JPWO2010079594A1 - ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用 - Google Patents

ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用 Download PDF

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Abstract

本発明の目的は、産業上有用なステロイドホルモン生合成の第一段階を触媒する重要な酵素蛋白質であるＰ４５０ｓｃｃ酵素蛋白質について高活性なＰ４５０ｓｃｃ酵素蛋白質を取得することである。本発明によれば、以下の理化学的性質を有するステロール側鎖切断酵素蛋白質が提供される。（１）作用：本明細書で定義する式（Ｉ）で表されるステロールに作用し、ステロール側鎖部分の20位と22位の炭素−炭素結合を切断する活性により該結合を切断して本明細書で定義する式（ＩＩ）で表される化合物を生成する。（２）基質特異性：該酵素蛋白質を産生する微生物を、4-コレステン-3-オンまたはコレステロールを１００μg/ml含む水溶液に２８℃で５時間反応させたときの、4-コレステン-3-オンからプロゲステロンへの変換反応率が１０％以上であり、かつコレステロールからプレグネノロンへの変換率が１０％以上である。

Description

本発明は、ステロール側鎖の20位と22位の結合を切断して医薬又は医薬中間体として産業上有用なプレグネノロン等を産生する酵素蛋白質、該酵素蛋白質をコードするDNA、該DNAをベクターに組み込んで得られる形質転換体、並びに該酵素蛋白質をを用いることによるプレグネノロン等、及びハイドロコルチゾンとその誘導体の製造方法等に関する。
11β,17α,21-トリヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン（ハイドロコルチゾン）は、その前駆物質であるプレグネノロン、プロゲステロン、７−デヒドロプレグネノロンとともに、医薬および医薬中間体として産業上有用な化合物である。プレグネノロンの既存の製造法としては、コレステロール、ジオスゲニンやスティグマステロールといった天然由来のステロール化合物を原料とし、複数の有機合成反応により合成される（非特許文献１）。しかし、これらの手法は、工程数が多く、目的生産物の収率が低く、工業的生産方法としては問題点がある。一方、ハイドロコルチゾンまでの生化学的な製造手段としては、動物由来のステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有する酵素（side chain cleavage cytochrome P450、以下「P450scc」と称することがある)によるステロール変換方法が開示されているが（非特許文献２）、動物由来酵素蛋白質は酵素蛋白質活性が低く、また、宿主となる細胞は培養に高価な培地が必要となり増殖速度が遅い等、その生産方法は確立されていない。さらに、ウシ由来のP450sccを酵母菌に形質転換し、電子伝達系を構成するアドレノドキシンおよびアドレノドキシンレダクターゼ存在下で、コレステロールからプレグネノロンに変換する方法も開示されているが、生産性は非常に低く工業レベルの生産性は得られていない（特許文献１）。
J. Org. Chem., 1979, 44, 1583 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 1988 特許第２９６３７１１号公報
本発明が解決しようとする課題は、産業上有用なステロイドホルモン生合成の第一段階を触媒する高活性なP450sccを提供すること、並び該P450sccを用いたプレグネノロン等、さらにはハイドロコルチゾンを安価かつ簡便に生産するための方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、微生物のP450scc数百種について、ステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を測定し、非常に高いステロール化合物側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有する酵素蛋白質を見出した。この蛋白質が上記活性を有することは新規であった。また、前記微生物由来の酵素蛋白質と、高い塩基配列の相同性を有することを指標としてその近縁微生物のP450蛋白質をコードするDNAをスクリーニングしたところ、新規の塩基配列を有するDNAが見出された。本発明者らは、これらの微生物由来酵素蛋白質をコードするDNAによる形質転換体を作製し、該酵素蛋白質形質転換体細胞、該形質転換体処理物および／または培養液を、原料となるステロール化合物に作用させることにより、高濃度で目的物であるプレグネノロン等を得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
＜１＞ 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのタンパク質；
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質。
＜２＞ 以下の理化学的性質を有するステロール側鎖切断酵素。
（１）作用：下記式（I）で表されるステロールに作用し、ステロール側鎖部分の20位と22位の炭素−炭素結合を切断する活性により該結合を切断して下記式（II）で表される化合物を生成する。
（２）基質特異性：該酵素を産生する微生物を、4−コレステン−3−オンまたはコレステロールを100μg/ml含む水溶液に28℃で5時間反応させたときの、4−コレステン−3−オンからプロゲステロンへの変換反応率が10％以上であり、かつコレステロールからプレグネノロンへの変換率が10％以上である。
（３）至適ｐＨ：7.5〜8.0
（４）作用至適温度：15〜20℃
（５）熱安定性：20℃で140時間保存後に30％以上の酵素活性が保持される。
（６）分子量：アミノ酸配列からの推定分子量が53〜54ＫＤａであり、ＳＤＳ電気泳動による測定で50〜56ＫＤａ
Figure 2010079594
 ［式（Ｉ）において、母核部分は、ステロイド類が有するＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ環からなる構造をもち、
その１位から１７位（１０位と１３位をのぞく）のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置に炭素−炭素不飽和結合を有しており、
その１位から１９位（１０位と１３位をのぞく）のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置の炭素上には、それぞれ独立して、
式；−ＯＸで表される基
（式中、Ｘ＝Ｈで表される水酸基、Ｘ＝ＣＯＲ1[Ｒ1は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｘ＝Ｒ2[Ｒ2は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｘ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、Ｘが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基、またはＸが当該炭素の隣接炭素原子であるエポキシ基）、
または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。
側鎖部分は、Ｒは、環状部分を有していてもよい炭素数１０以下の直鎖状のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、または環状部分を有していてもよい炭素数１０以下の分岐状のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、
２０位、２１位およびＲ内のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置の炭素上には、それぞれ独立して、
式；−ＯＹで表される基
（式中、Ｙ＝Ｈで表される水酸基、Ｙ＝ＣＯＲ3[Ｒ3は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｙ＝Ｒ4[Ｒ4は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｙ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、Ｙが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基、またはＹが当該炭素の隣接炭素原子であるエポキシ基）、
または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。］
［式（ＩＩ）において、母核部分は、式（Ｉ）の母核部分と同義である。
側鎖部分において、２１位の炭素上には０又は１つの、式；−ＯＹで表される基
（式中、Ｙ＝Ｈで表される水酸基、Ｙ＝ＣＯＲ3[Ｒ3は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｙ＝Ｒ4[Ｒ4は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｙ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、またはＹが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基）、
または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。］
＜３＞ ＜１＞に記載のタンパク質をコードするDNA。
＜４＞ 以下の(a)、(b)または(c)のいずれかのDNA；
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するDNA、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、かつステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質をコードするDNA、
（ｃ）配列番号1に記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質をコードするDNA。
＜５＞ ＜１＞または＜２＞記載の酵素タンパク質と、該酵素タンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質とを一つのタンパク質として機能するように結合させた融合タンパク質。
＜６＞ ＜３＞または＜４＞に記載のDNAと、該DNAがコードするタンパク質が宿主細胞内で発現可能な発現制御領域とを含む組み換えベクター。
＜７＞ ＜６＞に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入した形質転換体。
＜８＞ 下記式（I）で表されるステロールと、下記(i)または(ii)を接触させることを特徴とする、下記式(II)で表される化合物の製造方法。
(i) ＜１＞または＜２＞に記載の酵素タンパク質と、該酵素タンパク質への電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物；
(ii) ＜５＞に記載の融合タンパク質；
Figure 2010079594
 ［式（Ｉ）及び式（II）の定義は＜１＞と同義である］
＜９＞ 下記式（I）で表わされるステロールと、下記(a)から(c)の何れかを接触させることを特徴とする、下記式（II）で表わされる化合物の製造方法。
（a）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、および該タンパク質への電子伝達活性があるフェレドキシンタンパク質および該フェレドキシンタンパク質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物
（b）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質、および該タンパク質への電子伝達活性があるフェレドキシンタンパク質およフェレドキシンタンパク質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物
（c）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質と、該酵素タンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質とを一つのタンパク質として機能するように結合させた融合タンパク質。
Figure 2010079594
 ［式（Ｉ）及び式（II）の定義は＜１＞と同義である］
＜１０＞ ＜８＞または＜９＞の方法において、さらにステロール３位酸化異性化酵素、ステロイド１７α位水酸化酵素、ステロイド２１位水酸化酵素、およびステロイド１１β位水酸化酵素を接触させ、ハイドロコルチゾンを生成させることを特徴とする＜８＞または＜９＞に記載の方法。
＜１１＞ 上記式（Ｉ）で表されるステロールが、コレステロール、4-コレステン-3-オン、7-デヒドロコレステロール、エルゴステロール、β-シトステロール、スティグマステロール、カンペステロール、デスモステロール、 (20S)-20-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(22R)-22-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、又は(20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンである、＜８＞〜＜１０＞のいずれかに記載の方法。
＜１２＞ 上記式（II）で表される化合物が、プレグネノロン、プロゲステロン又は７−デヒドロプレグネノロンである、＜８＞〜＜１１＞のいずれかに記載の方法。
＜１３＞ 上記式（I）で表わされるステロールが、グルコース、グリセリン、メタノール、エタノール、サッカロース、クエン酸、酢酸のいずれかから選択される原料と該原料を資化して上記式（I）で表されるステロールを生成する能力を有する酵母とを接触させることにより生成させたものである＜８＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１４＞ グルコース、グリセリン、メタノール、エタノール、サッカロース、クエン酸、酢酸のいずれかから選択される原料からハイドロコルチゾンを製造する方法であって、前記原料を含む培地で、上記原料から下記式（I）で表わされるステロールを生成する活性及びステロール３位酸化異性化酵素、ステロイド１７α位水酸化酵素、ステロイド２１位水酸化酵素、およびステロイド１１β位水酸化酵素を生成する活性を有し、かつ以下の（A）〜（E）のいずれかの特徴を有する酵母を培養することによる方法。
（A）＜１＞又は＜２＞に記載のタンパク質と、該酵素タンパク質への電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物を生成する活性を有する；
（B）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、および該タンパク質への電子伝達活性があるフェレドキシンタンパク質および該フェレドキシンタンパク質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物を生成する活性を有する；
(C)配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質、および該タンパク質への電子伝達活性があるフェレドキシンタンパク質およフェレドキシンタンパク質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物を生成する活性を有する；
（D）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質と、該酵素タンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質とを一つのタンパク質として機能するように結合させた融合タンパク質を生成する活性を有する；
(E) ＜１＞または＜２＞記載の酵素タンパク質と、該酵素タンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質とを一つのタンパク質として機能するように結合させた融合タンパク質を生成する活性を有する：
Figure 2010079594
 ［式（Ｉ）の定義は＜１＞と同義である］
本発明により提供される、ステロール化合物側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有する新規酵素蛋白質を用いることによって、医薬および医薬中間体として産業上有用な化合物であるプレグネノロン等およびハイドロコルチゾンを効率的に製造することが可能になった。一般に動物由来のP450sccは、微生物を宿主として発現させると不溶性蛋白質となり、活性体として取得することは困難であるが、本発明により初めて提供される微生物由来のP450sccは、宿主として微生物を用いて発現させた場合に可溶性蛋白質となり容易に活性体として得られることから、産業上の有用性は高い。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛋白質
本発明によれば、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの蛋白質（以下、「CYPSS204A」と称することがある）が提供される。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質。
好ましくは、本発明の蛋白質は、ステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性について、基質濃度を10μＭから100μＭに上昇させた場合の活性の低下率が30％以下である。
本発明において、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１もしくは数個」とは、例えば、１から20個程度を意味し、好ましくは１から10個程度を意味し、さらに好ましくは1から5個程度を意味する。
本発明の酵素蛋白質は、さらに、以下の理化学的性質を有する。
作用：下記式（I）で表されるステロールに作用し、ステロール側鎖部分の20位と22位の炭素−炭素結合を切断する活性により該結合を切断して下記式（II）で表される化合物を生成する。
基質特異性：該酵素蛋白質を産生する微生物を、4-コレステン-3-オンまたはコレステロールを100μg/ml含む水溶液に28℃で5時間反応させたときの、4-コレステン-3-オンからプロゲステロンへの変換反応率が10％以上（好ましくは30％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、特に好ましくは70％以上）であり、かつコレステロールからプレグネノロンへの変換率が10％以上（好ましくは30％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、特に好ましくは６５％以上）である。
Figure 2010079594
［式（Ｉ）において、母核部分は、ステロイド類が有するＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ環からなる構造をもち、その１位から１７位（１０位と１３位を除く）のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置に炭素−炭素不飽和結合を有しており、その１位から１９位（１０位と１３位をのぞく）のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置の炭素上には、それぞれ独立して、 式；−ＯＸで表される基（式中、Ｘ＝Ｈで表される水酸基、Ｘ＝ＣＯＲ1[Ｒ1は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｘ＝Ｒ2[Ｒ2は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｘ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、Ｘが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基、またはＸが当該炭素の隣接炭素原子であるエポキシ基）、 または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。
側鎖部分は、Ｒは、環状部分を有していてもよい炭素数１０以下の直鎖状のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、または環状部分を有していてもよい炭素数１０以下の分岐状のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、 20位、２１位およびＲ内のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置の炭素上には、それぞれ独立して、式；−ＯＹで表される基（式中、Ｙ＝Ｈで表される水酸基、Ｙ＝ＣＯＲ3[Ｒ3は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｙ＝Ｒ4[Ｒ4は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｙ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、Ｙが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基、またはＹが当該炭素の隣接炭素原子であるエポキシ基）、または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。］
［式（ＩＩ）において、母核部分は、式（Ｉ）の母核部分と同義である。
側鎖部分において、２１位の炭素上には０又は１つの、式；−ＯＹで表される基（式中、Ｙ＝Ｈで表される水酸基、Ｙ＝ＣＯＲ3[Ｒ3は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｙ＝Ｒ4[Ｒ4は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｙ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、またはＹが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基）、 または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。］
式（Ｉ）は、好ましくは、コレステロール、4-コレステン-3-オン、7-デヒドロコレス
テロール、エルゴステロール、β-シトステロール、スティグマステロール、カンペステ
ロール、デスモステロール、 (20S)-20-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(22R)-22-
ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンであり、より好ましくは、コレステロール、4-コレステン-3-オン、7-デヒドロコレステロールである。
Figure 2010079594
式（ＩＩ）は、好ましくは、プレグネノロン、プロゲステロン、7-デヒドロプレグネノロンである。
Figure 2010079594
本発明の蛋白質のその他の性質としては、7-デヒドロコレステロールから７−デヒドロプレグネノロンへの変換率が、10％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは25％以上、エルゴステロールから７−デヒドロプレグネノロンへの変換率は、１％以上、好ましくは２％以上、β-シトステロールからプレグネノロンへの変換率は、10％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは30％以上、さらに好ましくは40％以上、スティグマステロールからプレグネノロンへの変換率は、1％以上、好ましくは２％以上、より好ましくは５％以上である。また、カンペステロールからプレグネノロンへの変換率は、10％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは25％以上、デスモステロールからプレグネノロンへの変換率は10％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、特に好ましくは65％以上）、(20S)-20-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンからプロゲステロンへの変換率は10％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは30％以上、さらに好ましくは40％以上、(22R)-22-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンからプロゲステロンへの変換率は10％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは30％以上、さらに好ましくは40％以上）、(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンからプロゲステロンへの変換率は10％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは30％以上、さらに好ましくは35％以上、(20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンからプロゲステロンへの変換率は10％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは30％以上、さらに好ましくは40％以上である。また、ラノステロールの変換率は0％である。
本発明の酵素蛋白質は、好ましくは、さらに以下の理化学的性質を有していてもよい。至適ｐＨ：７．５〜８．０、作用至適温度：１５〜20℃、熱安定性：20℃で140時間保存後に30％以上の酵素蛋白質活性が保持される。分子量はアミノ酸配列からの推定分子量が５３〜５４ＫＤａであり、ＳＤＳ電気泳動による測定で５０〜５６ＫＤａである。また、反応速度パラメーターである最大速度（Vmax)が50mmol/分/mol以上、基質濃度を10μMから100μMに上昇させた場合の活性の低下率が30%以下である。
VmaxおよびKmは、基質濃度を0.1〜500μMで4-コレステン-3-オンの変換を行い基質濃度と酵素蛋白質活性の関係を調べることによって求めることができる。また、基質濃度を10μＭから100μＭに上昇させた場合の活性の低下率も、基質濃度を0.1〜500μMで4-コレステン-3-オンの変換を行い基質濃度と酵素蛋白質活性の関係を調べることによって求めることができる。具体的には、反応液は1 mlで220 pmolのCYP204A1もしくは250 pmolのCYPSS204A、96μg/mlほうれん草由来フェレドキシン、0.1 U/mlほうれん草由来フェレドキシン還元酵素蛋白質、3 U/mlグルコースデヒドロゲナーゼ、60 mMグルコース、2 mM NADHと2 mM NADPHとなるように調製し、Tris-HClでpH 7.5にする。基質である4-コレステン-3-オンは終濃度が0.1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500μMとなるようにDMSOに溶かしたものを20μl加える。反応はNADHとNADPHの添加により開始し、200 rpm、15℃で60分間行うことができる。
本発明の酵素蛋白質の由来は、特に限定されるものではないが、好ましくは、微生物に由来する酵素蛋白質であり、例えば、Sphingomonas subterranea、最も好ましくは、Sphingomonas subterranea NBRC16086が挙げられる。また、上記アミノ酸配列を有するかまたは上記性質を有するものであれば、Novosphingobium aromaticivorans 、例えば、Novosphingobium aromaticivorans ATCC 700278等由来のものでもよい。
（２）本発明の酵素蛋白質の取得方法
本発明の酵素蛋白質の、例えば、上記したSphingomonas subterranea又はNovosphingobium aromaticivorans等の微生物から、通常の蛋白質の抽出、精製方法によって得ることができる。抽出方法として具体的には、例えばハサミ等による細片化、ホモジナイズ、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。また、精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、ザイモグラフィー等や、これらの組合わせ等の処理操作が挙げられる。
また、下述の本発明の蛋白質をコードするDNAを公知の方法に従ってクローニングし、適当な宿主に導入して、発現させることにより本発明の酵素蛋白質を得ることができる。例えば、本明細書に記載した本発明の酵素蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列の情報に基づいて本発明の酵素蛋白質の遺伝子に特異的なプローブ又はプライマーを設計し、当該プローブ又はプライマーを用いてSphingomonas subterranea又はNovosphingobium aromaticivorans等の微生物のDNAライブラリー（例えば、ゲノムDNAライブラリー、又はｃDNAライブラリー等）から本発明の酵素蛋白質をコードするDNAを単離又は増幅し、これを遺伝子組換え技術によりベクターに入れ、宿主細胞に導入し、そこで発現させることにより、本発明の酵素蛋白質を得ることができる。
（３）本発明の蛋白質をコードするDNA、組み換えベクター及び形質転換体
本発明によれば、上記した本発明の蛋白質をコードするDNAが提供される。本発明のDNAの具体例としては、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するDNA、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、かつステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上である蛋白質をコードするDNA、
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上である蛋白質をコードするDNA。
本発明の酵素蛋白質をコードする遺伝子は、Sphingomonas subterranea等及びNovosphingobium aromaticivoransからこの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、又は前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって、Sphingomonas subterranea及びNovosphingobium aromaticivorans等の微生物のDNAライブラリーから単離することもできる。また、本発明の酵素蛋白質の遺伝子は、天然の微生物から分離されたもののみならず、アミノ酸配列の変更が無いように当該酵素蛋白質を発現させる宿主細胞において適切に発現されるようコドンを変更して合成されたものであってもよい。
本発明において、「１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列」における「１もしくは数個」とは、例えば、1から30個程度を意味し、好ましくは１から20個程度を意味し、さらに好ましくは１から10個程度を意味し、さらに好ましくは１から5個程度を意味する。本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列」とは、配列番号１に記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するDNAとBLAST解析で90％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列を含むDNA等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が40〜70℃、好ましくは60〜65℃等で反応を行い、塩濃度が15ｍＭ〜300ｍＭ、好ましくは15ｍＭ〜60ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有する遺伝子の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（宝酒造）や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
本発明によればさらに、本発明のDNAを有する組み換えベクターが提供される。組み換えベクターは、該DNAがコードする蛋白質が宿主細胞内で発現可能な発現制御領域とを含む組み換えベクターを意味する。具体的には、通常、本発明のDNAが宿主微生物に適したプロモーターとともに、このプロモーターの下流に本発明のDNAのコード領域の５'末端側が連結されたベクターである。ベクターとしては、宿主微生物内で複製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プラスミドベクター、シャトルベクター、およびファージベクターが挙げられる。具体的なプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ322、ｐＵＣ18、ｐＨＳＧ298、ｐＵＣ118、ｐＳＴＶ28、ｐＴＷＶ228、ｐＨＹ300ＰＬＫ（宝酒造社製等）、ｐＫＫ223-3、ｐＰＬ−ラムダインデューシブルエクスプレッションベクター（ファルマシア社製等）、大腸菌−コリネ型細菌のシャトルベクターとしては、例えば、pCRY30(特開平3-210184号公報)、pCRY21(特開平2276575号公報)、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KEおよびpCRY3KX、pCRY2およびpCRY3(特開平1-191686号公報)、pAM330（特開昭58-67679号公報）、 pHM1519（特開昭58-77895号公報）、 pAJ655、pAJ611およびpAJ1844（特開昭58-192900号公報）、 pCG1（特開昭57-134500号公報）、 pCG2（特開昭58-35197号公報）、 pCG4およびpCG11（特開昭57-183799号公報）等、あるいはこれらの誘導体等を挙げることができる。また、ファージベクターとしては、（λFixIIベクタ−（Stratagene社製等）等を挙げることができる。
一方、酵母等の真菌類を用いる場合は、染色体組込み型プラスミドのうち、多コピーが染色体に組み込まれるベクターを用いる方法（Sakai, A. et al.,(1991) Biotechnology (N Y) 9, 1382-1385）および非組込み型プラスミドのうち２μｍプラスミド由来のpESCベクター（STRATAGENE社製）やpAURベクター（タカラバイオ社製）等の多コピー型プラスミド等を用いることができる。
酵母類を宿主とし、本発明の酵素蛋白質をコードするDNAを発現させるためのプロモーターとして、フォスフォグリセレートキナーゼをコードするPGK1遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするADH1遺伝子、あるいはジェネラルアミノ酸パーミアーゼをコードするGAP1遺伝子等の恒常的発現プロモーターを利用できるほか、GAL1/GAL10 (Johnston, M. et al., (1984) Mol. Cell. Biol. 4(8), 1440-1448)等の誘導型プロモーターを利用することもできる。これらは、グルコース非存在下において、ガラクトースを添加することにより発現誘導がされる。
本発明の酵素蛋白質をコードするDNAを発現させるためのプロモーターは、宿主微生物が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、それに限られるものではなく、本発明の酵素蛋白質の遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。具体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモーター、λファージ由来のＰＬプロモーター、トリプトファンラクトース雑種（tac）プロモーター（H. A. Bose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., Vol.80, p.21 (1983)）等が挙げられる。これらのプロモーターのうち、発現効率を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンのプロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を添加することにより遺伝子発現を誘導することができる。
本発明によれば、さらに本発明のDNA又は組換えベクターを宿主細胞に導入した形質転換体が提供される。本発明のDNA又は組み換えベクターを導入する宿主としては、特に限定されるものではないが、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、例えば、大腸菌、放線菌（Actinomycetes）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌、サーマス（Thermus）属細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌、サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、ピキア（Pichia）属酵母、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属酵母、キャンディダ（Candida）属酵母、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母、デバリヨミセス（Debaryomyces）属酵母、ヤロウィア（Yarrowia）属酵母、クリプトコッカス（Cryptococcus）属酵母、キサントフィロミセス（Xanthophyllomyces）属酵母、アスペルギルス（Aspergillus）属カビ、モルティエレラ（Mortierella）属カビ、フザリウム（Fusarium）属カビ、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属等を好適に用いることができる。好ましくは、宿主細胞は大腸菌、放線菌、シュードモナス属細菌、サッカロミセス属酵母である。
具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、セラチア・マーセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、デバリヨミセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lypolitica）、クリプトコッカス・カバタス（Cryptococcus curvatus）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nigar）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）、モルティエレラ・バイニエリ（Mortierella bainieri）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）カニンガメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、フザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）、シゾキトリウム・リマシアム（Schizochytrium limacium）、スラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum）等を用いることができる。
上記宿主微生物への遺伝子の導入法としては、コンピテントセル法［Journal of Molecular Biology, Vol.53, p.159 (1970)］、酢酸リチウム法[Ito, H. et al. J. Bacteriol., Vol.153, p.163 (1983)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, p.1929 (1978)]、パルス波通電法［J. Indust.Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)］等による形質転換法、ファージを用いた形質導入法［E. Ohtsubo, Genetics, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)］、細胞融合法［M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)］等を用いることができる。これらの方法から、宿主微生物に適した方法を適宜選択すればよい。
上記のような発現ベクターを用いた発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明の酵素蛋白質をコードするDNAを、宿主微生物の染色体中に直接導入する相同組換え技術あるいはトランスポゾンや挿入配列等を用いて導入する技術によっても発現させることができる。従って、本発明の形質転換体は、本発明の酵素蛋白質が発現していればよく、遺伝子の導入の方法は限定されない。
（４）本発明の形質転換体を用いた本発明の酵素蛋白質の製造
本発明によれば、上記（３）のようにして得られる形質転換体を培養し、その培養物から本発明の酵素蛋白質を採取することができる。
形質転換体の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
培養は、通常、通気撹拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
培養物からの酵素蛋白質の採取は、酵素蛋白質の活性を指標として公知の採取方法により行うことができる。酵素蛋白質は必ずしも均一にまで精製される必要はなく、用途に応じた精製度まで精製すればよい。
本発明で用いられる粗精製画分又は精製酵素蛋白質としては、形質転換体を培養した培養液から分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体を超音波、圧擦等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られる、本発明の酵素蛋白質 を含有する抽出物、該抽出物に更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られる本発明の酵素蛋白質の粗酵素蛋白質標品又は精製した酵素蛋白質標品を使用してもよい。さらに、上記菌体、破砕物、抽出物、粗精製画分または精製酵素蛋白質を担体に固定化したものも使用することができる。
これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精製酵素蛋白質の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。例えば、菌体を担体に固定化する場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。
（５）本発明の酵素蛋白質等を用いたプレグネノロン、プロゲステロン、７−デヒドロプレグネノロンの製造方法
本発明によれば、上記した式（Ｉ）で表されるステロールに、(i) 上記した本発明の酵
素蛋白質（CYPSS204A）と、該酵素蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質の混合物、あるいは(ii)本発明の酵素蛋白質と該酵素蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質の融合蛋白質と接触させることにより式（II）の化合物を製造することができる。
本発明においては、上記蛋白質以外にも、（a）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（CYP204A1）、および該蛋白質への電子伝達活性があるフェレドキシン蛋白質および該フェレドキシン蛋白質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素蛋白質の混合物、（b）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上である蛋白質、および該蛋白質への電子伝達活性があるフェレドキシン蛋白質およフェレドキシン蛋白質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素蛋白質の混合物、（c）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上である蛋白質と、該酵素蛋白質に電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質とを一つの蛋白質として機能するように結合させた融合蛋白質を式（I）のステロールに接触させることにより式（II）で表される化合物を製造することができる。
ここで、電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質は両者の活性を有する1種の蛋白質でもよい。例えば、Bacillus megateriumのP450-BM3遺伝子のP450還元酵素ドメインを酵素蛋白質（CYP204A1）に連結し、人工的に作製した融合蛋白質を利用できる（Helvig, C. and Capdevila, J. H., Biochemistry, (2000）39, 5196-5205)。また、上記蛋白質と式（Ｉ）で表されるステロールとの接触は、酵素蛋白質を添加することでもよいし、上記蛋白質を産生する微生物またはその処理物、上記形質転換体またはその処理物を接触させることでもよい。
また、フェレドキシンとフェレドキシン還元酵素としては、フェレドキシン還元酵素は、例えば以下の中から選択される。ホウレン草由来のフェレドキシンレダクターゼ、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来プチダレドキシンレダクターゼ、動物由来のアドレノドキシンレダクターゼ、スフィンゴモナス サブテラニア（Sphingomonas subterranea）由来フェレドキシンレダクターゼ、ノボスフィンゴビウム アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）由来フェレドキシンレダクターゼ、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来フラボドキシンレダクターゼやフェレドキシンレダクターゼ、、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来フェレドキシンレダクターゼ、またはその他のフェレドキシンレダクターゼ。フェレドキシンは、例えば以下の中から選択される；ホウレン草由来のフェレドキシン、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来プチダレドキシン、動物由来のアドレノドキシン、スフィンゴモナス サブテラニア（Sphingomonas subterranea）由来フェレドキシン、ノボスフィンゴビウム アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）由来フェレドキシン、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来フラボドキシンやフェレドキシン、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来フェレドキシン、またはその他のフェレドキシン型蛋白質。
反応の方法は特に限定されず、本発明の酵素蛋白質（CYPSS204A）及びCYP204A1又は該酵素蛋白質を産生する微生物等を含む液体に、基質となる式（Ｉ）で表されるステロールを加え、適当な温度、例えば、10℃から40℃程度）で反応させることができる。これにより、プレグネノロン、プロゲステロン、又は7-デヒドロプレグネノロン等の式(II)で表される化合物を製造することができる。あるいは本発明の酵素蛋白質を産生する微生物が，内在的に式(I)で表されるステロールを産生する場合でも，これを反応させて式(II)で表される化合物を製造することができる。
また、反応混合物から目的の式（ＩＩ）で表される化合物を分画する方法は特に限定されず、当業者に公知の分離又は精製のための手法を用いることができる。例えば、溶媒抽出、晶析、樹脂吸着、カラムクロマトグラフィー等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
（６）ハイドロコルチゾンおよびその誘導体の製造方法
上記式（II）で表される化合物の製造方法において、さらにステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質、ステロイド１１β位水酸化酵素蛋白質、ステロール３位酸化異性化酵素蛋白質、およびステロールΔ７−還元酵素蛋白質を接触させることによって、ハイドロコルチゾンを製造することができる。
ステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質、ステロイド１１β位水酸化酵素蛋白質、ステロール３位酸化異性化酵素蛋白質、ステロールΔ
７−還元酵素蛋白質の、上記式（II）で表される化合物あるいは該化合物から上記の蛋白質のいずれかの酵素反応による変換物への接触は、該酵素蛋白質を添加することでもよいし、上記蛋白質を産生する微生物またはその処理物、上記形質転換体またはその処理物を接触させることでもよい。ここで、ステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質、ステロイド１１β位水酸化酵素蛋白質、ステロール３位酸化異性化酵素蛋白質は、例えば、Molecular and Cellular Endocrinology 1990, 73, 73-80に記載のものが用いられる。またステロールΔ７−還元酵素蛋白質は、Journal of Biological Chemistry 1996, 271, 10866-10873記載のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のもの、あるいはApplied and Environmental Microbiology 2007, 73, 1736-1741記載のモルティエレラ（Mortierella）属カビ由来ものが用いられる。ステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質は、例えば、ウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c17が好ましい。また、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質は、ウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c21が好ましく、ステロイド１１β位水酸化酵素蛋白質としてはウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c11やクルブラリア・ルナタ（Curvularia lunata）由来P-450lun等が好ましい。さらにステロール３位酸化異性化酵素蛋白質はウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来３β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（3βHSD）やストレプトミセス（Streptomyces）属細菌由来コレステロール酸化酵素が好ましく、ステロールΔ７−還元酵素蛋白質はシロイヌナズナ由来ＮＡＤＰＨ−ステロールΔ７−還元酵素モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）由来ステロールΔ７−還元酵素（MoDELTA7SR）が好ましい。
さらに、グルコース、サッカロース、グリセリン、メタノール、エタノール、クエン酸、酢酸のいずれかから選択される原料を含む培地で、上記原料から上記式（I）で表わされるステロールを生成する活性及びステロールΔ７−還元酵素、ステロール３位酸
化異性化酵素、ステロイド１７α位水酸化酵素、ステロイド２１位水酸化酵素、およびステロイド１１β位水酸化酵素を生成する活性を有し、かつ以下の（A）〜（E）のいずれかの特徴を有する酵母、またはカビを培養することによる方法も本発明のハイドロコルチゾンの製造方法として好ましく用いられる。
（A）請求項１又は２に記載の蛋白質と、該酵素蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質の混合物を生成する活性を有する、
（B）請求項１又は２に記載の蛋白質と、該酵素蛋白質に電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質とを一つの蛋白質として機能するように結合させた融合蛋白質を生成する活性を有する、
（C）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、および該蛋白質への電子伝達活性があるフェレドキシン蛋白質および該フェレドキシン蛋白質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素蛋白質の混合物を生成する活性を有する、
（D）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上である蛋白質、および該蛋白質への電子伝達活性があるフェレドキシン蛋白質およフェレドキシン蛋白質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素蛋白質の混合物を生成する活性を有する、
（E）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上である蛋白質と、該酵素蛋白質に電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質とを一つの蛋白質として機能するように結合させた融合蛋白質を生成する活性を有する。
本方法において、該蛋白質を生成する活性を有するとは、該蛋白質をコードするDNAを上記の発現ベクターに挿入して、上記酵母またはカビを形質転換した形質転換酵母または形質転換カビを用いる方法が好ましく用いられる。
ここで、好ましく用いられる酵母またはカビとしては、サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、ピキア（Pichia）属酵母、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母、ヤロウィア（Yarrowia）属酵母、アスペルギルス（Aspergillus）属カビ、モルティエレラ（Mortierella）属カビがあげられる。より好ましくは、サッカロミセス属酵母があげられる。具体的にはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり、より具体的には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（JP2004-528827 A1）株、以下同様に、FY1679-18b株（JP2004-528827 A1）、KA311A株(FERM:P-19053)、YPH499株(ATCC#204679)、YPH500株(ATCC#204680)等が挙げられ、それぞれの酵素蛋白質をコードするDNAは、pESC-LEU（Stratagene社）、等の発現ベクターや酵母菌の染色体に挿入されていることが好ましい。また、これらの酵母またはカビが、以下（1）−(6)の性質のいずれかまたはすべてを持つことが好ましい。（1）ステロール−２２デサチュラーゼ蛋白質をコードする遺伝子またはその発現を制御する領域のDNA配列を改変することで内在性のステロールの２２位と２３位の間が不飽和化されない、（2）ＮＡＤＰ−シトクロムＰ４５０還元酵素蛋白質の発現が本蛋白質をコードする遺伝子をその発現制御領域とともに１コピー以上宿主細胞に導入することで、強化されている、（3）ステロールエステル化酵素蛋白質をコードする遺伝子またはその発現を制御する領域のDNA配列を改変することで内在性のステロールがエステル化されない、（4）ステロールエステル加水分解酵素の発現が本蛋白質をコードする遺伝子をその発現制御領域とともに１コピー以上宿主細胞に導入することで、強化されている、（5）ステロイド１７α水酸化酵素、ステロイド２１位水酸化酵素、ステロイド１１β位水酸化酵素に電子を伝達するフェレドキシン型蛋白質および該蛋白質へ電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質のそれぞれをコードする遺伝子をその発現制御領域とともに宿主細胞に導入することで、該蛋白質の発現が強化されている、（6）ステロール−２４メチル基転移酵素蛋白質をコードする遺伝子またはその発現を制御する領域のDNA配列を改変することで内在性のステロールの２４位にメチル基が存在しない。
反応混合物からハイドロコルチゾンを分画する方法は特に限定されず、当業者に公知の分離又は精製のための手法を用いることができる。例えば、溶媒抽出、晶析、樹脂吸着、カラムクロマトグラフィー等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
また、上記で製造したハイドロコルチゾンからは、図２及び図３に記載の誘導体を公知の方法で製造することができる。さらに、かくして製造されたハイドロコルチゾンおよびどの誘導体は、それ自体既知の方法により試験管内、あるいは生体内における薬理学的または生理学的試験により、その医薬としての活性や安全性のスクリーニングを行なうことにより該疾病治療薬とすることができる。この場合、上記工程により得た化合物を有効成分とする医薬組成物を製造する方法も本発明に含まれる。
具体的には、それ自体を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。かくして得られる医薬化合物はそれ自体を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、0.01〜90重量％の間で変動され得る。
本発明で得られた医薬組成物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、液剤等の剤形として経口的に投与してもよいし、あるいは薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁剤形等の注射剤として、例えば静脈内投与、筋肉内投与、局所内投与、皮下投与してもよい。また坐薬や舌下錠、経鼻、経肺製剤等の粘膜投与、さらには軟膏や貼付剤等の外用剤としての投与も可能である。経口、非経口の組成物を調製する場合には、有機または無機の固体または液体の担体、希釈剤とともに通常用いられる単位容量形態で混和することによって行うことができる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
経口投与および粘膜投与のための固形製剤を製造する際に用いられる賦形剤としては、例えば乳糖、ショ糖、デンプン、タルク、セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム等が用いられる。経口投与のための液体製剤、すなわちシロップ剤、懸濁剤、液剤等は、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水、植物油等を含む。この製剤は、不活性な希釈剤以外に補助剤、例えば湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤、安定剤等を含むこともできる。注射剤、粘膜投与剤等の製造に用いられる溶剤または懸濁化剤としては、例えば水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、オレイン酸エチル、レシチン等が挙げられる。坐剤に用いられる基剤としては、例えばカカオ脂、乳化カカオ脂、ラウリン脂、ウィテップゾール等が挙げられる。外用剤の製造には、溶解剤または溶解補助剤としてアルコ−ル、脂肪酸エステル類、プロピレングリコール等が、粘着剤としてカルボキシビニルポリマ−、多糖類等が、乳化剤として界面活性剤等などが使用される。
以下の実施例において一般的な実験方法はSambrookらの実験書（Sambrook, J., and Russel, D. W.: Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001）に従った。
実施例１：Sphingomonas subterranea NBRC16086由来P450scc(CYPSS204A)とフェレドキシンをコードするDNAの取得
Sphingomonas subterranea NBRC 16086（独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門）をL培地(1％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％NaCl、0.1％グルコース、pH7.2 )に接種して30℃で一晩培養して得られた菌体からゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAの抽出にはDNA抽出キットISOPLANT (和光純薬工業社製)を用いた。このゲノムDNAよりプライマーCYP-1F（配列番号５）およびプライマーCYP-2R（配列番号６）を用い、LA Taq ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）でCYPSSをコードするDNA（これを「CYPSS204A遺伝子」と称することがある）の一部をポリメラーゼ連鎖反応(PCR) を行って増幅した。この時の温度条件は、94℃/3分、(94℃/30秒, 55℃/30秒, 72℃/90秒）30サイクル、72℃/5分であった。
この反応の結果、増幅した1.0 kbの遺伝子断片の塩基配列を決定した。この塩基配列情報を基にインバースPCRを行って上記CYP204A1遺伝子およびその下流に存在するフェレドキシン遺伝子を含む1.8 kb DNA領域の全塩基配列（配列番号３)を決定した。また、CYPSS204A遺伝子（配列番号３の１番目から１４１９番目）の塩基配列を配列番号１に示し、CYP204A1のアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号1430から1762がフェレドキシンを示す。
実施例２：Sphingomonas subterranea NBRC 16086由来P450scc（CYPSS204A）の大腸菌発現株BP215の作製
実施例１で得られたSphingomonas subterranea NBRC 16086ゲノムDNAよりCYPSS204Aおよびその下流に存在するフェレドキシン遺伝子を含むDNA領域をプライマーCYP-3F（配列番号７） およびプライマーCYP-4R（配列番号８）を用いて、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製) でPCRにより増幅した。この時の温度条件は、95℃/5分、（98℃/30秒, 60℃/30秒, 68℃/2分）30サイクル、68℃/10分であった。
増幅された1.8 kb DNA断片をQIAquick PCR purification Kit (キアゲン社製)を用いて精製し、Nde IおよびSpe Iで消化したのち、大腸菌発現ベクターpT7NS-camAB（国際公開公報2003/087381パンフレット）にT4 DNAリガーゼを用いて連結して、大腸菌DH5aに形質転換することで、プラスミドpCYPSS-camABを構築した。このプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に形質転換して得られた菌株をBP215と命名した。
実施例３：Novosphingobium aromaticivorans ATCC 700278からP450scc（CYP204A1）をコードするDNAの取得と大腸菌発現株BP172の作成
Novosphingobium aromaticivorans （ATCC 700278）をL培地に接種して30℃で2日間培養して実施例１と同様に得られた菌体からゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAよりプライマーCYP-5F（配列番号９） およびプライマーCYP-6R（配列番号１０）及びLA Taq ポリメラーゼ (タカラバイオ社製)を用いてCYP204A1遺伝子およびその下流に存在するフェレドキシン遺伝子を含む断片を増幅した。この時の温度条件は、94℃/3分、（98℃/20秒, 63℃/30秒, 68℃/2分）30サイクル、72℃/5分であった。この1.8kbの塩基配列を配列番号４に示す。この塩基番号1〜1422がCYP204A1で1433〜1765がフェレドキシン遺伝子である。
この反応の結果増幅した、1.8 kb DNA断片をQIAquick PCR purification Kit (キアゲン社製)を用いて精製しし、Nde IおよびSpe Iで消化した後、大腸菌発現ベクターpT7-camABにT4 DNAリガーゼを用いて連結して、大腸菌DH5aに形質転換することで、プラスミドpCYP204A1-camABを構築した。このプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に形質転換して得られた菌株をBP172と命名した。CYP204A1遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２３に示す。
実施例４：CYP204A1遺伝子のBacillus megaterium での発現及び該菌体を用いた4-Cholesten-3-oneのプロゲステロンへの変換
実施例３で作製したpCYP204A1-camABを鋳型にしてプライマーCYP-7F（配列番号１１）およびCYP-8R（配列番号１２）及びKOD plus ポリメラーゼ (東洋紡社製)を用いてCYP204A1遺伝子およびその下流に存在するフェレドキシン遺伝子を含む断片を増幅した。この時の温度条件は、94℃/2分、（94℃/20秒、55℃/30秒, 68℃/3分）20サイクル、72℃/5分であった。
この反応の結果増幅した、CYP204A1遺伝子およびその下流に存在するフェレドキシン遺伝子を含む1.8 kb DNA断片をQIAquick PCR purification Kit (キアゲン社製)を用いて精製し、Nhe IおよびBam HIで消化した後、Bacillus megaterium発現ベクターpHW1520 (MoBiTec社製)にT4 DNAリガーゼを用いて連結して、大腸菌DH5aに形質転換することで、プラスミドpXYL204CBを構築した。このプラスミドをBacillus megateriumコンピテント細胞(MoBiTec社製)に形質転換して菌株pXYL204CBを得た。
この菌株を、テトラサイクリン10mg/ml(終濃度)を添加したTB培地2 mlに植菌し、37℃、16時間、220rpmで振とう培養した。この前培養液250μlを同様のTB培地2 5 mlに加え、37℃で2.5時間振とう培養後、50 % Xylose 250μlを添加し、30℃、125 rpmで6時間振とう培養した。この培養液から遠心分離により回収した菌体を変換用緩衝液(50mM KPB、2%グリセロール[pH 7.4]) 5 mlに懸濁し、菌体懸濁液とした。
この菌体懸濁液2mlに4-Cholesten-3-oneメタノール溶液(100 mg/ml) 2μlを加えて、振とう(220rpm)しながら30℃で24時間インキュベートした。その後、この反応液に2 mlの酢酸エチルを加えて、ボルテックスした後、遠心機で4,000 rpmで10分間遠心した。得られた酢酸エチル相1.5mlを濃縮乾固し、その後200μlのメタノールに溶解しHPLC分析に供した。この結果、24.5％の変換率で4Cholestene-3-oneをProgesteroneに変換した。HPLC条件は以下のとおりである。Column：Inertsil ODS-3 4.6 X 50 mm、flow rate：1.2ml/min、temp.：40℃、detect：PDA(240nm)、gradient： 0/ 4/ 5/5.5(min)、40/100/100/40(%B)。
実施例５：酵素蛋白質の諸性質
（１）発現ベクターの構築
CYP204A1、CYPSS、CYP11A遺伝子を含むDNA断片を増幅する為に以下のプライマーを作成した。CYP204A1-1F（配列番号１３)、CYP204A1-2R（配列番号１４)、CYPSS-1F（配列番号１５）、CYPSS-2R（配列番号１６）、CYP11A-1F（配列番号１７）、CYP11A-2R（配列番号１８）。次に、これらのプライマーとpCYP204A1-camAB、pCYPSS-camAB、ウシ由来のP450sccであるCYP11Aを挿入したpCYP11A-ARX（参考例１参照）を鋳型としてKOD plus (TOYOBO)を用いてPCR反応を行った。この時の温度条件は、95℃/3分、（98℃/20秒、55℃/30秒、72℃/2分）25サイクル、72℃/5分である。
この反応の結果、CYP204A1、CYPSS、CYP11Aにおいて約1.4 kbpの大きさのDNA断片（以下、DNA断片-A, B, Cという）が増幅された。Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (PROMEGA)で精製し、NdeIとXhoIにより消化した後に、pET22bにDNA Ligation Kit ver 2.1 (TaKaRa)により連結し、プラスミドpET22-CYP204A1、pET22-CYPSS、pET22-CYP11Aを得た。
（２）CYP204A1、CYPSS204A、CYP11A誘導菌体の作成
上記（１）で調製したプラスミドpET22-CYP204A1、pET22-CYPSS、pET22-CYP11Aを用い、大腸菌BL21 (DE3)を形質転換した。こうして得られた形質転換体を50μg/mlのカルベニシリンを含む1 mlのTB培地に植菌し、37℃で14時間培養した。この1 mlの培養液を50μg/mlのカルベニシリンとOvernight Express Autoinduction system 1 (Merck)を含む100 mlのTB培地に植菌し、25℃で24時間培養および目的蛋白質の誘導を行った。遠心により菌体を回収し、20 mlのCV buffer (50 mM KPB (Potassium phosphate buffer), 10% Glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol, 1 mM D-Glucose)に懸濁して-80℃で細胞懸濁液を保存した。
（３）無細胞抽出液の調製
上記（２）で調製した細胞懸濁液20 mlに680μlのX10 Bug Buster (Novagen)と20μlのBenzonase (Novagen)と2 mlの40 mg/ml Lysozymeを加えて、30℃で30分間攪拌して細胞を破砕し、遠心により無細胞抽出液を得た。得られた約20 mlの無細胞抽出液を1 LのBufferR (20 mM KPB pH 7.4, 20% glycerol)で2回透析し、その間に析出した沈殿を遠心により除いた。ここで上清として得られた無細胞抽出液を以後の実験に使用した。
（４）一酸化炭素結合スペクトル解析による各種P450sccの発現確認
得られた無細胞抽出液を2つに分けて片方に一酸化炭素をバブリングした。一酸化炭素バブリング有無の両方のサンプルにジチオナイトを加え、差スペクトルを測定した。CYP204A1とCYPSS204Aでは450 nm付近に極大吸収を持つピークが得られ、P450sccの発現が確認されたが、CYP11Aでは得られず活性型のP450がサンプル中に存在しないことが示唆された。この結果より以後の実験はCYP204A1とCYPSSで行うこととした。
（５）至適pHの検討
上記（３）で調製した無細胞抽出液を用いて、様々なpHで4-コレステン-3-オンの変換を行った。反応液は1 ml BufferR中で215 pmol/ml CYP204A1もしくは367 pmol/ml CYPSS204A、64μg/mlほうれん草由来フェレドキシン、0.1 U/mlほうれん草由来フェレドキシン還元酵素蛋白質、3 U/mlグルコースデヒドロゲナーゼ、60 mMグルコース、50μg/ml 4-Cholesten-3-one、2 mM NADHと2 mM NADPHとなるように調製し、1 mlの反応液中に様々なpHの200 mM Bufferを562μl加えてpHを調整した。反応はNADHとNADPHの添加により開始し、200 rpm、30℃で14時間行った。1.5 ml酢酸エチルを添加して反応を止め、抽出を行い、再度、0.75 ml酢酸エチルで抽出を行った。得られた酢酸エチル相をエバポレーターにより乾固し、200μlメタノールで残渣を溶解した。HPLC分析によりプロゲステロンの検出を行った。各pH条件における4-コレステン-3-オンからプロゲステロンへの酵素蛋白質活性を表１に示した。酵素蛋白質活性は1時間、1 molP450あたりのプロゲステロン生成量gで示した。この結果より、CYP204A1とCYPSSはTris-HCl pH 7.5で最も活性が高いことが示された。
（６）至適温度の検討
上記（３）で調製した無細胞抽出液を用いて、様々なpHで4-コレステン-3-オンの変換を行った。反応液は1 mlで215 pmol/ml CYP204A1もしくは391 pmol/ml CYPSS、64μg/mlほうれん草由来フェレドキシン、0.1 U/mlほうれん草由来フェレドキシン還元酵素蛋白質、3 U/mlグルコースデヒドロゲナーゼ、60 mMグルコース、50μg/ml 4-コレステン-3-オン、2 mM NADHと2 mM NADPHとなるように調製し、Tris-HClでpH 7.5にした。反応はNADHとNADPHの添加により開始し、200 rpm、温度条件をそれぞれ10, 15, 20, 25, 30℃として4時間行った。1.5 ml酢酸エチルを添加して反応を止め、抽出を行い、再度、0.75 ml酢酸エチルで抽出を行った。得られた酢酸エチル相をエバポレーターにより乾固し、200μlメタノールで残渣を溶解した。HPLC分析によりプロゲステロンの検出を行った。各温度条件における4-コレステン-3-オンからプロゲステロンへの酵素蛋白質活性を表１に示した。この結果より、CYP204A1は15から20℃で、CYPSSは15℃で最も活性が高いことが示された。
Figure 2010079594
（７）pH安定性試験
上記（３）で調製した0.5 mlの無細胞抽出液と様々なpHの0.5 mlの50 mM Bufferと混合してpHを測定して6℃で140時間保存した。酵素蛋白質液のpHはAcB (acetate buffer) pH 6.0, KPB pH 6.7, KPB pH 7.2, KPB pH 7.6, TES pH 7.5, Tris-HCl pH 8.1, Tris-HCl pH 8.9であった。調製した様々なpHの無細胞抽出液を用いて4-コレステン-3-オンの変換を行った。酵素蛋白質液を様々なpHのBufferで混ぜた直後と140時間保存したときに反応を行い、安定性を試験した。反応液は1 mlでCYP204A1もしくはCYPSSの各pHの酵素蛋白質液、64 μg/mlほうれん草由来フェレドキシン、0.1 U/mlほうれん草由来フェレドキシン還元酵素蛋白質、3 U/mlグルコースデヒドロゲナーゼ、60 mMグルコース、50μg/ml 4-コレステン-3-オン、2 mM NADHと2 mM NADPHとなるように調製し、200 mM Tris-HCを562μl加えてpH 7.5にした。様々なpHの酵素蛋白質液を加えても反応液がpH 7.5であることを確認した。反応はNADHとNADPHの添加により開始し、200 rpm、15℃で4時間行った。1.5 ml酢酸エチルを添加して反応を止め、抽出を行い、再度、0.75 ml酢酸エチルで抽出を行った。得られた酢酸エチル相をエバポレーターにより乾固し、200μlメタノールで残渣を溶解した。HPLC分析によりプロゲステロンの検出を行った。0時間と140時間の4-コレステン-3-オンからプロゲステロンへの酵素活性を表２に示した。この結果より、CYP204A1、CYPSSともにKPB pH 7.6で最も安定であることが示された。
Figure 2010079594
（８）温度安定性試験
上記（３）で調製した無細胞抽出液を様々な温度で140時間保存した。保存した温度は6, 10, 20, 30, 37, 45℃とした。保存前の酵素蛋白質液と140時間保存後のサンプルを用いて4-コレステン-3-オンの変換を行い、安定性を試験した。反応液は1 mlで各温度で保存したCYP204A1もしくはCYPSS酵素蛋白質液、64μg/mlほうれん草由来フェレドキシン、0.1 U/mlほうれん草由来フェレドキシン還元酵素蛋白質、3 U/mlグルコースデヒドロゲナーゼ、60 mMグルコース、50μg/ml 4-コレステン-3-オン、2 mM NADHと2 mM NADPHとなるように調製した。反応はNADHとNADPHの添加により開始し、200 rpm、15℃で4時間行った。1.5 ml酢酸エチルを添加して反応を止め、抽出を行い、再度、0.75 ml酢酸エチルで抽出を行った。得られた酢酸エチル相をエバポレーターにより乾固し、200μlメタノールで残渣を溶解した。HPLC分析によりプロゲステロンの検出を行った。0時間と140時間の4-コレステン-3-オンからプロゲステロンへの酵素蛋白質活性を表２に示した。この結果より、CYP204A1、CYPSSともに保存温度が下がるに従って安定性が上昇することが示された。特に、20℃で140時間保存した場合、CYP204A1は47%の活性が残存し、CYPSSは39%の活性が残存した。
Figure 2010079594
（９）CYP204A1とCYPSSのKinetics解析
上記（３）で調製した無細胞抽出液を用いて、基質濃度を0.1〜500μMで4-コレステン-3-オンの変換を行い基質濃度と酵素蛋白質活性の関係を調べた。反応液は1 mlで220 pmolのCYP204A1もしくは250 pmolのCYPSS、96μg/mlほうれん草由来フェレドキシン、0.1 U/mlほうれん草由来フェレドキシン還元酵素蛋白質、3 U/mlグルコースデヒドロゲナーゼ、60 mMグルコース、2 mM NADHと2 mM NADPHとなるように調製し、Tris-HClでpH 7.5にした。4-コレステン-3-オンは終濃度が0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500μMとなるようにDMSOに溶かしたものを20μl加えた。反応はNADHとNADPHの添加により開始し、200 rpm、15℃で60分間行った。1.5 ml酢酸エチルを添加して反応を止め、抽出を行い、再度、0.75 ml酢酸エチルで抽出を行った。得られた酢酸エチル相をエバポレーターにより乾固し、200μlメタノールで残渣を溶解した。HPLC分析によりプロゲステロンの検出を行った。基質濃度と酵素蛋白質活性の関係と、Lineweaver-Burk plotを作成して算出されたKinetics parametersを表５に示した。この結果より、CYP204A1とCYPSSのKm値は同等の1.0と1.1μMでVmaxは47.4と78.7 mmol/min/molとCYPSSの方が約1.7倍高いことが示された。また、この結果比較によりCYPSSの方が基質阻害がかかりにくいことが示された。
Figure 2010079594
Figure 2010079594
上記の結果の概要を以下に示す。 至適ｐH： pH 7.5 〜8.0(CYP204A1, CYPSSともに)、作用至適温度：15〜20℃ (CYP204A1, CYPSSともに)、pH安定性：中性付近で安定で、もっとも安定だったのはKPB pH 7.6 (CYPSS, CYP204A1ともに)、熱安定性：20℃で140時間保存後に30％以上の酵素蛋白質活性が保持される。(CYPSS, CYP204A1ともに)、Kinetics解析：Vmax CYPSSはCYP204A1に対して約1.7倍高い、Kｍ値：CYPSSとCYP204A1はほぼ同等（１μM）、基質阻害：4-コレステン-3-オンにより、基質阻害がかかることが分かったがCYPSSの方がCYP204A1に比べて基質阻害がかかりにくい、また4-コレステン-3-オンの濃度が10μMのときのCYPSSまたはCYP204A1の酵素蛋白質活性にくらべ、100μg/mlのときのそれぞれの酵素蛋白質活性は90%または67%であった。すなわち、基質濃度を１０μＭから１００μＭに上昇させた場合の活性の低下率は１０％または３３％であった。
実施例６：BP215株による4-コレステン-3-オンの変換反応(プロゲステロンの調製)
大腸菌発現BP215株をM9混合培地（Na2HPO4: 0.68%, KH2PO4: 0.3%, NaCl: 0.05%, NH4Cl: 0.01%, Casamino acid: 1%, D-Glucose: 0.4%, CaCl20.1mM, MgCl2: 1mM, Thiamine: 0.002%, FeSO4: 0.1mM, Carbenicillin: 0.005%）2mlに植菌し、30℃で17時間振とう培養し前培養液を得た。この前培養液0.25mlをOvernight ExpressTM Autoinduction System(Novagen Cat. No. 71300-4)を用いた本培養培地（Na2HPO4: 0.68%, KH2PO4: 0.3%, NaCl: 0.05%, NH4Cl: 0.01%, Casamino acid: 1%, CaCl20.1mM, MgCl2: 1mM, Thiamine: 0.002%, FeSO4: 0.1mM, Carbenicillin: 0.005%, Overnight ExpressTM溶液:7%, 5-Aminolevlic acid: 0.008%）２５mlに植菌し、25℃で24時間振とう培養した。この本培養液５mlを遠心分離（3500rpm, 10分間）して得た菌体にCV2バッファー（glycerol: 2%, Carbenicillin: 0.005%, Isopropyl βD-1-thiogalactopyranoside: 0.1mMを含む50mM(ｐH)燐酸カリウム緩衝液）1mlを加えた後、4-Cholesten-3-oneの1％メタノール溶液0.01mlおよびMethyl-β-cyclodextrinの25%水溶液0.02mlを加え28℃で5時間振とうし反応した。反応終了後、メタノール4mlを加え良く混合し、遠心分離して上層をHPLCで分析した。保持時間2.6分にプロゲステロンのピークを検出し、プロゲステロン標品と保持時間およびMSスペクトル(m/z=315 M+1)が一致した。蓄積量は78.0 mg/l(変換：78%)であった。また、4-Cholesten-3-one(保持時間8.1分)は検出されなかった。
分析条件：Chromolith speed rod RP18e(50x4.6mm)カラムで50%→100%CH3CNグラジエント(0〜3min) 100%CH3CN(3〜8min)を移動相とし流速2ml/min、CADTM(Charged Aerosol Detection)、MSで検出した。
実施例７：BP215株によるコレステロールの変換反応
基質をコレステロールとして実施例６と同様に反応後、処理分析した結果、保持時間2.5分にプレグネノロンのピークを検出し、プレグネノロン標品と保持時間およびMSスペクトル(m/z=317M+1)が一致した。蓄積量は68.2 mg/l(変換：68.2%)であった。また、Cholesterol(保持時間8.5分)は3.7%残留していた。
実施例８：BP215株による7-デヒドロコレステロール、エルゴステロールの変換反応
基質を7-デヒドロコレステロールとし実施例６と同様に反応後、処理分析した結果、保持時間2.1分に7-デヒドロプレグネノロンのピーク(m/z=315M+1)を検出した。蓄積量は34.3 mg/l(変換：34.3 %)であった。また、7-Dehydrochlesterol(保持時間7.5分)は54%残留していた。
基質をエルゴステロールとし実施例６と同様に反応後、処理分析した結果、保持時間2.1分に7-デヒドロプレグネノロンのピークを検出した。蓄積量は2.8 mg/l(変換：2.8 %)であった。
実施例９：BP215株による各種基質の変換反応
基質をβ-シトステロール、スティグマステロール、カンペステロールおよびデスモステロールとしてそれぞれ別々に実施例６と同様に反応後、処理分析した結果、保持時間2.5分にプレグネノロンのピークを検出し、プレグネノロン標品と保持時間およびMSスペクトル(m/z=317M+1)が一致した。蓄積量はそれぞれ40.9 mg/l(変換：40.9 %)、5.8 mg/l(変換：5.8 %)、27.9 mg/l(変換：27.9 %)、71.7 mg/l(変換：71.7 %)であった。また、添加した基質(保持時間はそれぞれ10.1、9.3、9.2、7.2分)はそれぞれ55.9%,70.8%,25.5%,21.3%残留していた。なお、β-シトステロールは生成物が微量であった為、反応液を酢酸エチルで抽出し5倍に濃縮して分析した。
実施例１０：(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシ-4-コレスト-4-エン-3-オン、及び(20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンの化学合成
20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンの２つの立体異性体の合成は、文献既知の合成方法を用いて20,22-ジヒドロキシコレステロールを経由したのちに、常法の酸化反応を用いて実施した。
（Ａ）20,22-ジヒドロキシコレステロール(10-A)の合成
Steroids(2004),69,483/ B.Watanabe et al.に、化合物(10-A)の２つの異性体[(20R,22R)体および(20R,22S)体]の化学合成が記載されており、その実験方法に従って同様に(10-A)の合成を実施した。
概要は、プレグネノロンを出発原料として、t-ブチルジメチルシリルクロライドで３位を保護基にして、4-メチル-1-ペンチンを付加させて(20R)-3β-(t-ブチルジメチルシリロキシ)コレスタ-5-エン-22-イン-20-オルを得た。これをLindlar触媒を用いてcis-オレフィンに還元して(20R,22Z)-3β-(t-ブチルジメチルシリロキシ)コレスタ-5,22-ジエン-20-オルとし、これをＶＯ(acac)2/ＴＢＨＰにより22,23-エポキシド（異性体混合物）に変換して、これを異性体混合物のまま分離せず、LiAlH4で還元して20,22-ジヒドロキシ体に変換して、ＴＢＡＦで３位の脱保護をして、(20R,22RS)-20,22-ジヒドロキシコレステロール(10-A)を得た。
（Ｂ）20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン(10-B)の合成
前出文献方法を参考に、まず(10-A)から(20R,22RS)-20,22-O-イソプロピリデンジオキシコレステロールを得た[ＰＰＴＳ存在下、22-ジメトキシプロパンを作用]。これを常法どおりOppenauer酸化により4-エン-3-オン体に変換した。この実験手順を具体的に記す。
十分に窒素置換したDean-Stark装置内で、(20R,22RS)-20,22-O-イソプロピリデンジオキシコレステロール(3.0g)をトルエン100mLに溶解し、1-メチル-4-ピペリドン(8.1mL,10eq)を添加したのち、反応温度を130-140℃にして、Al(OiPr)3 を(2.7g,2eq) 添加して４ｈｒかくはんした。反応終了後、ジエチルエーテルで希釈して常法処理したのち、シリカゲルクロマトグラフィー精製[ヘキサン/酢酸エチル＝8/1〜5/1]を行い、(20R,22RS)-20,22-O-イソプロピリデンジオキシコレスト-4-エン-3-オンを得た（2.9g, y97%）。
最後に(20R,22RS)-20,22-O-イソプロピリデンジオキシコレスト-4-エン-3-オンを脱アセトニド保護を行うことで(10-B)へ変換され、さらに２つの立体異性体を別々に取得することが出来た。以下に具体的な実験手順を記す。
(20R,22RS)-20,22-O-イソプロピリデンジオキシコレスト-4-エン-3-オン(2.9g)を、ＴＨＦ(20mL)＋メタノール(20mL)中で室温でかくはんしながら、２N塩酸(1.0mL)および過塩素酸(0.8mL)を添加して、６０ｈｒ反応した。クロロホルムで希釈して常法処理したのち、シリカゲルクロマトグラフィー精製をおこない[ヘキサン/酢酸エチル＝7/1〜2/1]、脱保護生成物(1.48g, y47%)と、未反応原料(1.24g)を分離取得した。 脱保護生成物からは、ヘキサン/酢酸エチルで再結晶して、白色固体(1.1g)を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3) δ: 0.90(d,J=6.6Hz,26-H3)，0.90(d,J=6.8Hz,27-H3)，0.91(s,18-H3)， 1.19(s,19-H3)，1.26(s,21-H3)，3.24(dd,J=9.4Hz,5.4Hz,22-H)，5.73(s,4-H) → (20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン(10-B)[非天然型異性体； 本発明による新規化合物である。]
回収した未反応原料(590mg)を、ＴＨＦ(15mL)＋メタノール(15mL)中で室温で攪拌しながら、過塩素酸(1.4mL)を添加して１０時間反応した。クロロホルムで希釈して常法処理したのち、シリカゲルクロマトグラフィー精製[ヘキサン/酢酸エチル＝7/1〜2/1]を行い、脱保護生成物(217mg, y40%)を得た。
1H-NMR(500MHz,CDCl3) δ: 0.89(d,J=6.3Hz,26-H3)，0.91(d,J=6.4Hz,27-H3)，0.93(s,18-H3)， 1.19(s,19-H3)，1.21(s,21-H3)，3.38(d,J=8.4Hz,22-H)，5.73(s,4-H) →(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン(10-B)[天然型異性体; (引用) Helv.Chim.Acta,(2006),89,813/W.Zhang et al. ]
実施例１１：BP215株による各種基質の変換反応
(20S)-20-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(22R)-22-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンを基質としてそれぞれ別々に実施例６と同様に反応し、生成物をHPLC分析した結果、プロゲステロンの生成を確認した。変換率はそれぞれ41.0%、42.3%、38.1%および69.8%であった。また、添加した基質(保持時間はそれぞれ4.9、4.4、3.8、3.5分)はそれぞれ4.8%,2.7%,0.6%,0.6%残留していた。
また、(20S) -20-ヒドロキシ-コレステロール、(22S) -22-ヒドロキシ-コレステロール、(22R)-22-ヒドロキシ-コレステロール、(20R, 22R) -20,22-ジヒドロキシ-コレステロールを基質としてそれぞれ別々に実施例６と同様に反応後、処理分析した結果、各基質に対応する側鎖開裂体のプレグネノロンの生成を確認した。蓄積量はそれぞれ89.2mg/L(変換：89.2 %)、37.5mg/L(変換：37.5%)、80.0mg/L(変換：80 %)、53.0mg/L(変換：53.0 %)であった。また、添加した基質はそれぞれ0%、23.5％、14.8％、0％残留していた。
実施例１２：BP172株を用いた各種基質の変換反応
4-コレステン-3-オン、コレステロール、7-デヒドロコレステロール、エルゴステロール、β-シトステロール、スティグマステロール、カンペステロール、デスモステロール、(20S)-20-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(22R)-22-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンを基質としてそれぞれ別々に実施例６と同様に反応し生成物をHPLC分析した結果、各基質に対応する側鎖開裂体のプロゲステロン、プレグネノロンまたは7-デヒドロプレグネノロンの生成を確認した。変換率はそれぞれ84.0%、71.2%、28.5%、22%、47.2%、6.5%、31.3%、66.1%、63.9％、80.9％、61.3％および41.7%であった。
また、(20S) -20-ヒドロキシ-コレステロール、(22S) -22-ヒドロキシ-コレステロール、(22R)-22-ヒドロキシ-コレステロール、(20R, 22R)-20,22-ジヒドロキシ-コレステロールを基質としてそれぞれ別々に実施例６と同様に反応後、処理分析した結果、各基質に対応する側鎖開裂体のプレグネノロンの生成を確認した。蓄積量はそれぞれ68.2mg/l (変換：68.2%)、12.9mg/l (変換：12.9%)、69.5mg/l(変換：69.5 %)、51.6mg/l(変換：51.6 %)であった。また、添加した基質はそれぞれ25.2%、60.1％、42.8％、0％残留していた。
参考例１：CYP11A発現大腸菌の作成
市販のヒト睾丸cDNA(Origene Technologies, Inc.)を鋳型として、プライマーCYP11A-1F（配列番号１９） およびプライマーCYP11A-2R（配列番号２０）、KOD plusポリメラーゼ（東洋紡社製)を用いてCYP11A1遺伝子をPCRを行って増幅した。この時の温度条件は、94℃/3分、（94℃/30秒, 55℃/60秒, 72℃/90秒）30サイクル、72℃/5分である。
この反応の結果、増幅した1.45 kbのCYP11A1遺伝子断片をQIAquick PCR purification Kit (キアゲン社製)を用いて精製し、Nde IおよびSpe Iで消化したのち大腸菌発現ベクターpT7NS-camABにT4 DNAリガーゼを用いて連結して、大腸菌DH5αに形質転換することで、プラスミドpCYP11A-camABを構築した。次いで、このプラスミドのSpe IおよびBam HI部位に予め調製しておいたウシ由来アドレノドキシン還元酵素蛋白質−アドレノドキシン遺伝子(adr-adx)断片をT4 DNAリガーゼを用いて挿入、連結して、大腸菌DH5αに形質転換することで、プラスミドpCYP11A-ARXを構築した。このプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に形質転換して得られた菌株をBL21CYP11と命名した。この時用いたadx-adr断片はプラスミドpKARX (Sawada et. al. Eur. J. Biochem. 265, 950-956, 1999)を鋳型として、プライマーbAdxR-1F（配列番号２１） およびプライマーbAdx-2R(配列番号２２）、KOD plusポリメラーゼ(東洋紡社製)を用いてPCRを行って増幅した。この時の温度条件は、94℃/3分、（94℃/30秒, 60℃/30秒, 72℃/120秒）25サイクル、72℃/5分であった。
この反応の結果、増幅した1.85 kbのadr-adx遺伝子断片をQIAquick PCR purification Kit (キアゲン社製)を用いて精製し、Spe IおよびFba Iで消化したのち、上述のpCYP11A-ARX構築に使用した。
比較例：CYP11A発現大腸菌による各種基質の変換反応
4-コレステン-3-オン（4Chol）、コレステロール（Chol）、7-デヒドロコレステロール（7-DHC）、エルゴステロール（Ergo）、β-シトステロール（Sito）、スティグマステロール（Stigma）、カンペステロール（Cam）およびデスモステロール（Des）、(20S)-20-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン（20-OH）、(22R)-22-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン（22-OH）、(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン(R-diol)、(20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン(S-diol)、ラノステロール（Lano）を基質としてそれぞれ別々に実施例６と同様に反応し、反応液を酢酸エチル1mlで分液し反応物および基質を抽出しHPLC分析した結果、各基質に対応する側鎖開裂体のプロゲステロン、プレグネノロンまたは7-デヒドロプレグネノロンの生成を確認した。変換率はそれぞれ0%、2.6%、0.7%、0%、0.8％、0％、1.0％、1.2％、0％、0.4％、4.3％および0%であり、基質の残存はそれぞれ100%、99%、99.2%、100%、99.7％、100％、99.1％、99.6％、100％、99.7％、95％および100%であった。
また、 (20S)-20-ヒドロキシ-コレステロール、(22S)-22-ヒドロキシ-コレステロール、(22R)-22-ヒドロキシ-コレステロール、(20R, 22R)-20,22-ジヒドロキシ-コレステロールを基質としてそれぞれ別々に実施例６と同様に反応後、処理分析した結果、各基質に対応する側鎖開裂体のプレグネノロンの生成を確認した。蓄積量はそれぞれ16.3mg/l(変換：16.3%)、6.1mg/l(変換：6.1%)、28.0mg/l(変換：28.0%)、32.3mg/l(変換：32.3%)であった。また、添加した基質はそれぞれ98.8%、92.6％、78.6％、51.6％残留していた。
各基質に対する変換反応率のまとめを以下の表６に示す。
Figure 2010079594
実施例１３：SDS-PAGE
BL21CYP11A、BP172及びBP215を、アンピシリン50μg/ml(終濃度)を添加したTB培地2 mlに各々植菌し、30℃、16時間、220 rpmで振とう培養した。この前培養液250μlを本培養用TB培地2 5 ml（アンピシリン50μg/ml〈終濃度〉、5-アミノレブリン酸40μg/ml〈終濃度〉、誘導剤：Overnight Express Autoinduction System1〈メルク社製〉）に加え、25℃で24時間振とう培養した。この培養液から遠心分離により回収した菌体を緩衝液(50 mMKPB、2%グリセロール[pH 7.4]) 5 mlに懸濁し、菌体懸濁液とした。この菌体懸濁液2 mlに×10 Bug Buster 66.7μl (Novagen社製)、Benzonase 0.67μl (Novagen社製)、40 mg/ml Lysozymeを添加し、30℃で20分間振とうして溶菌させた。 この菌体溶菌液を全蛋白質液とした。また、菌体溶菌液を遠心分離後、遠心上清を可溶性画分蛋白質液とした。不溶性画分蛋白質は菌体溶菌液を遠心分離後、遠心上清を全て除去し、緩衝液で３回洗浄後、再度緩衝液に懸濁して調製した。これらの全蛋白質液、可溶性画分蛋白質液、不溶性画分蛋白質液はSDS-PAGE用サンプルバッファー（BIO-RAD社製）20μlと各々混合し、SDS-PAGE泳動用サンプルとした。SDS-PAGE泳動用サンプルは95℃、5 min加熱後、ポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品社製）で電気泳動した(300V、30mA、60分)。電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルをトレイに移し、染色−脱色液（タカラバイオ社製）を適量添加し、染色及び脱色を行った。結果を図１に示す。
本発明の新規酵素蛋白質を用いることによって、医薬および医薬中間体として産業上有用な化合物であるプレグネノロン等およびハイドロコルチゾンを効率的に製造することが可能になった。
図１は、BL21CYP11A、BP172及びBP215を用いてSDS-PAGEを行った結果を示した図である。 図２は、ハイドロコルチコイドの誘導体及びその合成方法を示した図である。１．Faming Zhuanli Shenqing Gongkai Shuomingshu, 1896090, 17 Jan 2007２．J.Am.Chem.Soc., 82, 3696-701; 1960３．Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 87(4-5), 319-325; 2004； 及びAnnals of the New York Academy of Sciences, 434(Enzyme Eng.), 106-9; 1984 Ger. Offen., 3322120, 02 Feb 1984４．Ger. Offen., 3109459, 23 Sep 1982；Journal of the American Chemical Society, 81, 4956-62; 1959；及びJournal of the American Chemical Society, 77, 1028-32; 1955 ５．Huagong Shikan, 20(5), 30-32; 2006、U.S.S.R., 819119, 07 Apr 1981６．US2658023(1953)；J.Am.Chem.Soc.,77,763(1955)；特公昭46-20033；及特公昭47-13112７．J.Gen.Appl.Microbiol.,7,113(1961)８．Appl.Microbiol.,8,345(1960) 図３は、ハイドロコルチコイドの誘導体及びその合成方法を示した図である。Mometasone：Trtrahedron,55,3355(1999)；及びEur.Pat.Appl.,165037,18 Dec1985Triamcinolone；J.Org.Chem.,59(24),7534(1994)；及びEur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.,11,81(1981)Dexamethasone；Eur.Pat.Appl.,165037,18 Dec1985Budesonide；Huagong Shikan,20(5),20(2006)；及びHuaxue Gongye Yu Gongcheng,22(5),354(2005)Fluticasone；特開昭61-1699；EP 165037B1；EP 574318B1；EP 1207166A2；WO 02/100878A1；及びEP 1526139A1Betamethazone：Tetrahedron Lett.,33,4913(1992)

Claims (14)

  1. 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのタンパク質；
    （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質、
    （ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質。
  2. 以下の理化学的性質を有するステロール側鎖切断酵素。
    （１）作用：下記式（I）で表されるステロールに作用し、ステロール側鎖部分の20位と22位の炭素−炭素結合を切断する活性により該結合を切断して下記式（II）で表される化合物を生成する。
    （２）基質特異性：該酵素を産生する微生物を、4−コレステン−3−オンまたはコレステロールを100μg/ml含む水溶液に28℃で5時間反応させたときの、4−コレステン−3−オンからプロゲステロンへの変換反応率が10％以上であり、かつコレステロールからプレグネノロンへの変換率が10％以上である。
    （３）至適ｐＨ：7.5〜8.0
    （４）作用至適温度：15〜20℃
    （５）熱安定性：20℃で140時間保存後に30％以上の酵素活性が保持される。
    （６）分子量：アミノ酸配列からの推定分子量が53〜54ＫＤａであり、ＳＤＳ電気泳動による測定で50〜56ＫＤａ
    Figure 2010079594
     ［式（Ｉ）において、母核部分は、ステロイド類が有するＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ環からなる構造をもち、
    その１位から１７位（１０位と１３位をのぞく）のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置に炭素−炭素不飽和結合を有しており、
    その１位から１９位（１０位と１３位をのぞく）のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置の炭素上には、それぞれ独立して、
    式；−ＯＸで表される基
    （式中、Ｘ＝Ｈで表される水酸基、Ｘ＝ＣＯＲ1[Ｒ1は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｘ＝Ｒ2[Ｒ2は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｘ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、Ｘが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基、またはＸが当該炭素の隣接炭素原子であるエポキシ基）、
    または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。
    側鎖部分は、Ｒは、環状部分を有していてもよい炭素数１０以下の直鎖状のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、または環状部分を有していてもよい炭素数１０以下の分岐状のアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基であり、
    ２０位、２１位およびＲ内のいずれかの０箇所又は１箇所以上の位置の炭素上には、それぞれ独立して、
    式；−ＯＹで表される基
    （式中、Ｙ＝Ｈで表される水酸基、Ｙ＝ＣＯＲ3[Ｒ3は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｙ＝Ｒ4[Ｒ4は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｙ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、Ｙが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基、またはＹが当該炭素の隣接炭素原子であるエポキシ基）、
    または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。］
    ［式（ＩＩ）において、母核部分は、式（Ｉ）の母核部分と同義である。
    側鎖部分において、２１位の炭素上には０又は１つの、式；−ＯＹで表される基
    （式中、Ｙ＝Ｈで表される水酸基、Ｙ＝ＣＯＲ3[Ｒ3は水素原子または炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくは芳香族炭化水素]で表されるアシロキシル基、Ｙ＝Ｒ4[Ｒ4は酸素原子で置換されていてもよい炭素数１０以下のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基]で表されるＯアルキル基、Ｙ＝ＳＯ3Ｍ[Ｍは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属]で表される硫酸エステル類、またはＹが糖類の１位炭素であるＯグリコシル基）、
    または式；＝Ｏで表されるケト基で置換されている。］
  3. 請求項１に記載のタンパク質をコードするDNA。
  4. 以下の(a)、(b)または(c)のいずれかのDNA；
    （ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するDNA、
    （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、かつステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質をコードするDNA、
    （ｃ）配列番号1に記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつステロール側鎖の20位と22位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が５０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質をコードするDNA。
  5. 請求項１または２記載の酵素タンパク質と、該酵素タンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質とを一つのタンパク質として機能するように結合させた融合タンパク質。
  6. 請求項３または４に記載のDNAと、該DNAがコードするタンパク質が宿主細胞内で発現可能な発現制御領域とを含む組み換えベクター。
  7. 請求項６に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入した形質転換体。
  8. 下記式（I）で表されるステロールと、下記(i)または(ii)を接触させることを特徴とする、下記式(II)で表される化合物の製造方法。
    (i) 請求項１または２に記載の酵素タンパク質と、該酵素タンパク質への電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物；
    (ii)請求項５に記載の融合タンパク質；
    Figure 2010079594
     ［式（Ｉ）及び式（II）の定義は請求項１と同義である］
  9. 下記式（I）で表わされるステロールと、下記(a)から(c)の何れかを接触させることを特徴とする、下記式（II）で表わされる化合物の製造方法。
    （a）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、および該タンパク質への電子伝達活性があるフェレドキシンタンパク質および該フェレドキシンタンパク質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物
    （b）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質、および該タンパク質への電子伝達活性があるフェレドキシンタンパク質およフェレドキシンタンパク質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物
    （c）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質と、該酵素タンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質とを一つのタンパク質として機能するように結合させた融合タンパク質。
    Figure 2010079594
     ［式（Ｉ）及び式（II）の定義は請求項１と同義である］
  10. 請求項８または９の方法において、さらにステロール３位酸化異性化酵素、ステロイド１７α位水酸化酵素、ステロイド２１位水酸化酵素、およびステロイド１１β位水酸化酵素を接触させ、ハイドロコルチゾンを生成させることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
  11. 上記式（Ｉ）で表されるステロールが、コレステロール、4-コレステン-3-オン、7-デヒドロコレステロール、エルゴステロール、β-シトステロール、スティグマステロール、カンペステロール、デスモステロール、 (20S)-20-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(22R)-22-ヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、(20R,22R)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オン、又は(20R,22S)-20,22-ジヒドロキシコレスト-4-エン-3-オンである、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 上記式（II）で表される化合物が、プレグネノロン、プロゲステロン又は７−デヒドロプレグネノロンである、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 上記式（I）で表わされるステロールが、グルコース、グリセリン、メタノール、エタノール、サッカロース、酢酸、クエン酸のいずれかから選択される原料と該原料を資化して上記式（I）で表されるステロールを生成する能力を有する酵母とを接触させることにより生成させたものである請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. グルコース、グリセリン、メタノール、エタノール、サッカロース、酢酸、クエン酸のいずれかから選択される原料からハイドロコルチゾンを製造する方法であって、前記原料を含む培地で、上記原料から下記式（I）で表わされるステロールを生成する活性及びステロール３位酸化異性化酵素、ステロイド１７α位水酸化酵素、ステロイド２１位水酸化酵素、およびステロイド１１β位水酸化酵素を生成する活性を有し、かつ以下の（A）〜（E）のいずれかの特徴を有する酵母を培養することによる方法。
    （A）請求項１又は２に記載のタンパク質と、該酵素タンパク質への電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物を生成する活性を有する；
    （B）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、および該タンパク質への電子伝達活性があるフェレドキシンタンパク質および該フェレドキシンタンパク質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物を生成する活性を有する；
    (C)配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質、および該タンパク質への電子伝達活性があるフェレドキシンタンパク質およフェレドキシンタンパク質に電子を伝達するフェレドキシン還元酵素タンパク質の混合物を生成する活性を有する；
    （D）配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステロール側鎖の２０位と２２位の結合を切断する活性を有し、上記活性の反応速度パラメーターである最大速度（Ｖｍａｘ）が４０ｍｍｏｌ／分／ｍｏｌ以上であるタンパク質と、該酵素タンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質とを一つのタンパク質として機能するように結合させた融合タンパク質を生成する活性を有する；
    (E) 請求項１または２記載の酵素タンパク質と、該酵素タンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシンタンパク質、および該フェレドキシンタンパク質に電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素タンパク質とを一つのタンパク質として機能するように結合させた融合タンパク質を生成する活性を有する：
    Figure 2010079594
     ［式（Ｉ）の定義は請求項１と同義である］
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