ES2354603T3 - Cepas de levadura que producen esteroides de forma autónoma. - Google Patents

Abstract

Cepa de levadura genéticamente modificada que produce, de manera autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla, un esteroide o un derivado de esteroide, derivado del metabolismo del colesterol, estando comprendido dicho esteroide o derivado de esteroide en el grupo constituido por la pregnenolona, la 17α-hidroxi pregnenolona, el cortisol, la cortexolona, la progesterona, la 17α-hidroxi progesterona, y sus derivados acetilados, hidroxilados o que contienen un derivado halogenado o un grupo metilo, caracterizada porque presenta una inactivación de los genes endógenos ATF2, GCY1 y YPR1.

Description

La presente invención se refiere a la producción de esteroides en los microorganismos, principalmente las cepas de levaduras.

Los esteroides, principalmente los esteroides derivados del colesterol, están implicados en numerosos procesos fisiológicos entre los que se pueden citar la regulación de las tasas de glúcidos y colesterol en la circulación sanguínea, el mantenimiento y el desarrollo de la masa muscular, el desarrollo del sistema nervioso central.

Entre los inconvenientes observados en el caso de la desrregulación de las tasas de esteroides circulantes, se pueden citar la activación opcional de enfermedades auto-inmunes, tales como lupus, determinados cánceres, por ejemplo el cáncer de mama, enfermedades cardiovasculares, por ejemplo aterosclerosis. Los problemas de regulación de esteroides se sospechan igualmente en el caso de la activación de determinadas enfermedades neurológicas tales como las enfermedades de Parkinson o de Alzheimer.

Los esteroides, principalmente la hidrocortisona, pueden utilizarse como agentes terapéuticos como tales o como complementos en otros tratamientos. Así, los derivados de síntesis de los glucocorticoides se utilizan por sus acciones anti-inflamatorias y, a altas dosis, inmunosupresoras.

La obtención de los esteroides está actualmente ligada a procedimientos de extracción o de síntesis costosos. John Warcup Cornforth ha sido el primero en realizar la síntesis total de un esteroide, el colesterol, por un método enzimático. Sin embargo, es importante disponer de un método que permita obtener los esteroides de interés, principalmente los derivados del colesterol, a un precio asequible.

Un determinado número de proteínas implicadas en la biosíntesis de los esteroides se han expresado en la levadura. Así, la patente EP 360 361 demuestra la actividad de las proteínas P450 17α y P450c21 en la levadura Kluyveromyces lactis. Asimismo, se ha descrito la posibilidad de conversión in vivo de 11 desoxicortisol en hidrocortisona en una levadura genéticamente modificada que expresa P450c11 (Dumas et al., 1996), así como la producción de 17α-hidroxiprogesterona a partir de pregnenolona en la levadura (Degryse et al., 1999). Además, Duport et al. (Duport et al., 1998) han descrito la síntesis de pregnenolona y de progesterona en una levadura genéticamente modificada. Se ha descrito igualmente en la solicitud de patente WO 99/40203 que la inactivación del gen ATF2 en una cepa de levadura permite evitar la acetilación de los esteroides producidos por esta cepa.

La presente invención permite realizar la síntesis de esteroides, por la fermentación de cepas de levaduras genéticamente modificadas, en presencia de una fuente de carbono sencilla. El método propuesto por la presente invención permite por lo tanto obtener una gran cantidad de esteroides de interés, a bajo coste, porque el procedimiento aplica la fermentación de levaduras y la adición de una fuente de carbono sencilla, fácilmente disponible comercialmente.

Definiciones:

Por fuente de carbono sencilla, según la presente invención, se entienden las fuentes de carbono utilizables por el experto en la técnica para el crecimiento normal de una levadura. Se entiende designar principalmente los diferentes azúcares asimilables, tales como glucosa, galactosa o sacarosa, o las melazas, o los subproductos de estos azúcares. Una fuente de carbono sencilla muy particularmente preferida es el etanol y el glicerol.

Por derivado de un esteroide, se entiende designar, según la presente invención, un compuesto que puede obtenerse, principalmente por una o dos reacciones enzimáticas o químicas, a partir de dichos esteroides. Se entiende particularmente designar los esteroides acetilados, hidroxilados, o que contienen un sustituyente tal como un derivado halogenado (flúor, yodo), o un grupo metilo.

Los problemas a resolver para poder producir los esteroides en un microorganismo son de diferentes clases:

 conviene eliminar las reacciones parásitas que pueden observarse debido a la presencia de enzimas endógenas en el microorganismo elegido,

 conviene introducir los genes que permiten la modificación de los intermedios de síntesis de tal forma que los niveles de expresión obtenidos estén los más próximos posible a los niveles observados en los mamíferos. Así, recrear los buenos equilibrios es una condición importante del éxito de dicho proyecto,

 conviene obtener un nivel de expresión de los diferentes genes que permita orientar preferentemente la biosíntesis hacia el esteroide elegido.

La síntesis de los esteroides es una serie de reacciones extremadamente complejas, en las que participan numerosas enzimas para obtener el cortisol a partir del colesterol.

Conviene producir en primer lugar el 20,22 dihidroxicolesterol, que se transforma en pregnenolona, ella misma hidroxilada en 17-α hidroxi-pregnenolona. Ésta se transforma en 17-α hidroxiprogesterona, que proporciona el desoxicortisol, que lleva al cortisol (hidrocortisona).

Una vía alternativa consiste en la producción de pregnenolona, y progesterona, transformada en 17-α hidroxi-progesterona.

Se ha mostrado que se puede producir pregnenolona en la levadura, a partir de una fuente de carbono sencilla, (Duport et al., 1998, cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente solicitud). Para hacer esto, ha sido necesario suprimir una vía endógena (por disrupción del gen Δ22-esteroldesaturasa (ERG5) de la vía de biosíntesis endógena de los ergosteroles), con el fin de obtener una acumulación de productos saturados en C-22. En efecto, el ergosterol normalmente fabricado por la levadura difiere del colesterol en una insaturación en C-7(8) del núcleo B, una insaturación en C-22, y un grupo metilo adicional en C-24. Así, los productos saturados en C-22, y en C-7 en el núcleo B pueden utilizarse como sustratos por las enzimas situadas en la cadena de producción del cortisol.

La presente invención permite realizar la síntesis de esteroides, y principalmente los esteroides situados más abajo que la pregnenolona, de forma sencilla, por la fermentación de cepas de levaduras genéticamente modificadas, en presencia de una fuente de carbono sencilla. En un caso particular de la invención, los esteroides sintetizados se excretan en el medio de cultivo, lo que simplifica su purificación. El método propuesto por la presente invención permite por lo tanto obtener una gran cantidad de esteroides de interés, a bajo coste, porque el procedimiento aplica la fermentación de levaduras y la adición de una fuente de carbono sencilla, fácilmente disponible comercialmente.

De forma preferida, los esteroides que pueden producirse por la cepa de levadura según la invención son esteroides comprendidos en la vía de síntesis del cortisol, así como los enunciados anteriormente. Igualmente, se pueden producir otros tipos de esteroides, a partir de la 17-α hidroxipregnenolona, principalmente la dihidroepiandrosterona (DHEA), por la acción de la enzima 17 αhidroxilasa y liasa, y los esteroides derivados (androstendionas, testosterona...). Estos esteroides pueden producirse por introducción de las enzimas apropiadas en la cepa de levadura, de la misma forma que para la cepa ejemplificada en la presente invención

Para la aplicación del método según la invención, la invención se refiere igualmente a una cepa de levadura, genéticamente modificada, que produce un esteroide o un derivado de esteroide, caracterizada porque permite la producción de manera autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla.

El hecho de que la producción se realice de forma autónoma significa que no es necesario añadir sustratos para obtener el esteroide de interés, sino que la levadura puede producirlo a partir únicamente de la fuente de carbono sencilla de partida. También está claro que la cepa puede producir un esteroide de la vía metabólica, mediante la utilización de un sustrato situado anteriormente en la vía metabólica, en la medida en que la cepa de levadura según la presente invención contenga todos los genes necesarios para la terminación de la vía metabólica de producción de los esteroides.

Preferentemente, la cepa de levadura según la invención produce un esteroide o derivado de esteroide que es un derivado del metabolismo del colesterol, es decir, que forma parte de la cadena de metabolismo del colesterol. El metabolismo del colesterol es muy conocido para el experto en la técnica, y se explica en los textos de bioquímica y de endocrinología.

Así, preferentemente, dicho esteroide o derivado de esteroide está comprendido principalmente en el grupo constituido por la 17α-hidroxi pregnenolona, el cortisol, la cortisona, la cortexolona, la 17αhidroxi progesterona, y los derivados de estos esteroides.

Se puede producir igualmente la pregnenolona y la progesterona con una cepa de levadura según la presente invención.

Así, la presente invención tiene principalmente por objeto una cepa de levadura genéticamente modificada que produce, de manera autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla, un esteroide o un derivado de esteroide, derivado del metabolismo del colesterol, caracterizado porque dicho esteroide o derivado de esteroide está comprendido en el grupo constituido por la 17α-hidroxi pregnenolona, la hidrocortisona, la cortexolona, la 17α-hidroxi progesterona, y los derivados de estos esteroides.

Así, como se verá más adelante, la cepa de levadura según la invención presenta al menos una modificación genética elegida de un grupo constituido por la disrupción o inactivación de un gen endógeno, la modificación del promotor de un gen endógeno, la duplicación de un gen endógeno, la introducción de al menos un gen heterólogo, en una o varias copias, de forma episomal o cromosómica.

Es ventajoso por otra parte que la cepa de levadura de la invención presente una combinación de dichas modificaciones génicas.

Así, la presente invención tiene por objeto una cepa de levadura genéticamente modificada que produce, de manera autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla, un esteroide o un derivado de esteroide, derivado del metabolismo del colesterol, estando comprendido dicho esteroide o derivado de esteroide en el grupo constituido por la pregnenolona, la 17α-hidroxi pregnenolona, el cortisol, la cortexolona, la progesterona, la 17α-hidroxi progesterona, y sus derivados acetilados, hidroxilados o que contienen un derivado halogenado o un grupo metilo, que presenta una inactivación de los genes endógenos ATF2, GCY1 y YPR1.

En otro modo de realización, la cepa de levadura según la invención presenta al menos una inactivación adicional de un gen endógeno elegido del grupo constituido por ERG5, ARE1, ARE2, ATF1 y ADE2.

En otro modo de realización, la cepa de levadura según la invención presenta una disrupción de los genes endógenos ERG5, ATF2, GCY1, YPR1. Así como se describe más adelante, estos genes codifican proteínas que inducen reacciones parásitas en la levadura.

El gen ADE2 en cuanto a él puede disrumpirse igualmente de forma opcional, principalmente para integrar un gen heterólogo en la cepa de levadura.

En un modo de realización, la cepa de levadura según la invención presenta al menos un gen heterólogo integrado en el cromosoma, en al menos un locus elegido entre ADE2, HIS3, TRP1, LEU2, GCY1, ATF2, YPR1, efectuándose la integración de manera intragénica o intergénica muy cerca de uno de los loci.

En un modo de realización de la invención, dicha cepa de levadura presenta al menos un gen heterólogo situado sobre un plásmido multicopia o un plásmido de bajo número de copias, eligiéndose dicho plásmido multicopia entre los plásmidos a base de un replicón 2 micrómetros de levadura que se replica en Saccharomyces cerevisiae y eligiéndose dicho plásmido de bajo número de copias entre los plásmidos basados en un origen de replicación ARS cromosómico con un centrómero de levadura.

Para la aplicación de un modo de realización de la invención, y así como se desarrolla más abajo, la cepa de levadura según la invención presenta al menos un gen o un ADNc heterólogo elegido del grupo constituido por el gen de la esterol Δ7-reductasa y los ADNc de la citocromo P450 SCC, de la adrenodoxina, de la adrenodoxina reductasa, de la citocromo b5, de la 3β-hidroesteroide deshidrogenasa isomerasa, de la citocromo P450 reductasa, de la citocromo P450 C17, de la citocromo P450 C21, de la citocromo P450 C11, y de las secuencias que codifican estas proteínas.

Estos genes o ADNc heterólogos están bajo el control de una secuencia promotora elegida del grupo constituido por las secuencias promotoras endógenas de levadura TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GAL10, ATF2, TIR1, ARH1, ADE2, y el promotor híbrido GAL10-CYC1.

Es necesario utilizar una secuencia terminadora para cualquier gen o ADNc heterólogo introducido, preferentemente, elegida entre las secuencias terminadoras de los genes endógenos PGK1, CYC1, ATF2, ADE2, NCP1.

Se obtienen bloques o casetes de expresión, que consisten en un promotor, el gen heterólogo (o ADNc, que codifica opcionalmente la proteína madura precedida del codón ATG que codifica la metionina (Met-mat) o una proteína de fusión que posee opcionalmente señales de direccionamiento hacia compartimentos celulares), y una secuencia terminadora.

En un modo de realización, la cepa de levadura según la invención presenta el bloque de expresión heterólogo esterol Δ7-reductasa integrado en el cromosoma en el locus ADE2.

En un modo de realización particular de la invención, la cepa de levadura comprende al menos un casete de expresión de los genes que codifican P450scc, adrenodoxina cofactor de P450scc localizado en un plásmido de gran número de copias y comprende un casete de expresión de la adrenodoxina reductasa cofactor de P450scc localizado en un plásmido mono o de bajo número de copias o integrado en el cromosoma. De forma preferida, estos casetes de expresión contienen la proteína madura precedida de una metionina, y la proteína está localizada en el citosol.

En un modo de realización, la cepa de levadura comprende al menos un casete de expresión elegido entre los casetes de expresión de la 3β-hidroesteroide deshidrogenasa isomerasa, de la citocromo P450c17, de la citocromo P450c21 localizado en un plásmido de alto número de copias, de bajo número de copias o integrado en el cromosoma.

En un modo de realización particular, la cepa de levadura según la invención comprende al menos un casete de expresión para la P45011β situado en un plásmido multicopia, presentando la proteína producida una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias y/o al menos un casete de expresión para la adrenodoxina cofactor de la P45011β situado en un plásmido multicopia, con un promotor débil (es decir, cuya fuerza se parece a la del promotor CYC1), presentando la proteína producida una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias. De forma preferida, las proteínas se producen en forma de un precursor, con una señal homóloga o heteróloga de direccionamiento hacia las mitocondrias, alcanzando las proteínas su forma madura en este compartimento celular.

Es por lo tanto interesante indicar que en un caso particularmente preferido de la aplicación de la invención, se introduce en la cepa de levadura dos copias del gen que codifica la adrenodoxina, estando destinada una de ellas a expresar la proteína en el citosol de la célula, fabricándose la otra de tal manera que la proteína madura se encuentra en las mitocondrias.

En un modo de realización particular, la cepa de levadura comprende igualmente al menos un casete de expresión (promotor de expresión tal como se ha citado anteriormente con la parte codificadora del gen NCP1, ATR1, y/o ATR2, con su propio terminador o un terminador tal como se ha definido anteriormente) situado en un plásmido multicopia, de bajo número de copias o integrado en el cromosoma. Los casetes de expresión para NCP1, ATR1, y ATR2 podrían estar integrados principalmente en el locus NCP1 de S. cerevisiae.

En un modo de realización particular, la cepa de levadura según la invención expresa igualmente la proteína ARH1p, proteína homóloga de la adrenodoxina reductasa de los mamíferos en la levadura, a un nivel superior al nivel de expresión fisiológico. La sobreexpresión de esta proteína puede obtenerse por técnicas muy conocidas por el experto en la técnica, por ejemplo por el aporte de un nuevo casete de expresión (promotor de expresión, parte codificadora del gen ARH1 con su propio terminador o un terminador tal como se ha definido anteriormente) además del gen endógeno en la levadura. De manera sorprendente, se ha mostrado en efecto que una expresión del gen ARH1 a un nivel superior al nivel de expresión fisiológico aumenta de forma significativa la cantidad de esteroides producidos. Sin embargo, esta expresión no debe ser muy importante para obtener el efecto deseado. Así, si es deseable una expresión de la proteína ARH1 a un nivel superior respecto a un nivel fisiológico, hay que tener cuidado de no sobreexpresar mucho esta proteína so pena de perder este aumento de producción de esteroides.

La cepa de levadura según la presente invención puede poseer un carácter poliploide, diploide, haploide o aneuploide, sin que esto perjudique la aplicación de la invención.

Se trata, preferentemente, de una cepa de Saccharomyces cerevisiae, principalmente derivada de una de las cepas FY 1679-28c, FY 1679-18b que son esporas de la cepa FY 1679 depositada en la American Type Culture Collection con el número 96604.

Es útil que la cepa de levadura según la invención posea los elementos necesarios para la excreción del esteroide producido en el medio de cultivo, con el fin de simplificar la purificación del producto final.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de producción de un esteroide, caracterizado porque comprende las etapas de fermentación de una cepa de levadura según la invención en presencia de una fuente de carbono sencilla, y de recuperación del esteroide producido.

Finalmente, la invención tiene igualmente por objeto una preparación farmacéutica que comprende una cepa de levadura según la invención, opcionalmente con un excipiente farmacéuticamente aceptable, siendo dicho excipiente muy conocido por el experto en la técnica.

Aunque la cepa de levadura según la invención produce un esteroide de forma autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla, se le puede proporcionar igualmente colesterol o una estructura emparentada, o un sustrato ya presente como derivado del colesterol con el fin de obtener los productos situados más abajo. La posibilidad de poder entrar en cualquier etapa, principalmente a nivel pregnenolona o posterior de la vía de metabolismo del esteroide investigado permite por lo tanto principalmente poder proporcionar a la levadura sustratos no naturales, que dirigen la síntesis de esteroides no naturales y sustituidos, principalmente fluorados.

En un primer modo de realización, la cepa de levadura según la presente invención permite principalmente producir el esteroide investigado (principalmente el cortisol), en cantidad superior a 10 mg/l, preferentemente superior a 50 mg/l, de forma más preferida 80 mg/l de forma más preferida 100 mg/l, de la forma más preferida 200 mg/l.

En otro modo de realización, el esteroide de interés (de forma preferida la hidrocortisona) está presente en una proporción superior al 20%, preferentemente 25%, de forma más preferida 30%, de forma más preferida 35%, de forma más preferida 40%, de forma más preferida 50%, de la forma más preferida 65% del total de los esteroides producidos por la cepa según la invención (principalmente los intermedios de síntesis).

Con el fin de que la cepa de levadura según la presente invención pueda producir los esteroides de interés, es necesario que presente modificaciones genéticas. Así, la cepa de levadura según la invención presenta al menos una modificación genética elegida de un grupo constituido por la disrupción o inactivación de un gen endógeno, la modificación del promotor de un gen endógeno, la duplicación de un gen endógeno, la introducción de al menos un gen heterólogo (principalmente un bloque de expresión con promotor y/o terminador homólogo y una parte codificadora heteróloga), en una o varias copias, de forma episomal o cromosómica.

De forma preferida, la cepa de levadura según la invención presenta varias (al menos cuatro) modificaciones genéticas tales como se han enunciado anteriormente.

Así, determinados genes endógenos de la levadura se inactivan o disrumpen favorablemente. Se pueden inactivar o disrumpir los genes por la introducción, en la secuencia codificadora, de un gen exógeno (principalmente un bloque de expresión con promotor y/o terminador homólogo y una parte codificadora heteróloga) tal como se describe más abajo, y/o un marcador de selección. Se pueden modificar igualmente los promotores de estos genes con el fin de reducir el nivel de expresión.

El gen de levadura ATF2 (Cauet et al.,1999) codifica una acetil transferasa que utiliza la pregnenolona como sustrato y su disrupción permite suprimir esta reacción parásita de acetilación, cuyo producto no puede utilizarse, y aumentar así el rendimiento del esteroide de interés. Así, los rendimientos pueden multiplicarse por valores comprendidos entre 3 y 7 después de la inactivación del gen ATF2.

Los genes GCY1 y YPR1 codifican aldo-ceto-reductasas. Estos genes se inactivan o disrumpen ventajosamente. Estos dos genes forman parte de una familia de 6 genes más o menos homólogos y que se supone que codifican los seis aldo-ceto-reductasas. Sin embargo, los productos de estos dos genes son los más activos sobre los sustratos considerados aquí, principalmente GCY1, y su inactivación es por lo tanto extremadamente interesante para la obtención de la hidrocortisona.

Así como se ha precisado anteriormente, es interesante inactivar el gen ERG5, con el fin de acumular un sustrato que presenta una estructura lo más cercana posible a la estructura del colesterol. Sin embargo, se ha mostrado que la levadura según la invención puede a pesar de todo producir los esteroides de interés a pesar de la actividad de este gen. Sin embargo, con el fin de optimizar los rendimientos, puede ser útil inactivarlo por mutación, deleción y/o inserción.

También se puede, sin que esto sea realmente crítico para el éxito global de la producción de esteroides con la levadura según la presente invención, inactivar otros genes, tales como ARE1, ARE2, ADE2 o ATF1. Estos genes codifican todos proteínas cuya ausencia puede mejorar el rendimiento global de síntesis del esteroide de interés.

Así como se describe en el artículo de Duport et al., anteriormente citado (Duport et al., 1998), se indica que la presencia de un bloque de expresión con promotor y/o terminador homólogo y una secuencia que codifica la Δ7-reductasa es útil porque permite efectuar la desaturación del doble enlace 78 del ergosterol y de sus derivados, y obtener así uno o varios precursores de estructura más cercana a la estructura del colesterol, sustrato de partida para la producción de pregnenolona. Así, es ventajoso que la cepa de levadura según la presente invención contenga este bloque de expresión. En un caso particular, dicho bloque de expresión de la Δ7-reductasa se integra en el genoma de la levadura, de forma preferida en el locus del gen ADE2, dando lugar a la disrupción del gen ADE2. El promotor utilizado para la transcripción es un promotor inducible tal como GAL10-CYC1, o un promotor constitutivo, tal como el promotor GAL10-GAL10-CYC1 que está desrregulado en la cepa CA10 descrita en Duport et al., 1998. La proteína utilizada se obtiene preferentemente de Arabidopsis thaliana (pero también puede obtenerse de una especie de mamífero), clonándose el ADNc en la forma nativa (ADN complementario justo después de una metionina de inicio de la traducción), y bajo el control de un terminador de la transcripción clásico en la levadura tal como PGK1.

Debe indicarse que la actividad del gen Δ7-reductasa en la levadura se ha descrito por Lecain et al., 1996, cuyo contenido técnico (principalmente las secuencias del gen Δ7-reductasa y las construcciones y métodos de operación) se incorpora por referencia en la presente solicitud.

La primera etapa es la producción de pregnenolona, obtenida después de introducir, en la levadura, las enzimas que permiten transformar normalmente el colesterol en pregnenolona. En el caso presente, se trata de la enzima que permite la escisión de la cadena lateral (P450scc por side chain cleavage), con dos coenzimas (adrenodoxina, ADX, y adrenodoxina reductasa, ADR). La transformación de la levadura con estos bloques de expresión respectivos se describe en Duport et al., 1998, citado anteriormente.

Se utiliza preferentemente un ADN complementario que codifica las proteínas maduras, con una metionina añadida en el extremo N-terminal para permitir la traducción. Se utilizan promotores tales como el promotor híbrido GAL10-CYC1, o el promotor TEF1, para asegurar la transcripción de los ADNc. Se utilizan los terminadores clásicos, principalmente el terminador PGK1.

Los diferentes ADNc que codifican las proteínas P450scc, ADR o ADX pueden originarse de un vertebrado, por ejemplo humano o bovino, pero también rata o pez. Los genes que codifican estas proteínas se sitúan preferentemente en plásmidos, se prefiere para P450scc y ADX un plásmido multicopia de bajo o alto número de copias, principalmente derivado de un plásmido 2 micrómetros de levadura, aunque se utiliza antes un plásmido monocopia o de bajo número de copias para la expresión de ADR. El bloque de expresión para ADR también puede integrarse en el cromosoma de la levadura. Esto permite controlar la expresión de ADR, porque parece que una alta expresión perjudica la actividad scc buscada.

Las proteínas se expresan preferentemente para poder ejercer su actividad en el citosol.

La etapa siguiente es la conversión de la pregnenolona en 17α-hidroxi progesterona, por la acción conjugada de la 17α-hidoxilasa (P450c17) y de la 3β-OH-esteroide deshidrogenasa (3β-HSD).

Para la expresión de estas dos proteínas, se utilizan preferentemente promotores fuertes, tales como TEF1, TDH3, GAL10-CYC1. Sin embargo, puede ser igualmente conveniente un promotor más débil tal como CYC1. Los terminadores utilizados son clásicos, principalmente provienen de los genes PGK1 o NCP1. Se expresan los ADN complementarios que codifican las proteínas completas. La especie de origen de estas proteínas no parece modificar los resultados obtenidos, así que se pueden utilizar proteínas de origen humano (principalmente uno de los dos isotipos de la 3β-HSD), bovino, o de otros organismos (principalmente de peces). Se trata, para estas dos proteínas, de obtener la mejor expresión posible, y por lo tanto se pueden expresar en plásmidos mono o multicopias de bajo o alto número de copias, o habiendo integrado los bloques de expresión en al menos un cromosoma de la levadura.

Investigamos la conversión de la 17α-hidroxi progesterona en desoxicortisol, mediante la P450c21, que permite una hidroxilación en 21. Se trata de expresar la proteína, a partir de su ADNc, de la mejor forma posible. Para hacer esto, se utiliza un promotor fuerte (TEF1, TDH3, GAL10-CYC1...), véase el promotor CYC1, y un terminador clásico (principalmente PGK1) para concebir la unidad transcripcional.Ésta se pone en un plásmido mono o multicopias, de bajo o alto número de copias, o bien integrado en el genoma de la levadura. Debe indicarse que la especie de origen parece aquí importante, y que es preferible utilizar la P450c21 de origen humano.

El desoxicortisol se convierte en cortisol, bajo la acción del sistema P450c11, que contiene la P450c11, lo que permite la hidroxilación en 11-β, una adrenodoxina y una adrenodoxina reductasa, como cofactores.

Los inventores de la presente solicitud han mostrado que los resultados obtenidos eran mejores cuando este último sistema se expresa en la membrana interna de las mitocondrias de las levaduras. Así, es interesante producir proteínas de fusión, que contienen como precursor la secuencia de direccionamiento mitocondrial del precursor de la proteína Cox6p de la levadura.

Se utiliza preferentemente igualmente el ADNc que codifica las proteínas maduras. La proteína P450c11 es así la proteína de origen humano, bovino o una proteína híbrida humana-bovina. Esta última construcción es la forma preferida para la aplicación de la invención. El gen utilizado en la unidad transcripcional está preferentemente bajo el control del promotor CYC1. Es interesante poner un intrón de β-globina de conejo y un terminador del gen de la hormona de crecimiento humana en 3' de la secuencia codificadora. La unidad transcripcional se pone preferentemente en un plásmido multicopia.

La adrenodoxina se utiliza en su forma madura, se pone con una secuencia de direccionamiento hacia las mitocondrias, por ejemplo elegida entre las de los precursores de las proteínas Cox6p, Cox4p, fumarasa, ARH1p, F9 ATPasa, y bajo el control de un promotor elegido principalmente entre TDH3, TEF1, CYC1. Se prefiere una proteína de origen bovino o humano. Conviene poner un terminador en la unidad transcripcional, que puede ser PGK1. Se expresa el bloque de expresión preferentemente a partir de un plásmido multicopia.

La proteína que hace la función de adrenodoxina reductasa es la proteína ARH1p, endógena de la levadura, que se expresa normalmente en las mitocondrias del anfitrión. De forma preferida, la levadura se transforma sin embargo de tal forma que la cepa anfitriona contiene una copia natural del gen ARH1 y una segunda copia del gen ARH1 bajo el control del promotor CYC1. La actividad de esta proteína es indispensable para obtener el efecto buscado, y siempre se ha observado que la inactivación del gen es letal para la levadura (Lacour et al., 1998). Conviene indicar que la sobreexpresión de este gen parece tóxica para el organismo, y que el promotor elegido debe por lo tanto permitir un nivel de expresión que de lugar a la actividad 11-β hidroxilasa buscada sin ser perjudicial para la levadura. De manera sorprendente, se ha mostrado en efecto que una expresión del gen ARH1 a un nivel superior al nivel de expresión fisiológico aumenta de forma significativa la cantidad de esteroides producidos. Sin embargo, como se ha dicho anteriormente, esta expresión no debe ser muy importante para obtener el efecto deseado. Así, si es deseable una expresión de la proteína ARH1 a un nivel superior respecto a un nivel fisiológico, hay que tener cuidado de no sobreexpresar mucho esta proteína so pena de perder este aumento de producción de esteroides. A título de ejemplo, una integración del casete de expresión para ARH1, que contiene como promotor el promotor CYC1, a nivel del locus LEU2 de S. cerevisiae proporciona niveles de expresión y resultados satisfactorios. A la inversa, la integración en el mismo locus de un casete que contiene el promotor TEF1, reconocido como mucho más fuerte que el promotor CYC1, proporciona resultados menos interesantes.

Así, se introducen preferentemente dos copias de una unidad transcripcional que codifica la proteína co-enzima ADX, teniendo una de ellas una actividad en el exterior de las mitocondrias y principalmente en el citosol y teniendo la otra una actividad en las mitocondrias de la célula anfitriona.

Es igualmente posible introducir otros genes, principalmente los genes que codifican las proteínas que tienen una actividad NADPH P450 reductasa, tales como NCP1 (reductasa de levadura también denominada CPR1), ATR1 o ATR2 (reductasas de plantas), reductasa humana. Estas proteínas mejoran las actividades P450c17 y P450c21. Se utiliza bien el promotor endógeno (NCP1), o se ponen los ADN que codifican las proteínas bajo el control de promotores tales como GAL10-CYC1, CYC1, TEF1...

Es igualmente posible introducir el gen TGL1, que codifica una proteína que tiene una actividad de desesterificación, bajo el control de un promotor fuerte tal como GAL10-CYC1, en un plásmido multicopia o monocopia. Esto permite reducir el efecto de las reacciones de esterificación parásitas de los esteroles que pueden permanecer después de la inactivación de ATF2, y principalmente las producidas por el producto de los genes ARE1 y ARE2.

Se puede añadir también un plásmido que expresa la citocromo b5 de levadura u otra especie, que es un cofactor en varias de las reacciones definidas anteriormente.

También se puede, cuando se desea producir DHEA, introducir un plásmido que codifica la desmolasa (P450 17α), de bajo o alto número de copias, bajo el control de un promotor tal como GAL10CYC1, CYC1, TEF1, con un terminador PGK1.

Se puede introducir igualmente un ADNc que codifica la citocromo P450c17 que tiene una actividad liasa, por ejemplo el de origen humano, en presencia de un exceso de NADPH P-450 reductasa, como las reductasas de mamífero, NCP1, ATR1, o ATR2. Estas unidades transcripcionales utilizan preferentemente un promotor fuerte.

Finalmente, es posible restaurar la actividad de los genes endógenos ERG6 y ERG2, inhibidos por la pregnenolona, poniéndolos bajo el control de un promotor constitutivo fuerte.

Se pueden introducir también otros genes heterólogos, que codifican principalmente una proteína con actividad 24,25 esterol reductasa, o el gen HMG1, presente en la vía de síntesis del colesterol en el ser humano. Es igualmente interesante introducir el gen MDR1 humano, que codifica una bomba no inhibida por la acumulación de esteroles anormales que aparecen debido a la inhibición del gen ERG6 por la pregnenolona. Esto permite expulsar estos productos de los que una gran acumulación podría resultar tóxica para la célula anfitriona.

Se puede también sobreexpresar el gen PDR12 de levadura que tendrá un efecto de destoxificación para los esteroides que pueden inhibir el crecimiento de la levadura.

Se entiende que cuando se habla de gen anteriormente, se entiende no solamente el fragmento de ADN que codifica la proteína que presenta la actividad buscada (y principalmente el fragmento de ADNc que representa en particular las formas maduras), sino también los promotores (principalmente TEF1, GAL10-CYC1, CYC1, TDH3) y los terminadores (en particular PGK1). Estas unidades transcripcionales se introducen preferentemente en plásmidos de bajo o alto número de copias, o se integran en el cromosoma de la levadura.

Se entiende igualmente que, según el objetivo buscado, y principalmente el esteroide que se desea producir, es posible no introducir determinados genes que codifican las diferentes proteínas en cada etapa y proporcionar un intermedio a la levadura con el fin de obtener un esteroide más abajo en la cadena de metabolismo.

También es fácil no introducir genes que permiten obtener los productos situados muy por debajo, y poder por lo tanto parar en un punto relativamente alto en la cadena del metabolismo.

Las levaduras utilizadas para la aplicación de la presente invención son preferentemente:

 la cepa FY1679-28c, descrita en Duport et al., 1998, que posee el genotipo (MATα, rho-, ura3-52, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200, GAL2, fen1). Esta cepa ha sido descrita igualmente por Thierry et al., 1990.

 la cepa FY1679-18b, que posee el genotipo (MATα, rho-, ura3-52, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200, GAL2,fen1).

Estas dos cepas poseen por lo tanto un genotipo idéntico y un signo opuesto.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Representación esquemática de una vía de biosíntesis de la hidrocortisona tal como se puede obtener según la invención.

Figura 2: Representación esquemática de construcción de cepas de levaduras ejemplificadas según la invención.

Figura 3: Mapa del plásmido pCV29. PGK term: terminador PGK. GAL10/CYC1 prom : promotor GAL10/CYC1. HGH term : terminador del gen de la hormona de crecimiento humana. Intrón βglobina: intrón del gen de la β-globina de conejo. CYC1 prom: promotor CYC1. PGK term: terminador PGK. S. cerevisiae 2 micrómetros: origen de replicación 2 micrómetros de S. cerevisiae. Cox6pre: presecuencia de la citocromo oxidasa subunidad 6. Bovino/humano P450 11β: ADNc fusionado bovino/humano de la P45011β. mat-ADX : forma madura de la ADX con una metionina en NH2 terminal. E.coli replicón : Replicón E. coli

Figura 4: Mapa del plásmido pCC12. CYC1 prom: promotor CYC1. PGK term: terminador PGK. ARS CEN: origen de replicación cromosómico de S. cerevisiae. E.coli replicón : Replicón E. coli. TDH3 prom: promotor TDH3. 3β-HSDH: ADNc de la 3β hidroxi esteroide deshidrogenasa. matADR: forma madura de ADR precedida de una metionina.

Figura 5: Mapa del plásmido pFM10. CYC1p: promotor CYC1. P45011β: ADNc fusionado bovino/humano de la P45011β. ADE2: gen ADE2 de la levadura. TDH3p: promotor TDH3. 3βHSD: ADNc de la 3β hidroxi esteroide deshidrogenasa. R1: huella de recombinación cuya secuencia se proporciona en SEQ ID N° 39. GAL10/CYC1p: promotor GAL10/CYC1. matADX: ADNc que codifica la forma madura de ADX. URA3: gen URA3 de la levadura. P450scc: ADNc que codifica la forma madura de P450scc (CYP11A1). Origen 2 micrómetros: origen de replicación 2 micrómetros de S. cerevisiae. R2: huella de recombinación cuya secuencia se proporciona en SEQ ID N°40.

EJEMPLOS

Los ejemplos siguientes describen un modo de aplicación de la presente invención y no deben considerarse como limitativos de la invención.

Se parte, para las construcciones de las cepas de levadura FY1679-28c y FY1679-18b descritas anteriormente.

Ejemplo 1: Disrupción del gen YPR1

La construcción de la interrupción del gen YPR1 (YDR368w) por el gen URA3 en el plásmido pPOLYIII se ha obtenido por 4 PCR sucesivas. Por una parte, se realizaron tres PCR independientes para obtener la parte 5' del gen YPR1 (PCR 5), el gen URA3 funcional bordeado por las secuencias YPR1 (PCR 6), la parte 3' del gen YPR1 (PCR 7).

El ADN de la PCR5 se obtuvo por amplificación sobre una matriz de ADN genómico con los oligonucleótidos OTG11314 (SEQ ID N° 1) y OTG11315 (SEQ ID N° 2) igual el ADN de la PCR7 se obtiene por amplificación mediante los oligonucleótidos OTG11316 (SEQ ID N° 3) y OTG11317 (SEQ ID N° 4) sobre la misma matriz.

El gen URA3 flanqueado por la región YPR1 5' y 3' se amplifica mediante los oligonucleótidos OTG11463 (SEQ ID N° 5) y OTG11464 (SEQ ID N° 6) sobre una matriz pTG10054 descrita en Degryse et al., 1995 incorporado en la presente memoria por referencia en lo que respecta a la descripción de este plásmido.

Los productos de las PCR5, PCR6 y PCR7 se mezclaron de forma equimolecular y se amplificaron por PCR mediante los oligonucleótidos OTG11314 (SEQ ID N° 1) y OTG11317 (SEQ ID N° 4) para obtener un producto de PCR8.

Este producto PCR8 se digirió con la enzima XhoI y se subclonó en el plásmido pPOLYIII (descrito por Lathe et al., 1987 e incorporado en la presente memoria por referencia en lo que respecta a la descripción de este plásmido) digerido con XhoI para proporcionar el plásmido pTG12011. La orientación de la inserción en el plásmido pPOLYIII se determinó por digestión con las enzimas NcoI y EcoRI.

El plásmido pTG12011 que permite la disrupción del gen parásito YPR1 por el gen URA3 se digiere con la enzima XhoI. El producto de la digestión se utiliza para transformar la cepa FY1679-18b utilizando el método de cloruro de litio muy conocido por el experto en la técnica. Los transformantes se seleccionan sobre un medio desprovisto de uracilo. Los transformantes se analizan por amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos que han servido para la construcción del plásmido pTG12011.

Los clones positivos en este ensayo se criban por el método de bioconversión de 170H progesterona descrito más abajo en presencia de glucosa como fuente de carbono. La capacidad de bioconversión se analiza por HPLC como se describe en Dumas et al., 1996 y Degryse et al., 1999 cuyos contenidos se incorporan por referencia en la presente solicitud, principalmente las explicaciones de los estudios de bioconversión o como se describe en Kuronen et al., 1999. Un clon TGY195#4 se selecciona para nuevas caracterizaciones. La cepa TGY195#4 se transforma utilizando a la vez el plásmido YRp7 (Parent et al., 1985, que se incorpora por referencia por lo que respecta a la descripción de este plásmido) (1µg) y 5µg de plásmido pTG12045 (descrito más abajo) digerido con NotI. Las cepas transformadas se seleccionan sobre un medio desprovisto de triptófano. Se repican colonias (678 colonias) sobre un medio que contiene triptófano (para quitar el plásmido YRp7) y sobre un medio que contiene triptófano y 5 fluoro orotato (5F0) para seleccionar las colonias que han perdido el gen URA3 interrumpiendo el gen YPR1.

Ejemplo 2: Construcción de diferentes plásmidos.

Para la sobreexpresión de la proteína P450c21 en la levadura se utilizaron dos tipos de promotor, TEF1 (« Transcription elongation factor 1 ») y TDH3 (« glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3). En todos los casos, el terminador de transcripción es el terminador PGK. En estos plásmidos, el fragmento SalI, MluI contiene el ADNc de la P450c21 humana.

a) Construcción de los plásmidos pTG10470 y pTG10469

El plásmido pTG10289 se obtuvo por modificación de pMAc21 (Wu et al, 1991) por digestión con KpnI, MluI e introducción del oligonucleótido OTG5868 (SEQ ID N° 27).

El ADNc de este plásmido proviene de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, EEUU) con el nombre pc21/3c: Este es el fragmento EcoRI-BamHI de 1,6Kb que ha servido de base para la construcción de los diferentes plásmidos. Las modificaciones aportadas se describen en el artículo anterior y en el artículo de Hu et al, 1990.

En esta maniobra, la parte no codificadora de la P450c21 del plásmido pMAc21 que contiene el casete de expresión de la P450c21 se ha eliminado así como el sitio KpnI que se encontraba.

El plásmido pTG10292 se obtuvo por transferencia del ADNc c21 humano (fragmento SalI, MluI) del plásmido pTG10289 en el plásmido pTG10031 (descrito en Degryse et al., 1995, que se incorpora por referencia en la solicitud) mediante los sitios SalI y MluI.

El plásmido pTG10475 se obtuvo por PCR y recombinación. En efecto a partir del plásmido pTG10292, se amplificó un fragmento del ADNc P450c21 humano que representa aproximadamente 250 nucleótidos mediante los oligonucleótidos OTG7410 (SEQ ID N° 7) y OTG5927 (SEQ ID N° 8). Este fragmento representa la secuencia codificadora de la P450c21 humana de un sitio SalI y de la secuencia AAAA.

Este fragmento se digirió con SalI y se ligó sobre el fragmento lineal de pTG10292 digerido con SalI y se realizó un experimento de recombinación en la cepa BJ5183 descrita por Degryse et al., 1995.

El plásmido obtenido pTG10475 contiene un ADNc de la P450c21 con una secuencia codificadora idéntica a la del ADNc natural, contrariamente al plásmido pMAc21, sobre un fragmento compatible con los vectores utilizados generalmente por los inventores, es decir un fragmento bordeado por los sitios de restricción SalI y MluI. Este fragmento posee el entorno siguiente alrededor del codón ATG de inicio de la traducción GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC (SEQ ID N° 9).

A partir de este plásmido se transfirió el fragmento SalI, MluI que contiene el ADNc de la P450c21 humana en el plásmido pTG10158 (Degryse et al 1995) por clonación clásica para proporcionar el plásmido pTG10472.

Este mismo fragmento SalI MluI del plásmido pTG10472 se transfirió por clonación clásica en el plásmido pTG10085 (Degryse et al 1995) para proporcionar el plásmido pTG10469. Este plásmido posee por lo tanto el ADNc de la P430c21 humana bajo el control del promotor TEF1, con el terminador PGK1.

Este mismo fragmento que contiene el ADNc P450c21 sobre un fragmento de restricción SalI y MluI se transfiere en el plásmido pTG10092 por recombinación en la cepa BJ5183 para proporcionar el plásmido pTG10470 (Degryse et al., 1996).

El plásmido pTG10470 contiene por lo tanto el ADNc de la P450c21 humana bajo el control del promotor TEF1 y un terminador PGK1 con un marcador de selección URA3-d con el entrono del codón de inicio ATG descrito anteriormente.

b) Construcción del plásmido pTG12036.

El plásmido pTG12036 se construyó en 4 etapas a partir de pTG10802. El plásmido pTG10801 (que es el origen del plásmido pTG10802) es un plásmido de tipo pUC en el que se ha insertado una serie de sitios de restricción entre los sitios XhoI y XhoI. Esta serie de sitios comprende los sitios HindIII, SnabI, ClaI y SpeI.

Entre los sitios HindIII y ClaI, se insertó el casete HindIII ClaI de pTG10470 que comprende el promotor TEF1, el ADNc P450c21 humano y el terminador PGK1 entre los sitios HindIII y ClaI de pTG10801 para proporcionar pTG10802.

Este plásmido se digirió con XhoI y el casete introducido se deleciona por lo tanto para introducir un fragmento de PCR bordeado por sitios XhoI. Este fragmento de 2,5Kb proviene de la amplificación por el par de oligonucleótidos OTG11844 (SEQ ID N° 10) y OTG11845 (SEQ ID N° 11) sobre el plásmido pTG12010#40 (véase a continuación) para obtener un fragmento bordeado por XhoI que contiene el gen GCY1 interrumpido por el gen URA3 bordeado en 5' por un sitio de restricción ClaI.

Este fragmento se clonó entre los sitios XhoI del plásmido pTG10802 para obtener el plásmido pTG12035. Con el objetivo de introducir el sitio HindIII que falta, se utilizó el plásmido pTG12010#36. Este plásmido es esencialmente idéntico a pTG12010#40 pero posee un sitio HindIII en 3' del gen URA3 en el límite con el gen GCY1 pero no posee sitio ClaI en 5' del gen URA3 en la unión con el gen GCY1 (véase a continuación). Por recombinación in vivo en E. coli, entre el fragmento NcoI BamHI de 2,2Kb que contiene de 5' a 3' un fragmento del gen URA3, el fragmento 3' del gen GCY1 y finalmente una parte del plásmido pTG12035 es decir el fragmento grande StuI, AflII de 4,45Kb. Se obtiene el plásmido pTG12036.

El plásmido obtenido pTG12036 posee el gen GCY1 interrumpido por el gen URA3 bordeado por sitios ClaI y HindIII respectivamente en 5' y 3'. Este fragmento se reemplaza por el casete de expresión de la P450c21 contenido por el fragmento 2,33Kb ClaI, HindIII del plásmido pTG10469 (véase más arriba) para obtener el plásmido pTG12086.

c) Construcción del plásmido pTG12045.

El sitio único SphI del plásmido pPOLYIII se destruye por inserción del par de oligonucleótidos complementarios OTG11975 (SEQ ID N° 12) y OTG11976 (SEQ ID N° 13).

El sitio SphI de pPOLYIII se destruye y reemplaza por un sitio ClaI para proporcionar el plásmido pTG12040. En el plásmido pTG12040 entre los sitios únicos ClaI y EcoRI, se introduce un fragmento de ADN genómico ClaI EcoRI correspondiente a la parte 3' de 0,7Kb del gen YPR1 obtenido por amplificación con los oligonucleótidos OTG11981 (SEQ ID N° 14) y OTG11982 (SEQ ID N° 15) para proporcionar el plásmido pTG12041.

En este plásmido pTG12041 de 2,84Kb, la parte 5' del gen YPR1 (0,66Kb) amplificada por los oligonucleótidos OTG11314 (SEQ ID N° 1) y OTG11980 (SEQ ID N° 16) a partir de ADN genómico de levadura salvaje se clona en forma de un fragmento XhoI HindIII entre los sitios SalI y HindIII del plásmido ATG12041.

Se obtiene el plásmido pTG12042 de 3,5Kb. Este plásmido contiene el gen YPR1 interrumpido por los sitios ClaI y HindIII. Entre estos sitios, se clona el casete de la citocromo P450c21 en forma de un fragmento ClaI HindIII de 2,33 Kb que proviene del plásmido pTG10469. Se obtiene así el plásmido pTG12045.

d) Construcción de los plásmidos pTG12010#36 y #40

El plásmido pTG 12010 se construyó sobre una base del plásmido pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) mientras que el plásmido pTG12011 se construyó sobre una base del plásmido pPOLYIII (Lathe et al., 1987).

La construcción de la disrupción del gen GCY1 por el gen URA3 en el plásmido pUC19 se obtuvo por cuatro amplificaciones por PCR sucesivas. Por una parte, se realizaron tres PCR independientes para obtener la parte 5' del gen GCY1 (PCR1), el gen URA3 funcional bordeado por secuencias GCY1 (PCR2), la parte 3' del gen GCY1 (PCR3).

Las partes 5' y 3' del gen GCY1 mediante las parejas OTG11285, OTG11286 y OTG11287, OTG11289 (respectivamente SEQ ID N° 17 a SEQ ID N° 20) sobre una matriz de ADN genómico de la cepa FY1679-28c.

El gen URA3 flanqueado por secuencias GCY1 (de forma que se obtiene una deleción de una parte de la secuencia codificadora del gen GCY1) se amplifica mediante los oligonucleótidos OTG11305 (SEQ ID N° 21) y OTG11306 (SEQ ID N° 22) a partir de una matriz plásmido pTG10054 linealizado (Degryse et al., 1995).

Las condiciones de tampón y de concentración de la matriz y los cebadores para la amplificación están descritas por el productor o fabricante de la enzima Taq ADN polimerasa, y en particular para la enzima elongasa desarrollada por Life Technologies. Los ciclos de temperaturas son los siguientes: un primer ciclo de 6'30 para desnaturalizar cebador y matriz y 30 ciclos de 30s a 93°C, 2 mn a 54°C y 3mn a 68°C, el último ciclo es de 5 mn a 72°C. Los productos PCR1, PCR2 y PCR3 se mezclan de forma equimolecular y se amplifican de nuevo mediante los oligonucleótidos OTG 11285 (SEQ ID N° 17) y OTG11289 (SEQ ID N° 20). El producto final PCR4 de un tamaño de 2,9 Kb se subclona entre los sitios de restricción KpnI y BamHI del plásmido pUC19 para obtener el plásmido pTG12010.

La estructura del plásmido se verificó por perfil de restricción y secuenciación nucleotídica de los extremos.

La clonación de pTG12010 ha permitido de hecho obtener dos versiones de este plásmido, la versión pTG12010#40 (pTG12040 clon 40) y ATG12010#36. La voluntad inicial era obtener el gen GCY1 interrumpido por el gen URA3 bordeado por los sitios de ClaI y HindIII respectivamente en 5' y en 3' del gen. De hecho, se obtuvieron dos plásmidos diferentes, que difieren únicamente por la presencia o ausencia de sitios ClaI y HindIII en los extremos del gen URA3. El plásmido pTG12010#40 posee un sitio de restricción HindIII en el extremo 3' del gen URA3 pero no un sitio ClaI en 5'. El plásmido pTG12010 #36 no posee sitio HindIII en el extremo 3' pero sí un sitio ClaI en el extremo 5' del gen. Esta propiedad se utiliza pra obtener el plásmido que posee el gen URA3 bordeado por los sitios HindIII y ClaI que interrumpen la secuencia codificadora de GCY1.

e) Construcción del plásmido pTG12086

Este plásmido sirve para la integración de un casete de expresión para la P450c21 así como para la disrupción del gen GCY1 al mismo tiempo. Este plásmido se construyó a partir del plásmido pTG12036 y del plásmido pTG10614.

La construcción del plásmido pTG10614 se realizó como sigue. Este plásmido se construyó a partir de pTG10212 (Degryse et al., 1995) que es un plásmido de expresión de levadura basado en un promotor TDH3, un terminador PGK1 y un marcador de selección URA3-d.

Por recombinación homóloga en E. coli, el marcador de selección se reemplaza por el marcador de selección del plásmido pTG10054 (Degryse et al. 1995), para hacer esto el fragmento MluI, FspI de pTG10054 de 2,1Kb que contiene el marcador URA3 flanqueado por secuencias de recombinación se recombina con el fragmento grande HindIII de pTG10212 para proporcionar el plásmido pTG10610 que posee las mismas características que pTG10212 (Degryse et al., 1995) con un marcador URA3 en la misma orientación que pTG10054.

El fragmento SalI MluI que contiene el ADNc de la citocromo P450 c21 humana del plásmido pTG10472 (véase anteriormente) se transfiere en el plásmido pTG0610 para proporcionar el plásmido pTG10614.

El fragmento ClaI HindIII de este plásmido que contiene de 5' a 3', el promotor TDH3, el ADNc de la P450c21 humana bordeado por sitios SalI y MluI y el terminador PGK1 se transfiere en el plásmido pTG12036 para proporcionar el plásmido pTG12086 que contiene por lo tanto la secuencia del gen GCY1 interrumpida por el casete de expresión TDH3 de la citocromo P450c21 humana.

f) Construcción del plásmido pTG12048.

El plásmido pTG12048 se construyó a partir de los plásmidos pFL26CD, pTG10925 y pTG10953.

pTG10953 es idéntico al plásmido descrito en Lacour et al., 1998 pero el promotor TEF1 contenido por un fragmento ClaI SalI se reemplaza por un promotor CYC1 (Degryse et al., 1995). El casete de expresión está contenido en un fragmento de ADN NotI-NotI.

El plásmido pTG10925 se construyó a partir de pFL26CD descrito por Duport et al., 1998. El plásmido contiene un fragmento genómico de la levadura que comprende los genes LEU2 y NFS1 orientado de 5' a 3' y 3' y 5' respectivamente. Se introdujo un casete de expresión de ADR bordeado por sitios NotI en la región intergénica para proporcionar el plásmido pTG10925. Este casete (TEF1 -ADR bovina madura - terminador PGK1) se reemplazó por un nuevo casete que comprende el gen ARH1 bajo el control del promotor CYC1 y del terminador PGK1 para proporcionar el plásmido pTG12048. Sobre este plásmido, el gen LEU2 y el casete de expresión están en la misma orientación transcripcional.

Ejemplo 3. Construcción de la cepa TGY212#1

Se selecciona una colonia en el cribado descrito en el ejemplo 1. Se denomina TGY212#1. Esta colonia se somete a un experimento de bioconversión como se ha descrito anteriormente con 100µg/ml de sustrato 170H progesterona, la cepa se pone a crecer en un medio mínimo complementado con los aminoácidos necesarios y uracilo.

Esta cepa es capaz de convertir la 170H progesterona en 11-desoxicortisol con una eficacia del orden de 47% en 24 horas con una baja producción de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona en estas condiciones (< 0,5%). En determinadas condiciones (medio rico definido de tipo Kappeli con galactosa como fuente de carbono y puesta en marcha del cultivo a alta densidad: D0 600nm=5), la capacidad de reducción de la cetona aumenta para alcanzar 11% del sustrato de partida con una capacidad de bioconversión reducida a 1,5% del sustrato de partida.

En estas condiciones, la presencia probable del gen GCY1 constituye un gen para la bioconversión de la 170H progesterona. Se decidió por lo tanto disrumpir el gen GCY1 para impedir su actividad.

Ejemplo 4: Construcción de la cepa TGY243

Para hacer esto, la cepa TGY212#1 se transformó con 3µg del plásmido pTG12010#36 linealizado con las enzimas de restricción SphI y EcoRI. Veintisiete transformantes se seleccionaron sobre un medio mínimo complementado para las auxotrofías de TGY212#1 pero que no contiene uracilo.

Estas colonias se sometieron a ensayos de bioconversión en un medio mínimo complementado con galactosa como fuente de carbono porque es un inductor conocido de GCY1. Todos los clones TGY243 presentaban una capacidad de convertir la 170H progesterona en 11-desoxicortisol sin producir sin embargo cantidades detectables de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona.

Se seleccionó un clon TGY243#1 para introducir en lugar del gen URA3 un casete de expresión para la P450c21 humana.

Ejemplo 5: Construcción de la cepa TGY245

Esta cepa TGY243#1 se transforma con el plásmido YRp7 (1µg) descrito por Parent et al., 1985 y con el plásmido pTG12086 linealizado con la enzima XhoI (5µg).

El fragmento transformador de pTG12086 contiene la secuencia codificadora de GCY1 interrumpida por un casete de expresión para la P450c21 humana (TDH3: :ADNcP450c21 humana: terminador PGK1).

Se seleccionan las colonias que crecen en ausencia de triptófano. Estas 381 colonias se transfieren sobre un medio que contiene triptófano y 5 fluoro orotato. Se ensaya una docena de colonias en un medio rico de tipo YPG complementado con triptófano, histidina, leucina y uracilo a una concentración de 50µg/ml.

Las cepas se ponen a convertir la 170H progesterona a una concentración de 100µg/ml a partir de una DO600nm de 0,1 durante 16 Horas.

Entre estos 10 clones, se elige un clon TGY245#2D según dos criterios, su capacidad para convertir la 170H progesterona en 11-desoxicortisol y en segundo lugar la ausencia de la formación de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona lo que indica la disrupción de GCY1.

Ejemplo 6: Construcción de la cepa TGY260

La cepa se construyó por transformación de la TGY245 con el plásmido pTG12048 que permite la sobreexpresión del gen ARH1 en el locus LEU2

La cepa TGY260 se construyó a partir de la cepa TGY245 que se transformó con el plásmido pTG12048 linealizado.

Este plásmido pTG12048 es un plásmido de integración intergénica que contiene el marcador de selección LEU2. Sobre este plásmido, en la región entre el gen LEU2 y el gen NFS1 se integra un casete de expresión para el gen ARH1 (Lacour et al., op. cit.).

Este casete comprende el promotor CYC1 seguido del gen ARH1 y del terminador PGK1 bordeado por los sitios de restricción NotI. Este plásmido pTG12048 se linealizó con las enzimas de restricción XhoI y SalI.

Este fragmento se utiliza para transformar la cepa TGY245 utilizando un método clásico de transformación con cloruro de litio. Las colonias transformantes se seleccionan sobre un medio que no contiene leucina. Se seleccionó una cepa TGY260.

Se depositó la cepa TGY260 en la CNCM el 24 de enero de 2001 con el número I-2615.

Ejemplo 7: Construcción de la cepa CDR07matα

La cepa FY1679-28c se transformó con el plásmido pCD62.1, descrito en Duport et al. 1998, (cuyo contenido técnico de construcción de plásmidos y la obtención de las cepas se incorporan porreferencia en la presente solicitud), para proporcionar la cepa CDR01. Ésta se transforma con el plásmido pCD78, descrito igualmente en Duport et al., y se obtiene la cepa CA03.

Se disrumpe el gen ERG5 de dicha cepa CA03 con un casete que confiere la resistencia a la higromicina y se obtiene la cepa CA10.

Esta cepa se crece con una cepa relacionada FY1679-18b, y se pone a esporular. Las esporas se aíslan según las técnicas clásicas sobre un medio mínimo complementado para las auxotrofías es decir uracilo, triptófano, leucina e histidina.

Las esporas se criban según dos criterios que son la resistencia a la nistatina (12µg/ml en medio mínimo) y la resistencia a la higromicina (100-150µg/ml en medio rico). Las esporas que son resistentes a estos dos productos, se analizan en cromatografía en fase gaseosa para la presencia de campesterol como esterol principal de las membranas. La presencia de campesterol en las membranas de las cepas acoplada a la ausencia de ergosta 5-22 dienol indica el buen funcionamiento de la Δ7 Reductasa. Se selecciona una espora CDR07 MATα según los criterios anteriores.

La cepa CDR07 MATα se depositó en la CNCM el 24 de enero de 2001 con el número I-2616.

Ejemplo 8: construcción de las cepas UCY2 y UCY4

Se crecen las cepas TGY260 y CDR07 MATα para obtener la cepa SB14. Esta cepa se pone a esporular y se obtienen las cepas segregantes YCC4 y YCC5 (véase también a continuación).

Estas cepas se transforman con el plásmido pLIP5 (véase a continuación) y proporcionan respectivamente las cepas YCC8 y YCC9.

Estas cepas se transforman con el plásmido pTG12093 para obtener respectivamente las cepas UCY2 y UCY3.

El gen ATF2 se inactiva en la cepa UCY2, por utilización de un plásmido y una selección con G418, y se obtiene la cepa UCY4.

Ejemplo 9: Construcción de los plásmidos de transformación de las cepas UCY2, UCY3 y UCY4

a) Construcción del plásmido pCV29

Para la construcción de pCV29 (véase la Figura 3), se utilizaron los plásmidos pTG10767, pTG10022 y pCD63.

1. Construcción del plásmido pTG10767

El plásmido pTG10767 es un plásmido de expresión para la P450c11 de origen humano. Contiene de hecho dos casetes de expresión uno para la P450c11 de origen humano y el otro para la adrenodoxina. Estas dos proteínas se determinan para ser activas en las mitocondrias de la levadura S. cerevisiae, por la presencia de secuencias de direccionamiento del precursor de la citocromo Cox6p.

Este casete de expresión para la P450c11 de origen humano está bordeado por dos sitios de restricción NotI que permiten transportarlo en los diferentes vectores descritos por Degryse et al., 1995. De 5' a 3', comprende, el promotor CYC1 como se describe en la publicación anterior y el ADNc de la P450c11 humana modificado como se describe más adelante y finalmente una parte no codificadora de eucariota superior.

El ADNc P450c11 humano es el descrito por Chua et al., 1987, con las modificaciones siguientes. La parte codificadora para el péptido señal en el ADNc original está suprimida hasta el sitio de restricción BglII y reemplazada. Se suprimen aprovechando la ocasión 31 aminoácidos de la secuencia codificadora de la forma madura del ADNc para proporcionar la secuencia proteica siguiente en NH2 terminal (SEQ ID N° 23) :

MLSRAIFRNPVINRTLLRARPGAYHATRLTKNTFIQSRKYGTRGAAAPKAVLPFEAMPRCPGNK WMRMLQIWREQGYEDLHLEVHQTFQELGPIFRYDLGGAGMVCVMLPEDVEKLQQVDSLHPHRMSLEPW VAYRQH

Sobre la línea anterior, la parte en itálica corresponde a la secuencia de aminoácidos de la secuencia de direccionamiento del precursor de la citocromo oxidasa subunidad VI de levadura (COX6), la parte en negrita corresponde a la parte NH2 terminal de la P450c11 bovina (Dumas et al., 1996). La parte subrayada corresponde al inicio de la secuencia idéntico a la publicada del ADNc de la P45011β1 humana (Kawamoto et al., 1990).

El casete NotI que contiene el promotor CYC1 y el ADNc quimérico de la P45011β1 contiene igualmente una parte no codificadora situada en 3' del ADNc. Esta parte no codificadora está compuesta por 3 elementos proviniendo una parte no codificadora del ADNc natural y proviniendo una parte no codificadora del plásmido pCMV4 cuya secuencia está depositada en Genbank con el número AF239248 (Andersson et al., 1989). Además, las únicas partes no codificadoras que provienen de pCMV4 terminador del gen de la hormona de crecimiento humana y del intrón del gen de la β globina de conejo están conservadas en el vector final pCV29.

Al final un fragmento de ADN que contiene los sitios de restricción NotI contiene de 5' a 3' el promotor CYC1, un ADNc quimérico flanqueado por los sitios SalI y MluI que contiene una parte codificadora para la presecuencia de la citocromo oxidasa fusionado con un fragmento de la P45011β bovina hasta la parte correspondiente al sitio de restricción y el final del ADNc corresponde al ADNc de la P45011β1 humana. La parte no codificadora está compuesta por tres de origen de mamífero.

Este casete NotI se transfiere en el plásmido pTG10359 que se obtiene del plásmido pTG10350 (Dumas et al., 1996) digerido con las enzimas de restricción ClaI y PvuII y se religa sobre él mismo.

Este plásmido pTG10359 posee además un sitio de restricción único NotI. El plásmido pCV29 es un plásmido 3 casetes que contiene los casetes de expresión para la forma madura de ADX y la forma madura de la P450scc y una forma de la CYP11B1 humana dirigida a la mitocondria.

El plásmido pTG10022 se describe en la publicación de Degryse et al., 1995, incorporada por referencia en la presente solicitud, y contiene un origen de replicación 2 micrómetros para la levadura S. cerevisiae así como los elementos para la clonación en E. coli.

Los sitios de restricción de este plásmido se han modificado con los oligonucleótidos OLIP 174 y OLIP 175 (respectivamente SEQ ID N° 28 y 29) con el fin de integrar los sitios de restricción AscI y PmeI.

En el sitio de restricción NotI de este plásmido, se ha introducido un doble casete de expresión del plásmido pCD63 descrito por Duport et al., 1998. Este doble casete de expresión contenido en un fragmento NotI contiene un casete de expresión para la forma madura de ADX bovina y un casete de expresión para la forma madura de la P450scc bovina flanqueando un marcador de selección URA3. En el sitio único PmeI con extremos francos de este plásmido, se introdujeron el casete de expresión de la citocromo P45011β que contiene el ADNc de la P45011β humana bajo el control de los promotores CYC1 y el terminador PGK1 después de rellenar los extremos NotI con la ADN polimerasa fragmento de Klenow.

Uno de los plásmidos obtenidos pCV29 contiene tres casetes de expresión para ADX, la P450scc (las dos en forma madura), así como una forma de la P45011β humana dirigida a la mitocondria. Además, este plásmido contiene como marcador el gen URA3 flanqueado por dos casetes de expresión.

b) Construcción del plásmido pCC12

El plásmido pCC12 (véase la Figura 4) es un plásmido replicativo de levadura a base del origen de replicación cromosómico como ARS1 y un centrómero CEN (está en 16 en la levadura) los dos de S. cerevisiae. Este plásmido se replica en forma de una o dos copias en la levadura.

Se construyó a partir de pFL38C2 que deriva de pFL38 (Bonneaud et al., 1991, cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente solicitud, principalmente las descripciones de los plásmidos). En este plásmido, se introdujo en el sitio HindIII un oligonucleótido que contiene la secuencia de reconocimiento de los sitos NotI, PacI y AscI (OLIP FL SEQ ID N° 24). La orientación del policonector se verificó por secuenciación. Este plásmido contiene un marcador de selección URA3 bordeado por sitios BglII.

El gen URA3 se reemplazó por un gen ADE2 de 2,7Kb obtenido por amplificación por PCR sobre el genoma de FY1679-28c utilizando los oligonucleótidos 5'ADE2090 (SEQ ID N° 37, CGATTCGGATCCACTAGTAACGCCGTATC-GTGATTAACG) y 3'ADE2089 (SEQ ID N° 38 (CCTCAAGGATCCTCCTG-ACGTAGCGCTATCCTCGGTTCTG).

Para hacer esto, el plásmido pFL38C2 se digirió con la enzima BglII, el fragmento BglII URA3 se reemplazó por el fragmento de 2,7 Kb que contiene el gen ADE2. El plásmido obtenido pAM1 sirve de base para la construcción del plásmido pCC12.

Construcción del plásmido a partir del plásmido pAM1:

El plásmido pCC12 contiene dos casetes de expresión uno para 3â-HSDH de origen bovino, el otro para la adrenodoxina reductasa igualmente de origen bovino.

El ADNc de la 3β-HSDH bovina se reclonó por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de suprarrenales de buey. La secuencia codificadora del ADNc publicada por Zhao et al., 1989, no se modificó.

A los dos oligonucleótidos se les volvió a añadir un sitio SalI y 4 adeninas antes de ATG para proporcionar la secuencia GTCGACAAAAATG (SEQ ID N° 25). El sitio MluI está situado a ras del codón de terminación del ADNc de la 3β-HSDH bovina para proporcionar la secuencia: final del ADNc TGACCTGGAGTGACAATGACGCGT (SEQ ID N° 26). La secuencia reconocida por la enzima MluI es ACGCGT.

El ADNc se transfiere en forma de un fragmento SalI, MluI en el plásmido pTG10212 para proporcionar el plásmido pCC4. Este plásmido posee por lo tanto un fragmento NotI que contiene el ADNc de la 3β-HSDH bordeado por y un promotor TDH3 y un terminador PGK1, respectivamente en 5' y en 3'. Este casete de expresión se transfiere en el plásmido pTG12018 así el casete está bordeado ahora en 5' por un sitio NotI y en 3' por un sitio AscI. Este fragmento se clona en el plásmido de expresión de la levadura pAM1 en los sitios NotI y AscI para proporcionar el plásmido pCC11.

En el sitio NotI de este plásmido, se inserta el fragmento NotI que contiene el promotor TEF1, el ADNc de la forma madura de la adrenodoxina reductasa de origen bovino, y el terminador de levadura PGK1, respectivamente en este orden que proviene del plásmido pTG10361.

Este plásmido contiene el mismo ADNc que se describe en Dumas et al., 1996, (cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente solicitud, principalmente las descripciones de los plásmidos) salvo que la secuencia de direccionamiento del precursor de la citocromo oxidasa se ha reemplazado por un codón metionina. El ADNc codifica por lo tanto una forma madura del ADNc de la adrenodoxina reductasa.

Ejemplo 10: Construcción de la cepa CDR07

La cepa CDR07 se obtuvo por cruzamiento entre las cepas FY1679-18b MAT a y la cepa CA10 MAT α descrita por Duport et al., 1998.

Estas dos cepas se aislaron en primer lugar sobre un medio rico que contiene glicerol y sobre un medio que contiene acetato de potasio como se describe en « Yeast Protocols Methods in Cell and Molecular Biology Editado Por Ivor H Evans en 1996. Humana Press Totowa Nueva Jersey ».

Después de la esporulación, las tétradas se digirieron con zimoliasa 100T durante 30 minutos a 37°C. Se aplicaron varios ciclos de selección para obtener un clon que produce campesterol como esterol mayoritario habiendo perdido los demás caracteres de CA10.

Las esporas se seleccionan en primer lugar sobre un medio mínimo que contiene nistatina con suplementos (adenina, leucina, triptófano, uracilo, histidina). Los clones resistentes a la nistatina y auxótrofos para la adenina y la leucina se repican sobre un medio rico que contiene adenina e higromicina (200µg/ml) para detectar la deleción del gen ERG5 por el gen de resistencia a la higromicina.

Los clones auxótrofos para la adenina, la leucina (y el uracilo y el triptófano) e igualmente resistentes a la higromicina y a la nistatina se analizan para su perfil esterólico. Se seleccionan dos clones de signos sexuales opuestos que producen campesterol como esterol mayoritario.

Se denominan CDR07 MAT a y CDRO7 MAT α.

Ejemplo 11: Construcción de los plásmidos de integración pTG12093 y pLIP5 respectivamente para los locus HIS3 y TRP1.

a) Construcción de pLIP5

pLIP5 es un plásmido que puede utilizarse para las integraciones genómicas en el locus TRP1 o como plásmido multicopia en la levadura S.cerevisiae. El plásmido de base que sirve para la construcción de este plásmido es el plásmido pFL45S descrito en Bonneaud et al. 1991, cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente solicitud, principalmente las descripciones de los plásmidos).

Un fragmento de ADN genómico correspondiente a la parte 5' en 5' del promotor TRP1 se clonó en primer lugar utilizando los oligonucleótidos OLIP21 y OLIP22 (respectivamente SEQ ID N °30 y 31) para hacer una amplificación por PCR.

El producto de PCR se subclonó en primer lugar en pCR-Script AmpSK(+) (Stratagene, La Jolla California EEUU). Los extremos OLIP21 y OLIP22 poseen en efecto en 5' un sitio NarI así como un sitio HindIII en 3'. Este fragmento NarI, HindIII tiene reemplazados los sitios de clonación múltiples del plásmido pFL45S descrito más arriba.

El plásmido obtenido pLIP3 se modifica de nuevo utilizando el oligonucleótido OLIP20 (SEQ ID N° 32) que sirve para reemplazar el sitio único HindIII por el sitio único NotI. En este sitio NotI, se introduce un fragmento que contiene de 5' a 3' el promotor TEF1, el ADNc de la citocromo P-450c17alfa y el terminador PGK1 como se describe en Degryse et al., 1999 (cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente solicitud, principalmente las descripciones de los plásmidos).

El plásmido final pLIP5 que puede servir a la vez de plásmido multicopia a base del marcador TRP1, cuando la parte 2 micrómetros se retira, se puede utilizar como plásmido de integración a nivel del locus TRP1. El casete se integra así en 5' del gen TRP1.

b) Construcción del plásmido pTG12093

Este plásmido es un plásmido de integración intergénica a nivel del locus HIS3. Este plásmido se construye a partir del plásmido pUC-HIS3 descrito por Duport et al., 1998. El sitio único de restricción XhoI de este plásmido se transformó en un sitio de restricción único NotI utilizando un adaptador apropiado destruyendo el sitio XhoI para proporcionar el plásmido pUC19-HIS3. En el sitio único NotI de este plásmido, un fragmento NotI que proviene de pTG10792. Este fragmento contiene el promotor TDH3 el ADNc que codifica la ADX bovina madura fusionada con la secuencia de direccionamiento del precursor de la citocromo de COX6 (de la subunidad 6 de la citocromo oxidasa de levadura como se describe en Dumas et al., 1996. El fragmento de restricción SalI MluI del plásmido pTG10350 que contiene el ADNc descrito anteriormente se transfirió en el plásmido pTG10211 para formar el plásmido pTG10792.

Este plásmido posee por lo tanto un fragmento de 1,6 kilobases que contiene el promotor TDH3, el ADNc fusionado entre la ADX bovina madura y la presecuencia COX6 de levadura y el terminador PGK1 de 5' a 3'. Este fragmento NotI-NotI se inserta en el plásmido pTG12093. La transcripción de HIS3 y del casete de expresión están en la misma orientación.

Ejemplo 12: Cruzamiento de CDR07 MATα con TGY260 MATa

La cepa SB 14 (CDR07MATα X TGY260 MATa) se pone a esporular en un medio muy pobre que contiene acetato de potasio. Las diferentes ascas se ponen a crecer en un medio mínimo que contiene los productos siguientes uracilo, histidina, triptófano y adenina.

Las esporas se seleccionan sobre un medio mínimo correctamente complementado que contiene de 8 a 12µg/ml de nistatina. Las esporas positivas se seleccionan sobre la presencia del ADNc de la P450-c21 humana. Para hacer esto, se realiza un cribado de los clones en medio Kappeli (Arreguin de Lorencez M, Kappeli O J, 1987) que tiene como fuente de carbono 2% de etanol (y 0,1% de glucosa) en presencia de 300mg/ml de 170H progesterona.

La bioconversión se incuba hasta 72 horas. La capacidad de bioconversión se analiza por HPLC como se describe en Dumas et al., 1996 y Degryse et al., 1999 (cuyos contenidos se incorporan por referencia en la presente solicitud, principalmente las explicaciones de los estudios de bioconversión).

Estos clones se analizan igualmente para su perfil esterólico en cromatografía en fase gaseosa como describen Duport et al., 1998 (cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente solicitud, principalmente las explicaciones de los estudios de bioconversión) con el fin de detectar el campesterol y el ergosta 5,22 dienol.

Se seleccionan tres esporas YCC3, YCC4 y YCC5 como que producen el ergosta 5,22 dienol y el campesterol y que convierten la 170H-progesterona en 11-desoxicortisol con una eficacia de producción de 25, 120 y 42 µg/ml en 72 horas, respectivamente.

YCC4 y YCC5 se seleccionan para dos nuevas transformaciones sucesivas con los plásmidos pLIP5 y pTG12093 linealizados respectivamente con las enzimas ApaL1 y EcoR1. Los plásmidos pLIP5 y pTG12093 son plásmidos de expresión intergénica respectivamente para la P450c17 bovina y la ADX bovina mitocondrial.

pTG12093 es un plásmido de integración en la región intergénica en 3' del locus HIS3 mientras que pLIP5 es un plásmido de integración en la región intergénica en 5' del locus TRP1. Además, estos dos plásmidos contienen un sito único NotI que permite la integración de un casete de expresión que contiene en este orden; promotor TEF1, ADNc P450c17 bovino, terminador PGK1 para pLIP5 en este orden promotor TDH3, ADNc COXVIpre: :mat ADX bovina, terminador PGK1 para pTG12093.

La cepa YCC4 se transforma sucesivamente con los plásmidos pLIP5 y pTG12093 linealizados (con las enzimas de restricción ApaLI y EcoRI).

Durante la primera transformación, los clones transformantes se seleccionan en primer lugar sobre un medio que no contiene triptófano. Los clones que crecen en ausencia de triptófano se seleccionan por PCR con los oligonucleótidos C17-3 y C17-5 (respectivamente SEQ ID N° 33 y SEQ ID N° 34).

Se selecciona un clon YCC8 para una nueva transformación con el plásmido pTG12093 linealizado. De la misma manera, los clones que crecen en ausencia de histidina se seleccionan y se verifica la presencia del ADNc ADX por PCR mediante los oligonucleótidos ADX-3 ADX-5 (respectivamente SEQ ID N° 35 y SEQ ID N° 36).

Se selecciona un clon UCY2, su signo sexual es MATα.

Ejemplo 13 : Construcción de la cepa UCY4

La cepa UCY2 posee un gen ATF2 funcional es decir que la mayor parte de la pregnenolona producida se transforma en acetato de pregnenolona por la proteína ATF2p que es una pregnenolona acetil transferasa cuya función natural en la levadura se desconoce (Cauet et al., 1999). Además esta reacción es irreversible y por lo tanto, una vez producida la acetil pregnenolona no es transformable en hidrocortisona. Parece por lo tanto importante destruir esta actividad para permitir una mejor producción de hidrocortisona.

El gen ATF2 se ha disrumpido por lo tanto utilizando un gen de resistencia a G418. Para hacer esto, se construyó un plásmido pAM3kanaC de disrupción que permite la introducción de un marcador de resistencia a G418 en el gen ATF2.

Este plásmido se construyó a partir del plásmido pAM1 (cuya construcción se ha descrito más arriba), del plásmido pTG12002 que es un plásmido de expresión para el gen ATF2.

pTG12002 es un plásmido de expresión para ATF2 basado en el plásmido pTG10260 (Degryse et al., 1995) en el que el sitio de restricción XbaI del origen de replicación 2 micrómetros se ha inactivado. Este plásmido comprende por lo tanto un casete de expresión para el gen ATF2 (Cauet et al., 1999) que comprende el promotor CYC1, el gen ATF2 (flanqueado por los sitios de restricción SalI y MluI) y el terminador PGK1. Este casete se modificó por PCR para contener el gen ATF2 completo que comprende el promotor del gen ATF2, la secuencia codificadora del gen ATF2, el terminador del gen ATF2 sobre un fragmento de restricción KpnI, NotI. Este fragmento KpnI-NotI se introduce en los sitios KpnI-NotI del plásmido pAM1 para proporcionar el plásmido pAM3.

En el plásmido pAM3, el casete de expresión de la resistencia a G418 se introduce en el gen ATF2 lo que conlleva su inactivación.

Para hacer esto, el plásmido pAM3 se digiere con la enzima de restricción AccI y parcialmente con la enzima de restricción SacI. Una banda de aproximadamente 7.500pb se purifica en gel. El plásmido pFA6a kanMX4 (Wach et al Methods in Microbiology Volumen 26 Yeast Gene Analysis Capítulo 5 PCR-based Gene Targeting in Saccharomyces cerevisiae) se digiere con SacI y AccI, la banda de 1.500pb se purifica en gel. Los dos fragmentos se ligan y se transforman. Se obtiene un plásmido pAM3kanaC. pAM3kanaC se digiere con PvuII y NotI, la banda de 2.215pb se purifica en gel y se transforma en UCY2 que se reparte en matraces de medio rico que contiene 130 µg/ml de G418. Aproximadamente 600 clones se repican en este medio que contiene G418, dos clones son resistentes a G418. Se conserva un clon que no contiene el plásmido pAM3.

Este método de inactivación de gen es muy conocido por el experto en la técnica.

El clon único así obtenido se pone a bioconvertir con 100µg/ml de pregnenolona en medio Kappeli.

Al cabo de 24 horas, la ausencia de acetato de pregnenolona se verifica por extracción y cromatografía en fase gaseosa como se describe en Cauet et al 1999. Este fenómeno indica que el gen ATF2 responsable de la acetilación de la pregnenolona se ha disrumpido bien y no es funcional. La cepa se denomina UCY4.

Ejemplo 14: Construcción de las cepas UCY3 y UCY26.

El cribado de las esporas obtenidas por cruzamiento de las cepas CDR07 y TGY260 proporcionó varias cepas como las cepas YCC4 y YCC5. Como se ha descrito anteriormente, la cepa YCC4 se transformó con una serie de 2 plásmidos: pLIP5 y pTG12093. Se seleccionó una espora UCY2 (véase el ejemplo 12). De la misma manera, la cepa YCC5 se transformó igualmente con los plásmidos pLIP5 y pTG12093 y se obtuvo una nueva espora denominada UCY3. Como UCY2, UCY3 se caracteriza por la presencia y la expresión de la Δ7 reductasa de A. thaliana medida por la resistencia a la nistatina y la presencia de brasicasterol y de campesterol como esterol mayoritario de estas levaduras recombinantes. La presencia del ADNc ADX se verifica por PCR mediante los oligonucleótidos ADX-3 y ADX-5 (respectivamente SEQ ID N° 35 y SEQ ID N° 36), y por transferencia Western como se describe en Dumas et al., 1996, incorporado por referencia en la presente memoria en lo que se refiere a la descripción de esta técnica.

La actividad de hidroxilación en 17 y en 21 de la progesterona se verifica por bioconversión de la progesterona en 17OH-progesterona y 11-desoxicortisol. Para hacer esto, la cepa se incuba en presencia de 200mg/l de progesterona como se describe en Dumas et al., 1996 y Degryse et al., 1999 UCY3 es capaz de producir 11-desoxicortisol a partir de la progesterona lo que indica la presencia de las actividades P450c17 y P450c21. Se detecta igualmente la presencia de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona lo que indica que al menos una de las dos actividades codificadas por GCY1 o YPR1 está presente en la cepa. Para evitar la acumulación de acetato de pregnenolona, se eliminó la actividad de acetilación de la pregnenolona codificada por el gen ATF2. Con este objetivo, el plásmido pAM3kanaC (véase el ejemplo 13) se utilizó para transformar la cepa UCY3. pAM3kanaC se digirió en primer lugar con PvuII y NotI, la banda de 2.215pb se purificó en gel, se transformó en UCY3 que se alicuotó en matraces de medio rico que contiene 130 µg/ml de G418. Se aíslan las colonias resistentes al antibiótico G418 y que no son capaces de transformar la pregnenolona en acetato de pregnenolona; se selecciona más particularmente una colonia UCY26 para nuevas transformaciones y para ensayar su producción de hidrocortisona.

Ejemplo 15 : Construcción de la cepa UCY5.

Con el objetivo de disponer de una mejor variabilidad genética, la cepa UYC2 (véase el ejemplo 12) se cruzó con la cepa TGY245 (véase el ejemplo 5), se seleccionó así una cepa diploide YSA2-2n. Esta cepa se puso en condiciones de producción de ascas y 85 ascas se disecaron (como se describe en « Yeast Protocols in Molecular Biology Volumen 53 p59-67, 1996 »). Las esporas aisladas se cribaron sobre su propiedad auxótrofa. Así, se seleccionaron más particularmente los clones capaces de crecer en ausencia de triptófano y de histidina y que necesitan adenina. La expresión de la Δ7 reductasa se verifica asegurando la resistencia de la cepa a la nistatina así como la presencia de campesterol y brasicasterol en la membrana de estas cepas. Este último análisis se realiza por cromatografía en fase gaseosa de los esteroles totales de estas cepas como se describe en Duport et al., 1998. Además, la presencia de los ADNc que codifican la P450c17 y la ADX se verifica por PCR mediante los oligonucleótidos C17-3 y C175 (respectivamente SEQ ID N° 33 y SEQ ID N° 34) y los oligonucleótidos ADX-3 y ADX-5 (respectivamente SEQ ID N° 35 y SEQ ID N° 36) respectivamente. Finalmente, la funcionalidad de los genes GCY1 y YPR1 en estas esporas positivas se verifica de dos maneras: bien por PCR, bien por ausencia de la actividad 20 alfa reductasa sobre la 17 OH progesterona.

Por PCR, utilizando la pareja de oligonucleótidos X1TEF1 y X2C21 (respectivamente SEQ ID N° 47 y SEQ ID N° 48), se detecta la disrupción del gen YPR1 por el casete de expresión para la P450c21 humana en S.cerevisiae que contiene el promotor TEF1, el ADNc de la P450c21 humana así como el terminador PGK. Se detecta igualmente por PCR, utilizando las parejas de oligonucleótidos X3TDH3 y X2C21 (respectivamente SEQ ID N° 49 y SEQ ID N° 48), la disrupción del gen GCY1 por el casete de expresión para la P450c21 humana en S.cerevisiae que contiene el promotor TDH3, el ADNc de la P450c21 humana así como el terminador PGK.

La desaparición de las dos actividades GCY1 y YPR1 y la presencia de la actividad correspondiente a la actividad P450c17 y P450c21 se verifican finalmente por bioconversión de la progesterona en 11-desoxicortisol en las condiciones descritas por Dumas et al 1996 modificadas por Degryse et al 1999. Las levaduras recombinantes se incuban a 30°C en presencia de 200mg/l de progesterona con una densidad celular de 5 en un medio de cultivo de tipo Kappëli que contiene 2% de galactosa ó 2% de glucosa como fuente de carbono, en un volumen de 10ml. Después de una incubación de 48 horas, se extrae el medio de cultivo de estas levaduras como se ha descrito anteriormente y se mide en particular la cantidad de 17OH progesterona y 11-desoxicortisol producida por HPLC. La espora seleccionada no produce una cantidad detectable de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona pero produce 17OH progesterona y 11-desoxicortisol utilizando las dos fuentes de carbono. El clon elegido produce la mayor cantidad de 11-desoxicortisol.

Una cepa que responde positivamente a todos estos criterios se selecciona más particularmente para nuevas transformaciones, esta cepa se denomina UCY5.

Ejemplo 16: Construcción de los plásmidos pFM10 y pTG10897.

a) Construcción del plásmido pFM10

El plásmido pFM10 es un vector que permite la expresión simultánea de 4 proteínas en la levadura. No contiene origen de replicación para E. coli ni gen de resistencia a la ampicilina, por lo tanto este plásmido no puede replicarse en E.coli. Su obtención se realiza por recombinación en la levadura de dos plásmidos: pFM7 y pCB12. Contrariamente al plásmido pFM10, estos últimos se replican los dos en

E. coli porque poseen el replicón E.coli. El plásmido pFM7 se replica igualmente en S.cerevisiae, porque contiene igualmente el origen de replicación 2 micrómetros de la levadura S.cerevisiae. Estos dos plásmidos poseen además las secuencias R1 y R2 (respectivamente SEQ ID N° 39 y SEQ ID N° 40) que flanquean los casetes de expresión así como marcadores de selección. Las secuencias R1 y R2 provienen del gen de la fotoclorofilida oxidoreductasa de A thaliana y su tamaño es aproximadamente 300 pares de bases cada uno.

Las dos secuencias R1 y R2 se clonan en orientación inversa en los plásmidos pFM7 y pCB12. Así, entre las secuencias R1 y R2, el plásmido pFM7 contiene en orden: el origen de replicación 2 micrómetros contenido en el fragmento 2 micrómetros (fragmento bordeado por sitios de restricción EcoRI, tal como se describe por Urban et al., 1994), un fragmento bordeado por sitios NotI que proviene del plásmido pCD63 descrito en Duport et al., 1998 que contiene dos casetes de expresión para la forma madura de la P450scc y la forma madura de la ADX separada por el gen URA3 de la levadura funcional, y a continuación la secuencia R2. De la misma forma, el plásmido pCB12 contiene las secuencias R1 y R2 pero clonadas en sentido inverso al del plásmido pFM7. Así, entre las secuencias R2 y R1, se encuentra el casete de expresión para la P45011β, el marcador de selección ADE2, el casete de expresión para la 3β-HSD de origen bovino. El casete de expresión para la P45011β proviene del plásmido pCV29 y contiene el promotor CYC1, un ADNc híbrido que codifica la P45011β y un terminador PGK. El gen ADE2 proviene del plásmido pAM1, se trata del fragmento BglII-BglII. Asimismo, el casete de expresión para la 3β-HSD bovina es decir el promotor TDH3, el ADNc de la 3β-HSD bovina y el terminador PGK proviene del plásmido pCC12, se trata del fragmento ClaI-AscI.

b) Construcción del plásmido pTG10897

Mediante dos oligonucleótidos 20mers correspondientes respectivamente a la parte 5' y 3' de la secuencia codificadora del gen ATF2 (y que comprenden igualmente los sitios de clonación) y utilizando como matriz el ADN genómico de la cepa FY 1679-28c, se amplifica por PCR la secuencia codificadora del gen ATF2. Este producto de PCR se digiere con las enzimas ClaI y HindIII y se clona entre los sitios ClaI y HindIII del plásmido pTG10031 [Degryse, 1995 #102] para proporcionar el plásmido pTG10885. Este plásmido sirve de base para la construcción de un plásmido de disrupción del gen ATF2. La secuencia del gen URA3 se amplificó a partir de ADN genómico de la cepa TGY156 (descrita en Cauet et al. 1999 e incorporada en la presente memoria por referencia), esta cepa posee en efecto un gen ATF2 interrumpido por el gen URA3. Los oligonucleótidos OTG10842 (SEQ ID N° 41) y OTG10841 (SEQ ID N° 42) sirvieron por lo tanto para la amplificación sobre matriz de ADN genómico de la cepa TGY156 y el producto de la amplificación sirvió de cebador de recombinación con el plásmido pTG10885 digerido con las enzimas de restricción BstXI y StuI.

Se obtiene así el plásmido pTG10897 que contiene la secuencia codificadora del gen ATF2 interrumpida por el gen URA3. En efecto, el gen URA3 funcional se encuentra entre 509 nucleótidos de la parte 5' de la secuencia codificadora de ATF2 y 444 nucleótidos de la parte 3' de esta secuencia codificadora.

Ejemplo 17: Construcción de las cepas UCY6, UCY16, UCY16-pFM10, UCY19, UCY20, UCY24, UCY25, UCY27.

A partir de la cepa UCY5, se construyó una serie de nuevas cepas con el objetivo de mejorar la producción de esteroides de interés. En efecto, la cepa UCY5 no expresa adrenodoxina reductasa que es un componente esencial de la reacción de corte de la cadena lateral por la P450scc. Por otra parte, como se ha descrito anteriormente, el gen ATF2 codifica una acetil transferasa que utiliza la pregnenolona como sustrato y su disrupción permite suprimir esta reacción parásita de acetilación y aumentar así el rendimiento de esteroides de interés. Finalmente, la vía de biosíntesis exógena utiliza la actividad ARH1p endógena, siendo esta última esencial para la supervivencia de la levadura. Sin embargo, esta actividad mitocondrial, que reemplaza a la adrenodoxina reductasa de mamífero, podría ser limitativa en las cepas que producen hidrocortisona. Por lo tanto, se construyó una cepa que posee determinadas modificaciones que permiten aumentar de manera consecuente el rendimiento de producción de esteroides de interés a partir de la cepa UCY5. Así, esta cepa carece de actividad ATF2, sobreproduce la proteína adrenodoxina reductasa y sobreproduce igualmente la proteína ARH1.

Para permitir una expresión de la ADR en la cepa UCY5, esta última se transformó con el vector pTG10925 (véase el ejemplo 2 f) que cuando se transforma en la levadura en forma lineal permite la integración en el locus LEU2 y la expresión de la ADR bajo el control del promotor TEF1. La expresión de la ADR se verificó por transferencia Western como se describe en Dumas et al., 1996. Se utilizó más particularmente un clon que expresa la ADR y denominado UCY6 para las transformaciones siguientes.

Con el objetivo de eliminar la reacción parásita de acetilación que transforma la pregnenolona en acetato de pregnenolona y catalizada por la enzima ATF2, se disrumpió el gen ATF2 que codifica esta enzima. Este último se interrumpió en efecto por el marcador URA3, para hacer esto, se utilizó el fragmento NotI del plásmido pTG 10897 que contiene la secuencia del gen ATF2 interrumpida por el gen funcional de levadura URA3. Este fragmento se utiliza para transformar la cepa UCY6. Se seleccionan las colonias capaces de crecer en ausencia de uracilo y se mide la capacidad de estos clones para transformar la pregnenolona en acetato de pregnenolona como se describe por Cauet et al., 1999. Se aísla más particularmente un clon capaz de crecer en ausencia de uracilo e incapaz de transformar la pregnenolona en acetato de pregnenolona. Este clon se denomina UCY16.

Esta cepa no puede ser transformada con los plásmidos que contienen únicamente el marcador URA3, se construyeron dos nuevos plásmidos: los plásmidos pCB12 y pFM7. Estos dos plásmidos cuando se recombinan juntos, permiten obtener el plásmido pFM10 basado en los marcadores URA3 o/y ADE2 (véase anteriormente y la Figura 5). Así, para obtener el plásmido pFM10, el plásmido pFM7 se linealiza con la enzima de restricción AatII y el fragmento de ADN correspondiente se aísla en gel. El plásmido pCB12 en cuanto a él se digiere con BamH1 y la banda de 9.300 pares de bases se aísla según las técnicas clásicas de biología molecular. Aproximadamente 5 µg de los fragmentos de pCB12 y pFM7 se mezclan y sirven para transformar la cepa UCY16. Algunos clones UCY16-pFM10, capaces de crecer en medio mínimo (sin uracilo ni aminoácidos), se aíslan y las cepas correspondientes se ensayan para su nivel de producción de esteroides según el protocolo descrito a continuación.

Alternativamente y con el objetivo de poder utilizar en lo que sigue los plásmidos de tipo pCV29 basados en un marcador URA3, se obtuvo igualmente la disrupción del gen ATF2 en la cepa UCY6 transformando esta cepa con el plásmido pAM3kanaC linealizado (véase el ejemplo 13). Las colonias resistentes a G418 se ensayan para la ausencia o presencia de la actividad pregnenolona acetil transferasa como se describe por Cauet et al. 1999. Se selecciona muy particularmente una colonia resistente a G418 y que no posee actividad pregnenolona acetil transferasa. Esta cepa se denomina UCY24.

Con el objetivo de aumentar la actividad ARH1 en una cepa que contiene una vía de producción exógena de hidrocortisona, la cepa UCY5 se transformó con los plásmidos pTG12048 o pTG12050 linealizado previamente con XhoI y SapI respectivamente. El plásmido pTG12048 que se ha descrito anteriormente permite la sobreexpresión del gen ARH1 en el locus LEU2 bajo el control del promotor CYC1. El plásmido pTG12050 difiere del plásmido pTG12048 únicamente por el hecho de que el promotor CYC1 que controla la expresión del gen ARH1 se ha reemplazado por el promotor TEF1 tal como se describe en Degryse et al., 1995 y Dumas et al. 1996. UCY5 se transformó con pTG12048 o pTG12050 linealizado. En cada uno de los dos casos, se seleccionaron las colonias capaces de crecer en ausencia de leucina. Además, la presencia de los casetes de expresión para el gen ARH1 se verificó por PCR. Dos parejas de oligonucleótidos permiten en efecto verificar la presencia de una copia suplementaria del gen ARH1 (bajo el control del promotor CYC1 o TEF1). Por una parte, la pareja arh1D (SEQ ID N° 43) y nfs1R (SEQ ID N° 44) permite verificar la presencia de la unión entre el gen ARH1 y el gen NFS1. Por otra parte, la pareja leu2D (SEQ ID N° 45) y arh1R (SEQ ID N° 46) permite la verificación de la unión entre el gen LEU2 y el gen ARH1.

Además de la presencia de los casetes de expresión para el gen ARH1 que codifica la actividad ARH1, se ensayó igualmente la expresión de la proteína ARH1p en los clones obtenidos. La detección de la sobreexpresión de ARH1p no es sin embargo fácil. Este hecho se debe a la presencia natural de la proteína ARH1p a bajo nivel en las cepas de S.cerevisiae. Los experimentos de Transferencia Western realizados como se describe en Dumas et al., 1996 permiten sin embargo confirmar el aumento de la cantidad de ARH1p. Además de los experimentos de Transferencia Western que se muestran delicados, puede verificarse la presencia de una cantidad incrementada de ARH1p por experimentos de reducción del citocromo c o de 11beta hidroxilación del 11-desoxicortisol reconstituidos in vitro con mitocondrias purificadas de las levaduras recombinantes como se describe en Lacour et al., 1998 y Dumas et al., 1996, respectivamente. Se seleccionan muy particularmente dos clones, UCY19 y UCY20, respectivamente transformados con pTG12048 y pTG12050 y que sobreexpresan ARH1. El gen ATF2 se disrumpió en estas cepas como se ha descrito más arriba. Brevemente, el plásmido pAM3kanaC se linealizó y se utilizó para transformar las cepas UCY19 y UCY20. Los clones se seleccionaron por su propiedad de resistencia a G418 y la ausencia de actividad pregnenolona acetil transferasa como se describe por Cauet et al. 1999. Se seleccionan muy particularmente dos clones derivados de UCY19 y UCY20. Se trata respectivamente de las cepas UCY25 y UCY27 (véase la Figura 2).

Ejemplo 18: Producción de esteroides por las cepas según la invención

a) Transformación de UCY2 y UCY4 con pCV29 y pCC12

Las cepas UCY2 y UCY4 se transformaron con los dos plásmidos pCV29 y pCC12, descritos más arriba, cuyas estructuras se recuerdan a continuación y en las figuras 3 y 4.

5 El plásmido pCV29 contiene un origen de replicación de tipo 2 micrómetros para la replicación en la levadura. Además, este plásmido contiene 3 casetes de expresión respectivamente para la P45011β humana/bovina híbrido dirigido a la mitocondria tal como se ha descrito anteriormente, las formas maduras (con una metionina en el extremo NH2 terminal) de la adrenodoxina y de la P450scc. La expresión de estas tres proteínas está bajo el control de los promotores CYC1 (P45011β) y GAL10/CYC1

10 (ADX y P450scc en forma madura).

El plásmido pCC12 es un plásmido de bajo número de copias que contiene un casete de expresión para la forma madura de la adrenodoxina reductasa bovina bajo el control del promotor TEF1 así como un casete de expresión para la 3β-HSD bovina bajo el control del promotor TDH3.

Estas cepas se ponen a crecer en condiciones clásicas de fermentación en medio Kappeli con 15 glucosa como fuente de carbono. Al final de la fermentación (180h), los esteroides se extraen como se ha descrito anteriormente y se caracterizan por cromatografía líquida de alta presión.

La identidad de los productos se verificó por cromatografía en fase gaseosa, por cromatografía de alta presión en fase líquida y en fase reversa acoplada o no con espectrometría de masa y resonancia magnética nuclear (véase la Tabla 1).

20 Tabla 1. Balance de los esteroides obtenidos (resultados expresados en mg/l)

Cepas

Acetato de pregnenolona Progesterona 4-pregneno-17α-20α diol 3 ona No identificado Corticosterona Hidrocortisona

UCY2/pCV29 pCC12

+ 18 7 5 5 12 15

UCY4/pCV29 pCC12

+ 0 30 44 24 23 80

b) Transformación de las cepas UCY24, UCY25, UCY26 y UCY27 con pCV29 y pCC12 y transformación de la cepa UCY16 con pFM10

Estas cepas poseen numerosas modificaciones y se muestran difíciles de transformar. Consecuentemente, se utilizó un protocolo basado en la preparación de esferoplastos para estas 25 transformaciones, como se describe por Burgers et al., 1987. UCY16 se transformó según este protocolo con los plásmidos pFM7 y pCB12, proporcionando estos últimos el plásmido pMF10 por recombinación in vivo en la levadura. Como se ha descrito anteriormente, el plásmido pFM10 es un plásmido multicopia de levadura, que no contiene secuencias bacterianas y que permite la expresión de 4 proteínas heterólogas. Estas cuatro proteínas son como se ha visto anteriormente: una forma quimérica de la citocromo P45011β, 30 la 3β-HSD bovina, la ADX madura y la citocromo P450scc madura. Los ADNc correspondientes se ponen respectivamente bajo el control de los promotores CYC1, TDH3, GAL10/CYC1 y GAL10/CYC1. Los transformantes se seleccionan en un medio mínimo sin ninguna adición. La selección se hace únicamente sobre el marcador ADE2 (crecimiento en ausencia de adenina), la presencia de un gen funcional URA3 en el genoma y que sirve para la inactivación del gen ATF2 no permite la selección sobre el gen URA3. Es

35 por lo tanto necesario cribar varias colonias para estar seguros de tener un plásmido pFM10 funcional en la cepa UCY16.

Las cepas UCY24, UCY25, UCY26 y UCY27 se transformaron con los plásmidos pCV29 y

pCC12 según el mismo protocolo de preparación de los esferoplastos. Como se ha descrito

anteriormente, el plásmido pCV29 es un plásmido multicopia lanzadera entre E.coli y S.cerevisiae.

40 Permite la expresión de la citocromo P45011β, la ADX madura y de la citocromo P450scc respectivamente bajo el control de los promotores CYC1, GAL10/CYC1 y GAL10/CYC1 (véase la Figura 3). El plásmido pCC12 es un plásmido monocopia de levadura que permite la expresión de la ADR madura bovina y de la 3β-HSD bovina bajo el control de los promotores TEF1 y TDH3, respectivamente (véase la Figura 4).

Todas estas cepas se ponen a crecer en Erlenmeyer (volumen 100 ml y que contiene 30 ml de medio de cultivo) en las condiciones clásicas de fermentación en medio Kappeli con como fuente de carbono 2% de etanol y 0,1 % de glucosa. Después de 168 horas de cultivo, 500µl de medio de cultivo (células + medio) se extraen dos veces mediante 4ml de dicloroetano. La fase orgánica se reúne y se

5 separa en dos para secarla bajo flujo de nitrógeno. El extracto seco se resuspende en 100µl de una mezcla acetonitrilo/agua (50/50 volumen/volumen) ó 100µl de dicloroetano. Los extractos resuspendidos en la mezcla acetonitrilo/agua se tratan por HPLC, esto permite un análisis de la composición de diferentes esteroides (hidrocortisona, cortexolona, corticosterona, 170H-progesterona, 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona) como se describe en Valvo et al., 1994. Los extractos resuspendidos en dicloroetano

10 se analizan por cromatografía en fase gaseosa como se describe en Duport et al., 1998, permitiendo este último análisis medir la cantidad de pregnenolona y de progesterona de las muestras. Para cada una de las cepas transformadas, se mide así la productividad de esteroides de una decena de clones. Los resultados presentados a continuación, proporcionan los resultados del mejor de los diez clones ensayados para cada una de las cepas UCY24, UCY25, UCY26 y UCY27 transformadas con pCV29 y

15 pCC12 y de la cepa UCY16 transformada con pFM10.

Tabla 2. Balance de los esteroides obtenidos (resultados expresados en mg/l salvo la última línea: resultados expresados en porcentaje del total de los esteroides)

UCY24 pCV29+ pCC12

UCY25 pCV29+ pCC12 UCY26 pCV29+ pCC12 UCY27 pCV29+ pCC12 UCY16 pFM10 UCY4 pCV29+ pCC12

17 OH progesterona

0,6 0,6 1,0 0,6 0,5 0,2

desoxicorticosterona

0,5 0,0 0,2 0,3 1 0,0

cortexolona

4,5 2,7 2,1 2,0 7,6 0,7

4 pregneno 17α, 20α diol 3 ona

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,5

corticosterona

7,5 10,8 7,5 9,0 8,9 3,4

hidrocortisona

17,7 29,2 22,3 24,7 15,8 12,3

Esteroides Totales

30,8 43,3 33,1 36,6 33,8 21,2

% hidrocortisona

57 67 67 67 47 58

NB : No se detecta ni pregnenolona ni acetato de pregnenolona en el medio de cultivo de estas cepas

Las cepas UCY16 pFM10, UCY24 pCV29+pCC12, UCY25 pCV29+pCC12, UCY26

20 pCV29+pCC12 y UCY27 pCV29+pCC12 presentadas anteriormente son por lo tanto capaces de producir cantidades de hidrocortisona superiores a las producidas por la cepa UCY4/pCV29+pCC12. La cantidad total de esteroides pasa así de 21,2 µg/ml en la cepa UCY4/pCV29+pCC12 a 43,3 µg/ml en la cepa UCY25pCV29+pCC12 mientras que la cantidad de hidrocortisona pasa de 12,3 µg/ml a 29,2 µg/ml, respectivamente. Además, la hidrocortisona representa en estos ejemplos hasta aproximadamente 70%

25 de los esteroides totales. Se observa por lo tanto un fuerte aumento de la cantidad y de la calidad de hidrocortisona producida porque ninguna de estas cepas produce el contaminante 4 pregnen 17, 20 diol 3ona. Esta última característica particularmente ventajosa se debe a la ausencia de las proteínas codificadas por los genes GCY1 y/o YPR1 que son responsables de la reacción de reducción de la cetona en 20.

30 Es igualmente interesante indicar que, de manera inesperada, la sobreproducción controlada de ARH1p bajo el control del promotor CYC1 aumenta de forma significativa la cantidad de esteroides totales producidos así como la producción de hidrocortisona (véase UCY24 pCV29+pCC12 frente a UCY25 pCV29+pCC12). Sin embargo, esta expresión no debe ser muy importante para obtener el efecto deseado. Así, si es deseable una expresión de la proteína ARH1 a un nivel superior respecto a un nivel fisiológico, hay que tener cuidado de no sobreexpresar mucho esta proteína so pena de perder este

5 aumento de producción de esteroides. Así, el promotor TEF1 que se reconoce como mucho más fuerte que CYC1 (Nacken et al., 1996) proporciona resultados insatisfactorios (véase UCY25 pCV29+pCC12 frente a UCY27 pCV29+pCC12). En conclusión, la cepa UCY25/pCV29+pCC12 tiene un potencial estimado para producir 200mg/l de hidrocortisona en fermentador con un único contaminante importante (la corticosterona)

10 c) Ejemplo de producción en gran volumen de las cepas según la invención

Dos de las cepas anteriores se pusieron a crecer en fermentador de gran volumen en medio Kappeli según las técnicas muy conocidas por el experto en la técnica (véase por ejemplo Risenberg D. et al., 1999). La técnica de cultivo utilizada es alimentación en discontinuo en medio concentrado (fedbatch). El fermentador de volumen total 15 litros contiene al principio 6 litros de medio. La adición en

15 continuo de 4 litros de medio concentrado suplementario a lo largo de la fermentación así como líquidos correctores del pH y la adición continua de etanol lleva el volumen final a 11,5 litros aproximadamente al final del cultivo. Las cepas UCY4 pCV29+pCC12 y UCY16 pFM10 se cultivaron así 180h y pudo obtenerse así una producción incrementada de hidrocortisona (véase la tabla 3). A partir de estos resultados, se extrapolaron los resultados considerados para las cepas UCY24 pCV29+pCC12, UCY25

20 pCV29+pCC12, UCY26 pCV29+pCC12 y UCY27 pCV29+pCC12 (véase la tabla 3).

Tabla 3 Producción de hidrocortisona de diferentes clones obtenidos según la invención (resultados en mg/l)

Cepas

Hidrocortisona en mg/l

UCY4 pCV29+pCC12

80

UCY16 pFM10

110

UCY24 pCV29+ pCC12

123*

UCY25 pCV29+ pCC12

203*

UCY26 pCV29+ pCC12

155*

UCY27 pCV29+pCC12

172*

* Estos resultados se obtuvieron por extrapolación de los resultados obtenidos en fermentador de gran volumen con las cepas UCY4 pCV29+pCC12 y UCY16 pFM10.

Depósito de material biológico

Los organismos siguientes se depositaron el 24 de enero de 2001 en la Collection Nationale de

Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia, según

las disposiciones del Tratado de Budapest.

- Cepa CDR07 MATα

Número de orden I-2616

- Cepa TGY260

Número de orden I-2615

Lista de las cepas descritas en la presente solicitud

-

30 Fy1679-18b = (n) MATa ura3-52 trp1-Δ63 leu2-Δ1 his3-Δ200 fenl GAL fenS ura trp- leu-his

-

Fy1679-28c = (n) MATα ura3-52 trp1-Δ63 leu2-Δ1 his3-Δ200 fenl GAL fenS ura trp- leu-hisTGY195 #4 = Fy1679-18b ypr1 : : URA3 TGY212-1 = Fy1679-18b ypr1::TEF1p::P450c21 [5x?] ura- trp - leu-hisTGY243-1 = TGY212-1 gcyl::URA3 trp- leu-hisTGY245-2D = TGY243-1 gcyl::TDH3p::P450c21 ura-trp- leu-hisTGY260-A = TGY245-2D LEU2::CYC1p::ARH1 ura-trp-hisCDR01 = Fy1679-18b MATα LEU2::'b-mat ADR' ura-trp-his

-

CDR07 MATα= MATα ade2::GAL10/CYClp::Δ7 ura trp-leu-his- ade- (espora de CA10x Fy167928c)

-

CDR07 MATα= MATα ade2::GAL10/CYC1p::Δ7 ura trp-leu-his- ade- (espora de CA10 x Fy167928c)

-

CA03 = CDR01 ade2::GAL10/CYC1p::Δ7 ura trp- ade-his-, resistente a la nistatina (Duport et al., 1998)

-

CA10 = CA03 erg5::PGK1p::hygroR ura trp-ade-his-, resistente a la nistatina y la higromicina (Duport et al., 1998)

SB14 (2n) = TGY260-A x CDR07 Matα

YCC4 = (n) MATα ade2::GAL10/CYClp::Δ7 , LEU2::CYC1p::ARH1, ypr1::TEF1p::P450c21, ERG5, fen1(?), ura-trp- ade-his-, resistente a la nistatina, (espora de SB 14)

YCC8 = YCC4 transformada con pLIP5 (TRP1::TEF1p::P450c17::PGK1t), ura-ade-his-, resistente a la nistatina

UCY2 = YCC8 transformada con pTG12093 (HIS3::TDH3p::CoxVIpre:: matADX::PGK1 t) : HIS3::TDH3p:: CoxVIpre::matADX::PGK1t, ERG5, fen1 (?), ura- ade-, resistente a la nistatina

-

UCY4 = UCY2 atf2-Δ::G418R ura ade-, resistente a la nistatina y a G418.

YCC5 = (n) MATα ade2::GAL10/CYC1p::Δ7Reductasa, LEU2::CYC1p::ARH1, gcyl::TDH3p::P450c21, ERG5, fen1(?), ura-trp-ade-his-, (resistente a la nistatina, espora de SB 14).

YCC9 = YCC5 transformada con pLIP5 (TRP1::TEF1p::P450c17::PGK1t), ura-ade-his-, resistente a la nistatina.

UCY3 = YCC9 transformada con pTG12093 (HIS3::TDH3p::CoxVIpre:: matADX::PGK1 t) : IHS3::TDH3p:: CoxVIpre::matADX::PGK1t, ERG5, fen1 (?), ura- ade-, (resistente a la nistatina).

-

UCY26 = UCY3 atf2-Δ::G418R ura ade-, (resistente a la nistatina y a G418). YSA2 (2n) = TGY245-2D x UCY2. UCY5 = (n) MATα ade2::GAL10lCYC1p::Δ7Reductasa, LEU2::CYC1p::ARH1,

ypr1::TEF1p::P450c21, ERG5, gcy1::TDH3p::P450c21 fen1(?), ura-trp-his-, resistente a la nistatina, (espora de YSA2). UCY6 = UCY5 LEU2::TEF1 :: matADR ::PGK1t,. UCY16 = UCY6, atf2::URA3::atf2. UCY19 = UCY5, LEU2::CYC1 :: ARH1. UCY20 = UCY5, LEU2::TEF1:: ARH1. UCY25 = UCY19, atf2-Δ::G418R (resistente a la nistatina y a G418). UCY27 = UCY20, atf2-Δ::G418R (resistente a la nistatina y a G418).

UCY24 = UCY6, atf2-Δ::G418R (resistente a la nistatina y a G418).

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34.

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10.

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LISTA DE SECUENCIAS

<110> AVENTIS PHARMA SA

<120> Cepa de levadura que produce esteroides de forma autónoma

<130> Solicitud RMV 2544

<140>

<141>

<150> FR 0101294

<151> 2001-01-31

<160> 49

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11314 para amplificar la parte 5' de YPR1

<400> 1 tacgctcgag acgttggtgt cattgatatt ca 32

<210> 2

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11315 para amplificar la parte 5' de YPR1

<400> 2 cttcattcaa atagatagcc g 21

<210> 3

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11316 para amplificar la parte 3' de YPR1

<400> 3 tatggctaaa aagcacggcg tt 22

<210> 4

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11317 para amplificar la parte 3' de YPR1

<400> 4 cgatctcgag tttctcgttg ttcaggtact g 31

<210> 5

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11463 para amplificar URA3 flanqueado por YPR1 <400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 58

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11464 para amplificar URA3 flanqueado por YPR1

<400> 6 aacgccgtgc tttttagcca taagcttggg taataactga tataattaaa tagtactc 58

<210> 7

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG7410 para amplificar el ADNc de la P450c21 humana

<400> 7 ggaattccgt cgacaaaaat gctgctcctg ggcctgctgc 40

<210> 8

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG5927 para amplificar el ADNc de la P450c21 humana

<400> 8 cctcaatggt cctcttggag ttcagcacc 29

<210> 9

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Entorno alrededor del codón ATG de inicio de la traducción de P450c21

<400> 9 gtcgacaaaa atgctgctcc tgggcctgct gc 32

<210> 10

<211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11844

<400> 10 tttgctcgag gttacagaag ggc 23

<210> 11

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11845

<400> 11 gattctcgag caattggctg acta 24

<210> 12

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido ATG11975

<400> 12 aaatcgataa catg 14

<210> 13

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11976

<400> 13 ttatcgattt catg 14

<210> 14

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11981

<400> 14 attgatatcg ataaaaagca cggcgttgag 30

<210> 15

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11982

<400> 15 tctcggaatt caggtactgc agccag 26

<210> 16

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11980

<400> 16 caactaagct tcattcaaat agatagccgc 30

<210> 17

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11285

<400> 17 gattcggtaa tctccgaaca ggtaccaatt atatcagtta ttacccggga

<210> 18

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11286

<400> 18 agccatcttc aaagcggtt 19

<210> 19

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11287

<400> 19 ccgatcgaat caaaacgaac ag 22

<210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11289

<400> 20 tctaatcagc tagtaagaac 20

<210> 21

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11305

<400> 21

imagen1

<210> 22 5 <211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG11306

10 <400> 22 ctgttcgttt tgattcgatc gggaagcttg ggtaataact gatataatta aattgaactc 60

<210> 23

<211> 138

<212>

PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia N-Terminal de la proteína construida para la expresión de la P450c11

<400> 23

<210> 24

<211> 37

<212>

ADN 5 <213> Secuencia artificial

imagen1

<220>

<223> Oligonucleótido OLPI FL

<400> 24

agctggcggc cgcttaatta agtggcgcgc caagctt 37 10 <210> 25 <211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia añadida antes de la 3 beta-HSDH bovina

15 <400> 25 gtcgacaaaa atg 13

<210> 26

<211> 24

35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Final del ADNc de la 3 beta-HSDH bovina

<400> 26 tgacctggag tgacaatgac gcgt 24

<210> 27

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG5868

<400> 27 cgcgtgtac 9

<210> 28

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OLIP 174

<400> 28 agctgcggcc gcggcgcgcc gtttaaac 28

<210> 29

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OLIP 175

<400> 29 agctgtttaa acggcgcgcc gcggccgc 28

<210> 30

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido OLIP 21

<400> 30 aaacggcgca gtagggaata ttactgg

<210> 31

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OLIP 22

<400> 31 ccgaagctta atcggcaaaa aaagaaaagc

<210> 32

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OLIP 20

<400> 32 agctgcggcc gc 12

<210> 33

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido C17-3

<400> 33 actgatggtt ggggtgcatt ga 22

<210> 34

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido C17-5

<400> 34 atggcatcct ggaggttctg ag 22

<210> 35

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido ADX-3

<400> 35 gtacccgggg atccttattc tat 23

<210> 36

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido ADX-5

<400> 36 cagtccactt tataaaccgt gatg 24

<210> 37

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 5'ADE2090

<400> 37 cgattcggat ccactagtaa cgccgtatcg tgattaacg 39

<210> 38

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 3'ADE2089

<400> 38 cctcaaggat cctcctgacg tagcgctatc ctcggttctg 40

<210> 39

<211> 327

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Huella de recombinación R1

<400> 39

imagen1

5 <210> 40

<211> 336

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Huella de recombinación R2

<400> 40 aaaagtcgac aaaatggaag atatagaagg atacgaacca catatcactc

imagen1

<210> 41

<211> 46

15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido OTG10842

<400> 41

20

aaaaacgcgt aactattaaa gcgacgcaaa ttcgccgatg gtttgg 46

<210> 42

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25

<220>

<223> Oligonucleótido OTG1084

<400> 42

39

<210> 43

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido arh1D

<400> 43 cggagcgcta tccttagaga 20

<210> 44

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido nfs1R

<400> 44 acgtttcttt cgcctacgtg 20

<210> 45

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido leu2D

<400> 45 ggtaaggcca ttgaagatgc 20

<210> 46

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido arh1R

<400> 46 accccttttg ttccgagttc 20

<210> 47

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido X1TEF1

5 <400> 47 ttcaaaacac ccaagcacag 20

<210> 48

<211> 20

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido X2C21

<400> 48

ggtctgccag caaagtctgc 20 15 <210> 49

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Oligonucleótido X3TDH3

<400> 49 cgggcacaac ctcaatggag 20

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Cepa de levadura genéticamente modificada que produce, de manera autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla, un esteroide o un derivado de esteroide, derivado del metabolismo del colesterol, estando comprendido dicho esteroide o derivado de esteroide en el grupo constituido por la pregnenolona, la 17α-hidroxi pregnenolona, el cortisol, la cortexolona, la progesterona, la 17α-hidroxi progesterona, y sus derivados acetilados, hidroxilados o que contienen un derivado halogenado o un grupo metilo, caracterizada porque presenta una inactivación de los genes endógenos ATF2, GCY1 y YPR1.

2. 2.

   Cepa de levadura según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta al menos una inactivación adicional de un gen endógeno elegido del grupo constituido por ERG5, ARE1, ARE2, ATF1 y ADE2.

3. 3.Cepa de levadura según la reivindicación 2, caracterizada porque presenta una inactivación de los genes endógenos ERG5, ATF2, GCY1 y YPR1.
4. 4.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque presenta al menos un bloque de expresión para un gen heterólogo integrado en el cromosoma, en al menos un locus elegido entre ADE2, HIS3, TRP1, LEU2, GCY1, ATF2 y YPR1, efectuándose la integración de manera intragénica o intergénica, en proximidad inmediata de dicho locus.
5. 5.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque presenta al menos un bloque de expresión para un gen heterólogo situado en un plásmido multicopia o un plásmido de bajo número de copias.
6. 6.Cepa de levadura según la reivindicación 5, caracterizada porque el plásmido multicopia se elige entre los plásmidos a base de un replicón 2 micrómetros de levadura que se replica en Saccharomyces cerevisiae y porque el plásmido de bajo número de copias se elige entre los plásmidos basados en un origen de replicación ARS cromosómico con un centrómero de levadura.

7. 7.

   Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque presenta al menos un gen o un ADNc heterólogo en un bloque de expresión, eligiéndose dicho gen o ADNc del grupo constituido por el gen de la esterol Δ7-reductasa, de la citocromo P450 SCC, de la adrenodoxina, de la adrenodoxina reductasa, de la 3β-hidroesteroide deshidrogenasa isomerasa, de la citocromo b5, de la citocromo P450 reductasa, de la citocromo P450 C 17, de la citocromo P450 C21, de la citocromo P450 C11, y de las secuencias que codifican estas proteínas.

8. 8.

   Cepa de levadura según la reivindicación 7, caracterizada porque al menos un gen o ADNc heterólogo está bajo el control de una secuencia promotora elegida del grupo constituido por las secuencias promotoras endógenas de levadura TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GAL10, ATF2, TIR1, ARH1, ADE2, y el promotor híbrido GAL10-CYC1.

9. 9.

   Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizada porque la secuencia terminadora de al menos un gen o ADNc heterólogo en el bloque de expresión se elige entre las secuencias terminadoras de los genes endógenos PGK1, CYC1, ATF2, ADE2 y NCP1.

10. 10.

    Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque presenta el bloque de expresión heterólogo esterol Δ7-reductasa integrado en el cromosoma en el locus ADE2.

11. 11.

    Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión de los genes que codifican las formas maduras P450SCC y de la adrenodoxina localizado en un plásmido de alto número de copias.

12. 12.

    Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque comprende un casete de expresión de la adrenodoxina reductasa para P450SCC localizado en un plásmido mono o de bajo número de copias, o integrado en uno o varios cromosomas de levadura.

13. 13.

    Cepa de levadura según la reivindicación 12, caracterizada porque dicho casete de expresión de la adrenodoxina reductasa posee los elementos que aseguran la presencia de la proteína en el citosol de la célula anfitriona.

14. 14.

    Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión elegido entre los casetes de expresión de la 3β-hidroesteroide deshidrogenasa isomerasa, de la citocromo P450C 17, de la citocromo P450C21 localizado en un plásmido de alto número de copias.

15. 15.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión para la P45011β situado en un plásmido multicopia, presentando la proteína producida una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias.
16. 16.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión para un precursor de la adrenodoxina para P45011β situado en un plásmido multicopia, con un promotor débil, presentando la proteína producida una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias.
17. 17.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque presenta al menos dos casetes de expresión para la adrenodoxina, de manera tal que una proteína sea activa en el exterior de la mitocondria, siendo la otra activa en las mitocondrias de la célula anfitriona.
18. 18.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión para NCP1, ATR1, y/o ATR2 situado en un plásmido monocopia o integrado en el cromosoma.
19. 19.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque expresa la proteína ARH1 a un nivel superior respecto a un nivel fisiológico.
20. 20.Cepa de levadura según la reivindicación 19, caracterizada porque posee, además del gen endógeno, un segundo casete de expresión para la proteína ARH1.
21. 21.Cepa de levadura según la reivindicación 20, caracterizada porque la expresión de la proteína ARH1 está situada bajo el control del promotor CYC1 en dicho casete.
22. 22.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizada porque es poliploide, diploide, haploide o aneuploide.
23. 23.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque se trata de una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
24. 24.Cepa de levadura según la reivindicación 22, caracterizada porque se deriva de la cepa FY 1679-28c o de la cepa FY 1679-18b.
25. 25. epa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada porque posee los elementos necesarios para la excreción del esteroide producido en el medio de cultivo.
26. 26.Procedimiento de producción de un esteroide, caracterizado porque comprende las etapas de fermentación de una cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 25 en presencia de una fuente de carbono sencilla y de recuperación del esteroide producido.
27. 27.Preparación farmacéutica que comprende una cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 25.