MXPA03006031A

MXPA03006031A - Cepas de levaduras que producen esteroides de manera autonoma.

Info

Publication number: MXPA03006031A
Application number: MXPA03006031A
Authority: MX
Inventors: Winter Jacques
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2005-02-14
Also published as: FR2820145A1; FR2820145B1; KR20030082580A; ZA200305772B; US7670829B2; IL157118A0; US20100112634A1; JP4620932B2; CY1111099T1; CA2435096A1; AR033857A1; DK1385980T3; ATE486134T1; US7977065B2; US20040137556A1; BRPI0206809B1; NO20033242D0; WO2002061109A2; EP1385980B1; NZ526381A

Abstract

La presente invencion se refiere a cepas de levaduras geneticamente modificadas y que producen esteroides de manera autonoma, a partir de una fuente de carbono simple. La invencion se refiere tambien a un procedimiento para la produccion de esteroides a partir de tales cepas de levadura.

Description

CEPAS DE LEVADURAS QUE PRODUCEN ESTEROIDES DE MANERA AUTÓNOMA La ' presente invención se refiere a la producción de esferoides en microorganismos, especialmente cepas de levadura. Los esferoides, especialmente los esferoides derivados del colesterol, están implicados en numerosos procesos fisiológicos entre los cuales podemos mencionar la regulación de la tasa de glúcidos y colesterol en la circulación sanguínea, el mantenimiento y desarrollo de la masa muscular, el desarrollo del sistema nervioso central. Entre los inconvenientes observados en casos de deregulación de las tasas de esferoides circulantes, podemos mencionar el desencadenamiento eventual de enfermedades auto-inmunes tales como lupus, de ciertos cánceres, por ejemplo cáncer de mama, de enfermedades cardiovasculares, por ejemplo aterosclerosis . Problemas de regulación de esferoides se sospechan también en el caso del desencadenamiento de ciertas enfermedades neurológicas tales como enfermedades de Parkinson o de Alzheimer . Los esferoides, especialmente la hidrocortisona, pueden emplearse como agentes terapéuticos como tales o bien como complementos en otros tratamientos. Asi, los derivados de la síntesis de los glucocorticoides se utilizan por sus acciones anti-inflamatorias, y, en dosis elevadas, inmunosupresoras . La obtención de esferoides se relaciona actualmente con procedimientos de extracción o de síntesis costosos. John Warcup Cornforth fue el primero en lograr la síntesis total de un esteroide, el colesterol, a través de un método enzimático. Sin embargo, es importante contar con un método que permita obtener los esteroides de interés, especialmente los derivados del colesterol, a un precio accesible, ün cierto número de proteínas implicadas en la biosíntesis de los esteroides han sido expresadas en la levadura. Así, la patente EP 360 361 demuestra la actividad de las proteínas P450 17a y OP450c21 en la levadura Kluyveromyces lactis. De la misma manera, se ha descrito la posibilidad de conversión in vivo de 11 desoxicortisol en hidrocortisona en un levadura genéticamente modificada que expresa la P450cll (Dumas B. y colaboradores. 11 beta-hidroxilase activity in recombinant yeast mitochondria . In vivo conversión of 11-deoxycortisol to hydrocortisone [Actividad 11 beta-hidroxilasa en mitochondria de levadura recombinante . Conversión in vivo de 11-desoxicortisol en hidrocortisona] . Eur J. Biochem, 1996. 238(2): p. 495-504), así como la producción de 17a-hidroxiprogesterona a partir de pregnenolona en la levadura (Degryse E. y colaboradores. Pregnenolone metabolized to 17alpha-hydroxyprogesterone in yeast: biochemical analysis of a metabolic pathway [Pregnenolona metabolizada en 17alfa-hidroxiprogesterona en levadura: análisis bioquímico de una vía metabólica] . J. Steroid Biochem Mol . Biol, 1999. 71(5-6): p.239.46). Además, Duport y colaboradores (Duport C. y colaboradores, Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast [Biosintesis autosuficiente de pregnenolona y progesterona en levadura manipulada]. Nat Biotechnol, 1998. 16(2): p. 186-9) han descrito la síntesis de la pregnenolona y de la progesterona en una levadura genéticamente modificada. Se ha descrito también en la solicitud de patente WO 99/40203, que la desactivación del gen ATF2 en una cepa de levadura permite evitar la acetilación de los esteroides producidos por esta cepa. La presente invención permite lograr la síntesis de esteroides, a través de la fermentación de cepas de levadura genéticamente modificadas, en presencia de una fuente de carbono simple. La metodología propuesta por la presente invención permite por consiguiente obtener una gran cantidad de esteroides de interés, a un costo bajo, puesto que el procedimiento contempla la fermentación de levadura y la adición de una fuente de carbono simple, fácilmente disponible en el comercio. Definiciones : Por fuente de carbono simple, de conformidad con la presente invención, entendemos fuentes de carbono que pueden ser utilizadas por la persona con conocimientos en la materia para el crecimiento normal de una levadura. Entendemos específicamente los diferentes azúcares asimilables, tales como glucosa, galactosa o sacarosa, o bien las melasas, o bien los subproductos de estos azúcares, una fuente de carbono simple muy especialmente preferida es etanol y glicerol . Por derivados de un esteroide entendemos, de conformidad con la presente invención, un compuesto que puede conseguirse, especialmente a través de una o dos reacciones enzimáticas o químicas, a partir de dichos esteroides. Entendemos específicamente los esteroides acetilados, hidroxilados, o bien que llevan un sustituyente, por ejemplo un sustituyente halogenado (flúor, yodo), o bien un grupo metilo. Los problemas a resolver para producir esteroides en un microorganismo son de índoles diferentes: conviene eliminar las reacciones parásitas que pueden observarse debido a la presencia de enzimas endógenas en el microorganismo seleccionado, conviene introducir genes que permiten la modificación de los intermediarios de síntesis de tal manera que los niveles de expresión obtenidos sean lo más cercano posible a los niveles observados en los mamíferos. Así, la re-creación de buenos equilibrios es una condición importante del éxito de un proyecto de este tipo, conviene obtener un nivel de expresión de los diferentes genes que permite orientar preferentemente la biosintesis hacia el esteroide escogido. La síntesis de los esteroides es una cadena de reacciones extremadamente complejas en las cuales participan varias enzimas para obtener el cortisol a partir del colesterol. Conviene primero producir el 20, 22 dihidroxicolesterol, el cuál es transformado entonces en pregnenolona, la cuál es idroxilada en 17- hidroxi-pregnenolona. Esta 17a-hidroxi-pregnenolona es transformada entonces en 17-a hidroxi-progesterona, la cuál proporciona el desoxicortisol, llevando al cortisol (hidrocortisona) . Una vía alterna consiste en la producción de pregnenolona, después de progesterona, transformada en 17-a hidroxi-progesterona . Se ha mostrado que se puede producir pregnenolona en levadura, a partir de una fuente de carbono simple, (Duport y colaboradores, 1998) , cuyo contenido se incorpora por referencia a la presente demanda. Para este propósito, ha sido necesario suprimir una vía endógena (por disrupción del gen ?22 esterol-desaturasa {ERGS) por la vía de biosintesis endógena de ergosteroles) , con el objeto de obtener una acumulación de productos saturados en C-22. De hecho, el ergosterol normalmente fabricado por la levadura difiere del colesterol por una insaturación en C-7 (8) del núcleo B, una insaturación en C-22, y un grupo metilo adicional en C-24. Así, los productos saturados en C-22 y en C-7 en el núcleo B pueden ser utilizados como sustratos por las enzimas colocadas en la cadena de producción del cortxsol. La presente invención permite lograr la síntesis de esteroides y, especialmente, los esteroides colocados corriente debajo de la pregnenolona, de manera sencilla, por la fermentación de cepas de levadura genéticamente modificadas, en presencia de una fuente de carbono simple. En un caso particular de la invención, los esteroides sintetizados son excretados en el medio de cultivo, lo que simplifica su purificación. El método propuesto por la presente invención permite por consiguiente obtener una gran cantidad de esteroides de interés, a un bajo costo, puesto que el procedimiento contempla la fermentación de levadura y la adición de una fuente de carbono simple, fácilmente disponible en el comercio . De manera preferida, los esteroides que pueden ser producidos por la cepa de levadura de conformidad con la presente invención son esteroides incluidos en la vía de síntesis del cortxsol, como se indicó arriba. Se puede también producir otros tipos de esteroides, a partir de la 17-a hidroxi-pregnenolona, especialmente la dihidroepiandrosterona (DHEA) , por acción de la enzima 17-a hidroxilasa y liasa, y los esteroides derivados (androstendionas, testosterona .. ) . Estos esteroides pueden ser producidos por introducción de las enzimas apropiadas en la cepa de levadura, de la misma manera que para la cepa ejemplificada dentro del marco de la presente invención. Para utilizar el método de conformidad con la invención, la invención se refiere también a una cepa de levadura genéticamente modificada que produce un esteroide o un derivado de esteroide, que se caracteriza porque permite la producción de manera autónoma a partir de una fuente de carbono simple. El hecho que la producción se lleve a cabo de manera autónoma significa que no hay necesidad de agregar sustratos adicionales para obtener el esteroide de interés, sino que la levadura puede producirlos simplemente a partir de la fuente de carbono simple del inicio. Es también claro que la cepa puede producir un esteroide a través de la via metabólica, mediante utilización de un sustrato colocado corriente arriba en la via metabólica, en la medida en que la cepa de levadura de conformidad con la presente invención contiene todos los genes necesarios para la culminación de la via metabólica de la producción de los esteroides. De preferencia, la cepa de levadura de conformidad con la presente invención produce un esteroide o derivado de esteroide que es un derivado del metabolismo del colesterol, es decir, que forma parte de la cadena de metabolismo del colesterol. El metabolismo del colesterol es bien conocido en la persona con conocimientos en la materia, y se explica en las obras de bioquímica y endocrinología. Asi, de preferencia, dicho esteroide o derivado de esteroide se encuentra especialmente en el grupo constituido por 17-a hidroxi-pregnenolona, cortisol, cortisona, cortexolona, 17-a-hidroxi progesterona, y los derivados de estos esteroides. Se puede también producir la pregnenolona y la progesterona con una cepa de levadura de conformidad con la presente invención. Así, la presente invención tiene especialmente por objeto una cepa de levadura genéticamente modificada que produce, de manera autónoma a partir de una fuente de carbono simple, un esteroide o un derivado de esteroide, derivado del metabolismo del colesterol, que se caracteriza porque dicho esteroide o derivado de esteroide se encuentra del grupo constituido por la 17-a-hidroxi-pregnenolona, hidrocortisona, cortexolona, 17-a.hidroxi progesterona, y derivados de estos esteroides. Como se verá más adelante, las cepas de levadura de conformidad con la presente invención presenta por lo menos la modificación genética seleccionada dentro de un grupo que consiste de la disrupción o desactivación de un gen endógeno, la modificación del promotor de un gen endógeno, la duplicación de un gen endógeno, la introducción de por lo menos un gen heterólogo, en una o varias copias, de manera episomal o cromosómica.

Resulta además provechoso que la cepa de levadura de la presente invención presente una combinación de dichas modificaciones génicas. Como se explicará más adelante, la cepa de levadura presenta por lo menos una disrupcion de un gen endógeno seleccionado del grupo constituido por ERG5, ATF2, GCY1, YPR1, ARE1, ARE2, ATFI, ADE2, en una primera modalidad. En una modalidad preferida, la cepa de levadura de conformidad con la presente invención presenta una disrupcion de los genes endógenos ERG5, ATF2, GCY1 r YPR1. Como se describe más adelante, estos genes codifican proteínas que inducen reacciones para cepas en la levadura. El gen ADE2 puede también ser trastornado de manera opcional, especialmente para integrar un gen heterólogo en la cepa de levadura. En una modalidad, la cepa de levadura de conformidad con la presente invención presenta por lo menos un gen heterólogo integrado dentro del cromosoma, en por lo menos un locus seleccionado entre ADE2, HIS3, TRP1 , LEU2, GCY1 , ATF2r YPR1 , la integración efectuándose de manera intragénica o intergénica en cercanía inmediata con uno de los loci. En una modalidad de la presente invención, dicha cepa de levadura presenta por lo menos un gen heterólogo ubicado en un plásmido de copias múltiples o un plásmido con bajo número de copias, dicho plásmido de copias múltiples seleccionándose entre los plásmidos basados en un replicón de 2 mieras de levadura que se replica en Saccharomyces cerevisiae y dicho plásmido de bajo número de copias se selecciona entre los plásmidos basado en un origen de replicación ARS cromosómico con un centrómero de levadura. Para aplicar una modalidad, y como se explica con mayores detalles abajo, la cepa de levadura de conformidad con la presente invención presenta por lo menos un gen o un ADNc heterólogo seleccionado dentro del grupo que consiste de gen de la esterol A7-reductasa y ADNc de citocromo P450 SCC, de adrenodoxina de adrenodoxina reductasa, de citocromo b5, de 3 ~hidrosteroide deshidrogenasa isomerasa, de citocromo P450 reductasa, de citocromo P450 C17, de citocromo P450 C21, de citocromo P450 Cll, y de secuencias que codifican estas proteínas. Estos genes, ADNc heterólogos se encuentran bajo el control de una secuencia promotora seleccionada dentro del grupo que consiste de secuencias promotoras endógenas de levadura TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GALIO, ATF2, TIR1 , ARH1 , ADE2, y del promotor híbrido GAL10-CYC1. Es necesario utilizar una secuencia de terminación para cualquier gen o ADNc heterólogo introducido de preferencia, seleccionada entre las secuencias de terminación de genes endógenos PGK1 , CYCl, ATF2, ADE2, NCPI. Se obtienen entonces bloques o cassetts de expresión que consisten de u promotor, el gen heterólogo (o bien ADNc, que codifica eventualmente la proteína madura precedida por el codón ATG que codifica la metionina (Met-mat) o bien una proteína de fusión que posee eventualmente señales de direccionamiento hacia los compartimientos celulares) y la secuencia de terminación. En un modo de realización, las cepas de levadura de conformidad con la presente invención presenta el bloque de expresión heterólogo esterol A7-reductasa integrado en el cromosoma en el locus ADE2. En una modalidad particular de la invención, la cepa de levadura comprende por lo menos un cassette de expresión de los genes que codifican P450scc, adrenodoxina co-factor de P450scc localizada en un plásmido de gran número de copias, y contiene un cassette de expresión de la adrenodoxina reductasa co-factor de P450scc localizada en un plásmido de una sola copia o de un bajo número de copias o es integrada en el cromosoma. De manera preferida, estos cassetts de expresión contienen la proteína madura precedida por una metionina, y la proteína se localiza en el citosol. En una modalidad, la cepa de levadura comprende por lo menos un cassette de expresión seleccionado entre los cassetts de expresión de la 3p-hidrosteroide deshidrogenasa isomerasa, de citocromo P450cl7, de citocromo P450c21 localizado en un plásmido de alto número de copias, de bajo número de copias, o bien integrado en el cromosoma. En una modalidad particular, las cepas de levadura de conformidad con la presente invención comprende por lo menos un cassette de expresión para la P450 11ß ubicada en un plásmido de copias múltiples, la proteina producida presentando una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias, y/o por lo menos un cassette de expresión para la adrenodoxina co-factor de la P450 11ß ubicado en un plásmido 'de copias múltiples, con un promotor débil (es decir cuya fuerza es similar a la fuerza de promotor CYC1) , la proteína producida presentando una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias . De manera preferida, las proteínas son producidas bajo forma de un precursor, con una señal homologa o heteróloga de direccionamiento hacia las mitocondrias, las proteínas tomando su forma madura en este compartimiento celular. Por consiguiente es interesante observar que en el caso particularmente preferido de aplicación de la presente invención, se introduce en la cepa de levadura dos copias del gen que codifica la adrenodoxina, una estas copias tiene el propósito de expresar la proteína en el citosol de la célula, y la otra copia fabricándose de tal manera que la proteína madura se encuentre entre las mitocondrias. En una modalidad particular, la cepa de levadura comprende también por lo menos un cassette de expresión (promotor de expresión tal como se mencionó arriba con una parte codificador del gen NCPl, ATR1 r y/o ATR2, con su propio terminador o un terminador de conformidad con lo definido arriba) colocado en un plásmido de copias múltiples, con bajo número de copias o bien integrado en el cromosoma. Los cassetts de expresión para NCPl, ATR1, y ATR2, pueden estar integrados especialmente en el locus NCPl de S. cerevisiae. En una modalidad particular, las cepas de levadura de conformidad con la presente invención expresa también la proteina AHlp, proteina homologa de la adrenodoxina reductasa de los mamíferos en la levadura, a un nivel superior al nivel de expresión fisiológico. La sobre- expresión de esta proteína puede obtenerse a través de técnicas bien conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia, por ejemplo gracias a la aportación de un nuevo cassette de expresión (promotor de expresión, parte codificadora del gen ARH1 con su propio terminador o un terminador de conformidad con lo definido arriba) además del gen endógeno en la levadura. De manera sorprendente, se ha mostrado que una expresión del gen ARH1 a nivel superior al nivel de expresión fisiológica incrementa de manera significativa la cantidad de esferoide producidos. Sin embargo, esta expresión no debe ser especialmente • importante para obtener un efecto deseado. Así, si una expresión de la proteína ARH1 a un nivel superior con relación a un nivel fisiológico es deseable, se debe cuidar de no sobre-expresar excesivamente esta proteína porque se podría perder este incremento de la producción de esteroides . La cepa de levadura de conformidad con la presente invención puede poseer un carácter poliploide, diploide, haploide, o aneuploide, sin perjudicar la aplicación de la invención. Se trata de preferencia de una cepa de Saccharo yces cerevísiae, especialmente derivados de las cepas FY 1679-28c, FY 1679-18b que son esporas de la cepa FY 1679 depositada ante la American Type Culture Collection bajo el número 96604. La invención tiene también por objeto una cepa de levadura porque se caracteriza porque se trata de la cepa CDR07 Mat-a ó TGY260, depositadas ante la CNCM el día 24 de enero del 2001, bajo los números de orden respectivos 1-2616 e 1-2615. La invención se refiere también a una cepa obtenida después del cruzamiento de CDR07 Mat-a y TGY260, y eventualmente la esporulación y transformación con un plásmido de levadura, especialmente las cepas UCY2 y UCY4 y las cepas UCY3 y UCY26 descritas en la presente invención. La invención tiene también por objeto cepas de levadura obténidas después del cruzamiento de UCY2 y TGY245, y eventualmente esporulación y transformación con por lo menos un plásmido de levadura, especialmente las cepas UCY5, UCY6, UCY16, UCY19, UCY20, UCY24, ÜCY25 y UCY26, también descritas en la presente invención. Es útil que la cepa de levadura de conformidad con la presente invención tenga los elementos necesarios para la excreción del esteroide producido en el medio de cultivo con el objeto de simplificar la purificación del producto final. La invención se refiere también a un procedimiento de producción de un esferoide, que se caracteriza porque comprende las etapas de fermentación de una cepa de levadura de conformidad con la presente invención en presencia de una fuente de carbono simple, y la recuperación del esteroide producido . Finalmente, la invención tiene también por objeto una preparación farmacéutica que comprende una cepa de levadura de conformidad con la presente invención, eventualménte con un excipiente farmacéuticamente aceptable, un excipiente de este tipo es bien conocido por parte de la persona con ciertos conocimientos en la materia. Aún cuando la cepa de levadura de conformidad con la presente invención produce un esteroide de manear autónoma a partir de una fuente de carbono simple, se puede también suministrar colesterol o un estructura similar, o. un sustrato ya presente como derivado de colesterol con el objeto de obtener los productos corriente abajo. La posibilidad de poder entrar en cualquier etapa, especialmente a nivel de pregnenolona o posterior de la vía del metabolismo del esteroide buscado permite por consiguiente suministrar especialmente a la levadura sustratos no naturales que llevan a la síntesis de esteroides no naturales y sustituidos, especialmente fluorados . En una primera modalidad, la cepa de levadura de conformidad con la presente invención permite especialmente la producción del esteroide buscado (especialmente el cortisol) , en una cantidad superior a 10 mg/1, de manera preferida mayor que 50 mg/1, de manera más preferida 80 mg/1, de manera todavía más preferida 100 mg/1, y especialmente 200 mg/1. En otra modalidad, el esteroide de interés (de manera preferida hidrocortisona) está presente en una proporción mayor que 20%, de preferencia 25%, de manera más preferida 30%, de manera más preferida 35%, de manera más preferida 40%, de manera más preferida 50%, de manera más preferida 65%, del total de esteroides producidos por la cepa de conformidad con la invención (especialmente los productos intermedios de síntesis) . Para que la cepa de levadura de conformidad con la presente invención pueda producir los esteroides de interés, es necesario que presente modificaciones genéticas. Así, la cepa de levadura de conformidad con la presente invención tiene por lo menos una modificación genética seleccionada dentro del grupo que constituido por la disrupción o la desactivación de un gen endógeno, la modificación del promotor de un gen endógeno, la duplicación de un gen endógeno, la introducción de por lo menos un gen heterólogo (especialmente un bloque de expresión con promotor) y/o terminador homólogo en una parte codificadora heterologa) , en una o varias copias, de manera episomal o cromosómica. De preferencia, la cepa de levadura de conformidad con la presente invención tiene varias (al menos cuatro) modificaciones genéticas tales como las mencionadas arriba. Asi, algunos genes endógenos de la levadura son favorablemente desactivados o trastornados. Se puede desactivar o trastornar los genes mediante la introducción, en la secuencia codificadora, de un gen exógeno (especialmente un bloque de expresión con promotor y/o terminador homólogo y una parte codificadora heterologa) como se describe más adelante, y/o de un marcador de selección. Se puede también modificar los promotores de sus genes con el objeto de reducir el nivel de expresión. El gen de levadura ATF2 (Cauet G. y colaboradores, Pregnenolone esterification in Saccharomyces cerevisiae. A potential detoxification mechanism [Esterificación de pregnenolona en Saccharomyces cerevisiae. Un mecanismo de detoxificación potencial] Eur J Biochem, 1999. 261(1): p. 317-24) codifica una acetil transferasa que utiliza la pregnenolona como sustrato y su disrupción permite suprimir esta reacción parásita de acetilación, cuyo producto no puede ser utilizado entonces, y permite incrementar de esta forma el rendimiento de esteroide de interés. Asi, los rendimientos pueden ser multiplicados por valores comprendidos entre 3 y 7 después de la desactivación del gen ATF2. Los genes GCY1 y YPR1 codifican aldo-queto-reductasa . Estos genes son provechosamente desactivados o trastornados . Estos dos genes fueron parte de una familia de seis genes más o menos homólogos que se creen codifican, los seis aldo-queto-reductasa. Sin embargo, los productos de estos dos genes son los más activos sobre los sustratos contemplados aquí, especialmente GCY1, y su desactivación es por consiguiente extremadamente interesante para la obtención de la hidrocortisona . Como se indicó arriba, es interesante desactivar el gen ERG5 con el objeto de acumular un sustrato que presenta una estructura más cercana posible a la estructura del colesterol. Sin embargo, se ha demostrado que la levadura de conformidad con la presente invención puede, a pesar de todo, producir los esteroides de interés a pesar de la actividad de este gen. Sin embargo, con el objeto de utilizar los rendimientos, puede ser útil desactivarlo a través de mutación, deleción y/o inserción. Sin que esto sea realmente crítico para el éxito global de la producción de esteroides con la levadura de conformidad con la presente invención, se puede también desactivar otros genes, por ejemplo ARE1 , ARE2, ADE2, 6 ATF1. Estos genes codifican todos proteínas cuya ausencia puede mejorar el rendimiento global de la síntesis del esteroide de interés. Tal como se describe en el artículo de Duport y colaboradores, previamente citado (Duport y colaboradores, 1998) se indica que la presencia de un bloque de expresión con promotor y/o terminador homólogo y una secuencia que codifica la A7-reductasa es útil porque permite efectuar la desaturación del doble enlace 7-8 del ergosterol y sus derivados, y obtener así uno o varios precursores de estructura más cercana a la estructura del colesterol, sustrato de inicio para la producción de pregnenolona. Así, resulta provechoso que la cepa de levadura de conformidad con la presente invención contenga este bloque de expresión. En un caso particular, dicho bloque de expresión de la ?7 reductasa está integrada en el genoma de la levadura, de manera preferente en el locus del gen ADE2, lo que provoca de esta manera la disrupción del gen ADE2. El promotor utilizado para la transcripción es un promotor inducible, por ejemplo GAL10-CYC1, o un promotor constitutivo, por ejemplo el promotor GA 10-GAL10-CYC1 el cuál es desregulado en la cepa CA10 descrita en Duport y colaboradores, 1998. La proteína utilizada es obtenida de preferencia a partir de Arabidopsis thaliana (pero también puede obtenerse de otra especie de mamífero), el ADNc es clonado bajo la forma nativa (ADN complementario justo después de una metionina de inicio de traducción) , y bajo el control de un terminador de transcripción clásico en la levadura, por ejemplo PGK1. Se observará que la actividad del gen A7-reductasa en la levadura ha sido descrita por Lecain E. y colaboradores, Cloning by metabolic interference in yeast and enzymatic characterization of Arabidopsis thaliana sterol delta 7-reductase [Clonación por interferencia metabólica en levadura y caracterización enzimática de esterol delta 7-reductasa de Arabidopsis thaliana]. J. Biol Chem, 1996. 271 (18): p. 10866-73, cuyo contenido técnico (especialmente las secuencias del gen A7-reductasa y las construcciones y métodos de operación) se incorpora por referencia en la presente solicitud. La primera etapa es la producción de pregnenolona, la cuál es obtenida después de introducción, en la levadura, de las enzimas que permiten transformar normalmente el colesterol en pregnenolona. En el caso presente, se trata de la enzima que permite la disociación de la cadena lateral (P450scc para disociación de cadena lateral) , con dos coenzimas (adrenodoxina, ADX, y adrenodoxina reductasa ADR) . La transformación de la levadura con estos bloques de expresión respectivos se describe en Duport y colaboradores, 1998, mencionado previamente. Se utiliza de preferencia un ADN complementario que codifica las proteínas maduras, con una metlonina agregada en el extremo N-terminal para permitir la traducción. Se utilizan promotores tales como el promotor híbrido Gñ lO-CYCl, o el promotor TEF1, para asegurar la transcripción de ADNc. Se utilizan terminadores plásticos, especialmente el terminador PGK1. Los diferentes )Nc que codifican las proteínas P450SCc/ ADR ó ADX pueden ser de origen de un vertebrado, por ejemplo, ser humano o bovino, pero también rata o pez. Los genes que codifican estas proteínas están de preferencia colocados en plásmidos, prefriéndose para P450scc y ADX un plásmido de copias múltiples con un bajo número de copias o un gran número de copias, especialmente derivados de un plásmido de 2 mieras de levadura, mientras que se utiliza de preferencia un plásmido de una sola copia o de un bajo número de copias para la expresión de ADR. El bloque de expresión para ADR puede también estar integrado en el cromosoma de la levadura. Esto permite controlar la expresión del ADR, puesto que parece que un exceso de expresión perjudica la actividad scc buscada. Las proteínas son expresadas de preferencia para poder ejercer su actividad en el citosol. La etapa siguiente es la conversión de la pregnenolona en 17 -hidroxi progesterona, a través de la acción conjugada de la 17a-hidroxilasa (P450cl7) y de la 33-OH-esteroide deshidrogenasa (3 ~HSD) .

Para la expresión de estas dos proteínas, se utiliza de preferencia promotores fuertes tales como TEF1, TDH3, GAL10-CYC1. Sin embargo, un promotor más débil, por ejemplo CYC1 puede también ser adecuado. Los terminadores utilizados son clásicos, provenientes especialmente de los genes PGK1, o NCP1. Se expresan los ADN complementarios que codifican proteínas completas . La especie de origen de estas proteínas no parece modificar los resultados obtenidos . Por consiguiente se puede utilizar proteínas de origen humano (especialmente una u otra de los dos isotipos de la 3ß-?3?) , de origen bovino, o bien de otros organismos (especialmente de peces) . Se trata, para estas dos proteínas, de obtener la mejor expresión posible, y se puede por consiguiente expresar en plásmidos de una sola copia o de copias múltiples con un bajo número de copias o un gran número de copias, o bien mediante la integración de los bloques de expresión en por lo menos un cromosoma de la levadura. Después se busca la conversión de la 17a-hidroxi progesterona en desoxicortisol, a través de la P450c21, lo que permite una hidroxilación en 21. Se trata de expresar la proteína a partir de su ADNc, de la mejor manera posible. Para este propósito, se utiliza un promotor fuerte (TEF1 , TDH3, GAL10-CYCl...)r hasta el promotor CYC1, y un terminador clásico (especialmente PGK1) para conseguir la unidad de transcripción. Esta se coloca en un plásmido de una sola copia o de copias múltiples, con un bajo número de copias o un gran numero de copias, o bien se integra en el genoma de la levadura. Se observará que la especie de origen parece ser importante aquí, y es preferible utilizar la P450c21 de origen humano. El desoxicortisol es convertido entonces en cortisol, bajo la acción del sistema P450cll, que contiene la P450cll, permitiendo la hidroxilación en ll-ß, una adrenodoxina y una adrenodoxina reductasa, como co-factores. Los inventores de la presente solicitud mostraron que los resultados obtenidos eran mejores cuando este último sistema es expresado en la membrana interna de las mitocondrias de levaduras. Asi, es interesante producir proteínas de fusión que llevan como precursor la secuencia de direccionamiento mitocondrial del precursor de la proteína Cox6p de la levadura. Se utiliza de preferencia también el ADNc que codifica las proteínas maduras. La proteína P450cll es por consiguiente la proteína de origen humano, bovino y una proteína híbrida humana-bovina . Esta última construcción es la forma preferida para la aplicación de la presente invención. El gen utilizado en la unidad de transcripción se encuentra de preferencia bajo el control de promotor CYC1. Es interesante colocar un intron de ß-globina que conecta en un terminador de gen de hormona de crecimiento humano en 3' de la secuencia codificadora. La unidad de transcripción se coloca de preferencia en plásmido de copias múltiples. La adrenodoxina es utilizada en su forma madura, colocada con una secuencia de direccionamiento hacia las mitocondrias, como por ejemplo seleccionada entre las de los precursores de proteínas Cox6p, Cox4p, fumarasa, AERHlp, F9 ATPasa, y bajo el control de un promotor seleccionado especialmente entre TDH3, TEF1, CYC1. Se prefiere una proteína de origen bovino o humano . Es conveniente conectar un terminador en la unidad de transcripción, que puede ser PGK1. Se expresa el bloque de expresión a partir de un plásmido de copias múltiples. La proteína que hace la función de adrenodoxina reductasa es la proteína ARHlp, endógena de levadura, normalmente expresada en las mitocondrias del huésped. De manera preferida, se transforma sin embargo la levadura de tal manera que la cepa huésped contenga una copia natural del gen A íTl y una segunda copia del gen ARH1 bajo el control del promotor CYC1. La actividad de dicha proteína es indispensable para obtener el efecto buscado, se ha observado que la desactivación del gen es letal para levadura (Lacour T., T. Achstetter, y B. Dumas, Characterization of recombinant adrenodoxin reductase homologue (Arhlp) from yeast. Implication in in vitro cytochrome p45011beta monooxygenase system. J. Biol. Chem, 1998. 273(37): p. 23984-92) . Es importante observar que la sobre expresión de este gen parece ser tóxica para el organismo, y que el promotor seleccionado debe por consiguiente permitir un nivel de expresión que lleva a la actividad ll-ß hidroxilasa buscada sin ser perjudicial para la levadura. De manera sorprendente, se ha mostrado que una expresión del gen ARH1 a un nivel superior del nivel de expresión fisiológica incrementa de manera significati a la cantidad de esteroides producidos . Sin embargo, como se mencionó arriba, esta expresión no debe ser excesivamente importante para obtener el efecto deseado. Así, si una expresión de la proteína ARH1 a un nivel superior en comparación con un nivel fisiológico es deseable, se debe tomar cuidado para no sobre expresar de manera excesivamente fuerte esta proteína porque se puede perder este incremento de producción de esteroides. A título de ejemplo, una integración del cassette de expresión para Aífl que mantiene como promotor el promotor CYC1, a nivel del locus EU2 de S. cerevisiae proporciona niveles de expresión y resultados satisfactorios. A la inversa, la integración del mismo locus de un cassette que tiene el promotor TEF1, reconocido como mucho más fuerte que el promotor CYCl, da resultados menos interesantes . Así, se introduce de preferencia dos copias de una unidad de transcripción que codifica la proteína co-enzima ADX, una de ellas teniendo una actividad fuera de las mitocondrias y especialmente en el citosol, y la otra teniendo una actividad dentro de las mitocondrias de la células huésped. Es también posible introducir otros genes, especialmente los genes que codifican las proteínas que tienen una actividad NADPH P450 reductasa, tales como NCP1 (reductasa de levadura que se conoce también como CPR1) , ATR1 o bien ATR2 (reductasas de plantas) , reductasa humana. Estas proteínas mejoran las actividades de P450cl7 y P450c21. Se utiliza ya sea el promotor endógeno {NCP1) , o bien se colocan los ADN que codifican las proteínas bajo el control de promotores tales como GAL10-CYC1, CYC1, TEF1... Es también posible producir el gen TG 1, que codifica una proteína que tiene una actividad de desesterificación, bajo el control del promotor fuerte como por ejemplo GAL10-CYC1, en un plásmido de copias múltiples o de una sola copia. Esto permite la reducción del efecto de reacciones de esterificaciones parásitas de los esteróles que pueden subsistir aún después de la desactivación de ATF2, y especialmente las producidas por el producto de los genes ARE1 y ARE2. Se puede también agregar un plásmido que expresa el citocromo b5 de la levadura o bien otra especie, que es un co-factor en varias de las reacciones definidas arriba. Asimismo, cuando se desea producir DHEA, se puede introducir un plásmido que codifica la desmolasa (P450 o¾7, con bajo número de copias o gran número de copias, bajo el control de un promotor como por e emplo GAL10-CYC1, CYCl, TEF1, con un terminador PGK1. Se puede también introducir un ADNc que codifica el citocromo P450cl7 que tiene una actividad liasa, como por ejemplo, el de origen humano, , en presencia de un exceso de NADPH P-450 reductasa, como las reductasas de mamífero, NCP1 , ATR1, o bien ATR2. Estas unidades de transcripción utilizan de preferencia un promotor fuerte . Finalmente, es posible restaurar la actividad de genes endógenos ERG6 y ERG2, inhibidos por la pregnenolona, colocándolos bajo el control de un promotor constitutivo fuerte. Se puede también introducir otros genes heterólogos que codifican especialmente una proteína de actividad 24, 25 esterol reductasa, o bien el gen HMG1, presente en la vía de síntesis del colesterol en el ser humano. Es también interesante introducir el gen MDR1 humano que codifica una bomba no inhibida con la acumulación de esteróles anormales que aparecen debido a la inhibición del gen ERG6 por la pregnenolona. Se permite expulsar estos productos cuya acumulación excesivamente grande podría ser tóxica para la célula huésped. Se puede también sobre expresar el gen PDR12 de levadura lo que tendrá un efecto de destoxificación para los esteroides que pueden inhibir el crecimiento de la levadura.

Se entiende que cuando se habla del gen antes mencionado, no se habla solamente del fragmento de ADN que codifica la proteina presenta la actividad buscada (y específicamente el fragmento de ADNc que representa en particular las formas maduras), sino también los promotores (especialmente TEF1 , GA 10-GYC1, CYC1, TDH3) y los terminadores (en particular PCK1) . Estas unidades de transcripción son introducidas de preferencia en los plásmidos con bajo número de copias, o gran número de copias, o bien integradas en el cromosoma de la levadura. Se entiende también que, según el objetivo buscado, y especialmente el esteroide que se desea producir, es posible introducir solamente unos de los genes codificadores para las diferentes proteínas en cada etapa, y suministrar un intermediario a la levadura con el objeto de obtener un esteroide corriente abajo en la cadena del metabolismo. Es también fácil no introducir genes que permiten obtener los productos colocados muy corriente abajo, y poder por consiguiente pararse relativamente alto en la cadena del metabolismo. La levadura utilizada para la aplicación de la presente invención es de preferencia: - la cepa FY 1679-28c, descrita en Duport y colaboradores. 1998, que posee el genotipo [MATOL, rho'r ura3-52r trp 1 ?63, leu2 ?1 , his3 ?200, GAL2r fenl) . Esta cepa ha sido descrita también por T ierry y colaboradores. The complete sequences of the 8.2 kb segment left of ??? on chromosome III reveáis five ORF' s, including a gene for a yeast ribokinase [La secuencia completa del segmento de 8.2 kb dejado de MAT en el cromosoma III revela cinco ORF's, incluyendo un gen para una riboquinasa de levadura]. Yeast, 1990. Nov-Dec 6(6): p. 521-34. - la cepa FY 1679-18b, que posee el genotipo {MATa, rho~, ura3-52, trp 1 ?63, leu2 ?1 , his3 ?200, GAL2, fenl) . Estas dos cepas poseen por consiguiente un genotipo idéntico y un signo opuesto. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Representación esquemática de una via de biosintesis de la hidrocortisona tal como se puede obtener de conformidad con la presente invención. Figura 2 : Representación esquemática de construcción de cepas de levaduras ejemplificadas de conformidad con la presente invención. Figura 3 : Carta del plásmido pCV29. PGK term: terminador PGK. GAL10/CYC1 prom: promotor GAL10/CYC1. HGH term: terminador de gen de la hormona de crecimiento humana. Intron ß-globina: intron del gen de la ß-globina de conejo. CYC1 prom: promotor CYC1. PGH term: terminador PGK. S. cerevisiae 2 mieras: origen de replicación de 2 mieras de S cerevisiae. Cox6pre: pre-secuencia de la citocromo oxidasa bajo la unidad 6. P450 11ß bovino/humano : ADNc fusionado bovino/humano de la ?45011ß. Mat ADX: forma madura de ADX con una metionina en NH2 terminal. E. coli replicón: Replicón de E. coli. Figura 4 : Carta del plásmido pCCl2. CYC1 prom: promotor CYC1. PGK term: terminador PGK. ARS CEN: origen de replicación cromosómica de S. cerevisiae. E. coli replicón: Replicón de E. coli. TDH3 prom: promotor TDH3. 3ß-?3??: ADNc de la 3ß hidroxi esteroide deshidrogenasa. matADR: forma madura de ADR precedida de una metionina. Figura 5: Carta del plásmido pFMIO. CYClp: promotor CYC1. ?45011ß:' ADNc fusionado bovino/humano de la ?45011ß. ADE2 : gen ADE2 de la levadura. TDH3p: promotor TDH3. 3ß-??O: ADNc de la 3ß hidroxi esteroide deshidrogenasa. Rl : pie de recombinación cuya secuencia se proporciona en SEQ ID NO: 39. Gñ lO/CYClp: promotor GAL10/CYC1. matADX: ADNc que codifica la forma madura de ADX. URA3 : gen URA3 de la levadura. P450scc: ADNc que codifica la forma matura de P450ECC (CYP11A1) . Origin 2 micron: origen de replicación 2 mieras de S. cerevisiae. R2 : pie de recombinación cuya secuencia se proporciona en SEQ ID NO: 40. EJEMPLOS Los ejemplos siguientes describen un modo de aplicación de la presente invención y no deben considerarse como limitativos de la invención. Para las construcciones se inicia a partir de las cepas de levadura FY1679-28c y FY1679-18b descritas arriba.

Ejemplo 1: Disrupción del gen YPRl La construcción de la interrupción del gen YPRl (YDR367 ) por el gen URA3 en el plásmido pPOLYIII se obtuvo a través de 4 reacciones en cadena de polimerasa sucesivas. Se efectuó por un lado 3 reacciones en cadena de polimerasa independientes para obtener la parte 5' del gen YPRl (PCR 5) , el gen URA3 funcional bordeado por secuencias YPRl (PCR 6), la parte 3' YPRl (PCR 7) . El ADN de la PCR5 ha sido obtenido por amplificación en una matriz de ADN genómico con los oligonucleotidos OTG11314 (SEQ ID NO: 1) y OTG11315 (SEQ ID NO: 2) asi como el ADN de la PCR7 se obtiene por amplificación gracias a los nucleótidos OTG11316 (SEQ ID NO: 3) y OTG11317 (SEQ ID NO: 4) en la misma matriz . El gen URA3 flanqueado de la región YPRl 5' y 3' es amplificado gracias a los oligonucleotidos OTG11463 (SEQ ID NO: 5) y OTG11464 (SEQ ID NO: 6) en una matriz pTG10054 de conformidad con lo descrito en Degryse E. y colaboradores. In vivo cloning by homologous recombination in yeast using a two-plasmid-based system [Clonación in vivo por recombinación homologa en levadura utilizando un sistema basado en dos plásmidos] . Yeast, 1995. 11(7): p. 629-40, que se incorpora aquí por referencia en cuanto a la descripción de este plásmido . Los productos de las PCR5, PCR6 y PCR7 han sido mezclados de manera equimolar y después amplificado por reacción en cadena de polimerasa gracias a a los oligonucleótidos OTG11314 (SEQ ID NO: 1) y OTG11317 (SEQ ID NO: 4) para obtener un producto de PCR8. Este producto de PCR8 ha sido digerido por al enzima Xhol y después subclonado en el plásmido pPOLYIII (descrito por Lathe R. y colaboradores, Plasmid and bacteriophage vectors for excisión of intact inserts, Gene, 1987.57: p. 193-201 y que se incorpora aqui por referencia en cuanto a la descripción de este plásmido. El plásmido pTG12011 que permite la disrupción del gen parásito YPRl por el gen URA3 es digerido por la enzima Xhol. El producto de la digestión es utilizado para transformar la cepa FY1679-18b utilizando el método de cloruro de litio bien conocido por parte del experto en la materia. Los transformantes son seleccionados en un medio sin uracílo. Los transformantes son analizados por amplificación por reacción en cadena de polimerasa utilizando los oligonucleótidos que han servido a la construcción del plásmido de pTG12011. Los clones positivos en esta prueba son después tamizados a través del método de bioconversión de 17OH progesterona descrito arriba en presencia de glucosa como fuente de carbono. La capacidad de bioconversión es analizada por HPLC de conformidad con lo descrito por Dumas y colaboradores, 1996 y Degryse y colaboradores, 1999 cuyos contenidos son incorporados por referencia a la presente solicitud, especialmente las explicaciones de los estudios de bioconversión o bien de conformidad con lo descrito en Kuronen P. y colaboradores, Reversed-phase liquid chromatographic separation and simultaneous profiling of steroidal glycoalkaloids and their agl cones . Chromatogr A, 1999.863(1): p. 25-35. Un clon TGY195#4 se selecciona para nuevas caracterizaciones. La cepa TGY195#4 es transformada utilizando a la vez el plásmido YRp7 (Parent SA, y colaboradores, Vector systems for the expression, analysis and cloning of DNA sequences in S. cerevisiae [Sistemas de vectores para la expresión, análi'sis y clonaciones de secuencias de ADN en S. cerevisiae]. Yeast, 1985. 1(2): p. 83-138, 19857 que se incorpora por referencia en cuanto a la descripción de este plásmido) (1 g) y 5 µg de plásmido pTG12045 (descrito más adelante) digerido por Notl. Las cepas transformadas son seleccionadas en un medio sin triptófano. Colonias (678 colonias) son sembradas de nuevo en un medio que contiene triptófano (para eliminar el plásmido YRp7) y en un medio que contiene triptófano y 5-fluoro-orotato (5F0) para seleccionar las colonias que han perdido el gen URA3 que interrumpe el gen YPR1. Ejemplo 2: Construcción de diferentes plásmidos Para la sobre-expresión de la proteina P450c21 en la levadura, se utilizan dos tipos de promotores, TEF1 ("factor de elongación de transcripción 1") y TDH3 ("gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenase 3) . En todos los casos, el terminador de transcripción es el terminador PGK. En estos plásmidos, el fragmento SaU, MluI, lleva ADNC de la P450c21 humana. a) Construcción de los plásmidos pTG10470 y pTG10469 El plásmido pTG10289 ha sido obtenido por modificación de pMAc21 (Wu, DA. y colaboradores, Expression and functional study of ild-type and mutant human cytochrome P450c21 in Saccharomyces cerevisiae [Expresión y estudio funcional de citocromo P450c21 de ser humano mutante y de tipo silvestre en Saccharomyces cerevisiae}. DNA Cell Biol, 1991. 10(3) : p. 201-9) por digestión con KpríL, MluI e introducción del oligonucleótido OTG5868 (SEQ ID NO: 27) . El ADNc de este plásmido proviene de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, Estados Unidos de América) bajo el nombre de pc21/3c. Es el fragmento EcoRl-BamHI 1.6 kb que sirvió de base para la construcción de diferentes plásmidos. Las modificaciones que se hicieron se describen en el articulo antes mencionado y en el articulo Hu y colaboradores, 1990. En esta manipulación, la parte no codificadora de la P450c21 del plásmido pMAc21 que contiene el cassette de expresión de la P450c21 ha sido eliminada asi como el sitio KpríL que se encontrará ahi . El plásmido pTG10292 ha sido obtenido por transferencia del ADNc c21 humano (fragmentos Salí, MluI) del plásmido pTG10289 en el plásmido pTG10031 (descrito en Degryse y colaboradores, 1995, que se incorpora por referencia a la solicitud) gracias a los sitios Salí, y MluI. El plásmido pTG10475 ha sido obtenido por reacción en cadena de polimerasa y recombinación. De hecho a partir del plásmido pTG10292, un fragmento del ADNc de P450c21 humana que representa aproximadamente 250 nucleótidos ha sido amplificado gracias a los oligonucleótidos OTG7410 (SEQ ID NO: 7) y OTG5927 (SEQ ID NO: 8) . Este fragmento representa la secuencia codificadora de la P450c21 humana de un sitio Salí y de la secuencia ?7???. Este fragmento fue digerido por Salí y después ligado en el fragmento lineal de pTG10292 digerido por Salí y después se llevó a cabo un experimento de recombinación de a BJ5183 descrita por Degryse y colaboradores, 1995. El plásmido obtenido pTG10475 lleva un ADNc de la P450c21 con una secuencia codificadora idéntica a la secuencia codificadora del ADNc natural, a diferencia del plásmido pMAc21, en un fragmento compatible con los vectores utilizados generalmente por los inductores, es decir, un fragmento flanqueado por los sitios de restricción Salí y MluI. Este fragmento tiene el entorno siguiente alrededor del codón ATG de inicio de la traducción GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC (SEQ ID NO: 9) .

A partir de este plásmido, el fragmento Salí, Mlul que lleva el ADNc de la P450c21 humana ha sido transferido al plásmido pTG10158 (Degryse y colaboradores, 1995) por clonación clásica para proporcionar el plásmido pTG10472. Este mismo fragmento Salí y Mlul del plásmido pTG10472 fue después transferido por clonación clásica al plásmido pTG10085 (Degryse y colaboradores, 1995) para proporcionar el plásmido pTG10469. Este plásmido posee entonces el ADNc de la P450c21 humana bajo el control del promotor TEF1, con el terminador PGK1. Este mismo fragmento que lleva el ADNc de P450c21 en un fragmento de restricción 5aJI y Mlul fue transferido al plásmido pTG10092 por recombinación en la cepa BJ5183 para proporcionar el plásmido pTG10470 (Degryse E. y colaboradores. In vivo intermolecular recombination in Escherichia coli: application to plasmid constructions [Recombinación intermolecular in vivo en Escherichia coli: aplicación a construcciones de plásmido]. Gene, 1996. 170(1): p. 45-50) . El plásmido pTG10470 lleva entonces el ADNc de la P450c21 humana bajo el control del promotor TEF1 y de un terminador PGK1 con un marcador de selección URA3-d con el entorno del codón iniciador ATG descrito arriba. b) Construcción del plásmido pTG12036 El plásmido pTG12036 ha sido construido en cuatro etapas a partir de pTG10802. El plásmido pTG10801 (que se encuentra en el origen del plásmido pTG10802) es un plásmido de tipo pUC en donde una serie de sitios de restricción fue insertada entre los sitios Xhol y Xhol. Esta serie de sitios incluye los sitios ¿findlll, SnabI, Clal y Spel. Entre los sitios Hindlll y Clal, el cassette Hindlll Clal del pTG10470 que lleva el promotor TEFlr el ADNc de P450c21 humano y el terminador PGK1 fue insertado entre los sitios Hindlll y Clal de pTG10801 para proporcionar pTG10802. Este plásmido fue después digerido por Xhol y el cassette producido presenta entonces deleción para introducir un fragmento de reacción en cadena de polimerasa flanqueado por sitios Xhol. Este fragmento de 2.5 kb proviene de la amplificación del par de oligonucleótidos OTG11844 (SEQ ID NO: 10) y OTG11845 (SEQ ID NO: 11) en el plásmido pTG12010#40 (véase abajo) para obtener un fragmento blanqueado por Xhol que contienen el gen GCY1 interrumpido por el gen URA3 flanqueado en 5' por un sitio de restricción Clal. Este fragmento ha sido clonado entre los sitios Xhol del plásmido pTG10802 para obtener él plásmido pTG12035. Con el propósito de introducir el sitio Hindlll faltante, el plásmido pTG12010#36 ha sido utilizado. Este plásmido es esencialmente idéntico a pTG12010#40 pero posee un sitio HZndlII en 3' del gen URA3 en el limite entre el gen GCY1 pero no posee sitio Clal en 5' del gen URA3 en la unión con el gen GCYl (véase abajo) . Por recombinación in vivo entre E. coli entre el fragmento Ncol, BamHI de 2.2 kb, que lleva de 5 ' hasta 3 ' un fragmento de gen URA3, el f agmento 3 ' del gen GCYl y después una parte del plásmido pTG12035, es decir el gran fragmento Stul, AflII de 4.45 kb. Se obtiene el plásmido PTG12036. El plásmido obtenido pTG12036 posee el gen GCYl interrumpido por el gen URA3 flanqueado por sitios Clal y ffindIII, respectivamente en 5' y 3'. Este fragmento es después reemplazado por el cassette de expresión de la P450c21 portado por el fragmento 2.33 kb de Clal y HindIII del plásmido pTGl0469 (véase arriba) para obtener el plásmido pTG12086. c) Construcción del plásmido pTG12045. El sitio único Sphl del plásmido pPOLYIII es destruido por inserción del par de oligonucleótidos complementarios OTG11975 (SEQ ID NO: 12) y (SEQ ID NO: 13) . El sitio Sphl de pPOLYIII es destruido y reemplazado por un sitio Clal para proporcionar el plásmido pTG12040. En el plásmido pTG12040 entre los sitios Clal y EcoKL, se introduce un fragmento de ADN genómico Clal JSCOJ I que corresponde a la parte 3' de 0.7 kb del gen YPR1 obtenido por amplificación con los oligonucleótidos OTG11981 (SEQ ID NO: 14) y OTG11982 (SEQ ID NO: 15) para proporcionar el plásmido pTG12041. En este plásmido pTG12041 de 2.84 kb, la parte 5' del gen YPR1 (0.66 kb) amplificada por los oligonucleótidos OTG11314 (SEQ ID NO: 1) y OTG11980 (SEQ ID NO: 16), a partir del ADN genómico de levadura silvestre es clonada bajo la forma de un fragmento Xhol HindIII entre los sitios Salí y HindIII del plásmido pG12041. Se obtiene el plásmido pTG12042 de 3.5 kb. Este plásmido lleva el gen YPR1 interrumpido por los sitios Clal e HindIII. Entre estos sitios, el cassette del citocromo P450c21 es clonado bajo la forma de un fragmento Clal HindIII de 2.33 kb que proviene del plásmido pTG10469. De esta forma se obtiene el plásmido pTG12045. d) Construcción de los plásmido pTG12010#36 y #40 El plásmido pTG 12010 fue construido con base en el plásmido pUC19 (Yanisch-Perron y colaboradores, Improved M13 phage cloning vectors and ost strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors [Vectores de clonación de fagos M13 mejorados y cepas huéspedes: secuencias de nucleótidos en vectores M13mpl8 y pUC19] . Gene, 1985. 33(1): p. 103-19) mientras que el plásmido pTG12011 fue construido con base en el plásmido pPOLYIII (Lathe y colaboradores, 1987) . La construcción de la disrupcxón del gen GCYl por el gen URA3 en el plásmido pUC19 se obtuvo a través de cuatro amplificaciones y sucesivas por reacciones en cadena de polimerasa. Por un lado, se efectuaron tres reacciones en cadena de polimerasa independientes para obtener la parte 5' del gen GCY1 (PCR1) , el gen URA3 funcional flanqueado por secuencias GCY1 (PCR2) , la parte 3' del gen GCY1 (PCR3) . Las partes 5' y 3' del gen GCY1 gracias a pares OTG11285, OTG11286 y OTG11287, OTG11289 (respectivamente SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 20) en una matriz de ADN genómico de la cepa FY1679-28c. El gen URA3 flanqueado de las secuencias GCY1 {'para obtener una deleción de una parte de la secuencia codificadora del gen GCY1, es amplificado gracias a loa oligonucleótidos OTG11305 (SEQ ID NO: 21} y OTG11306 (SEQ ID NO: 22) a partir de una matriz de plásmido pTG10054 linealizada (Degryse y colaboradores, 1995) . Las condiciones de tampón y de concentración en matriz y cebadores para la amplificación son descritos por el productor o fabricante de la enzima Taq ADN polimerasa, y particularmente para la enzima elongasa desarrollada por Life Technologies . Los ciclos de temperatura son los siguientes : un primer ciclo de 6 '30 para desnaturalizar el cebador y la matriz y después 30 ciclos de 30s a una temperatura de 93° C, 2 minutos a 54° C y 3 minutos a 68° C, el último ciclo es de 5 minutos a 72° C. Los productos PCR1, PCR2 y PCR3 se mezclan de manera equimolar y se amplifican de nuevo gracias a los oligonucleótidos OTG 11285 (SEQ ID NO: 17) y OTG11289 (SEQ ID NO: 20) . El producto final PCR4 de un tamaño de 2.9 kb es después subclonado entre los sitios de restricción Kpnl y BamHI del plásmido pUC19 para obtener el plásmido pTG12010. La estructura del plásmido fue verificada por perfil de restricción y secuenciamiento nucleotidico de los extremos . La clonación del pTG12010 permitió obtener dos versiones de este plásmido, la versión pTG12010#40 (pTG12040 clon 40) y pTG12010#36. ¦ La idea inicial era obtener el gen GCY1 interrumpido por el gen URA3 bordeado por los sitios de Clal e HindIU, respectivamente, en 5' y 3' del gen. De hecho, dos plásmidos diferentes fueron obtenidos, los cuales difieren únicamente por la presencia o ausencia de sitios Clal e HindIU en los extremos del gen ???3. El plásmido pTG12010#40 posee un sitio de restricción HindIU en el extremo 3' del gen URA3 pero no posee sitio Clal en 5'. El plásmido pTG12010 #36 no posee sitio HindIU en el extremo 3' pero un sitio Clal en el extremo 5' del gen. Esta propiedad es utilizada para obtener el plásmido que posee el gen ÜRA3 bordeado por los sitios HindIU y Clal que interrumpen la secuencia codificadora de GCJ1. e) Construcción del plásmido pTG12086 Este plásmido sirve para 1 integración de un cassette de expresión para la P450c21 asi como para la disrupción del gen GCY1 al mismo tiempo. Este plásmido ha sido construido a partir del plásmido pTG12036 del plásmido pTG10614. La construcción del plásmido pTG10614 fue efectuada de la siguiente manera. Este, plásmido fue construido a partir de pTGl0212 (Degryse y colaboradores, 1995) que es un plásmido de expresión de levadura basado en el promotor TDH3, un terminador PGKl y un marcador de selección URA3-d. Por recombinación homologa en E. coli, el marcador de selección es reemplazado por el marcador de selección de plásmido de pTG10054 (Degryse y colaboradores, 1995) . Para este propósito, el fragmento MluI, Fsol de pTG10054 de 2.1 kb que contiene el marcador URA3 flanqueado por secuencias de recombinación es recombinado con el gran fragmento HindIII de pTG10212 para proporcionar el plásmido pTGl0610 que posee las mismas características que pTG10212 (Degryse y colaboradores, 1995) con un marcador ÜRA3 en la misma orientación que pG10054. El fragmento Salí MluL que lleva el ADNc de cxtocromo P450c21 humano del plásmido pTG10472 (véase arriba) es transferido al plásmido pTG0610 para proporcionar el plásmido pTG10614. El fragmento Clal HindIII de este plásmido que contiene de 5' a 3', el promotor TDH3, el ADNc de la P450c21 humana flanqueado por sitios Salí y MluI y después el terminador PGKl es transferido el plásmido pTG12036 para proporcionar el plásmido pTG12086 que contiene entonces la secuencia del gen GCYlf interrumpido por el cassette de expresión TDH3 del cxtocromo P450c21 humano. f) Construcción del plásmido pTG12048 El plásmido pTG12048 ha sido construido a partir de los plásmidos pFL26CD, pTG10925 y pTG10953. El pTG10953 idéntico al plásmido descrito en Lacour y colaboradores, 1998 pero el promotor TEFl que es portado por un fragmento Clal Salí es reemplazado por un promotor CYC1 (Degryse y colaboradores, 1995) . El cassette de expresión es llevado por un fragmento de ADN Notl-Notl. El plásmido pTG10925 ha sido construido a partir de pFL26CD descrito por Duport y colaboradores, 1998. El plásmido contiene un fragmento genómico de la levadura que comprende los genes LEU2 y NFS1 orientado de 5' hacia 3' y 3' y 5", respectivamente. Un cassette de expreesión del )N flanqueado por sitio otl ha sido introducido en la región intergénica para proporcionar el plásmido pTG10925. Este cassette (TEFl -.ADR bovino madura - terminador PGK1) ha sido reemplazado por un nuevo cassette que comprende el gen ???1 bajo el control del promotor CYC1 y el terminador de PGK1 para proporcionar el plásmido pTG12048. En este plásmido, el gen LE02 y el cassette de expresión se encuentran en la misma orientación transcripcional . Ejemplo 3. Construcción de la cepa TGY212#1 Una colonia es seleccionada en el tamiz descrito en el ejemplo 1. Tiene como nombre TGY212#1. Esta colonia es sometida a un experimento de bioconversion de conformidad con lo descrito previamente con 100 g/ml de sustrato 170H progesterona, la cepa es cultivada en un medio mínimo complementado por aminoácidos necesarios y uracilo. Esta cepa puede convertir la 170H progesterona en 11-desoxicortisol con una eficacia del orden del 47% en 24 horas con una baja producción de 4 pregnena 17a, 20a diol 3 ona en estas condiciones (menos que 0.5%) . En ciertas condiciones (medio rico definido de tipo Kapeli con galactosa como fuente de carbono y arranque del cultivo de alta densidad: DO 600 nm = 5) , la capacidad de reducción de la cetona es incrementada para alcanzar 11% del sustrato de inicio con una capacidad de bioconversion reducida a 1.5% del sustrato de inicio. En estas condiciones, la presencia probable del gen GCY1 constituye un gen para la bioconversion de la 17OH progesterona. Se ha decidido por consiguiente interrumpir el gen GCY1 para impedir su actividad. Ejemplo 4: Construcción de la cepa TGY243 Para este propósito, la cepa TGY212#1 ha sido transformada por 3 µg de plásmido pTG12010#36 linearizado por las enzimas de restricción Sphl y EcoRI. Veintisiete transformantes han sido seleccionados en un medio mínimo complementado para las auxotrofias de TGY212#1 pero sin uracilo. Estas colonias fueron sometidas a prueba de bioconversion en un medio mínimo complementado con galactosa como fuente de carbono puesto que es un inductor conocido de GCY1. Todos los clones TGY243 presentaron una capacidad de conversión de la 170H progesterona en 11-desoxicortisol sin producir cantidades detectables de 4-pregnene 17a, 20a diol 3 ona. Un clon TGY243#1 ha sido seleccionado para introducir en el lugar del gen ÜRA3 un cassette de expresión para la P450c21 humana. Ejemplo 5: Construcción de la cepa TGY245 Esta cepa TGY243#1 es transformado por el plásmido YRp7 (1 g) descrita por Parent y colaboradores, 1985 y por el plásmido pTG12086 linearizado por la enzima Xfrol (5 µg) . El fragmento transformador de pTG12086 contiene la secuencia codificadora de GCY1 interrumpida por un cassette de expresión para la P450c21 humana [TDH3: : ADNcP450c21 humana: terminador PGK1) . Las colonias que crecen en ausencia de triptófano son seleccionadas. Estas 381 colonias son después transferidas a un medio que contiene triptófano y 5 fluoro orotato. Una decena de colonias son después probadas en un medio rico de tipo YPG complementado con triptófano, histidina, leucina y uracilo en una concentración de 50 g/ml. Las cepas son manejadas para que conviertan la 17OH progesterona a una concentración de 100 µg/ml a partir de una DO600nm de 0.1 durante 16 horas. Entre estos diez clones, se selecciona un clon TGY245#2D de conformidad con dos criterios, su capacidad de conversión de la 170H progesterona en 11-desoxicortisol y segundo la ausencia de formación de 4-pregnen-17a, 20a-diol-3-ona lo que indica la disrupción de GCY1. Ejemplo 6: Construcción de la cepa TGY260 La cepa fue construida por transformación de la TGY245 por el plásmido pTG12048 que permite la sobre-expresión del gen ARífl en el locus LEU2. La cepa TGY260 fue construida a partir de la cepa TGY245 que fue transformada por el plásmido pTG12048 linearizado. Este plásmido pTG12048 es un plásmido de integración intergénica que lleva el marcador de selección LEU2. En este plásmido, en la región entre el gen LEU2 y el gen NFS1 se integra un cassette de expresión para el gen ARHl (Lacour y colaboradores, op. Cit) . Este cassette contiene un promotor CYC1 seguido del gen ARífl y del terminador PGK1 flanqueado por los sitios de restricción íVotl. Este plásmido pTG12048 ha sido linearizado por las enzimas de restricción Xnol y Salí. Este fragmento es utilizado para transformar las cepas TGY245 utilizando un método clásico de transformación de cloruro de litio. Las colonias transformantes son después seleccionadas en un medio que no contiene leucina. Se selecciona una cepa TGY260. SE deposito una cepa TGY260 ante la CNCM el 24 el dia 24 de enero de 2001 bajo el número 1-2615. Ejemplo 7: Construcción de la cepa CDR07mat La cepa FY1679-28c fue transformado por el plásmido pCD62.1, descrito en Duport y colaboradores, 1998, (cuyo contenido técnico de la construcción de plásmidos y obtención de cepas que incorporan por referencia a la presente solicitud) , para proporcionar la cepa CDR01. Esta cepa es transformada por el plásmido pCD78, también descrito por Duport y colaboradores, y se obtiene la cepa CA03. Se trastorna el gen ERG5 de dicha cepa CA03 con un cassette que' proporciona una resistencia a la higromicina y se obtiene la cepa CA10. Esta cepa es cruzada con una cepa pariente FY1679-18b, y empieza a producir esporas. Las esporas son aisladas de conformidad con técnicas clásicas en un medio minimo complementado para las auxotrofias, es decir, uracilo, triptófano, leucina e histidina. Las esporas son tamizadas de conformidad con los criterios que son la resistencia a la nistatina (12 g/ml en medio minimo) y la resistencia a la higromicina (100-150 µg/ml en medio rico) . Las esporas resistentes a estos dos productos son después analizadas en cromatografía en fase gaseosa para determinar la presencia de campesterol como ésteres principal de las membranas. La presencia de campesterol en las membranas de las cepas junto con la ausencia de ergosta 5-22 dienol indica el buen funcionamiento de la ?7 reductasa. Una espora CDR07 MAT es seleccionada de conformidad con los criterios siguientes.

La cepa CDR07 ???a fue depositada ante ia CNCM el día 24 de enero del 2001 bajo el número 1-2616. Ejemplo 8: Construcción de las cepas UCY2 y UCY4 SE cruzan las cepas TGY260 y CDR07 MATa para obtener la cepa SB14. Esta cepa empieza a producir esporas y se obtienen las cepas segregantes YCC4 e YCC5 (véase abajo) . Estas cepas son transformadas por el plásmido pLIP5 (véase abajo) y proporcionan respectivamente las cepas YCC8 e YCC9. Estas cepas son transformadas por el plásmido pTG12093 para obtener respectivamente la cepa UCY2 e UCY3. El gen ATF2 es desactivado en la cepa UCY2, por la utilización de plásmido y de una selección al G418, y se obtiene entonces la cepa UCY4. Ejemplo 9: Construcción de los plásmidos de transformación de cepas UCY2, UCY, y UCY4. a) Construcción del plásmido pCV29 Para la construcción del plásmido pCV29 (véase figura 3) , los plásmidos pTG10767, pTG10022 y pCD63 han sido utilizados. 1. Construcción del tejido pTGl0767 El plásmido pTG10767 es un plásmido de expresión para al P450cll de origen humano. Contiene de hecho dos cassetts de expresión, uno para la P450cll de origen humano y otro para la adrenodoxina . Estas dos proteínas son enfocadas porque son activas en las mitocondrias de la levadura S. cerevisiae, por la presencia de secuencias de direccionaiaiento del precursor del citocromo Cox6p. Este cassette de expresión para P450C11 de origen humano es flanqueado por dos sitios de restricción iVotl que permiten transportarlo a los diferentes vectores de descritos por Degryse y colaboradores, 1995. De 5' a 3', comprende, el promotor CYC1 de conformidad con lo descrito en la publicación arriba y después el ADNc de P450cll humano modificado de conformidad con lo descrito arriba y finalmente una parte no codificadora de eucariota" superior. El ADNc de P450cll humano es el ADNc descrito por Chua SC .y colaboradores, Cloning of cDNA encoding steroid 11 beta-hidroxylase (P450cll) [Clonación de ADNc que codifica el esteroide beta-hidroxilasa (P450cll)]. Proc Nati Acad Sci USA, 1987. Oct;84(20): p. 7193-7, con las modificaciones siguientes. La parte codificadora para el péptido señal en el ADNc original ha sido removida hasta el sitio de restricción BglII y reemplazada. Esto elimina de una vez 31 aminoácidos de la secuencia codificadora de la forma madura del ADNc para proporcionar la secuencia proteica siguiente en NH2 terminal (SEQ ID NO: 23) : MI.SRAIFRNPVINRTLLRARPGA YHATRLTKNTF1QSRKYG1 GAAA?KAVL?V EAMPRCPGNKWMRMLQIWREOGYEDLHLEVHOTPORLGPIFRYDLGGA GMy. yMLPEjy FJ En el renglón anterior, la parte en cursivas corresponde a la secuencia de aminoácidos de las secuencias de direccionamiento del precursor de la citocromo oxidasa bajo la unidad VI de levadura (COX6) , la parte en negritas corresponde a la parte NH2 terminal del P450cll de bovino (Dumas y colaboradores, 1996) . La parte subrayada corresponde al principio de la secuencia idéntica a la secuencia publicada del ADNc de ?45011ß1 de ser humano (Kawamoto T y colaboradores, Cloninng of cDNA and genomic DNA for human cytochrome P-450 11 beta [Clonación de ADNc y ADN genómico para citocromo P450 11 beta de ser humano] . FEBS Lett, 1990.269(2) :p. 345-9) . El cassette Notl que lleva el promotor CYC1 y el ADNc quimérico de ?45011ß1 contiene también una parte no codificadora colocada en 3' del ADNc. Esta parte no codificadora consiste de tres elementos una parte no codificadora proveniente del ADNc natural y una parte no codificadora proveniente del plásmido pCMV4 cuya secuencia está depositada en Genbank bajo el número AF239248 (Anderson S. y colaboradores, Cloning, structure, and expresión of the mitochondrial cytochrome P-450 sterol 26-hidroxilase, a bile acid biosynthetic enzyme [Clonación, estructura y expresión de la citocroma P-450 esterol 26-hidroxilasa, mitocondrial, una enzima biosintética de ácido biliar] . J. Biol. Chem, 1989. 264 (14): p. 8222-8229). Además, las únicas partes no codificadoras provenientes del pC V4 terminador del gen de la hormona de crecimiento humano y del intron del gen de la ß globina de conejo se conservan en el vector final pCV29. Al final, un fragmento de ADN que lleva sitios de restricción Notl contiene de 5' hasta 3' el promotor CYCl, un ADNc quimérico enmarcado por sitios Salí y Mlu que contienen una parte codificadora para la pre-secuencia de la citocromo oxidasa fusionada a un fragmento de ?4501?ß de bovino hasta la parte correspondiente al sitio de restricción y después el final del ADNc corresponde al ADNc de ? 50???? de ser humano. La parte no codificadora consiste de 3 de origen de mamífero. Este cassette Notl es transferido al plásmido pTG10359 el cuál proviene del plásmido pTG10350 (Dumas y colaboradores, 1996) digerido por las enzimas de restricción Clal y Pwl y religado sobre el mismo. Este plásmido pTGl0359 posee además un sitio de restricción único Notl. El plásmido pCV29 es un plásmido de tres cassetts que contiene los cassetts de expresión para la forma madura del ADX y la forma madura de P450scc y una forma de la CYP11B1 humana enfocada a la mitocondria. El plásmido pTG10022 es descrita en la publicación de Degryse y colaboradores, 1995, que se incorpora por referencia a la presente solicitud y contiene un origen de replicación de 2 mieras para la levadura S. cerevisiae asi como los elementos para la clonación en E. coli.

Los sitios de restricción de este plásmido han sido modificados con los oligonucleótidos OLIP 174 y OLIP 175 (respectivamente SEQ ID No. 28 y 29) con el objeto de integrar los sitios de restricción AscI y Pme . En el sitio de restricción Notl de este plásmido, se ha introducido un doble cassette de expresión del plásmido pCD63 descrito con Duport y colaboradores, 1998. Este doble cassette de expresión contenido en un fragmento Notl contiene un cassete de expresión para la forma madura de ADX de bovino y un cassette de expresión para la forma madura de P450scc de bovino que enmarca un marcador de selección ÜRA3. En el sitio único Pznel de extremos planos de este plásmido, el cassette de expresión del citocromo ?45011ß que contiene el ADNc de ?45011ß de ser humano bajo control de los promotores CYC1 y terminador PGK1 ha sido introducido después del llenado de los extremos Notl por el fragmento de ADN polimerasa de lenow. Uno de estos plásmidos obtenidos pCV29 contiene tres cassetts de expresión para el ADX, P450scc (ambos bajo forma madura) , asi como una forma de ?45011ß de ser humano enfocado a la mitocondria. Además, este plásmido lleva como marcador el gen URA3 enmarcado por dos cassetts de expresión. b) Construcción del plásmido pCC12 El plásmido pCC12 (véase figura 4) es un plásmido replicante de levadura con base en el origen de replicación cromosómica como ARS1 y .un centrómero CEN (existen 16 en la levadura) , ambos de S. cerevisiae. Este plásmido se replica bajo las formas de una o dos copias en la levadura. Se construyo a partir de pFL38C2 el cuál es derivado de pFL38 (Bonneaud N. y colaboradores, A family of low and high copy replicative, integrative and single-stranded S. cerevlsiae/E. coli. Shuttle vectors [Una familia de vectores de transporte de S. cerevisiae/E. coli.una sola cadena integrativos, replicantes con bajo y alto número de copias] . Yeast, 1991 Ago-Sep; 7(6): p. 609-15, cuyo contenido se incorpora por referencia a la presente solicitud, específicamente las descripciones de los plásmido) . En tes plásmido, se ha introducido en el sitio HindIII un oligonucleótido que contiene las secuencias de reconocimiento de los sitios Notl, Pací e Ase! (OLIP FL SEQ ID NO: 24) . La orientación del polienlazador ha sido verificado por secuenciamiento . Este plásmido lleva un marcador de selección UBA3 flanqueado por sitios .BglII. El gen URA3 ha sido reemplazado por el gen ADE2 , de 2.7 kb obtenido por amplificación por reacción en cadena de polimerasa en el genoma de FY1679-28c utilizando los oligonucleótidos 5'ADE2090 (SEQ ID NO: 37, CGATTCGGATCCACTAGTAACGCCGTATCGTGATTAACG) y 3'ADE2089 (SEQ ID NO: 38 (CCTCAAGGATCCTCCTGACGTAGCGCTATCCTCGGTTCTG) . Para este propósito, el plásmido pFL38C2 ha sido digerido por la enzima BglII, el fragmento BglII URA3 ha sido reemplazado por el fragmento de 2.7 kb que contiene el gen ADE2. El plásmido obtenido pAMl sirve de base para la construcción del plásmido pCC12. Construcción del plásmido a partir del plásmido p¾Ml : El plásmido pCC12 contiene dos cassetts de expresión, un cassette para 3 -HSDH de origen bovino y el otro cassette para adrenodoxina reductasa también de origen bovino. El ADNc de 3p-HSDH bovino ha sido reclonado por reacción en cadena de polimerasa a partir de un banco de ADNc de suprarenales de res. La secuencia codificadora del ADNc publicado por Zhao HF. y colaboradores, Molecular cloning, cDNA structure and predicted amino acid sequence of bovine 3 beta-hydroxy-5-ene steroid dehydrogenase/delta 5-delta 4 isomerase [Clonación molecular, estructura de ADNc y secuencia predicha de aminoácidos de 3-beta-hidroxi-5-eno esteroide deshidrogenasa bovina/delta 5-delta-4-isomerasa] . FEBS Lett, 1989. 259(1): p. 153-7. Los dos oligonucleótidos agregan un sitio Salí y 4 adeninas delane de ATG para proporcionar la secuencia GTCGACAAAAATG (SEQ ID NO: 25) . El sitio MluI se encuentra al ras del codón de terminación del ADNC de 3p-HSDS de origen bovino para proporcionar una secuencia: fin del ADNc TGACCTGGAGTGACAATGACGCGT (SEQ ID NO: 26) . La secuencia reconocida por la enzima MluI es ACGCGT.

El ADNc es transferido bajo forma de un fragmento Salí, Muí en el plásmido pTG10212 para proporcionar el plásmido pCC4. Este plásmido posee entonces un fragmento Notl que contiene el ADNc de 3 -HSDH flanqueado por un promotor TDH3y un terminador PGK1, respectivamente, en 5' y 3'. Este cassette de expresión es transferido después en el plásmido pTG12018 de tal manera que el cassette se mantenga flanqueado en 5' por un sitio Notl y en 3' por un sitio AscI. Este fragmento es después clonado en el plásmido de expresión de la levadura pA l en los sitios Notl y AscI para proporcionar el plásmido pCCll. En el sitio Notl de este plásmido, se inserta el fragmento Notl que lleva el promotor TEF1, el ADNc de la forma madura de la adrenodoxina reductasa de origen bovino, y el terminador de levadura PGK1 , respectivamente, en este orden, proviniendo del plásmido pTG10361. Este plásmido lleva el mismo ADNc descrito en Dumas y colaboradores, 1996, (cuyo contenido se incorpora por referencia) a la presente solicitud, específicamente las descripciones de los plásmidos) salvo que la secuencia de direccionamiento del precursor de la citocromo oxidasa ha sido reemplazad por un codón de metionina. El ADNc codifica por consiguiente una forma madura de ADNc de la adrenodoxina reductasa. Ejemplo 10; Construcción de la cepa CDR07 La cepa CDR07 ha sido obtenida por cruzamiento entre las cepas FY1679-18b M& a y la cepa CA10 M2\T descrita por Duport y colaboradores, 1998. Estas dos cepas han sido primero aisladas en un medio rico que contenia glicerol y después en un medio que contenia acetato de potasio de conformidad con lo descrito en "Yeast Protocols in Cell and Molecular Biology" [Método de protocolos de levadura en biología celular y molecular] , editado por Ivor H Evans en 1996. Human Press Totowa Nueva Jersey. Después de la esporulación, las tétradas fueron digeridas por zimoliasa 100T durante 30 minutos a una temperatura de 37 C. Varios ciclos de selección han sido aplicados para obtener un clon que produce campesterol como esterol mayoritario y que ha perdido los demás caracteres del CA10. Las esporas son primero seleccionadas en un medio mínimo que contiene nistatina con suplementos (adenina, leucina, triptófano, uracilo, histidina) . Los clones resistentes a la nistatina y auxótrofos para la adenina y la leucina son después sembrados de nuevo en medio rico que contiene adenina e higromicina (200 µg/ml) para detectar la deleción del gen ERG5 por el gen de la resistencia a la higromicina. Clones auxótrofos para la adenina, la leucina (uracilo y triptófano) y también resistentes a la higromicina y a la nistatina son analizadas por su perfil esterólico. Dos clones de signos sexuales opuestos que producen campesterol como esterol mayoritario se seleccionan. Se conocen como CDR07 ??.? a y CDR07 MAT a. Ejemplo 11: Construcción de plásmidos de integración pTG12093 y pLIP5, respectivamente, para los locus HIS3 y TRPl. a) Construcción de pLIP5 pLIP5 es un plásmido que puede ser utilizado para las integraciones genómicas en el locus TRPl o bien como plásmido de copias múltiples en la levadura S. cerivisiae. El plásmido de base ha servido para la construcción de este plásmido es el plásmido pFL45S descrito en Bonneaud y colaboradores, 1991, y el contenido es incorporado por referencia a la presente solicitud, específicamente las descripciones de los plásmidos) . Un fragmento de ADN genómico que corresponde a la parte 5 ' corriente arriba del promotor TRPl ha sido primero clonado e utilizando los oligonucleótidos OLIP21 y OLIP22 (respectivamente SEQ ID NO: 30 y 31) para lograr una amplificación por reacción en cadena de polimerasa. El producto de la reacción en cadena de polimerasa ha sido subclonada en pCR-Script AmpSK (+) (Stratagene, la Joya California, Estados Unidos de América. Los extremos OLIP21 y OLIP22 poseen de hecho en 5' un sitio iVarl así como un sitio HindIII en 3'. Este fragmento Narl, HindIII a reemplazado los sitios de clonación útiles del plásmido pFL45S descrito arriba . El plásmido obtenido pLIP3 es de nuevo modificado utilizando el oligonucleótido OLIP20 (SEQ ID NO: 32) que sirve para reemplazar el sitio único HindIII por el sitio único Notl. En este sitio Notl, se introduce un fragmento que contiene de 5' a 3', el promotor TEF1, el ¾DNc del citocromo P-450cl7alfa y después el terminador PGK1 de conformidad con lo descrito en Degryse y colaboradores, 1999 (cuyo contenido se incorpora por referencia a la presente solicitud, específicamente las descripciones de los plásmidos) . El plásmido final pLIP5 puede servir tanto de plásmido de copias múltiples basado en el marcador TRP1, cuando la parte de dos mieras es retirada, se puede utilizar, plásmido de integración a nivel del locus TRP1. El cassette por consiguiente se encuentra integrado en 5' del gen TRP1. b) Construcción del plásmido pTG12093 Este plásmido es un plásmido de integración intergénico a nivel de locus HIS3. Este plásmido es construido a partir del plásmido pUC-HIS3 descrito por Duport y colaboradores, 1998. El sitio único de restricción Xñol de este plásmido ha sido transformado en un sitio de restricción único líoti utilizando un adaptador apropiado, destruyendo al mismo tiempo el sitio Xfrol para proporcionar el plásmido pUC19-HJS3. En el sitio Notl único de este plásmido, un fragmento Notl que proviene de pTG10792. Este fragmento contiene el promotor TDH3, el ADNc codificando para ADX bovino madura fusionada a la secuencia de direccionamiento del precursor del citocromo de COXs (de la subunidad 6 de la citocromo oxidasa de levadura de conformidad con lo descrito en Dumas y colaboradores, 1996. El fragmento de restricción Salí MluI del plásmido pTG10350 que contiene el ADNc previamente descrito ha sido transferido al plásmido pTGl0211 para formar el plásmido pTG10792. Este plásmido posee por consiguiente un fragmento de 1.6 kilobases que contiene el promotor TDH3, el ADNc fusionado entre el ADX de bovino maduro y la pre-secuencia OCX6 de levadura, y el terminador PGK1 de 5' a 3'. Este fragmento Notl-Notl es insertado en el plásmido pTG12093. El plásmido de HIS3 y del cassette de expresión se encuentran en la misma orientación. Ejemplo 12: Cruzamiento de CDR07 MATct con TGY260 MATa La cepa SB14 (CDRO7???a X TGY260 MATa) esporula en un medio muy pobre que contiene acetato de potasio. Los diferentes ascii crecen después en un medio mínimo que contiene los productos siguientes: uracilo, histidina, triptófano y adenina. Las esporas son después seleccionadas en un medio mínimo correctamente complementado que contiene de 8 a 12 µg/ml de nistatina. Las esporas positivas son después seleccionadas en presencia del ADNc de P450-c21 de ser humano. Para este propósito, se lleva a cabo un tamizado de los clones en medio Kappeli (Arreguín de Lorencez M. y Kappeli 0 J, Regulation of gluconeogenic enzymes during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae gro ing in a chemostat [Regulación de enzimas gluconeogénicas durante el ciclo celular de Saccharomyces cerevisiae que crece en un guimiostato] . Gen. Microbiol, 1987. 133 (Pt 9) : p. 2517-22) con fuente de carbono siendo etanol al 2% (y glucosa al 0.1%) en presencia de 300 mg/ml de 17OH progesterona. La bioconversion es incubada hasta 72 horas. La capacidad de bioconversion es analizada en HPLC de conformidad con lo descrito por Dumas y colaboradores, 1996 y Degryse y colaboradores, 1999 (cuyos contenidos se incorporan por referencia a la presente solicitud, específicamente las especificaciones de los estudios de bioconversion) . Estos clones son también analizados por su perfil esterólico en cromatografía en fase gaseosa de conformidad con lo descrito por Duport y colaboradores, 1998 (cuyo contenido se incorpora por referencia a la presente solicitud, específicamente las explicaciones de los estudios de bioconversion) con el objeto de detectar el campesterol y el ergosta 5.22 dienol. Tres esporas YCC3, YCC4 e YCC5 se seleccionan como produciendo ergosta 5.22 dienol y campesterol y convirtiendo la 170H-progcsterona en 11-desoxicortisol con una eficacia de producción de 25, 120 y 42 g/lILl en 72 horas, respectivamente. YCC4 y YCC5 se seleccionan entonces para dos nuevas transformaciones sucesivas con los plásmido pLIP5 y pTG12093 linearizados respectivamente por las enzimas ApaLl y EcoRl.Los plásmidos pLIP5 y pTG12093 son plásmidos de expresión intergénicos respectivamente para P450cl7 de origen bovino y ADX de origen bovino mitocondrial. El pTG12093 es un plásmido de integración en la región intergénica en 3' del locus HIS3 mientras que el pLIP5 es un plásmido de integración en la región intergénica en 5' del locus TRP1. Además, estos dos plásmidos llevan un sitio único Notl que permite la integración de un cassette de expresión que contiene en este orden: promotor TEF1, ADNc de P 50C17 de origen bovino, terminador PGK1 para el pLIP5 en este orden promotor TDH3, ADNc COXVpre: :mat ADX de bovino, terminador PGK1 para el pTG12093. La cepa CYY4 es transformada sucesivamente por los plásmidos en pLIP5 y pTG12093 linearizados (por las enzimas de restricción ApaLl y EcóR ) . Durante la primera transformación, los clones transformantes son seleccionados primero en un medio que no contiene triptófano. Los clones que crecen en ausencia de triptófano son entonces seleccionados por reacción en cadena de polimerasa con los oligonucleótidos C17-3 y C17-5 (respectivamente SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34) . Un clon CYY8 es seleccionado para una nueva transformación por el plásmido pTG12093 linearizado. De la misma manera, los clones que crecen en ausencia de histidina son seleccionados después se verifica la presencia del ADNc de ADX por reacción en cadena de polimerasa con la ayuda de los oligonucleótidos ADX-3, ADX-5 (respectivamente SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36) . Un clon UCY2 se selecciona, su signo sexual es ???a. Ejemplo 13: Construcción de la cepa UCY4 La cepa UCY2 posee un gen ATF2 funcional, es decir que la mayor parte de la pregnenolona producida es transformada en acetato de pregnenolona con la proteina ATF2p que es una pregnenolona acetil transferasa cuya función natural en la levadura se desconoce (Cauet y colaboradores, 1999) . Además, esta región es irreversible, y por consiguiente, una vez producida, la acetil pregnenolona no puede ser transformada en hidrocortisona. Para por consiguiente importante destruir esta actividad para permitir una mejor producción de hidrocortisona . El gen ATF2 ha sido por consiguiente trastornado utilizando un gen de resistencia a G418. Para este propósito, se construyó un plásmido pAM3kanaC de disrupción que permite la introducción de un marcador de resistencia al G418 en el gen ATF2. Este plásmido ha sido construido a partir del plásmido pAMl (cuya construcción ha sido descrita arriba) , del plásmido pTG12002 que es un plásmido de expresión para el gen ATF2. El pTG12002 es un plásmido de expresión para ATF2 basado en el plásmido pTG10260 (Degryse y colaboradores, 1995) en el cuál el sitio de restricción Xbal de origen de replicación 2 miera ha sido desactivado. Este plásmido contiene por consiguiente un cassette de expresión para el gen ATF2 (Cauet y colaboradores, 1999) que comprende el promotor CYC1, el gen ATF2 (enmarcado por los sitios de restricción Salí y Mlul) y el terminador PGK1. Este cassette ha sido modificado por reacción en cadena de polimerasa para contener el gen ATF2 completo que comprende el promotor del gen ATF2, la secuencia codificadora del gen ATF2, el terminador del gen ATF2 en un fragmento de restricción Kpnl, Notl. Este fragmento Kpnl-Notl es introducido en los sitios Jpnl-Notl del plásmido pAMl para proporcionar el plásmido p¾M3. En el plásmido pAM3, el cassette de expresión de la resistencia al G418 es introducido en el gen ATF2 provocando su desactivación. Para este propósito, el plásmido pAM3 es digerido por la enzima de restricción Accl, y después parcialmente por la enzima de restricción Sacl. Una banda de aproximadamente 7500 pares de bases es purificada en gel. El plásmido pFA6a kanMX4 (Wach y colaboradores, Methods in Microbiology [Métodos en Microbiología] volumen 26, Yeast Gene Analysis [Análisis de Gen de levadura] capitulo 5, PCR-based Gene Targeting in Saccharomyces cerevísiae" [Enfoque génico basado en la reacción en cadena de polimerasa en Saccharomyces cerevísiae] ) es digerido por SacI, y Accl, la banda a 1500 pares de bases es purificada en gel. Los dos fragmentos son ligados y después transformados. Un plásmido es obtenido pAM3kanaC. El pAM3kanaC es digerido por PvuII y no Notl, la banda a 2215 pares de bases purificada en gel y después transformada en UCY2 que es extendida en cajas de medio rico que contiene 130 µg/ml de G418. Aproximadamente 600 clones son sembrados en este medio que contiene G418, dos clones son resistentes al G418. Un clon que no contiene el plásmido pAM3 es conservado. Este método de desactivación de gen es bien conocido por parte de la persona con conocimientos en la materia. El clon único obtenido de esta manera es colocado en condiciones de bioconversión con 100 µ/ml de pregnenolona en medio Kappeli. Al cabo de 24 horas, la ausencia de acetato de pregnenolona es verificada por extracción y cromatografía en fase gaseosa de conformidad con lo descrito en Cauet y colaboradores, 1999. Este fenómeno indica que el gen ATF2 responsable de la acetilación de la pregnenolona ha sido trastornado y ya no es funcional . La cepa se conoce como UCY4. Ejemplo 14: Construcción de cepas UCY3 y UCY26.

El tamizado de las esporas obtenidas por cruzamiento de las cepas CDR07 y TGY260 provocó la formación de varias cepas entre las cuales las cepas YCC4 e YCC5. De conformidad con lo descrito arriba, la cepa YCC4 ha sido transformada por una serie de 2 plásmidos: pLIPS y PTGD12093. Una espora UCY2 ha sido entonces seleccionada (ver ejemplo 12) . De la misma manera, la cepa YCC5 ha sido también transformada por los plásmidos pLIP5 y PtG12093 y una nueva espora nombrada UCY3 ha sido obtenida. Como UCY2, UCY3 se caracteriza por la presencia y la expresión de 1&7 reductasa de A. thaiana medida por la resistencia a la nistatina y la presencia de brasicasterol y de campesterol como esterol mayoritario en estas levaduras recombinantes . La presencia del ADNc de ADX se verifica a través de una reacción en cadena de polimerasa a través de los oligonucleótidos ADX-3 y ADX-5 (respectivamente SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36), y después por Western blot de conformidad con lo descrito en Dumas y colaboradores, 1996, que se incorpora por referencia aquí en cuanto a la descripción de esta técnica. La actividad de hidroxilación en 17 y en 21 de la progesterona es verificada mediante la bioconversión de la progesterona en 170H-progesterona y 11-desoxicortisol . Para este propósito, la cepa es incubada en presencia de 200 mg/1 de progesterona de conformidad con lo descrito en Dumas y colaboradores, 1999. UCY3 puede producir 11-desoxicortisol a partir de la progesterona lo que indica la presencia de las actividades P450cl7 y P450c21. Se detecta también la presencia de 4-pregneno 17a, 20a diol 3 ona lo que indica que por lo menos una de las dos actividades codificadas por GCY1 o YPR1 está presente en la cepa. Para evitar la acumulación de acetato de pregnenolona, la actividad de acetilación de la pregnenolona codificada por el gen ATF2 ha sido eliminada. Para este propósito, el plásmido P¾M3kanaC (véase ejemplo 13) ha sido utilizado para transformar la cepa UCY3. El p¾M3kanaC ha sido primero digerido por PvuII y Notl, la banda a 2215 pares de bases es purificado en gel, y después transformada en UCY3 que es extendida en cajas de medio rico que contienen 130 µg/ml de G418. Colonias resistentes al antibiótico G418 y que ya no puede transformar la pregnenolona en acetato de pregnolona son aisladas; una colonia UCY26 se selecciona de manera más particular para nuevas transformaciones y para probar la producción de hidrocortisona. Ejemplo 15: Construcción de la cepa UCY5. Con el propósito de contar con una mejor variabilidad genética, la cepa UYC2 (véase ejemplo 12) ha sido cruzada con la cepa TGY245 (véase ejemplo 5), una cepa diploide YSA2-2n ha sido seleccionada por consiguiente. Esta cepa ha sido puesta en condición de producción de aseas y 85 aseas han sido disecadas (de conformidad on lo descrito en "Yeast Protocole in Molecular Biology""' [Protocolos de Levadura en Biología Molecular] Volumen 53 páginas 59-67, 1996) . Las esporas aisladas son tamizadas con relación a su propiedad auxótrofa. Así, los clones capaces de crecer en ausencia de triptófano y de histidina y que requieren de adenina son seleccionados de manera más particular. La expresión de la ?7 reductasa es verificada cerciorándose de la resistencia de la cepa a la nistatina asi como de la presencia de campesterol y brasicasterol en la membrana de estas cepas. Este último análisis es efectuado por cromatografía en fase gaseosa de los esteróles totales de estas cepas de conformidad con lo descrito en Duport y colaboradores, 1998. Además, la presencia de los ADNcs que "codifican la P450cl7 y ADX es verificada a través de una reacción en cadena de polimerasa gracias a los oligonucleótidos C17-3 y C17-5 (respectivamente SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34) y los oligonucleótidos ADX-3 y ADX-5 (respectivamente SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36) respectivamente. Finalmente, la funcionalidad de los genes GCY1 e YPR1 en estas esporas positivas es verificada de dos maneras: ya sea por reacción en cadena de polímeras, ya sea por ausencia de actividad 20 alfa reductasa en la 17 OH progeterona. Por reacción en cadena de polimerasa utilizando el par de oligonucleótidos X1TEF1 y X2C21 (respectivamente SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48), se detecta la disrupción del gen YPR1 por el cassette de expresión para la P450c21 de ser humano en S.cerevisiae que contiene el promotor TEF1, el ADNc de P450c21 de ser humano así como el terminador PGK. Se detecta también por reacción en cadena de polimerasa utilizando los pares de oligonucleótidos X3TDH.3 y X2C21 (respectivamente SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 48), la disrupción del gen GCYl por el cassette de expresión para P450c21 de ser humano en S.cerevisiae que contiene el promotor TDH3, el ADNc de P450c21 de ser humano así como el terminador PGK. La desaparición de las dos actividades GCYl e YPR1 y la presencia de la actividad correspondiente a la actividad P450cl7 y P450c21 se verifican finalmente al par de la bioconversión de la progesterona en 11-desoxicortisol en las condiciones descritas en Dumas y colaboradores 1996 modificadas por Degryse y colaboradores 1999. Las levaduras recombinantes son incubadas a una temperatura de 30°C en presencia de 200 mg/1 de progesterona con u na densidad celular de 5 en un medio de cultivo de tipo Kappéli que contiene 2% de galactosa o 2% de glucosa como fuente de carbono, en un volumen de 10 mi. Después de una incubación de 48 horas, se extrae el medio de cultivo de estas levaduras de conformidad con lo descrito anteriormente y se mide en particular la cantidad de 17OH progesterona y 11-desoxicortisol producido por HPLC. La espora selecciona ya no produce una cantidad detectable de 4-pregnen 17x, 20a diol 3 ona pero produce 170H progeterona y 11-desoxicortisol utilizando las dos fuentes de carbono. El clon seleccionado produce la mayor cantidad de 11-desoxicortisol . Una cepa que responde positivamente a todos estos criterios es seleccionada más particularmente para nuevas transformaciones, esta cepa es conocida como UCY5. E emplo 16: Construcción de plásmidos pEMIO y pTG10897-a) .- Construcción del plásmido pE IO El plásmido pEMIO es un vector que permite la expresión simultánea de 4 proteínas en la levadura. No contiene origen de replicación para E. coli ni gen de resistencia a la ampicilina. Por consiguiente, este plásmido no puede replicarse en E. coli. Su obtención es efectuada por recombinación en la levadura de dos plásmidos: pEM7 y pCB12. A diferencia del plásmido pEMIO, estos últimos se replican ambos en E. coli puesto que poseen el replicón de E. coli. El plásmido pEM7 se replica también en S. cerevisiae, puesto que contiene también el origen de replicación de 2 mieras de la levadura S. cerevisiae. Estos dos plásmidos poseen además las secuencias Rl y R2 (respectivamente SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40) que flanquean los cassettes de expresión así como los marcadores de selección. Las secuencias Rl y R2 provienen del gen de la fotoclorofilida oxidoreductasa de ? thaliana y su tamaño es de aproximadamente 300 pares de bases cada una. Las dos secuencias Rl y R2 son clonadas en orientación inversa en los plásmidos pEM7 y pCB12. Así mismo, entre las secuencias Rl y R2, el plásmido pEM7 contiene en el orden siguiente: el origen de replicación de 2 mieras contenido de fragmento de 2 mieras (fragmento flanqueado por los sitios de restricción EcoRI, de conformidad con lo descrito por Urban, P., y colaboradores, Characterization of recombinant plant cinnamate 4-hydroxylase produced in yeast. inetic and spectral properties of the mayor plant P450 of the phenylpropanoid pathway [Caracterización de 4-hidroxilasa de cinamato de planta recombinante producida en levadura. Propiedades cinéticas y espectrales de P450 de plantas mayores de la vía de fenilpropanoide] . Eur J Biochem, 1994. 223(3): p. 843-50, un fragmento flanqueado por los sitios NotX que provienen del plásmido pCD63 descrito por Duport y colaboradores, 1998 que contienen dos cassettes de expresión para la forma madura de P450scc y la forma madura de ADX separada por el g en ÜRA3 de la levadura funcional, después viene la secuencia R2. De la misma manera el plásmido pCB12 las secuencias Rl y R2 pero clonadas en el sentido inverso del caso del plásmido pFM7. Asi, entre la secuencias R2 y Rl, se encuentra el cassette de expresión para P450uP,el marcador de selección ADE2, el cassette de expresión par$ 3 -HSD de origen bovino. El cassette de expresión para P450uP, proviene del plásmido pCV28 y contiene el promotor CYC1, un ADNc híbrido que codifica para P450up y un terminador PGK. El gen ¾DE2 proviene del plásmido p¾Ml, se trata del fragmento BglII-BglII. Asimismo, el cassette de expresión para 3 -HSD de bovino, es decir el promotor TDH3, el ADNc de 3p-HSD de bovino y el terminador PG proviene del plásmido pCC12, se trata del fragmento CLAI-AscI. b) .- construcción del plásmido pTG10897 Con la ayuda de dos oligonucleótidos 2Omeros que corresponden, respectivamente, a la parte 5' y a la parte 3' de la secuencia codificadora del gen ATF2 (y que incluye también los sitios de clonación) y utilizan como matriz ADN genómico de la cepa FY 1679-28c, se amplifica por reacción en cadena de polimerasa la secuencia codificadora del gen ATF2. Este producto de reacción en cadena de polimerasa es después digerido por las enzimas CLAI e HindIII y es clonado entre los sitios CLAI e HindIII del plásmido pTG10031 [Degryse, 1995 #102] para proporcionar el plásmido pTG10885. Este plásmido sirve de base a la construcción de un plásmido de disrupción de gen ATF2. La secuencia del gen URA3 ha sido amplificada a partir del ADN genómico de la cepa TGY156 (descrita en Cauet y colaboradores, 1999 y que se incorpora aquí por referencia) , esta cepa posee de hecho un gen ATF2 interrumpido por el gen URA3. Los oligonucleótidos OTG10842 (SEQ ID NO: 41) y OTG10841 (SEQ ID NO: 42) sirvieron por consiguiente para amplificar en matriz de ADN genómico de la cepa TGY156 y el producto de la amplificación sirvió de cebador de recombinación con el plásmido pTG10885 digerido por las enzimas de restricción BstXI y Stul. Ser obtiene de esta manera el plásmido pTG10897 que contiene la secuencia codificadora del gen ATF2 interrumpida por gen ÜRA3. De hecho, el gen URA3 funcional se encuentra entre 509 nucleótidos de la parte 5' de la secuencia codificadora de ATF2 y 444 nucleótidos de la parte 3r de esta secuencia codificadora. Ejemplo 17: Construcción de las cepas UCY16/ UCY17 } 6-pFM10, UCY19, UCY20, UCY24, UCY25, UCY27. A partir de la cepa UCY5, se construyó una serie de cepas novedosas con el objeto de mejorar la producción de esteroide de interés. De hecho, la cepa UCY5 no expresa adrenodoxina reductasa que es un componente esencial de la reacción de corte de la cadena lateral por la P450scc. Además, como se ha descrito antes, el gen ATF2 codifica para una acetil transferasa que utilice la pregnenolona como sustrato y su disrupción permite suprimir esta reacción parásita de acetilación e incrementar así el rendimiento en esteroide de interés. Finalmente, la vía de biosintésis exógena utiliza la actividad ARHlp endógena, esta última es esencial para la supervivencia de la levadura. Sin embargo, esta actividad mitocondrial que reemplaza la adrenoxina reductasa de mamífero puede ser limitante en las cepas que produzcan la hidrocortisona. Una cepa que posee ciertas modificaciones que permiten incrementar de manera consecuente el rendimiento de producción en esteroide de interés ha sido construida por consiguiente a partir de la cepa UCY5. Asi, esta cepa no tiene actividad ATF2, sobre-produce la proteina adrenodoxina reductasa y sobre-produce también la proteina ARH1. Para permitir Una expresión del ADR en la cepa UCY5, esta última ha sido transformada por el vector pTG10925 (véase ejemplo 2 f) que, cuando es transformado en la levadura en forma lineal permite la integración en el locus EU2 y la expresión de ADR bajo el control del promotor TEF1. La expresión de ADR ha sido verificada por Western blot de conformidad con lo descrito por Dumas y colaboradores, 1996. Un clon que expresa ADR y que se conoce como UCY6 ha sido utilizado más particularmente para las transformaciones siguientes . Con el propósito de eliminar la reacción parásita de acetilación que transforma la pregnenolona en acetato de pregnenolona y catalizado por la enzima ATF2, el gen ATF2 que codifica para esta enzima ha sido trastornado. Este último ha sido de hecho interrumpido por el marcador ÜRA3, para este propósito, el fragmento Notl del plásmido pTG10897 que contiene la secuencia del gen ATF2 interrumpido por el gen funcional de levadura UBA3 ha sido utilizado. Este fragmento es utilizado para transformar la cepa UCY6. Las colonias capaces de crecer en ausencia de uracilo son seleccionados, y después se mide la capacidad de estos clones para transformar la pregnenolona en acetato de pregnenolona de conformidad con lo descrito por Cauet y colaboradores, 1999. Un clon capaz de crecer en ausencia de uracilo e incapaz de transformar la pregnenolona en acetato de pregnenolona ha sido más particularmente aislado. Ete clon se conoce como UCY16. Puesto que esta cepa no puede ser transformada por los plásmidos que llevan solamente el marcador URA3, dos nuevos plásmidos han sido construidos: los plásmidos pCBl2 y pFM7. Estos dos plásmidos, cuando son combinados conjuntamente, permiten la obtención del plásmido pFMIO con base en los marcadores ÜRA3 y/o ADE2 (véase arriba y Figura 5) . Asi, para obtener el plásmido pEMIO, el plásmido pEM7 es linearizado por la enzima de restricción AatlI y el fragmento de ADN que corresponde es aislado en gel. El plásmido pCB12 es digerido por BamHl y la banda de 9300 pares de bases es aislada de conformidad con técnicas clásicas de biología molecular. Se mezclan aproximadamente 5 pg de los fragmentos de pCB12 y pFM7 los cuales sirven para transformar la cepa UCY16. Algunos clones UCY16-pFM10, capaces de crecer en milio mínimo (sin uracilo ni aminoácidos) , son aislados y las cepas correspondientes son probadas para determinar su nivel de producción de esteroides de conformidad con el protocolo descrito abajo. Alternativamente, y con el propósito de poder utilizar después los plásmidos de tipo pCV29 basados en u n marcador ÜRA3, se obtuvo la disrupción del gen ATF2 en la cepa UCY6 también transformando esta cepa a través del plásmido pAM3kanaC linealirizado (véase ejemplo 13) . Las colonias resistentes a G418 son después probadas para determinar la ausencia o presencia de la actividad pregnenolona acetil transferasa de conformidad con lo descrito por Cauet y colaboradores, 1999. Una colonia resistente a G418 y que no tiene ya actividad pregnenolona acetil transferasa se selecciona más particularmente. Esta cepa se conoce como UCY24. Con el propósito de incrementar la actividad ARH1 en una cepa que contiene una vía de producción exógena de la hidrocortisona, la cepa UCY5 ha sido transformada por los plásmidos pTG12048 o pTG12050 linearizados antes por Xhol y SapI, respectivamente. El plásmido pTG12048 descrito arriba permite la sobreexpresión del gen ARH1 en el locus EU2 bajo el control del promotor CYC1. El plásmido pTG12050 difiere del plásmido pTG12048 únicamente por el hecho que el promotor CYCl que controla la expresión del gen ARH1 ha sido reemplazado por el promotor TEF1 de conformidad con lo descrito por Degryse y colaboradores, 1995 y Dumas y colaboradores, 1996. UCY5 ha sido transformada por pTG12048 o pTG12050 linearizado. En cada uno de esos casos, las colonias capaces de crecer en ausencia de leucina han sido seleccionadas. Además, la presencia de los cassettes de expresión para el gen ARH1 ha sido verificado por reacción en cadena de polimerasa. Dos pares de oligonucleótidos que permiten verificar la presencia de la copia suplementaria del gen ARffl (bajo el control del promotor CYC1 o TEF1) . Por un lado, el par arahlD (SEQ ID NO: 43) y nfslR (SEQ ID NO: 44) permite verificar la presencia de la unión entre el gen ???1 y el gen NFS1. Además, el par leu2D (SEQ ID NO: 45) y arhlR (SEQ ID NO: 46) permite la verificación de la unión entre el gen EU2 y el gen ARH1. además, de la presencia del cassette de expresión para el gen ARAH1 que codifica la actividad ARH1, la expresión de la proteina ARHlp ha sido igualmente probada en los clones obtenidos. La detección de la sobreexpresión de ARHlp sin embargo no es fácil. Esto se debe a la presencia natural de la proteina ARHlp a un bajo nivel en las cepas de . cerevisiae. Experimentos de Western Blot efectuados de conformidad con lo descrito en Dumas y colaboradores, 1996 permite sin embargo confirmar el incremento de la cantidad de ARHlp. Además de los experimentos de Western Blot que son delicados, la presencia de una cantidad incrementada de ARHlp puede ser verificada por experimentos de reducción de citocromo c o bien de llbeta hidroxilación del 11-dosoxicortisol reconstituidos in vitro con mitocondrias purificadas levaduras recombinantes de conformidad con lo descrito en Lacour y colaboradores, 1998 y Dumas y colaboradores, 1996, respectivamente. Dos clones UCY19 y UCY20, respectivamente transformados por pTG12048 y pTGD12050 y que sobreexpresan ARHI, se seleccionan de manera más particular. El gen ATF2 ha sido entonces trastornado en estas cepas de conformidad con lo descrito arriba. En resumen, el plásmido pi¾M3kanC ha sido linearizado y después utilizado para transformar las cepas UCY19 y UCY20. Los clones han sido después seleccionados por su propiedad de resistencia al G418 y ausencia de actividad pregnenolona acetil transferasa de conformidad con lo descrito por Cauet y colaboradores 1999. Dos clones derivados de UCY19 y UCY20 son más particularmente seleccionados. Se trata, respectivamente, de las cepas UCY25 y ÜCY27 (véase Figura 2) . Ejemplo 18: Producción de esferoides por las cepas de conformidad con la invención a) .- Transformación de UCY2 y UCY4 por pCV29 y pCC12 Las cepas ÜCY2 y UCY4 han sido transformadas por los dos plásmidos pCV29 y pCC12, descritos arriba cuyas estructuras se recuerdan a continuación y en las figuras 3 y 4. El plásmido pCV29 lleva un origen de replicacion de tipo 2 mieras para replicacion en la levadura. Además, este plásmido lleva 3 cassettes de expresión respectivamente para ?45011ß de ser humano/bovino híbrido enfocado a la mitochondria de conformidad con lo descrito arriba, las formas maduras (con una metionina en el extremo NH2 terminal) de la adrenodoxina y de P450scc. La expresión de estas tres proteínas se encuentra bajo el control de los promotores CYC1 (?45011ß) y GAL10/CYC1 (ADX y P450scc en forma madura) . El plásmido pCC12 es un plásmido con bajo número de copias que lleva un cassette de expresión para la forma madura de la adrenodoxina reductasa bovina bajo el control de promotor TEFl así como un cassette de expresión para la ß -HSD bovina bajo el control del promotor TDH3. Estas cepas se cultivan en condiciones clásicas de fermentación en medio Kappeli con glucosa como fuente de carbono. Al final de la fermentación (180h) , los esteroides son extraídos de conformidad con lo descrito arriba y caracterizados en cromatografía líquida de alta presión. La identidad de los productos ha sido verificada por cromatografía en fase gaseosa, por cromatografía de alta presión en fase líquida y en fase reversa acoplada o no con la espectrometría de masa y la resonancia magnética nuclear (véase Tabla 1) . Tabla 1. Balance de los esteroides obtenidos (resultados expresados en mg/1) Cepas Acetato Proges- 4-pregnen- No Corti- Hidro- de preg- terona 17OÍ-20OÍ iden- coste- corti- nenolona diol 3 ona tifi- roña sona cado UCY2/pCV29 18 7 5 5 12 15 + pCC12 UCY4/pCV29 0 30 44 24 23 80 +pCC12 b) .- Transformación de las cepas UCY24, UCY25, ÜCY26 y UCY27 por pCv29 y pCC!2 y transformación de la cepa UCY16 por pEMlO Estas cepas poseen numerosas modificaciones y difíciles de transformar. En consecuencia,- un protocolo basado en la preparación de los esferoplastos ha sido utilizado para estas transformaciones de conformidad con lo descrito por Burgers P.M. y Percival .J, Transformation of yeast spheroplasts without cell fusión [Transformación de esferoplastos de levadura sin fusión celular]. Jtoal Biochem, 1987. 163(2): p. 391-7. UCY16 ha sido transformada siguiendo este protocolo por los plásmidos pFM7 y pCB12, estos últimos produciendo el plásmido pEMlO por recombinación in vivo por la levadura. De conformidad con lo descrito arriba, el plásmido pFMIO es un plásmido de copias múltiples de levadura, que no contiene secuencias bacterianas y permite la expresión de 4 proteínas heterólogas . Estas cuatro proteínas son como se vio arriba: una forma quimérica de citocromo ? 50??ß, la 3ß-?3? bovina, ADX madura y el citocromo P450scc maduro. Los KDNc correspondientes son colocados respectivamente bajo el control de los promotores CYC1, TDH3, GALIO/CYC1 y GAL10/CYC1. Los transformantes son seleccionados en un medio mínimo sin ninguna adición. La selección se hace únicamente en el marcador ADE2 (crecimiento en ausencia de adenina) , la presencia de un gen funcional URA3 en el genoma y que sirve a desactivar el gen ATF2 no permite la selección en el gen URA3. Por consiguiente es necesario tamizar varias colonias para cerciorarse de tener un plásmido pFMIO funcional en la cepa UCY16. Las cepas UCY24, UCY25, UCY26 y UCY27 han sido transformadas por los plásmidos pCV29 y pCC12 de conformidad con el mismo protocolo de preparación de esferoplastos . De conformidad con lo descrito arriba el plásmido pCV29 es un plásmido de copias múltiples de transporte entre E.coli y S. cerevisiae. Permite la expresión del citocromo ?45011ß, ADX maduro y citocromo P450scc respectivamente, bajo el control de los promotores CYC1, GAL10/CYC1 y GALIO/CYC1 (véase Fgirua 3) . El plásmido pCC12 es un plásmido de una sola copia de levadura que permite la expresión del ADR maduro de bovino y de la |3 -HSD de bovino ba o el control de los promotores TEF1 y TDH3, respectivamente, (véase Figura 4) . Todas esas cepas crecen en Erlenmeyer (volumen 100 mi y que contiene 30 mi de medio de cultivo) en condiciones clásicas de fermentación en medio appeli teniendo como fuente de carbono 2% de etanol y0.1% de glucosa. Después de 168 horas de cultivo, se extraen 500 µ? de medio de cultivo (células + medio) en dos veces por medio de 4 mi de dicloroetano. La fase orgánica es conjuntada y después separada en dos partes para ser secada bajo un flujo de nitrógeno. El extracto seco es resuspendido en 100 µ? de una mezcla acetonitrilo/agua (50/50 volumen/volumen) o 100 µ? de dicloroetano . Los extractos resuspendidos en la mezcla acetonitrilo/agua son tratados por HPLC, lo que permite un análisis de la composición en esteroides diferentes (hidrocortisona, cortexolona, corticosterona, 170H-progesterona, 4-pregnen-17cx, 20a diol 3 ona) de conformidad con lo descrito en Valvo, L, y colaboradores, General igh-performance liquid chromatographic procedures for the rapid screening of natural and synthetic corticosteroids [Procedimientos cromatográficos líquidos de alto desempeño generales para el tamizado rápido de corticosteroides naturales y sintéticos] . J Pharm Biomed Anal, 1994. 12(6): p. 805-10. Los extractos resuspendidos en el digloroetano son analizados por cromatografía en fase gaseosa de conformidad con lo descrito en Duport y colaboradores, 1998, este último análisis permitiendo medir la cantidad de pregnenolona y de progesterona en las muestras. Para cada una de las cepas transformadas, se mide de esta forma la productividad en esteroides de una decena de clones. Los resultados presentados a continuación proporcionan los resultados del mejor de los diez clones probados para cada una de las cepas UCY24, UCY25, UCY26 y UCY27 transformadas por pCV29 y pCC12 y de la cepa UCY16 transformada por pEMIO.

Tabla 2. Balance de los esteroides obtenidos (resultados expresados en mg/1 salvo el último renglón: resultados expresados en porcentaje de la totalidad de los esteroides) TJCY2 ÜCY25 UCY26 pCV29+ pCV29+ pCV29+ pCC12 pCC12 pCC12 170H progesterona 0.6 0.6 1.0 dexoxicorticosterona 0.5 0.0 0.2 cortexolona 4.5 2.7 2.1 4-pregnen-17cx, 20a 0.0 0.0 0.0 diol 3 ona corticosterona 7.5 10.8 7.5 hidrocortisona 17.7 29.2 22.3 Esteroides Totales 30.8 43.3 36.6 % de hidrocortisona 57 67 67 UCY27 UCY16 UCY4 PCV2 + pFM10+ pCV29+ pCC12 PCC12 170H progesterona 0.6 0.5 0.2 dexoxicorticosterona 0.3 1 0.0 cortexolona 2.0 7.6 0.7 4-pregnen-17cx, 20a 0.0 0.0 4.5 diol 3 ona corticosterona 9.0 8.9 3.4 hidrocortisona 24.7 15.8 12.3 Esteroides Totales 36.6 33.8 21.2 % de hidrocortisona 67 47 58 B: No se detecta ni pregnenolona ni acetato de pregnenolona en el medio de cultivo de estas cepas . Las cepas UCY16 pEMIO, UCY24 pCVP29+pCCl2, UCY25 pCV29+pCC12, UCY26 pCV29+pCC12 y UCY27 pCV29+pCC12 presentadas arriba pueden por consiguiente producir cantidades de hidrocortisona superiores a las cantidades producidas por al cepa UCY4/pCV29+pCC12. La cantidad total de esteroides pasa asi de 21.2 g/ml en la cepa UCY4/pCV29+pCC12 a 43.3 ug/ml en la cepa UCY25 pCV29+pCC12 mientras que la cantidad de hidrocortisona pasa de 12.3 µg/l??l a 29.2 µg/ml, respectivamente. Además, la hidrocortisona representa en estos ejemplos hasta aproximadamente 70% de los esteroides totales . Se observa por consiguiente un fuerte incremento de la cantidad y de la calidad de la hidrocortisona producida puesto que ninguna de estas cepas produce el contaminante 4-pregnen-17, 20-diol-3-ona. Esta última característica particularmente provechosa se debe a la ausencia de proteínas codificadas por los genes GCY1 y/o JPR1 responsables de la reacción de reducción de la cetona en 20. Es también interesante observar que de manera inesperada la sobre producción controlada de ARHlp bajo el control del promotor CYC1 incremente de manera significativa la cantidad de esteroides totales producidos así como la producción de hidrocortisona (véase UCY24 pCV29+pCC12 versus UCY25 pCV29+pCC12) . Sin embargo, esta expresión no debe ser excesivamente importante para obtener el efecto deseado. Asi, si una expresión de la protexna ARHl a un nivel superior en comparación a un nivel fisiológico es deseable, se debe cuidar de no sobreexpresar excesivamente esta protexna porque en este caso se podría perder este incremento de producción de esteroides. Asi, el promotor TEF1 el cual es reconocido como mucho más fuerte que CYC1 (Nacken, V., T. Achstetter, y E. Degryse, Probing the limits of expression levéis by varying promoter strength and plasmid copy number in Saecharom ees cerevisiae [Probando los limites de niveles de expresión por medio de la variación de la fuerza del promotor y del número de copias del plásmido en Saccharomyces cerevisiae]. Gene, 1996. 175(1-2): p. 253-60) proporciona resultados insatisfactorios (véase UCY25 pCV29+pCC12 versus UCY27 pCV29+pCC12) . En conclusión la cepa UCY25/pCV29+pCC12 tiene un potencial estimado para producir 200 mg/1 de hidrocortisona en un fermentador con un solo contaminante mayor (la corticosterona) . c) .- Ejemplo de producción en gran volumen de las cepas en la invención Dos de las cepas anteriores fueron cultivadas en fermentador de gran volumen en medio Kappeli de conformidad con técnicas bien conocidas del experto en la materia (véase, por ejemplo, Risenberg D. Risenberg D. y R. Guthke, High-cell-density cultivation of microorganisms [Cultivo celular de alta densidad en microorganismos] . Appl Microbiol Biotechnol, 1999. 51: p. 422-430. La técnica de cultivo utilizada es un discontinuo alimentado a medio concentrado (alimentación de lotes) . El fermentador de un volumen total de 15 litros contiene al principio 6 litros de medio. Se agrega de manera continua 4 litros de medio concentrados suplementario en el transcurso de la fermentación asi como líquidos correctores de pH y se agrega de manera continua etanol hasta llegar a un volumen final de 11.5 litros aproximadamente al final del cultivo. Las cepas UCY4 pCV29+pCC12 y UCY16 pEMIO fueron cultivados de esta manera durante 180 horas y se pudo obtener de esta forma una producción incrementada de hidrocortisona (véase tabla 3) . A partir de estos resultados, se extrapoló los resultados posibles para las cepas UCY24 Pcv29+pCCl2, UCY25 pCV29+pCC12, UCY26 pCV29+pCC12 y UCY27 pCV29+pCC12 (véase tabla 3) . Tabla 3 Producción de hidrocortospma de diferentes clones obtenidos de conformidad con la presente invención (resultados en mg/1) Cepas Hidrocortisona en mg/1 UCY4 pCV29+pCC12 80 UCY16 pEMIO 110 UCY24 pCV29+pCC12 123* UCY25 pCV29+pCC12 203* UCY26 pCV29+pCC12 155* UCY27 pCV29+pCC12 172* * Estos resultados fueron obtenidos por extrapolación de los resultados obtenidos en termentador de gran volumen con las cepas ÜCY4 pCV29+pCC12 y UCY16 pFMIO. Depósito de material biológico Los organismos siguientes han sido depositados el dia 25 de enero de 2001 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) , 25 rué du Docteur Roux, 75724 Paris Cedes 15, France, de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest. - Cepa CDR07 MMO¡ Número de orden 1-2616 - Cepa TGY260 Número de orden 1-2615 Lista de las ceptas descritas en la presente solicitud Fyl679-18b = (n) MATa ura3-52 trp 1 ?63 leu2- ?1 hls3-?200 fenl G7AL fens ura- trp- leu- his- Fyl679-28c = (n) MATa ura3-52 trp 1 ?63 leu2- ?1 his3~ ?200 fenl GAL fens ura" trp" leu" his- TGY195 #4 = Fyl679-18b yprl : :ÜRA3 TGY212-1 = Fyl679-18b yprl ::TEF1P: :P450c21 [5x?] ura" trp" leu" his" TGY243-1 = TGY212-1 gcyl : :ura3 trp" leu" his" TGY245-2D = TGY243-1 grey! ; :TDH3P: : P450c21 ura" trp" leu" his- TGY260-A = TGY245-2D LEU2: :CYC1P: : AKHl ura" trp- his- CDR01 = Fyl679-18b MATa LEU2: :'b-mat ADR' ura" trp" his" CDR07 MATa = MATa ade2: : GAL10/CYC1P: : ?7 ura" trp" leu- his"ade" (espora de CAIO x Fyl679-28c) CDR07 ???a = ???a ade2: : GALIO/CYC1P: :?7 ura" trp- leu" his- ade" (espora de CAIO x Fyl679-28c) CA03 = CDR01 ade2: -.GALIO/CYClp: :?7 ura- trp- his- resistente a la nistatina (Duport y colaboradores, 1998) CAIO = CA03 erg5: :PGK1P: :higroR ura" trp- ade- his- resistente a la nistatina y a la higromicina (Duport y colaboradores, 1998) SB14 (2n) = TGY260-A x CDR07 MAT<¾ YCC4 = (n) MATa ade2: :GAL10/CYC1P: : ?7 LEU2: : CYC1P: zAKHl, yprl : : TEF1P: .-P450c21, ERG5, fenl ( ? ) , ura" trp" ade" his" resistente a la nistatina (espora de SB14) YCC8 = YCC4 transformada con pLIP5 (TRP1 : : TEF1P: :P450cl7 : :p450C17 : : PGK11) , ura- ade- his" resistente a la nistatina UCY2 = YCC8 transformada con pTG12093 (HCoxVIPre; rmatADX: iPGKl t) : HIS3: : TDH3P: : CoxVIpre : :matADX: :PGKlt, ERG5^ fenl (?), ura- ade- resistente a la nistatina UCY4 = UCY2 atf2-A: :G418R ura- ade- resistente a la nistatina y a G418.

UCY5 = (n) MATa ade2 : : GAL10/CYC1P: : A7Reductasa, LEU2: : CYC1P: :ARH1, gcyl : : TDH3P: : P450C21, ERG5, fenl (?) , ura" trp" ade" his" resistente a la nistatina, espora de SB14) . YCC9 = YCC5 transformada con pLIP5 ( TRP1 :: TEF1P: :P450C17: :pgklt) r ura" ade" his~ resistente a la nistatina. UCY3 = YCC9 transformada con pTG12093 HIS3: : TDH3P: : CoxVIpre : :matADX: : PGKltf HIS3: : TDH3P: : CoxVIpre : rmatADX: :PGKlt, ERG5r fenl (?)ERG5, fenl (?) , ura" ade" (resistente a la nistatina) . UCY26 = UCY3 at 2-?: :G418R ura" ade" (resistente a la nistatina y a G418) . YSA2 (2N) = TGY245-2D x UCY2. UCY5 = (n) MATa ade2 : : GAL10/CYClP: : A7Reductasa, LEU2: : CYC1P: :AKH1, yprl : : TEF1P: : P450C21, ERG5, gcyl: : TDH3P : P450c21 fen(?) , ura" trp" his", resistente a la nistatina, (espora de YSA2) . ÜCY6 = UCY5 LEU2: : TEF1 : -. atADR: : PGKltr UCY16 = UCY36, atf2: : URA3: : atf2 UCY19 = UCY5, LEU2: :CYC1 : :ARHl . UCY20 = UCY5, LEU2.-TEF1: :ARH1. UCY25 = UCY19 atf2-A: :G418R (resistente a la nistantina y a G418) . ÜCY27 = UCY20 at 2-?: :G418R (resistente a la nistantina y a G418) .

UCY24 = UCY6 at 2-?: :G418R (resistente a la nistantina y a G418) .

LISTA DE SECUENCIAS <110> AVENTIS PHARMA SA <120> CEPAS DE LEVADURAS QUE PRODUCEN ES EROIDES DE MANERA AUTÓNOMA <130> Solicitud RMV 2544 <140> <141> <150> FR 0101294 <151> 2001-01-31 <160> 49 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> El oligonucleótido OTG11314 para amplificar la parte 5' de YPR1 <400> 1 tacgctcgag acgttggtgt cattgatatt ca 32 <210> 2 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> El oligonucleótido OTG11315 para amplificar la parte 5' de YPR1 <400> 2 cttcattcaa atagatagcc g 21 <210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> El oligonucleótido OTG11316 para amplificar la parte 3' de YPR1 <400> 3 tatggctaaa aagcacggcg tt 22 <210> 4 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> El oligonucleótido OTG11317 para amplificar la parte 3' de YPR1 <400> 4 cgatctcgag tttctcgttg ttcaggtact g 31 <210> 5 <211> 65 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> El oligonucleótido OTG11463 para amplificar URA3 flanqueado por YPRl <400> 5 cggctatcta tttgaatgaa gatcgatttt caattcaatt catcattttt 50 ttattctttt ttttg 65 <210> 6 <211> 58 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> El oligonucleótido OTG11464 para amplificar URA3 flanqueado por YPRl <400> 6 aacgccgtgc tttttagcca taagcttggg taataactga tataattaaa tagtactc 58 <210> 7 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> El oligonucleótido OTG7410 para amplificar el ADNc de la P450c21 humana <400> 7 ggaattccgt cgacaaaaat gctgctcctg ggcctgctgc 40 <210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> El oligonucleótido OTG5927 para amplificar el ADNc de la P450c21 humana <400> 8 cctcaatggt cctcttggag ttcagcacc 29 <210> 9 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Entorno alrededor del codón ATG de inicio de la traducción de P450c21 <400> 9 gtcgacaaaa atgctgctcc tgggcctgct gc 32 <210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11844 <400> 10 tttgctcgag gttacagaag ggc 23 <210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11845 <400> 11 gattctcgag caattggctg acta 24 <210> 12 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11975 <400> 12 aaatcgataa catg 14 <210> 13 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido 0TG11976 <400> 13 ttatcgattt catg 14 <210> 14 <211> 30 <212> ??? <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11981 <400> 14 attgatatcg ataaaaagca cggcgttgag 30 <210> 15 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11982 <400> 15 tctcggaatt caggtactgc agccag 26 <210> 16 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11980 <400> 16 caactaagct tcattcaaat agatagccgc 30 <210> 17 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11285 <400> 17 gattcggtaa tctccgaaca ggtaccaatt atatcagtta ttacccggga 50 <210> 18 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11286 <400> 18 agccatcttc aaagcggtt 19 <210> 19 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11287 <400> 19 ccgatcgaat caaaacgaac ag 22 <210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11289 <400> 20 tctaatcagc tagtaagaac 2 <210> 21 <211> 67 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11305 <400> 21 aaccgctttg aaagatggct atcgattttc aattcaattc atcatttttt ttttattctt 60 ttttttg 67 <210> 22 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG11306 <400> 22 ctgtLcgttt tgatLcgatc gggaagcttg ggtaataact gatataatta aattgaactc 60 <210> 23 <211> 138 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia N-terminal de la proteine construida para expresión de la P450cll <400> 23 Met Leu Ser Arg Ala lie Phe Arg Asn Pro Val lie Asn Arg Thr Leu 1 5 10 - 15 Leu Arg Ala Arg Pro Gly Ala Tyr His Ala Thr Arg Leu Thr Lys Asn 20 25 30 Thr Phe lie Gln Ser Arg Lys Tyr Gly Thr Arg Gly Ala Ala Ala Pro 35 40 45 Lys AJa Va.l Leu Pro Phe Glu Ala Met Pro Arg Cys Pro Gly Asn Lys 50 55 60 Trp Met Arg Met Leu Gln lie Trp Arg Glu Gln Gly Tyr Glu Asp Leu 65 70 75 80 His Leu Glu Val His Gln Thr Phe Gln Glu Leu Gly Pro lie Phe Arg 85 90 95 Tyr Asp Leu Gly Gly Ala Gly Met Val Cys Val Met Leu Pro Glu Asp 100 105 . 110 Val Glu Lys Leu Gln Gln Val Asp Ser Leu His Pro His Arg Met Ser 115 120 125 Leu Glu Pro Trp Val Ala Tyr Arg Gln His 130 135 <210> 24 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OLPI FL <400> 24 agctggcggc cgcttaatta agtggcgcgc caagctt 37 <210> 25 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia agregada delante de la 3 beta-HSDH bovina <400> 25 gtcgacaaaa atg 13 <210> 26 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Fin del ADNc de la 3 beta-HSDH bovina <400> 26 tgacctggag tgacaatgac gcgt 24 <210> 27 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG5868 <400> 27 cgcgtgtac <210> 28 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OLIP 174 <400> 28 agctgcggcc gcggcgcgcc gtttaaac <210> 29 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OLIP 175 <400> 29 agctgtttaa acggcgcgcc gcggccgc <210> 30 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OLIP 21 <400> 30 aaacggcgca gtagggaata ttactgg 27 <210> 31 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OLIP 22 <400> 31 ccgaagctta atcggcaaaa aaagaaaagc 30 <210> 32 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido OLIP 20 <400> 32 agctgcggcc ge 12 <210> 33 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido C17-3 <400> 33 actgatggtt ggggtgcatt ga 22 <210> 34 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido C17-5 <400> 34 atggcatcct ggaggttctg ag 22 <210> 35 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido ADX-3 <400> 35 gtacccgggg atccttattc tat 23 <210> 36 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido ADX-5 <400> 36 cagtccactt tataaaccgt gatg 24 <210> 37 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido 5'ADE2090 <400> 37 cgattcggat ccactagtaa cgccgtatcg tgattaacg 39 <210> 38 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido 3'ADE2089 <400> 38 cctcaaggat cctcctgacg tagcgctatc ctcggttctg 40 <210> 39 <211> 327 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Base de recombinación Rl <400> 39 atggcccttc aagctgc tt ctttggtctc ctctgctttc tctgtccgca aagatggaaa 60 attaaatgcL tcagcatcat catcattcaa agagtctagt ctgttcggtg tttcactttc 120 ggagcaaagc aaagctgact ttgtctcttc ctcattgaga tgcaagaggg aacagagctt 180 gaggaataat aaagcgatt.a ttcgagctca agcaatcgcg acttcaactc catcagtcác 240 aaaatcttcc ttagaccgca agaaaacact tagaaaagga aacgtggttg tcacgggagc 300 ttcttcaggg ctaggtttag caacggc 327 <210> 40 <211> 336 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Base de recom inación R2 <400> 40 ataatggcgt gcagagactt cctcaaggc gagagagccg ctcaatctgc agggatgcct 60 aaggacc»gct acactatgat gcatttggac tnggcgtctt tggacagcgt gaggcagttt 120 cttgataact tcaggcgagc tgagatgcct ctcgatgtgt tggtctgcaa tgccgcagtc 180 tatcagccaa cggctaatca acctactttc actgctgaag ggtttgagct tagcgttggg 240 ataaaccatt tgggccactt tcttctttca agattgttga ttgstgactt gaagaactcc 300 gattatccat caaaacgtct catcattgtt ggtacc 335 <2.10> 41 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG10842 <400> 41 aaaaacgcgt aactattaaa gcgacgcaaa ttcgccgatg gtttgg 46 <210> 42 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido OTG10841 <400> 42 aaaagtcgac aaaatggaag atatagaagg atacgaacca catatcactc 50 <210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido arhlD <400> 43 cggagcgcta tccttagaga 20 <210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido nfslR <400> 44 acgtttcttt cgcctacgtg 20 <210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido leu2D <400> 45 ggtaaggcca ttgaagatgc 20 <210> 46 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido arhlR <400> 46 accccttttg ttccgagttc 20 <210> 47 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido XlTEFl <400> 47 ttcaaaacac ccaagcacag 20 <210> 48 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido X2C21 <400> 48 ggtctgccag caaagtctgc 20 <210> 49 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido X3TDH3 <400> 49 cgggcacaac ctcaatggag 20

Claims

REIVINDICACIONES Cepa de levadura genéticamente modificada que produce, de manera autónoma, a partir de una fuente de carbono simple, un esteroide o un derivado de esteroide, derivado del metabolismo del colesterol, que se caracteriza porque dicho esteroide o derivado de esteroide se encuentra dentro del grupo constituido por la 17a-hidroxi prenegnolona, cortisol, cortexolona, 17cx-hidroxi progesterona y los derivados de etos esteroides . Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 1, que se caracteriza porque presenta por lo menos una modificación genética seleccionada dentro del grupo constituido por la disrupción o la desactivación de un gen endógeno, la modificación del promotor de un gen endógeno, la duplicación de un gen endógeno, la introducción de por lo menos un gen heterólogo, en un bloque de expresión, en una o varias copias, de manera episomal o cromosómica. Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 2, que se caracteriza porque presenta una combinación de dichas modificaciones génicas. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque presenta por lo menos una disrupción de un gen endógeno seleccionado dentro del grupo constituido por ERG5, ATF2, GCY1, YPR1, ARE1, ARE2, ATF1, ADE2. Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 4, que se caracteriza porque presenta una disrupción de los genes endógenos ERG5, ATF2 , GCY1, y YPR1. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza porque presenta por lo menos un bloque de expresión para un gen heterólogo integrado en el cromosoma, y por lo menos un locus seleccionado entre ADE2, HIS3, TRP1, LEU2, GCY1, ATF2, LYPR1, la integración efectuándose de manera intragénica o intergénica, en cercanía inmediata de dicho locus . Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza porque presenta por lo menos un bloque de expresión para un gen heterólogo ubicado en un plásmido de copias múltiples o un plásmido de bajo número de copias. Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 7, que se caracteriza porque el plásmido de copias múltiples se selecciona entre los plásmidos con base en un replicón de 2 mieras de levadura que se replica en Saccharomyces cerevlsiae y porque el plásmido de bajo número de copias se selecciona entre los plásmidos basados en un origen de replicación ARS cromosómico con un centrómero de levadura. 9. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que se caracteriza porque presenta por lo menos un gen o un ADNc heterólogo en un bloque de expresión, dicho gen o ADNc seleccionándose dentro del grupo constituido por el gen de la esterol A7-reductasa, del citocromo P450 SCC, de la adrenodoxina, de la adrenodoxina reductasa, de la 3ß - hidrosteroide deshidrogenasa isomerasa, del citocromo b5, de la citocromo P450 reductasa, del citocromo P450 C17, del citocromo P450 C21, del citocromo P450 CU y de las secuencias que codifican para estas proteínas. 10. Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 9, que se caracteriza porque en por lo menos un gen o ADNc heterólogo y bajo el control de una secuencia promotora seleccionada dentro del grupo constituido por las secuencias promotoras endógenas de levadura TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GALIO, ATF2, TIR1, ARH1, ADE2, y del promotor híbrido GAL10-CYC1. 11. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, que se caracteriza porque la secuencia de terminación de por lo menos un gen o ADNc heterólogo en el bloque de expresión se selecciona entre las secuencias de terminación de los genes endógenos PGK1, CYC1, ATF2, ADE2, NCP1. 12. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que se caracteriza porque presenta el bloque de expresión heterólogo esterol ?7 - reductasa integrado en el cromosoma al locus ???.2. 13. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que se caracteriza porque comprende por lo menos un cassette de expresión de genes que codifican para las formas maduras de P450scc y de la adrenodoxina localizada en un plásmido de gran número de copias . 14. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que se caracteriza porque comprende un cassette de expresión de la adrenodoxina reductasa para P450scc localizada en un plásmido de una sola copia o de un bajo número de copias, o bien integrada en uno o varios cromosomas de levadura. 15. Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 14, que se caracteriza porque dicho cassette de expresión de la adrenodoxina reductasa posee los elementos que aseguran la presencia de la proteina en el citosol de la célula huésped. 16. Cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que se caracteriza porque comprende por lo menos un cassette de expresión seleccionado entre los cassetts de expresión de la $ - hidrosteroide deshidrogenase isomerasa, del citocromo P450cl7, del citocromo P450c21 localizado en un plásmido de gran número de copias. 17. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que se caracteriza porque comprende por lo menos un cassette de expresión para la ?45011ß que se encuentra en un plásmido de copias múltiples, la proteína producida presentando una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias . 18. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que se caracteriza porque comprende por lo menos un cassette de expresión para un precursor de la adrenodoxina para ?45011ß colocada en un plásmido de copias múltiples, con un promotor débil, la proteína producida presentando una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias. 19. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que se caracteriza porque presenta por lo menos dos cassetts de expresión para la adrenodoxina, de tal manera que una proteína tenga actividad hacia el exterior de la mitocondria, la otra activa en las mitocondrias de la célula huésped. 20. Cepa de levadura de conformidad con la cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que se caracteriza porque comprende por lo menos un cassette de expresión para la NCP1, ATR1 y/o ATR2 colocada en un plásmido de copias múltiples o bien integrada en el cromosoma. 1. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que se caracteriza porque expresa la proteina ARH1 a un nivel superior con relación a un nivel fisiológico. 2. Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 21, que se caracteriza porque posee, además del gen endógeno, un segundo cassette de expresión para la proteina ARH1. 3. Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 22, que se caracteriza porque la expresión de la proteina ARH1 se encuentra bajo el control del promotor CYC1 de dicho cassett. 4. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que se caracteriza porque es poliploide, diploide, haploide o aneuploide. 5. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que se caracteriza porque se trata de una cepa de Saccharomyces cerevisiae. 6. Cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 24, que se caracteriza porque el derivada de la cepa FY 1679-28c o de la cepa FY 1679-18b. 7. Cepa de levadura caracterizada porque se trata de la cepa CDR07 Mat-x o bien TGY260, depositada ante la CNCM el día 24 de Enero de 2001 bajo los números de orden respectivos 1-2616 e 1-2615, o bien de una cepa obtenida después de cruzamiento de CDR07 Mat-a y TGY260, y eventualmente esporulación y transformación con un plásmido de levadura, especialmente la cepa UCY2 o UCY4. 8. Cepa de levadura de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que se caracteriza porque posee los elementos necesarios para la excreción del esferoide producido en el medio de cultivo. 9. Procedimiento de producción de un esferoide, que se caracteriza porque comprende las etapas de fermentación de una cepa de levadura de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 28 en presencia de una fuente de carbono simple, y de recuperación del esferoide producido . 0. Preparación farmacéutica que comprende una cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.