of recombinant adrenodoxin reductase homologue (Arhlp) from yeast. Implication in in vitro cytochrome p45011beta monooxygenase system. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23984-92.

Lathe R. et al., Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts. Gene, 1987. 57: p. 193-201.

Lecain E. et al., Cloning by metabolic interference in yeast and enzymatic characterization of Arabidopsis thaliana sterol delta 7-reductase. J Biol Chem, 1996. 271(18): p. 10866-73.

Meng-Chun Hu and Bon-chu Chung. Expression of human 21-hydroxylase (P450c21) in bacterial and mammalian cells: A

system to characterize normal and mutant enzyme. DNA and Cell

Biology. 1991. 10(3): p. 201-209.

Nacken, V., T. Achstetter and E. Degryse, Probing the limits of expression levels by varying promoter strength and plasmid copy number in Saccharomyces cerevisiae. Gene, 1996. 175(1-2): p. 253-60.

Parent SA., et al., Vector systems for the expression,

analysis and cloning of DNA sequences in S. cerevisiae.

Yeast, 1985. 1(2): p. 83-138.

Risenberg D. and R. Guthke, High-cell-density cultivation of microorganisms. Appl. Microbiol Biotechnol, 1999. 51: p.

422-430.

Thierry et al. The complete sequence of the 8.2 kb segment left of MAT on chromosome III reveals five ORFs, including a gene for a yeast ribokinase. Yeast, 1990. Nov-Dec; 6(6): p.

521-34.

Urban, P., et al., Characterization of recombinant plant cinnamate 4-hydroxylase produced in yeast. Kinetic and spectral properties of the major plant P450 of the phenylpropanoid pathway. Eur J Biochem, 1994. 222(3): p.

843-50.

Valvo, L., et al., General high-performance liquid chromatographic procedures for the rapid screening of natural and synthetic corticosteroids. J Pharm Biomed Anal, 1994. 12 (6): p. 805-10.

Wu, DA. et al., Expression and functional study of wild-type and mutant human cytochrome P450c21 in Saccharomyces cerevisiae. DNA Cell Biol, 1991. 10(3): p. 201-9.

Yanisch-Perron et al., Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19

vectors. Gene, 1985. 33(1): p. 103-19.

Zhao HF. et al., Molecular cloning, cDNA structure and predicted amino acid sequence of bovine 3 beta-hydroxy-5-ene steroid dehydrogenase/delta 5-delta 4 isomerase. FEBS Lett,

1989. 259(1): p. 153-7.

Claims

1. Genetisk modifisert gjærstamme som fra en enkel karbonkilde autonomt produserer et steroid eller steroidderivat, avledet fra kolesterolmetabolisme, der nevnte steroid eller steroidderivatet er inkludert i gruppen bestående av pregnenolon, 17a-hydroksypregnenolon, kortisol, korteksolon, progesteron, 17a-hydroksyprogesteron og deres acetylerte eller hydroksylerte derivater eller derivater som bærer et halogenert derivat eller en metylgruppe,karakterisert vedat den utviser en inaktivering av de endogene ATF2, GCY1 og YPRl genene.

2. Gjærstamme ifølge krav 1,karakterisert vedat den utviser minst en ytterligere inaktivering av et endogent gen valgt fra ERG5, ARE1, ARE2, ATF1 og ADE2.

3. Gjærstamme ifølge krav 2,karakterisert vedat den utviser en inaktivering av de endogene ERG5, ATF2, GCY1 og YPRl genene.

4. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat den har minst én ekspresjonsblokk for et heterologt gen integrert i kromosomet, minst ett locus valgt blant ADE2, HIS3, TRP1, LEU2, GCY1, ATF2 og YPRl, idet integreringen er gjennomført intragenisk eller intergenisk i umiddelbar nærhet av nevnte locus.

5. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat den har minst én ekspresjonsblokk for et heterogent gen lokalisert på et multikopiplasmid eller et lavkopiplasmid.

6. Gjærstamme ifølge krav 5,karakterisert vedatmulti-kopiplasmidet er valgt fra gjær-2-mikron replikonbaserte plasmider som replikerer i Saccharomyces cerevisiae og at lavkopiplasmidet er valgt blant plasmider basert på en kromosomal ARS-replikasjonsstart (origin of replication) med et gjærcentromer.

7. Gjærstarnme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert vedat den har minst ett heterologt gen eller cDNA i en ekspresjonsblokk idet genet eller cDNA er valgt fra gruppen bestående av genet til sterol-A7-reduktase, av cytokrom P450 SCC, av adrenodoksin, av adrenodoksinreduktase, av 3P-hydrosteroiddehydrogenaseisomerase, av cytokrom b5, av cytokrom P450-reduktase, av cytokrom P450 Cl7, av cytokrom P450 C21 og av cytokrom P450 Cl 1, og av sekvensene som koder for disse proteinene.

8. Gjærstamme ifølge krav 7,karakterisert vedat minst ett heterologt gen eller cDNA er under kontroll av en promotersekvens valgt fra gruppen bestående av de gjærendogene promotersekvenser TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GAL 10, ATF2, TIR1, ARH1 og ADE2, og hybridpromoteren GAL10-CYC1.

9. Gjærstamme i følge hvilken som helst av krav 7 og 8,karakterisert vedat terminatorsekvensen av minst ett heterologt gen eller cDNA i ekspresjonsblokken, er valgt blant terminatorsekvensene til de endogene genene PGK1, CYC1, ATF2, ADE2 og NCP1.

10. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9,karakterisert vedat den har sterol-A7-reduktaseheterologe ekspresjonsblokken integrert i kromosomet ved ADE2-lokus.

11. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10,karakterisert vedat den omfatter minst en kassett for ekspresjon av av genene som koder for de modne formene av P450SCC og for adrenodoksin lokalisert på et høykopiplasmid.

12. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11,karakterisert vedat den omfatter en kassett for ekspresjon av adrenodoksinreduktase for P450SCC, lokalisert på et enkelt kopiplasmid eller på et lavkopi plasmid eller integrert i ett eller flere gjærkromosomer.

13. Gjærstamme ifølge krav 12,karakterisert vedat ekspresjonskassetten av adrenodoksinreduktase har elementene som sikrer at proteinet er til stede i vertscellens cytosol.

14. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13,karakterisert vedat den omfatter minst én ekspresjonskassett valgt fra kassettene for ekspresjon av 3p-hydrosteroiddehydrogenaseisomerase, av cytokrom P450C17 og av cytokrom p450C21, lokalisert på et høykopiplasmid.

15. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14,karakterisert vedat den omfatter minst én ekspresjonskassett for p4501ip, lokalisert på et multikopiplasmid, idet proteinet som produseres, har et signal for adressering til mitokondria.

16. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 15,karakterisert vedat den omfatter minst én ekspresjonskassett for en forløper av adrendoksin for P45011P, lokalisert på et multikopiplasmid, med en svak promoter, idet det produserte protein har et signal for adressering til mitokondria.

17. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16,karakterisert vedat den har minst to ekspresjonskassetter for adrendoksin, slik at ett protein er aktivt utenfor mitokondria, og det andre er aktivt i vertscellens mitokondria.

18. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 17,karakterisert vedat den omfatter minst én ekspresjonskassett for NCP1-, ATR1- og/eller ATR2, lokalisert på et enkeltkopiplasmid eller integrert i kromosomet.

19. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18,karakterisert vedat den uttrykker ARH 1-proteinet i en mengde høyere enn et fysiologiske nivå.

20. Gjærstamme ifølge krav 19,karakterisert vedat den i tillegg til det endogene gen har en andre ekspresjonskassett for ARH 1-proteinet.

21. Gjærstamme ifølge krav 20,karakterisert vedat ekspresjonen av ARH 1-proteinet er anbrakt under kontroll av CYCl-promoteren i kassetten.

22. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 21,karakterisert vedat den er polyploid, diploid, haploid eller aneuploid.

23. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 22,karakterisert vedat den er en stamme av Saccharomyces cerevisiae.

24. Gjærstamme ifølge krav 22,karakterisert vedat den er avledet fra FY 1679-28c-stammen eller FY 1679-18b-stammen.

25. Gjærstamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 27,karakterisert vedat den har de elementene som er nødvendig for å skille ut steroidet som produseres til kulturmediet.

26. Fremgangsmåte for fremstilling av et steroid,karakterisertv e d at den omfatter fermentering av en gjærstamme i følge ett av kravene 1 til 25 ved tilstedeværelse av en enkel karbonkilde og deretter gjenvinne de produserte steroider.

27. Farmasøytisk preparat, k a r a k t e r i