CN102272304A - 切断固醇侧链的酶蛋白质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是针对P450scc酶蛋白质获得高活性的P450scc酶蛋白质,该P450scc酶蛋白质是在催化工业上有用的类固醇激素的生物合成的第一阶段的重要的酶蛋白质。本发明提供具有以下理化性质的切断固醇侧链的酶蛋白质。(1)作用:作用于本说明书中定义的式(I)表示的固醇,通过切断固醇侧链部分的20位和22位的碳-碳键的活性来切断该键,从而生成本说明书中定义的式(II)表示的化合物;(2)底物特异性:当使产生该酶的微生物在含100μg/ml的4-胆甾烯-3-酮或胆固醇的水溶液中于28℃反应5小时时,从4-胆甾烯-3-酮到孕酮的转化反应率为10%以上,且从胆固醇到孕烯醇酮的转化率为10%以上。
Description
技术领域
本发明涉及切断固醇侧链的20位和22位的键并产生作为医药或医药中间体而有工业价值的孕烯醇酮等的酶蛋白质、编码该酶蛋白质的DNA、将该DNA组入载体而得到的转化体、以及利用该酶蛋白质制造孕烯醇酮等、以及制造皮质醇及其衍生物的方法等。
背景技术
11β,17α,21-三羟基-4-孕烯-3,20-二酮(皮质醇)与作为其前体的孕烯醇酮、孕酮、7-脱氢孕烯醇酮均是作为医药和医药中间体而在工业上有价值的化合物。作为孕烯醇酮的现有制造方法,以胆固醇、薯蓣皂素(diosgenin)、豆固醇这样的天然来源固醇化合物作为原料,通过多个有机合成反应进行合成(非专利文献1)。但是,这些方法的工序数多、目的产物的收率低,作为工业生产方法存在问题。另一方面,作为到皮质醇为止的生物化学制造方法,已经公开了利用具有切断动物来源的固醇侧链的20位和22位的键的活性的酶(side chain cleavage cytochrome P450(侧链裂解细胞色素P450),以下也称为“P450scc”)的固醇转化方法(非专利文献2)。动物来源酶蛋白质的酶蛋白质活性低,此外,由于作为宿主的细胞的培养需要昂贵的培养基、增殖速度慢等因素,其生产方法尚未建立。此外,已经公开了用牛来源的P450scc转化酵母菌,并在构成电子传递系统的皮质铁氧还蛋白和皮质铁氧还蛋白还原酶的存在下、将胆固醇转化成孕烯醇酮的方法,但其生产性非常低,未获得工业水平的生产性(专利文献1)。
非专利文献1:J.Org.Chem.,1979,44,1583
非专利文献2:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85,1988
专利文献1:日本专利第2963711号公报
发明内容
发明所要解决的问题
本发明所要解决的问题是提供对工业上有用的类固醇激素的生物合成的第一阶段进行催化的高活性P450scc,以及提供用于使用该P450scc廉价且简便地生产孕烯醇酮等、进而生产皮质醇的方法。
解决问题的方法
本发明人为解决上述问题进行了深入研究,针对数百种微生物的P450scc,测定了其切断固醇侧链的20位和22位的键的活性,结果发现了具有非常高的切断固醇化合物侧链的20位和22位的键的活性的酶蛋白质。该蛋白质具有上述活性是新发现的。此外,以与所述微生物来源的酶蛋白质具有高碱基序列同源性作为指标,筛选了编码其近亲微生物的P450蛋白质的DNA,发现了具有新的碱基序列的DNA。本发明人发现:利用编码这些微生物来源的酶蛋白质的DNA制作了转化体,并通过使该酶蛋白质转化体细胞、该转化体处理物和/或培养液与作为原料的固醇化合物作用,能够以高浓度获得作为目的物的孕烯醇酮等。本发明正是基于这些认识而完成的。
即,本发明提供以下的发明。
[1]以下(a)、(b)或(c)中任一项的蛋白质:
(a)蛋白质,其由SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列组成;
(b)蛋白质,其由在SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、并具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上;
(c)蛋白质,其由与SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸序列组成、并具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上。
[2]具有以下理化性质的切断固醇侧链的酶。
(1)作用:作用于下述式(I)表示的固醇,通过切断固醇侧链部分的20位和22位的碳-碳键的活性来切断该键,从而生成下述式(II)表示的化合物;
(2)底物特异性:当使产生该酶的微生物在含100μg/ml的4-胆甾烯-3-酮或胆固醇的水溶液中于28℃反应5小时时,从4-胆甾烯-3-酮到孕酮的转化反应率为10%以上,且从胆固醇到孕烯醇酮的转化率为10%以上;
(3)最适pH:7.5~8.0;
(4)作用最适温度:15~20℃;
(5)热稳定性:于20℃保存140小时后,能保持30%以上的酶活性;
(6)分子量:从氨基酸序列推算的分子量为53~54KDa,且利用SDS电泳测定的分子量为50~56KDa;
[化学式1]
[式(I)中,
母核部分具有由类固醇类所具有的A、B、C、D环构成的结构,
其1位至17位(10位和13位除外)中的任意0个或1个以上位置上具有碳-碳不饱和键,
其1位至19位(10位和13位除外)中的任意0个或1个以上位置的碳上彼此独立地被式:-OX表示的基团(式中,当X=H时表示羟基,当X=COR1[R1为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基]时表示酰氧基,当X=R2[R2为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基]时表示O烷基,X=SO3M[M为氢原子、碱金属或碱土金属]时表示硫酸酯类,当X为糖类的1位碳时表示O糖基,或当X为与该碳相邻碳原子时表示环氧基)或式:=O表示的氧代基取代;
在侧链部分,R为任选具有环状部分的碳原子数10以下的直链烷基、烯基或炔基,或任选具有环状部分的碳原子数10以下的支链烷基、烯基或炔基,
20位、21位和R内的任意0个或1个以上位置的碳上彼此独立地被式:-OY表示的基团(式中,当Y=H时表示羟基,当Y=COR3[R3为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基]时表示酰氧基,当Y=R4[R4为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基]时表示O烷基,当Y=SO3M[M为氢原子、碱金属或碱土金属]时表示硫酸酯类,当Y为糖类的1位碳时表示O糖基,或当Y为与该碳相邻的碳原子时表示环氧基)或式:=O表示的氧代基取代;]
[式(II)中,母核部分的定义与式(I)的母核部分定义相同;
在侧链部分,21位的碳上被0个或1个式:-OY表示的基团(式中,当Y=H时表示羟基,当Y=COR3[R3为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基]时表示酰氧基,当Y=R4[R4为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基]时表示O烷基,当Y=SO3M[M为氢原子、碱金属或碱土金属]时表示硫酸酯类,或当Y为糖类的1位碳时表示O糖基)或式:=O表示的氧代基取代]。
[3]编码项[1]所述的蛋白质的DNA。
[4]以下(a)、(b)或(c)中任一项的DNA:
(a)DNA,其具有SEQ ID NO:1所述的碱基序列;
(b)DNA,其具有在SEQ ID NO:1所述的碱基序列中发生1个或数个碱基的缺失、取代和/或添加而得到的碱基序列、并编码具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上的蛋白质;
(c)DNA,其具有能够与具有SEQ ID NO:1所述的碱基序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列、并编码具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上的蛋白质。
[5]一种融合蛋白质,其是使项[1]或[2]所述的酶蛋白质、对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质、以及对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质。
[6]一种重组载体,其包含项[3]或[4]所述的DNA、以及使得该DNA编码的蛋白质能够在宿主细胞内表达的表达调控区。
[7]将项[6]所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。
[8]制造下述式(II)表示的化合物的方法,该方法包括使下述式(I)表示的固醇与下述(i)或(ii)接触:
(i)项[1]或[2]所述的酶蛋白质、具有向该酶蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质、以及具有向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(ii)项[5]所述的融合蛋白质;
[化学式2]
[式(I)以及式(II)中的定义与项[1]中的定义相同]。
[9]制造下述式(II)所表示的化合物的方法,该方法包括使下述式(I)所表示的固醇与下述(a)~(c)中的任一个接触:
(a)由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列的蛋白质组成、具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质、以及向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(b)由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质以及向铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(c)使由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质或者由在SEQID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质以及对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质。
[化学式3]
[式(I)以及式(II)中的定义与项[1]中的定义相同]。
[10]根据项[8]或[9]所述的方法,其中,在项[8]或[9]的方法中,再使固醇3位氧化异构酶、类固醇17α位羟化酶、类固醇21位羟化酶和类固醇11β位羟化酶接触,从而生成皮质醇。
[11]根据项[8]~[10]中任一项所述的方法,其中,上述式(I)表示的固醇是胆固醇、4-胆甾烯-3-酮、7-脱氢胆固醇、麦角固醇、β-谷固醇、豆固醇、菜油固醇、链甾醇、(20S)-20-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(22R)-22-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(20R,22R)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮或(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮。
[12]根据项[8]~[11]中任一项所述的方法,其中,上述式(II)表示的化合物是孕烯醇酮、孕酮或7-脱氢孕烯醇酮。
[13]根据项[8]~[12]中任一项所述的方法,其中,
上述式(I)所表示的固醇是通过使选自葡萄糖、甘油、甲醇、乙醇、蔗二糖、柠檬酸、乙酸中的任意原料与具有同化该原料生成上述式(I)表示的固醇的能力的酵母接触而生成的。
[14]一种从选自葡萄糖、甘油、甲醇、乙醇、蔗二糖、柠檬酸、乙酸中的任意原料制造皮质醇的方法,该方法包括用含所述原料的培养基培养酵母,
所述酵母具有从上述原料生成下述式(I)所表示的固醇的活性、以及生成固醇3位氧化异构酶、类固醇17α位羟化酶、类固醇21位羟化酶和类固醇11β位羟化酶的活性,且具有以下(A)~(E)中任一项的特征:
(A)具有生成下述混合物的活性,该混合物是项[1]或[2]所述的蛋白质、具有向该酶蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质以及具有向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(B)具有生成下述混合物的活性,该混合物是由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列的蛋白质组成、具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质以及向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(C)具有生成下述混合物的活性,该混合物是由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质以及向铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(D)具有生成下述融合蛋白质的活性,该融合蛋白质是使由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质或者由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质以及对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质;
(E)具有生成如下融合蛋白质的活性,该融合蛋白质是使项[1]或[2]所述的酶蛋白质、对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质以及对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质:
[化学式4]
[式(I)中的定义与项[1]中的定义相同]。
发明效果
通过使用本发明提供的具有切断固醇化合物侧链的20位和22位的键的活性的新的酶蛋白质,能够有效率地制造作为医药和医药中间体在工业上有用的化合物——孕烯醇酮等和皮质醇。一般而言,动物来源的P450scc如以微生物作为宿主进行表达,则成为不溶性蛋白质,以活性体的形式获得动物来源的P450scc是困难的。本发明首次提供的微生物来源的P450scc在使用微生物作为宿主进行表达的情况下,成为可溶性蛋白质,能够容易地以活性体的形式获得,因此工业价值高。
发明的具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行具体说明。
(1)本发明的蛋白质
根据本发明,提供以下(a)、(b)或(c)中任一项的蛋白质(以下也称为“CYPSS204A”)。
(a)蛋白质,其由SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列组成;
(b)蛋白质,其由在SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上;
(c)蛋白质,其由与SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列具有95%以上的同源性的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上。
优选地,本发明的蛋白质在切断固醇侧链的20位和22位的键的活性方面,在底物浓度从10μM提高至100μM的情况下的活性降低率为30%以下。
本发明中,“发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列”中的“1个或数个”是指:例如1~20个左右、优选1~10个左右、更优选1~5个左右。
本发明的酶蛋白质进一步具有以下理化性质。
作用:作用于下述式(I)表示的固醇、通过切断固醇侧链部分的20位和22位的碳-碳键的活性来切断该键,从而生成下述式(II)表示的化合物。
底物特异性:当使产生该酶蛋白质的微生物在含100μg/ml的4-胆甾烯-3-酮或胆固醇的水溶液中于28℃反应5小时时,从4-胆甾烯-3-酮到孕酮的转化反应率为10%以上(优选30%以上、更优选50%以上、进一步优选60%以上、特别优选70%以上),且从胆固醇到孕烯醇酮的转化率为10%以上(优选30%以上、更优选50%以上、进一步优选60%以上、特别优选65%以上)。
[化学式5]
[式(I)中,母核部分具有由类固醇类所具有的A、B、C、D环构成的结构,其1位至17位(10位与13位除外)中的任意0个或1个以上的位置上具有碳-碳不饱和键,其1位至19位(10位和13位除外)中的任意0个或1个以上的位置的碳上彼此独立地被式:-OX表示的基团(式中,当X=H时表示羟基,当X=COR1[R1为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基]时表示酰氧基,当X=R2[R2为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基]时表示O烷基,当X=SO3M[M为氢原子、碱金属或碱土金属]时表示硫酸酯类,当X为糖类的1位碳时表示O糖基、或当X为与该碳相邻碳原子时表示环氧基)或式:=O表示的氧代基取代;
在侧链部分,R为任选具有环状部分的碳原子数10以下的直链烷基、烯基或炔基,或任选具有环状部分的碳原子数10以下的支链烷基、烯基或炔基,20位、21位和R内的任意0个或1个以上的位置的碳上彼此独立地被式:-OY表示的基团(式中,当Y=H时表示羟基,当Y=COR3[R3为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基]时表示酰氧基,当Y=R4[R4为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基]时表示O烷基,当Y=SO3M[M为氢原子、碱金属或碱土金属]时表示硫酸酯类,当Y为糖类的1位碳时表示O糖基,或当Y为与该碳相邻的碳原子时表示环氧基)或式:=O表示的氧代基取代;]
[式(II)中,母核部分与式(I)的母核部分定义相同,
在侧链部分,21位的碳上被0个或1个式:-OY表示的基团(式中,当Y=H时表示羟基,当Y=COR3[R3为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基]时表示酰氧基,当Y=R4[R4为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基]时表示O烷基,当Y=SO3M[M为氢原子、碱金属或碱土金属]时表示硫酸酯类,或当Y为糖类的1位碳时表示O糖基)或式:=O表示的氧代基取代;]
式(I)优选为胆固醇、4-胆甾烯-3-酮、7-脱氢胆固醇、麦角固醇、β-谷固醇、豆固醇、菜油固醇、链甾醇、(20S)-20-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(22R)-22-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(20R,22R)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮、(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮,更优选为胆固醇、4-胆甾烯-3-酮、7-脱氢胆固醇。
[化学式6]
式(II)优选为孕烯醇酮、孕酮、7-脱氢孕烯醇酮。
[化学式7]
作为本发明的蛋白质的其它性质,从7-脱氢胆固醇到7-脱氢孕烯醇酮的转化率为10%以上、优选20%以上、更优选25%以上;从麦角固醇到7-脱氢孕烯醇酮的转化率为1%以上、优选2%以上;从β-谷固醇到孕烯醇酮的转化率为10%以上、优选20%以上、更优选30%以上、进一步优选40%以上;从豆固醇到孕烯醇酮的转化率为1%以上、优选2%以上、更优选5%以上。此外,从菜油固醇到孕烯醇酮的转化率为10%以上、优选20%以上、更优选25%以上;从链甾醇到孕烯醇酮的转化率为10%以上、优选30%以上、更优选50%以上、更优选60%以上、特别优选65%以上;从(20S)-20-羟基胆甾-4-烯-3-酮到孕酮的转化率为10%以上、优选20%以上、更优选30%以上、进一步优选40%以上;从(22R)-22-羟基胆甾-4-烯-3-酮到孕酮的转化率为10%以上、优选20%以上、更优选30%以上、进一步优选40%以上;从(20R,22R)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮到孕酮的转化率为10%以上、优选20%以上、更优选30%以上、更优选35%以上;从(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮到孕酮的转化率为10%以上、优选20%以上、更优选30%以上、进一步优选40%以上。此外,羊毛固醇的转化率为0%。
本发明的酶蛋白质优选还可以具有以下理化性质。最适pH:7.5~8.0、作用最适温度:15~20℃,热稳定性:于20℃保存140小时后,保持30%以上的酶蛋白质活性。分子量方面,从氨基酸序列推算的分子量为53~54KDa,而利用SDS电泳测定的分子量为50~56KDa。此外,作为反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上,底物浓度从10μM提高至100μM的情况下的活性降低率为30%以下。
Vmax和Km可以这样求出:以底物浓度0.1~500μM的条件进行4-胆甾烯-3-酮的转化,通过考察底物浓度与酶蛋白质活性的关系来求出。此外,底物浓度从10μM提高至100μM的情况下的活性的降低率也可以通过以底物浓度0.1~500μM的条件进行4-胆甾烯-3-酮的转化、并考察底物浓度与酶蛋白质活性的关系来求出。具体地,制备反应液,使得1ml反应液中包含220pmol的CYP204A1或250pmol的CYPSS204A、96μg/ml菠菜来源铁氧还蛋白、0.1U/ml菠菜来源铁氧还蛋白还原酶蛋白质、3U/ml葡糖脱氢酶、60mM葡萄糖、2mM NADH和2mM NADPH,并用Tris-HCl调整至pH 7.5。加入20μl溶于DMSO中的4-胆甾烯-3-酮,并使作为底物的4-胆甾烯-3-酮的终浓度为0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500μM。反应可以通过添加NADH与NADPH而开始,并在200rpm、15℃的条件下进行60分钟。
对于本发明的酶蛋白质的来源没有特殊限制,优选为来源于微生物的酶蛋白质,可以列举出例如地下鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas subterranea)、最优选地,地下鞘氨醇单胞菌NBRC16086。此外,只要具有上述氨基酸序列或者具有上述性质即可,还可以是溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Novosphingobiumaromaticivorans)、例如溶芳烃鞘氨醇单胞菌ATCC 700278等来源的酶蛋白质。
(2)本发明的酶蛋白质的获得方法
本发明的酶蛋白质可以从例如上述的地下鞘氨醇单胞菌或溶芳烃鞘氨醇单胞菌等微生物通过常规的蛋白质提取、纯化方法而得到。作为提取方法,具体可以列举出:例如利用剪刀等进行的细片化,利用匀浆化、声波处理、渗透压休克法、冻融法等细胞破碎进行的提取,表面活性剂提取等,或上述的组合等处理操作。此外,作为纯化方法,具体可以列举出:例如利用硫酸铵(硫铵)、硫酸钠等进行的盐析、离心分离、透析、超滤法、吸附色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、反相色谱、凝胶过滤法、凝胶渗透色谱、亲和色谱、电泳法、酶谱法(zymography)等、或者上述的组合等处理操作。
此外,通过采用公知方法克隆下述编码本发明的蛋白质的DNA,将其导入适当的宿主并进行表达,可以得到本发明的酶蛋白质。例如,通过基于本说明书中记载的编码本发明的酶蛋白质的基因的碱基序列的信息,设计本发明的酶蛋白质的基因特异性的探针或引物,使用该探针或引物从地下鞘氨醇单胞菌或溶芳烃鞘氨醇单胞菌等微生物的DNA文库(例如基因组DNA文库或cDNA文库等)分离或扩增编码本发明的酶蛋白质的DNA,利用基因重组技术将其装入载体,再导入宿主细胞,并在宿主细胞中表达,能够得到本发明的酶蛋白质。
(3)编码本发明的蛋白质的DNA、重组载体和转化体
根据本发明,提供编码上述本发明的蛋白质的DNA。
作为本发明的DNA的具体例子,可以列举出以下(a)、(b)或(c)中任一项的DNA。
(a)DNA,其具有SEQ ID NO:1所述的碱基序列;
(b)DNA,其具有在SEQ ID NO:1所述的碱基序列中发生1个或数个碱基的缺失、取代和/或添加而得到的碱基序列、并编码具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上的蛋白质;
(c)DNA,其具有能够与具有SEQ ID NO:1所述的碱基序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列、并编码具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为50mmol/分钟/mol以上的蛋白质。
编码本发明的酶蛋白质的基因还可以通过从地下鞘氨醇单胞菌等和溶芳烃鞘氨醇单胞菌中,以基于编码本发明的酶蛋白质的基因的碱基序列而制作的寡核苷酸作为探针进行杂交、或者以基于所述序列制作的寡核苷酸作为引物进行PCR,从地下鞘氨醇单胞菌和溶芳烃鞘氨醇单胞菌等微生物的DNA文库中分离。此外,本发明的酶蛋白质的基因不仅可以是从天然微生物分离的,也可以是,为了适于在不引起氨基酸序列的变更的条件下,在表达该酶蛋白质的宿主细胞中表达而进行密码子变更并合成的基因。
本发明中,“发生1个或数个碱基的缺失、取代和/或添加而得到的碱基序列”中的“1个或数个”是指:例如1~30个左右、优选1~20个左右、更优选1~10个左右、进一步优选1~5个左右。本发明中,“能够在严格条件下杂交的碱基序列”可以列举出:包含与具有SEQ ID NO:1所述的碱基序列或其互补序列的DNA在BLAST解析中有90%以上、更优选95%以上的同源性的碱基序列的DNA等。此外,严格条件下的杂交可以采用下述方法来进行:在常规杂交缓冲液中、以温度40~70℃、优选60~65℃等条件进行反应,并在盐浓度15mM~300mM、优选15mM~60mM等的洗涤液中进行洗涤。
具有在SEQ ID NO:1所述的碱基序列中发生1个或数个碱基的缺失、取代和/或添加而得到的碱基序列的基因可以通过使用突变剂的方法、定点突变法等常规突变操作来制作得到。这些可以使用例如Site DirectedMutagenesis Kit(宝酒造)、Quick Change Site Directed MutagenesisKit(STRATAGENE公司制造)等市售试剂盒容易地进行。
根据本发明,还提供具有本发明的DNA的重组载体。重组载体是指包含使得该DNA编码的蛋白质能够在宿主细胞内表达的表达调控区的重组载体。具体地,通常是本发明的DNA和适合宿主微生物的启动子连接而得的载体,其中本发明的DNA的编码区域的5′末端侧连接于该启动子的下游。对于载体没有特殊限制,只要能够在宿主微生物内复制增殖即可,可以列举出质粒载体、穿梭载体和噬菌体载体。作为具体的质粒载体,可以列举出pBR322、pUC18、pHSG298、pUC118、pSTV28、pTWV228、pHY300PLK(宝酒造公司制造等)、pKK223-3、pPL-Lambda Inducible Expression Vector(Pharmacia公司制造等),作为大肠杆菌-棒状杆菌型细菌的穿梭载体,可以列举出例如pCRY30(特开平3-210184号公报)、pCRY21(特开平2276575号公报)、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX、pCRY2和pCRY3(特开平1-191686号公报)、pAM330(特开昭58-67679号公报)、pHM1519(特开昭58-77895号公报)、pAJ655、pAJ611和pAJ1844(特开昭58-192900号公报)、pCG1(特开昭57-134500号公报)、pCG2(特开昭58-35197号公报)、pCG4和pCG11(特开昭57-183799号公报)等,或者它们的衍生物等。此外,作为噬菌体载体,可以列举出(λFixII载体(Stratagene公司制造等)等。
另一方面,在使用酵母等真菌类的情况下,可以采用使用染色体整合型质粒中的多拷贝整合至染色体的载体的方法(Sakai,A.等人,(1991)Biotechnology(NY)9,1382-1385),或者使用非整合型质粒中的2μm质粒来源的pESC载体(STRATAGENE公司制造)、pAUR载体(TAKARA Bio公司制造)等多拷贝型质粒等。
作为用于以酵母类为宿主、表达编码本发明的酶蛋白质的DNA的启动子,除了可以利用编码磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase)的PGK1基因、编码醇脱氢酶的ADH1基因、或者编码通用氨基酸通透酶的GAP1基因等恒定表达启动子之外,还可以利用GAL1/GAL10(Johnston,M.等人,(1984)Mol.Cell.Biol.4(8),1440-1448)等诱导型启动子。这些可以通过在不存在葡萄糖的条件下,添加半乳糖来进行诱导表达。
用于表达编码本发明的酶蛋白质的DNA的启动子,通常可以使用宿主微生物所带有的启动子,但不限于此,可以适用任何启动子,只要是用于引发本发明的酶蛋白质的基因的转录的碱基序列即可。具体地,可以列举出乳糖操纵子的启动子、色氨酸操纵子的启动子、λ噬菌体来源的PL启动子、色氨酸乳糖杂合(tac)启动子(H.A.Bose等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.80,p.21(1983))等。这些启动子中,出于提高表达效率的目的,也可以使用有诱导性的启动子。例如。对于上述乳糖操纵子的启动子的情况,可以通过添加乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导基因表达。
根据本发明,还提供将本发明的DNA或重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。对于导入本发明的DNA或重组载体的宿主没有特殊限制,可以适宜地使用埃希氏菌属(Escherichia)细菌例如大肠杆菌、放线菌属(Actinomycetes)细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、沙雷氏菌属(Serratia)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、棒杆菌属(Corynebacterium)细菌、短杆菌属(Brevibacterium)细菌、红球菌属(Rhodococcus)细菌、乳杆菌属(Lactobacillus)细菌、链霉菌属(Streptomyces)细菌、栖热菌属(Thermus)细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌、酵母菌属(Saccharomyces)酵母、毕赤酵母属(Pichia)酵母、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)酵母、假丝酵母属(Candida)酵母、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)酵母、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)酵母、耶氏酵母属(Yarrowia)酵母、隐球酵母属(Cryptococcus)酵母、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)酵母、曲霉属(Aspergillus)霉菌、被孢霉属(Mortierella)霉菌、镰刀菌属(Fusarium)霉菌、裂殖壶菌(Schizochytrium)属、破囊壶菌(Thraustochytrium)属等。优选地,宿主细胞可以是大肠杆菌、放线菌、假单胞菌属细菌、酵母菌属酵母。
具体地,可以使用大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、乳酸链球菌(Streptococcuslactis)、干酪乳细菌(Lactobacillus casei)、浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lypolitica)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、黑曲霉(Aspergillus nigar)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)、贝勒被孢霉(Mortierella bainieri)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)、Fusarium fujikuroi、裂殖壶菌(Schizochytrium limacium)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)等。
作为将基因导入上述宿主微生物的方法,可以采用利用感受态细胞法[Journal of Molecular Biology,Vol.53,p.159(1970)]、乙酸锂法[Ito,H.等人,J.Bacteriol.,Vol.153,p.163(1983)]、原生质球法[Hinnen,A.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.75,p.1929(1978)]、电脉冲法[J.Indust.Microbiol.,Vol.5,p.159(1990)]等的转化法、使用噬菌体的转化法[E.Ohtsubo,Genetics,Vol.64,p.189(1970)]、接合转移法[J.G.C.Ottow,Ann.Rev.Microbiol.,Vol.29,p.80(1975)]、细胞融合法[M.H.Gabor,J.Bacteriol.,Vol.137,p.1346(1979)]等。从这些方法中可以适宜选择适合宿主微生物的方法。
除了使用诸如上述的表达载体的表达方法以外,还可以通过将与启动子连接后的编码本发明的酶蛋白质的DNA直接导入宿主微生物的染色体中的同源重组技术、或者使用转座子、插入序列等进行导入的技术来进行表达。因此,本发明的转化体只要表达本发明的酶蛋白质即可,对于基因导入的方法没有限制。
(4)使用本发明的转化体制造本发明的酶蛋白质
根据本发明,对像上述(3)那样得到的转化体进行培养,并从该培养物收集本发明的酶蛋白质。
转化体的培养可以使用包含碳源、氮源、无机盐、各种维生素等的常规营养培养基来进行,作为碳源,可以使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等糖类,乙醇、甲醇等醇类,柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸等有机酸类,废糖蜜等。作为氮源,可以单独或混合使用例如氨气、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素等。此外,作为无机盐,可以使用例如磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁等。此外,培养基中可以添加蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆(corn steep liquor)、酪蛋白氨基酸、生物素等各种维生素等营养素。
培养通常在通气搅拌、振荡等需氧条件下进行。对培养温度没有特殊限制,只要是宿主微生物能够生长繁育的温度即可,此外,对培养过程中的pH也没有特殊限制,只要是宿主微生物能够生长繁育的pH即可。培养中的pH调整可以通过添加酸或碱来进行。
从培养物收集酶蛋白质,可以以酶蛋白质的活性作为指标,采用公知的收集方法来进行。酶蛋白质没有必要一定纯化至均一,只要纯化至与用途相应的纯化度即可。
作为本发明中使用的粗纯化级分或纯化酶蛋白质,不仅可以使用从培养转化体而得到的培养液分离的菌体,还可以使用对培养液、菌体采用超声波、压榨等手段进行破碎而得到的破碎物,将该破碎物用水等提取而得到的、含有本发明的酶蛋白质的提取物,对该提取物进一步进行硫铵盐析、柱色谱等处理而得到的本发明的酶蛋白质的粗酶蛋白质制品或纯化的酶蛋白质制品。而且,还可以使用将上述菌体、破碎物、提取物、粗纯化级分或纯化酶蛋白质固定于载体而得到的制品。
所述菌体、菌体破碎物、提取物或纯化酶蛋白质的固定化可以按照其本身已知的常规采用的方法,采用在丙烯酰胺单体、藻酸、或角叉菜胶(carrageenan)等适当的载体上固定化菌体等方法来进行。例如,在将菌体固定化于载体的情况下,可以从培养物回收后直接使用,或者使用由适当缓冲液例如0.02~0.2M左右的磷酸缓冲液(pH6~10)等洗涤后的菌体。
(5)使用本发明的酶蛋白质等制造孕烯醇酮、孕酮、7-脱氢孕烯醇酮的方法
根据本发明,通过使(i)上述的本发明的酶蛋白质(CYPSS204A)、具有向该酶蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质和具有向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;或者(ii)本发明的酶蛋白质、具有向该酶蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质和具有向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的融合蛋白质与上述式(I)表示的固醇接触,能够制造式(II)的化合物。
在本发明中,除了上述蛋白质以外,通过使下述蛋白质与式(I)的固醇接触,也能够制造式(II)表示的化合物:(a)由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列构成的蛋白质(CYP204A1)、具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质和向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;(b)由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质、具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质和向铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;(c)使由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质或由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质、对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质和对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质。
这里,具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质和具有向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质也可以是具有这两者的活性的1种蛋白质。例如,可以利用将巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)的P450-BM3基因的P450还原酶结构域与酶蛋白质(CYP204A1)连接而人工制作的融合蛋白质(Helvig,C.和Capdevila,J.H.,Biochemistry,(2000)39,5196-5205)。此外,上述蛋白质与式(I)表示的固醇的接触可以是添加酶蛋白质,也可以是使产生上述蛋白质的微生物或其处理物、上述转化体或其处理物进行接触。
此外,作为铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶,其中,铁氧还蛋白还原酶可以例如选自下组:菠菜来源的铁氧还蛋白还原酶、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源假单胞氧还蛋白还原酶、动物来源的皮质铁氧还蛋白还原酶、地下鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas subterranea)来源铁氧还蛋白还原酶、溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Novosphingobium aromaticivorans)来源铁氧还蛋白还原酶、大肠杆菌(Escherichia coli)来源黄素氧还蛋白还原酶或铁氧还蛋白还原酶、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源铁氧还蛋白还原酶、或其它的铁氧还蛋白还原酶。而铁氧还蛋白可以例如选自下组:菠菜来源的铁氧还蛋白、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源假单胞氧还蛋白、动物来源的皮质铁氧还蛋白、地下鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas subterranea)来源铁氧还蛋白、溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Novosphingobium aromaticivorans)来源铁氧还蛋白、大肠杆菌(Escherichia coli)来源黄素氧还蛋白或铁氧还蛋白、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源铁氧还蛋白、或其它的铁氧还蛋白型蛋白质。
对于反应的方法没有特殊限制,可以在含有本发明的酶蛋白质(CYPSS204A)和CYP204A1或产生该酶蛋白质的微生物等的液体中加入作为底物的式(I)表示的固醇,并于适当的温度(例如10℃~40℃左右)进行反应。由此,能够制造孕烯醇酮、孕酮或7-脱氢孕烯醇酮等式(II)表示的化合物。或者,在产生本发明的酶蛋白质的微生物内源性产生式(I)表示的固醇的情况下,使固醇进行反应,也能够制造式(II)表示的化合物。
此外,对于从反应混合物中分级出作为目标的式(II)表示的化合物的方法没有特殊限制,可以使用本领域技术人员公知的用于分离或纯化的方法。例如,可以通过溶剂提取、结晶析出、树脂吸附、柱色谱等来进行,但不限于此。
(6)制造皮质醇及其衍生物的方法
在上述式(II)表示的化合物的制造方法中,通过进一步使类固醇17α位羟化酶蛋白质、类固醇21位羟化酶蛋白质、类固醇11β位羟化酶蛋白质、固醇3位氧化异构酶蛋白质和固醇Δ7-还原酶蛋白质进行接触,可以制造皮质醇。
类固醇17α位羟化酶蛋白质、类固醇21位羟化酶蛋白质、类固醇11β位羟化酶蛋白质、固醇3位氧化异构酶蛋白质、固醇Δ7-还原酶蛋白质与上述式(II)表示的化合物或者从该化合物利用上述的蛋白质中任意的酶反应而得到的转化物的接触,可以是添加该酶蛋白质,也可以是使产生上述蛋白质的微生物或其处理物、上述转化体或其处理物进行接触。这里,类固醇17α位羟化酶蛋白质、类固醇21位羟化酶蛋白质、类固醇11β位羟化酶蛋白质、固醇3位氧化异构酶蛋白质可以使用例如Molecular and CellularEndocrinology 1990,73,73-80所述的那些。此外,固醇Δ7-还原酶蛋白质可以使用Journal of Biological Chemistry 1996,271,10866-10873记载的拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的、或者Applied and Environmental Microbiology2007,73,1736-1741记载的被孢霉属(Mortierella)霉菌来源的。类固醇17α位羟化酶蛋白质优选例如牛、小鼠、大鼠或者人来源的细胞色素P450c17。此外,类固醇21位羟化酶蛋白质优选牛、小鼠、大鼠或者人来源的细胞色素P450c21,作为类固醇11β位羟化酶蛋白质优选牛、小鼠、大鼠或者人来源的细胞色素P450c11或新月弯孢菌(Curvularia lunata)来源的P-450lun等。而且,固醇3位氧化异构酶蛋白质优选牛、小鼠、大鼠或者人来源的3β-羟基类固醇脱氢酶(3βHSD)或链霉菌属(Streptomyces)细菌来源的胆固醇氧化酶,固醇Δ7-还原酶蛋白质优选拟南芥来源NADPH-固醇Δ7-还原酶、高山被孢霉(Mortierella alpina)来源固醇Δ7-还原酶(MoDELTA7SR)。
而且,通过用含有选自葡萄糖、蔗二糖、甘油、甲醇、乙醇、柠檬酸、乙酸中的任意原料的培养基,对具有从上述原料生成上述式(I)所表示的固醇的活性以及生成固醇Δ7-还原酶、固醇3位氧化异构酶、类固醇17α位羟化酶、类固醇21位羟化酶和类固醇11β位羟化酶的活性、且具有以下(A)~(E)中任一项的特征的酵母或霉菌进行培养的方法,也是优选的本发明的皮质醇的制造方法。
(A)具有生成如下混合物的活性,该混合物是项1或2所述的蛋白质、具有向该酶蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质和具有向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(B)具有生成如下融合蛋白质的活性,该融合蛋白质是使项1或2所述的蛋白质、对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质和对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质;
(C)具有生成如下混合物的活性,该混合物是由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质、具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质和向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(D)具有生成如下混合物的活性,该混合物是由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质和向铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(E)具有生成如下融合蛋白质的活性,该融合蛋白质是使由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质或由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度(Vmax)为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质和对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质。
本方法中,具有生成该蛋白质的活性是指:优选采用使用将编码该蛋白质的DNA插入上述表达载体、并转化上述酵母或霉菌而得到的转化酵母或转化霉菌的方法。
这里,作为优选使用的酵母或霉菌,可以列举出酵母菌属(Saccharomyces)酵母、毕赤酵母属(Pichia)酵母、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)酵母、耶氏酵母属(Yarrowia)酵母、曲霉属(Aspergillus)霉菌、被孢霉属(Mortierella)霉菌。更优选地,可以列举出酵母菌属酵母。具体地可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),更具体地可以列举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(JP2004-528827 A1)株(下同)、FY1679-18b株(JP2004-528827A1)、KA311A株(FERM:P-19053)、YPH499株(ATCC#204679)、YPH500株(ATCC#204680)等,编码各酶蛋白质的DNA优选插入pESC-LEU(Stratagene公司)等表达载体或酵母菌的染色体。此外,优选这些酵母或霉菌具有以下(1)-(6)的任意性质或全部。(1)通过对编码固醇-22去饱和酶蛋白质的基因或调控其表达的区域的DNA序列进行修饰,使内源性的固醇的22位与23位之间未进行不饱和化;(2)NADP-细胞色素P450还原酶蛋白质的表达,通过将编码该蛋白质的基因与其表达调控区一起以1拷贝以上导入宿主细胞,而得到强化;(3)通过对编码固醇酯化酶蛋白质的基因或调控其表达的区域的DNA序列进行修饰,使内源性的固醇未酯化;(4)固醇酯水解酶的表达,通过将编码该蛋白质的基因与其表达调控区一起以1拷贝以上导入宿主细胞,而得到强化;(5)通过将分别编码向类固醇17α羟化酶、类固醇21位羟化酶、类固醇11β位羟化酶传递电子的铁氧还蛋白型蛋白质和具有针对该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的基因与其表达调控区一起导入宿主细胞,该蛋白质的表达得到强化;(6)通过对编码固醇-24甲基转移酶蛋白质的基因或调控其表达的区域的DNA序列进行修饰,使内源性的固醇的24位上不存在甲基。
对于从反应混合物中分级出皮质醇的方法没有特殊限制,可以使用本领域技术人员公知的用于分离或纯化的方法。例如,可以通过溶剂提取、结晶析出、树脂吸附、柱色谱等来进行,但不限于此。
此外,从上述制造的皮质醇出发,可以采用公知方法制造图2以及图3所述的衍生物。而且,对于这样制造的皮质醇及其衍生物,可以采用其本身已知的方法,利用试管内或者生物体内的药理学或生理学试验,进行其作为医药的活性、安全性的筛选,从而将其作为该疾病治疗药物。这种情况下,制造以通过上述工序获得的化合物作为有效成分的医药组合物的方法也包含在本发明中。
具体地,其本身可以单独使用,也可以与药学可接收的载体相配合作为医药组合物使用。这样得到的医药化合物本身可以单独使用,也可以与药学可接收的载体相配合作为医药组合物使用。相对于载体,此时的有效成分的比例可以在0.01~90重量%之间变动。
根据需要,本发明中得到的医药组合物,可以以施加了糖衣的片剂、胶囊剂、软胶囊剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、液剂等剂型口服施用,或者以与药学可接受的液体的无菌性溶液或悬浮剂型等注射剂的形式例如静脉内施用、肌肉内施用、局部内施用、皮下施用。此外,还可以是栓剂、舌下片剂、经鼻、经肺制剂等粘膜施用,以及软膏、贴敷剂等作为外用制剂施用。在制备口服、非口服的组合物时,可以通过与有机或无机的固体或液体的载体、稀释剂一起、以常规使用的单位容量形式混合来进行。这些制剂中的有效成分量调整为可以获得指示的范围的适当容量。
作为制造用于口服施用和粘膜施用的固形制剂时使用的赋形剂,可以使用例如乳糖、蔗糖、淀粉、滑石粉、纤维素、糊精、高岭土、碳酸钙等。用于口服施用的液体制剂、即糖浆剂、悬浮剂、液剂等中包含通常使用的非活性稀释剂,例如水、植物油等。该制剂中除了非活性稀释剂以外,还可以包含添加剂,例如湿润剂、助悬剂、甜味剂、香味剂、着色剂、保存剂、稳定剂等。作为注射剂、粘膜施用剂等制造中使用的溶剂或悬浮化剂,可以列举出例如水、丙二醇、聚乙二醇、苄醇、油酸乙酯、磷脂酰胆碱等。作为栓剂中使用的基质,可以列举出例如可可脂、乳化可可脂、月桂油(laurin butter)、Witepsol等。外用制剂的制造中,作为溶解剂或溶解添加剂可以使用醇、脂肪酸酯类、丙二醇等,作为粘合剂可以使用羧基乙烯基聚合物、多糖类等,作为乳化剂可以使用表面活性剂等等。
实施例
以下实施例中,常规实验方法遵照Sambrook等的实验手册(Sambrook,J.,and Russel,D.W.:Molecular cloning:a laboratory manual.3rd edition.ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)进行。
实施例1:获得编码地下鞘氨醇单胞菌NBRC16086来源P450scc(CYPSS204A)和铁氧还蛋白的DNA
将地下鞘氨醇单胞菌NBRC 16086(独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门)接种于L培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、0.1%葡萄糖、pH7.2),30℃培养过夜,从所得的菌体中提取基因组DNA。基因组DNA的提取使用了DNA提取试剂盒ISOPLANT(和光纯药工业公司制造)。对于该基因组DNA,使用引物CYP-1F(SEQ ID NO:5)和引物CYP-2R(SEQ ID NO:6)使用LA Taq聚合酶(TAKARA Bio公司制造)进行聚合酶链式反应(PCR),扩增出编码CYPSS的DNA(有时也称为“CYPSS204A基因”)的一部分。此时的温度条件是:94℃/3分钟、(94℃/30秒,55℃/30秒,72℃/90秒)30个循环、72℃/5分钟。
测定了作为该反应的结果扩增出的1.0kb基因片段的碱基序列。以该碱基序列信息为基础进行反向PCR,测定了包含上述CYP204A1基因及其下游存在的铁氧还蛋白基因的1.8kb DNA区域的全碱基序列(SEQ ID NO:3)。此外,CYPSS204A基因(SEQ ID NO:3的1位~1419位)的碱基序列示于SEQID NO:1,CYP204A1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1所述的碱基序列中,碱基编号1430~1762表示铁氧还蛋白。
实施例2:制作地下鞘氨醇单胞菌NBRC 16086来源P450scc(CYPSS204A)的大肠杆菌表达株BP215
从实施例1中所得的地下鞘氨醇单胞菌NBRC 16086基因组DNA,利用引物CYP-3F(SEQ ID NO:7)和引物CYP-4R(SEQ ID NO:8),使用KODplus聚合酶(东洋纺绩公司制造)进行PCR,扩增出包含CYPSS204A及存在于其下游的铁氧还蛋白基因的DNA区域。此时的温度条件是:95℃/5分钟、(98℃/30秒,60℃/30秒,68℃/2分钟)30个循环、68℃/10分钟。
使用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification Kit)(QIAGEN公司制造),对扩增出的1.8kb DNA片段进行纯化,在用Nde I和Spe I进行消化后,使用T4 DNA连接酶将其与大肠杆菌表达载体pT7NS-camAB(国际公开公报2003/087381小册子)连接,并转化大肠杆菌DH5a,从而构建了质粒pCYPSS-camAB。用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),将所得的菌株命名为BP215。
实施例3:从溶芳烃鞘氨醇单胞菌ATCC 700278获得编码P450scc(CYP204A1)的DNA以及制作大肠杆菌表达株BP172
将溶芳烃鞘氨醇单胞菌(ATCC 700278)接种于L培养基,30℃培养2天,像实施例1那样从所得菌体提取基因组DNA。使用引物CYP-5F(SEQ ID NO:9)和引物CYP-6R(SEQ ID NO:10)、以及LA Taq聚合酶(TAKARA Bio公司制造),从该基因组DNA扩增出包含CYP204A1基因及存在于其下游的铁氧还蛋白基因的片段。此时的温度条件是:94℃/3分钟、(98℃/20秒,63℃/30秒,68℃/2分钟)30个循环、72℃/5分钟。该1.8kb的碱基序列示于SEQ IDNO:4。其碱基编号1~1422是CYP204A1,1433~1765是铁氧还蛋白基因。
使用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification Kit)(QIAGEN公司制造),对作为该反应的结果扩增出的包含CYP204A1基因及存在于其下游的铁氧还蛋白基因的1.8kb DNA片段进行纯化,在用Nde I和Spe I进行消化后,使用T4 DNA连接酶将其与大肠杆菌表达载体pT7-camAB连接,并转化大肠杆菌DH5a,从而构建了质粒pCYP204A1-camAB。用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),将所得的菌株命名为BP172。CYP204A1基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:23。
实施例4:在巨大芽胞杆菌中表达CYP204A1基因以及使用该菌体将4-胆甾烯-3-酮转化为孕酮
以实施例3中制作的pCYP204A1-camAB作为模板,使用引物CYP-7F(SEQ ID NO:11)和CYP-8R(SEQ ID NO:12)、以及KOD plus聚合酶(东洋纺公司制造),扩增出包含CYP204A1基因及存在于其下游的铁氧还蛋白基因的片段。此时的温度条件是:94℃/2分钟、(94℃/20秒、55℃/30秒,68℃/3分钟)20个循环、72℃/5分钟。
使用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification Kit)(QIAGEN公司制造),对作为该反应的结果扩增出的包含CYP204A1基因及存在于其下游的铁氧还蛋白基因的1.8kb DNA片段进行纯化,在用Nhe I和Bam HI进行消化后,使用T4 DNA连接酶将其连接与巨大芽胞杆菌表达载体pHW1520(MoBiTec公司制造)连接,并转化大肠杆菌DH5a,从而构建了质粒pXYL204CB。用该质粒转化巨大芽胞杆菌感受态细胞(MoBiTec公司制造),得到了菌株pXYL204CB。
将该菌株接菌于添加了四环素10mg/ml(终浓度)的TB培养基2ml中,37℃、220rpm振荡培养16小时。将该前培养液250μl加入到相同的TB培养基25ml中,37℃振荡培养2.5小时后,添加50%木糖250μl,30℃、125rpm振荡培养6小时。将从该培养液通过离心分离回收的菌体悬浮于转化用缓冲液(50mM KPB、2%甘油[pH 7.4])5ml中,作为菌体悬浮液。
在该菌体悬浮液2ml中加入4-胆甾烯-3-酮甲醇溶液(100mg/ml)2μl,振荡(220rpm)条件下于30℃温育24小时。然后,向该反应液中加入2ml的乙酸乙酯,漩涡混合后,用离心机4000rpm离心10分钟。对所得的乙酸乙酯相1.5ml进行浓缩干燥,然后将其溶解于200μl的甲醇中,用于HPLC分析。其结果是,4-胆甾烯-3-酮以24.5%的转化率转化为孕酮。HPLC条件如下。柱:Inertsil ODS-3 4.6X50mm;流速:1.2ml/min;温度:40℃;检测器:PDA(240nm);梯度:0/4/5/5.5(min)、40/100/100/40(%B)。
实施例5:酶蛋白质的各种性质
(1)表达载体的构建
为了扩增包含CYP204A1、CYPSS、CYP11A基因的DNA片段,制作了以下引物:CYP204A1-1F(SEQ ID NO:13)、CYP204A1-2R(SEQ ID NO:14)、CYPSS-1F(SEQ ID NO:15)、CYPSS-2R(SEQ ID NO:16)、CYP11A-1F(SEQ ID NO:17)、CYP11A-2R(SEQ ID NO:18)。然后,使用这些引物,以插入有pCYP204A1-camAB、pCYPSS-camAB和作为牛来源的P450scc的CYP11A的pCYP11A-ARX(参照参考例1)作为模板,利用KODplus(TOYOBO)进行了PCR反应。此时的温度条件是:95℃/3分钟、(98℃/20秒、55℃/30秒、72℃/2分钟)25个循环、72℃/5分钟。
该反应的结果是,在CYP204A1、CYPSS、CYP11A方面,扩增出了约1.4kbp大小的DNA片段(以下称为DNA片段-A,B,C)。用Wizard SV凝胶(Wizard SV Gel)和PCR提纯系统(PCR Clean-Up System)(PROMEGA)进行纯化,在用NdeI和XhoI进行消化后,使用DNA连接试剂盒ver 2.1(DNALigation Kit ver 2.1)(TaKaRa)将其与pET22b连接,从而得到了质粒pET22-CYP204A1、pET22-CYPSS、pET22-CYP11A。
(2)制作CYP204A1、CYPSS204A、CYP11A诱导菌体
使用上述(1)中制备的质粒pET22-CYP204A1、pET22-CYPSS、pET22-CYP11A转化大肠杆菌BL21(DE3)。将这样得到的转化体接菌于含50μg/ml羧苄青霉素的1mlTB培养基中,37℃培养14小时。将该1ml的培养液接菌于含50μg/ml羧苄青霉素和过夜表达自动诱导系统1(OvernightExpress Autoinduction system 1)(Merck)的100ml的TB培养基中,于25℃进行24小时的培养并诱导目的蛋白质。通过离心回收菌体,将其悬浮于20ml的CV缓冲液(50mM KPB(磷酸钾缓冲液),10%甘油,1mM EDTA,2mM二硫苏糖醇,1mM D-葡萄糖)中,于-80℃保存细胞悬浮液。
(3)制备无细胞提取液
在上述(2)中制备的细胞悬浮液20ml中加入680μl的X10 Bug Buster(Novagen)、20μl的核酸酶(Benzonase)(Novagen)和2ml的40mg/ml溶菌酶,30℃搅拌30分钟破碎细胞,通过离心得到了无细胞提取液。将所得的约20ml的无细胞提取液用1L的缓冲液R(20mM KPB pH 7.4,20%甘油)透析2次,其间通过离心除去析出的沉淀。这里,将作为上清的所得的无细胞提取液用于以后的实验。
(4)利用一氧化碳结合谱解析确认各种P450scc的表达
将所得的无细胞提取液分成两份,向其中的一份鼓入一氧化碳。向有或没有鼓入一氧化碳的两份样品中加入连二亚硫酸盐(dithionite),测定了差谱。对于CYP204A1和CYPSS204A,得到了在450nm附近具有极大吸收的峰,确认了P450scc的表达;而在CYP11A则未得到,这提示样品中不存在活性型的P450。根据该结果,以后的实验使用CYP204A1和CYPSS进行。
(5)最适pH的研究
使用上述(3)中制备的无细胞提取液,在各种pH下进行了4-胆甾烯-3-酮的转化。制备反应液,使得1ml缓冲液R中包含215pmol/mlCYP204A1或367pmol/mlCYPSS204A、64μg/ml菠菜来源铁氧还蛋白、0.1U/ml菠菜来源铁氧还蛋白还原酶蛋白质、3U/ml葡糖脱氢酶、60mM葡萄糖、50μg/ml 4-胆甾烯-3-酮、2mM NADH和2mM NADPH,在1ml的反应液中中加入各种pH的200mM缓冲液562μl来调整pH。反应通过NADH和NADPH的添加而开始,200rpm、30℃进行14小时。添加1.5ml乙酸乙酯来终止反应,进行提取,然后再次用0.75ml乙酸乙酯进行提取。将所得的乙酸乙酯相用蒸发器进行干燥,用200μl甲醇溶解残渣。利用HPLC分析对孕酮进行检测。各pH条件下的从4-胆甾烯-3-酮到孕酮的酶蛋白质活性如表1所示。酶蛋白质活性以1小时、每1molP450的孕酮生成量g来表示。该结果显示,CYP204A1和CYPSS在Tris-HCl pH 7.5的条件下具有最高活性。
(6)最适温度的研究
使用上述(3)中制备的无细胞提取液,在各种pH下进行了4-胆甾烯-3-酮的转化。制备反应液,使得1ml中包含215pmol/mlCYP204A1或391pmol/mlCYPSS、64μg/ml菠菜来源铁氧还蛋白、0.1U/ml菠菜来源铁氧还蛋白还原酶蛋白质、3U/ml葡糖脱氢酶、60mM葡萄糖、50μg/ml 4-胆甾烯-3-酮、2mM NADH和2mM NADPH,用Tris-HCl调整为pH 7.5。反应通过NADH和NADPH的添加而开始,在200rpm、温度条件分别为10,15,20,25,30℃的条件下进行4小时。添加1.5ml乙酸乙酯来终止反应,进行提取,然后再次用0.75ml乙酸乙酯进行提取。将所得的乙酸乙酯相用蒸发器进行干燥,用200μl甲醇溶解残渣。利用HPLC分析对孕酮进行检测。各温度条件下的从4-胆甾烯-3-酮到孕酮的酶蛋白质活性如表1所示。该结果显示,CYP204A1在15~20℃具有最高活性,而CYPSS在15℃具有最高活性。
[表1]
(7)pH稳定性试验
将上述(3)中制备的0.5ml的无细胞提取液与各种pH的0.5ml的50mM缓冲液混合,测定pH并于6℃保存140小时。酶蛋白质液的pH为AcB(醋酸盐缓冲液(acetate buffer))pH 6.0,KPB pH 6.7,KPB pH 7.2,KPB pH 7.6,TES pH 7.5,Tris-HCl pH 8.1,Tris-HCl pH 8.9。使用制备的各种pH的无细胞提取液进行4-胆甾烯-3-酮的转化。在刚刚将酶蛋白质液用各种pH的缓冲液混合后、以及保存140小时后进行反应,测试了稳定性。制备反应液,使得1ml中包含CYP204A1或CYPSS的各pH的酶蛋白质液、64μg/ml菠菜来源铁氧还蛋白、0.1U/ml菠菜来源铁氧还蛋白还原酶蛋白质、3U/ml葡糖脱氢酶、60mM葡萄糖、50μg/ml 4-胆甾烯-3-酮、2mM NADH和2mMNADPH,加入200mM Tris-HCl 562μl,调整至pH 7.5。确认即使加入各种pH的酶蛋白质液,反应液仍为pH 7.5。反应通过NADH和NADPH的添加而开始,200rpm、15℃进行4小时。添加1.5ml乙酸乙酯来终止反应,进行提取,然后再次用0.75ml乙酸乙酯进行提取。将所得的乙酸乙酯相用蒸发器进行干燥,用200μl甲醇溶解残渣。利用HPLC分析对孕酮进行检测。0小时和140小时的从4-胆甾烯-3-酮到孕酮的酶活性示于表2。该结果显示,CYP204A1、CYPSS均是在KPB pH 7.6最稳定。
[表2]
(8)温度稳定性试验
将上述(3)中制备的无细胞提取液在各种温度下保存140小时。保存的温度是6,10,20,30,37,45℃。使用保存前的酶蛋白质液和140小时保存后的样品进行4-胆甾烯-3-酮的转化,测试了稳定性。制备反应液,使得1ml中包含各温度下保存后的CYP204A1或CYPSS酶蛋白质液、64μg/ml菠菜来源铁氧还蛋白、0.1U/ml菠菜来源铁氧还蛋白还原酶蛋白质、3U/ml葡糖脱氢酶、60mM葡萄糖、50μg/ml 4-胆甾烯-3-酮、2mM NADH和2mM NADPH。反应通过NADH和NADPH的添加而开始,200rpm、15℃进行4小时。添加1.5ml乙酸乙酯来终止反应,进行提取,然后再次用0.75ml乙酸乙酯进行提取。将所得的乙酸乙酯相用蒸发器进行干燥,用200μl甲醇溶解残渣。利用HPLC分析对孕酮进行检测。0小时与140小时的从4-胆甾烯-3-酮到孕酮的酶蛋白质活性如表3所示。该结果显示,CYP204A1、CYPSS的稳定性均随保存温度的降低而提高。特别是,在20℃保存140小时时,CYP204A1残存47%的活性,而CYPSS残存39%的活性。
[表3]
(9)CYP204A1与CYPSS的动力学解析
使用上述(3)中制备的无细胞提取液,以底物浓度0.1~500μM的条件进行4-胆甾烯-3-酮的转化,考察了底物浓度与酶蛋白质活性的关系。制备反应液,使得1ml中包含220pmol的CYP204A1或250pmol的CYPSS、96μg/ml菠菜来源铁氧还蛋白、0.1U/ml菠菜来源铁氧还蛋白还原酶蛋白质、3U/ml葡糖脱氢酶、60mM葡萄糖、2mM NADH和2mM NADPH,用Tris-HCl调整至pH 7.5。加入20μl溶解于DMSO中的4-胆甾烯-3-酮,使得终浓度为0.1,0.5,1,2,5,10,20,50,100,500μM。反应通过NADH和NADPH的添加而开始,200rpm、15℃进行60分钟。添加1.5ml乙酸乙酯来终止反应,进行提取,然后再次用0.75ml乙酸乙酯进行提取。将所得的乙酸乙酯相用蒸发器进行干燥,用200μl甲醇溶解残渣。利用HPLC分析对孕酮进行检测。底物浓度与酶蛋白质活性的关系、以及通过制作Lineweaver-Burk plot而计算出的动力学参数如表5所示。该结果显示,CYP204A1与CYPSS的Km值为同等程度的1.0和1.1μM,而Vmax为47.4和78.7mmol/min/mol,CYPSS高至约1.7倍。此外,该结果的比较显示,对CYPSS不易施加底物抑制。
[表4]
[表5]
上述的结果的概要如下。最适pH:pH 7.5~8.0(CYP204A1,CYPSS两者);作用最适温度:15~20℃(CYP204A1,CYPSS两者);pH稳定性:在中性附近稳定、最稳定为KPB pH 7.6(CYPSS,CYP204A1两者);热稳定性:于20℃保存140小时后,保持30%以上的酶蛋白质活性(CYPSS,CYP204A1两者);动力学解析:Vmax方面,与CYP204A1相比CYPSS高至约1.7倍;Km值:CYPSS与CYP204A1基本等同(1μM);底物抑制:通过4-胆甾烯-3-酮可以施加底物抑制,与CYP204A1相比,CYPSS不易受底物抑制,此外,与4-胆甾烯-3-酮的浓度为10μM时的CYPSS或CYP204A1的酶蛋白质活性相比,100μg/ml时的各酶蛋白质活性分别为90%或67%。即,底物浓度从10μM提高至100μM的情况下的活性的降低率为10%或33%。
实施例6:利用BP215株进行4-胆甾烯-3-酮的转化反应(孕酮的制备)
将大肠杆菌表达BP215株接菌于M9混合培养基(Na2HPO4:0.68%,KH2PO4:0.3%,NaCl:0.05%,NH4Cl:0.01%,酪蛋白氨基酸:1%,D-葡萄糖:0.4%,CaCl20.1mM,MgCl2:1mM,硫胺:0.002%,FeSO4:0.1mM,羧苄青霉素:0.005%)2ml中,30℃、振荡培养17小时,得到了前培养液。将该前培养液0.25ml接菌于使用Overnight ExpressTM AutoinductionSystem(Novagen Cat.No.71300-4)的本培养培养基(Na2HPO4:0.68%,KH2PO4:0.3%,NaCl:0.05%,NH4Cl:0.01%,酪蛋白氨基酸:1%,CaCl20.1mM,MgCl2:1mM,硫胺:0.002%,FeSO4:0.1mM,羧苄青霉素:0.005%,OvernightExpressTM溶液:7%,5-Aminolevlic acid:0.008%)25ml中,25℃振荡培养24小时。对该本培养液5ml进行离心分离(3500rpm,10分钟),在所得菌体中加入CV2缓冲液(含甘油:2%,羧苄青霉素:0.005%,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷:0.1mM的50mM(pH)磷酸钾缓冲液)1ml后,再加入4-胆甾烯-3-酮的1%甲醇溶液0.01ml和甲基-β-环糊精的25%水溶液0.02ml,28℃振荡5小时进行反应。反应结束后,加入甲醇4ml并充分混合,离心分离并对上层进行HPLC分析。在保留时间2.6分钟检出孕酮的峰,与孕酮标准品的保留时间和MS谱(m/z=315M+1)一致。累积量为78.0mg/l(转化:78%)。此外,未检出4-胆甾烯-3-酮(保留时间8.1分钟)。
分析条件:Chromolith speed rod RP18e(50x4.6mm)柱,移动相为50%→100%CH3CN梯度(0~3min)100%CH3CN(3~8min),流速2ml/min,CADTM(Charged Aerosol Detection),MS检测。
实施例7:利用BP215株进行的胆固醇的转化反应
以胆固醇作为底物,像实施例6那样进行反应后,进行处理分析,结果在保留时间2.5分钟检出了孕烯醇酮的峰,与孕烯醇酮标准品的保留时间和MS谱(m/z=317M+1)一致。累积量为68.2mg/l(转化:68.2%)。此外,胆固醇(保留时间8.5分)有3.7%残留。
实施例8:利用BP215株进行的7-脱氢胆固醇、麦角固醇的转化反应
以7-脱氢胆固醇作为底物,像实施例6那样进行反应后,进行处理分析,结果在保留时间2.1分钟检出了7-脱氢孕烯醇酮的峰(m/z=315M+1)。累积量为34.3mg/l(转化:34.3%)。此外,7-脱氢胆固醇(保留时间7.5分钟)有54%残留。
以麦角固醇作为底物,像实施例6那样进行反应后,进行处理分析,结果在保留时间2.1分钟检出了7-脱氢孕烯醇酮的峰。累积量为2.8mg/l(转化:2.8%)。
实施例9:利用BP215株进行的各种底物的转化反应
以β-谷固醇、豆固醇、菜油固醇和链甾醇作为底物,分别像实施例6那样进行反应后,进行处理分析,结果在保留时间2.5分钟检出了孕烯醇酮的峰,与孕烯醇酮标准品的保留时间和MS谱(m/z=317M+1)一致。累积量分别为40.9mg/l(转化:40.9%)、5.8mg/l(转化:5.8%)、27.9mg/l(转化:27.9%)、71.7mg/l(转化:71.7%)。此外,添加的底物(保留时间分别为10.1、9.3、9.2、7.2分钟)分别有55.9%,70.8%,25.5%,21.3%残留。而且,对于β-谷固醇而言,产物是微量的,因此将反应液用乙酸乙酯提取并浓缩5倍来进行分析。
实施例10:(20R,22R)-20,22-二羟基-4-胆甾-4-烯-3-酮、以及(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮的化学合成
20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮的2个立体异构体的合成使用文献公开的合成方法,在经由20,22-二羟基胆固醇后采用常规的氧化反应来实施。
(A)20,22-二羟基胆固醇(10-A)的合成
Steroids(2004),69,483/B.Watanabe等人记载了化合物(10-A)的2个异构体[(20R,22R)体和(20R,22S)体]的化学合成,按照该实验方法来实施(10-A)的合成。
简要地说,以孕烯醇酮作为出发原料,用叔丁基二甲基氯硅烷(tert-butyldimethyl silyl chloride)将3位做成保护基,再添加4-甲基-1-戊炔,从而得到了(20R)-3β-(叔丁基二甲基硅氧基)胆甾-5-烯-22-炔-20-醇。将其用Lindlar催化剂还原为顺式烯烃,从而得到(20R,22Z)-3β-(叔丁基二甲基硅氧基)胆甾-5,22-二烯-20-醇,将其用VO(acac)2/TBHP转化为22,23-环氧化合物(epoxide)(异构体混合物),将其以异构体混合物的形式不进行分离,而是用LiAlH4进行还原,从而转化为20,22-二羟基体,用TBAF将3位脱保护,从而得到(20R,22RS)-20,22-二羟基胆固醇(10-A)。
(B)20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮(10-B)的合成
参考前面文献的方法,首先从(10-A)得到了(20R,22RS)-20,22-O-异亚丙基二氧胆固醇((20R,22RS)-20,22-O-isopropylidenedioxy cholesterol)[PPTS存在下,使22-二甲氧基丙烷作用]。将其按常规方法通过Oppenauer氧化转化成4-烯-3-酮体。实验步骤具体如下。
在充分氮置换Dean-Stark装置内,将(20R,22RS)-20,22-O-异亚丙基二氧胆固醇(3.0g)溶解于甲苯100mL,添加1-甲基-4-哌啶酮(piperidone)(8.1mL,10eq)后,控制反应温度为130-140℃,添加Al(OiPr)3(2.7g,2eq)并搅拌4小时。反应结束后,用乙醚稀释并进行常规处理,然后进行二氧化硅凝胶色谱纯化[己烷/乙酸乙酯=8/1~5/1],得到了(20R,22RS)-20,22-O-异亚丙基二氧胆甾-4-烯-3-酮(2.9g,y97%)。
最后,通过对(20R,22RS)-20,22-O-异亚丙基二氧胆甾-4-烯-3-酮进行脱缩酮(acetonide)保护,将其转化为(10-B),进一步再分别获得2个立体异构体。具体实验步骤如下。
将(20R,22RS)-20,22-O-异亚丙基二氧胆甾-4-烯-3-酮(2.9g)在THF(20mL)+甲醇(20mL)中于室温进行搅拌,同时添加2N盐酸(1.0mL)和高氯酸(0.8mL),反应60小时。用氯仿稀释并进行常规处理后,进行二氧化硅凝胶色谱纯化[己烷/乙酸乙酯=7/1~2/1],分离获得脱保护产物(1.48g,y47%)和未反应原料(1.24g)。对于脱保护产物,用己烷/乙酸乙酯进行重结晶,得到了白色固体(1.1g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.90(d,J=6.6Hz,26-H3),0.90(d,J=6.8Hz,27-H3),0.91(s,18-H3),1.19(s,19-H3),1.26(s,21-H3),3.24(dd,J=9.4Hz,5.4Hz,22-H),5.73(s,4-H)→(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮(10-B)[非天然型异构体;本发明的新化合物]
将回收的未反应原料(590mg)在THF(15mL)+甲醇(15mL)中于室温进行搅拌,添加高氯酸(1.4mL),反应10小时。用氯仿稀释并进行常规处理后,进行二氧化硅凝胶色谱纯化[己烷/乙酸乙酯=7/1~2/1],得到了脱保护产物(217mg,y40%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:0.89(d,J=6.3Hz,26-H3),0.91(d,J=6.4Hz,27-H3),0.93(s,18-H3),1.19(s,19-H3),1.21(s,21-H3),3.38(d,J=8.4Hz,22-H),5.73(s,4-H)→(20R,22R)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮(10-B)[天然型异构体;(引用)Helv.Chim.Acta,(2006),89,813/W.Zhang等人]
实施例11:利用BP215株进行的各种底物的转化反应
以(20S)-20-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(22R)-22-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(20R,22R)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮、(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮作为底物,分别像实施例6那样进行反应,对产物进行HPLC分析,结果确认了孕酮的生成。转化率分别为41.0%、42.3%、38.1%和69.8%。此外,添加的底物(保留时间分别为4.9、4.4、3.8、3.5分钟)分别有4.8%、2.7%、0.6%、0.6%残留。
此外,以(20S)-20-羟基-胆固醇、(22S)-22-羟基-胆固醇、(22R)-22-羟基-胆固醇、(20R,22R)-20,22-二羟基-胆固醇作为底物,分别像实施例6那样进行反应后,进行处理分析,结果确认了与各底物对应的侧链开裂体的孕烯醇酮的生成。累积量分别为89.2mg/L(转化:89.2%)、37.5mg/L(转化:37.5%)、80.0mg/L(转化:80%)、53.0mg/L(转化:53.0%)。此外,添加的底物分别有0%、23.5%、14.8%、0%残留。
实施例12:利用BP172株进行的各种底物的转化反应
以4-胆甾烯-3-酮、胆固醇、7-脱氢胆固醇、麦角固醇、β-谷固醇、豆固醇、菜油固醇、链甾醇、(20S)-20-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(22R)-22-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(20R,22R)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮、(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮作为底物,分别像实施例6那样进行反应,对产物进行HPLC分析,结果确认了与各底物对应的侧链开裂体的孕酮、孕烯醇酮或7-脱氢孕烯醇酮的生成。转化率分别为84.0%、71.2%、28.5%、22%、47.2%、6.5%、31.3%、66.1%、63.9%、80.9%、61.3%和41.7%。
此外,以(20S)-20-羟基-胆固醇、(22S)-22-羟基-胆固醇、(22R)-22-羟基-胆固醇、(20R,22R)-20,22-二羟基-胆固醇作为底物,分别像实施例6进行反应后,进行处理分析,结果确认了与各底物对应的侧链开裂体的孕烯醇酮的生成。累积量分别为68.2mg/l(转化:68.2%)、12.9mg/l(转化:12.9%)、69.5mg/l(转化:69.5%)、51.6mg/l(转化:51.6%)。此外,添加的底物分别有25.2%、60.1%、42.8%、0%残留。
参考例1:制作CYP11A表达大肠杆菌
以市售的人睾丸cDNA(Origene Technologies,Inc.)作为模板,使用引物CYP11A-1F(SEQ ID NO:19)和引物CYP11A-2R(SEQ ID NO:20)、KOD plus聚合酶(东洋纺公司制造)进行PCR,扩增了CYP11A1基因。此时的温度条件是:94℃/3分钟、(94℃/30秒,55℃/60秒,72℃/90秒)30个循环、72℃/5分钟。
使用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification Kit)(QIAGEN公司制造)对作为该反应的结果的扩增出的1.45kb的CYP11A1基因片段进行纯化,在用Nde I和Spe I进行消化后,使用T4 DNA连接酶将其与大肠杆菌表达载体pT7NS-camAB连接,并转化大肠杆菌DH5α,从而构建了质粒pCYP11A-camAB。然后,使用T4DNA连接酶在该质粒的Spe I和Bam HI部位插入并连接预先制备的牛来源皮质铁氧还蛋白还原酶蛋白质-皮质铁氧还蛋白基因(adr-adx)片段,并转化大肠杆菌DH5α,从而构建了质粒pCYP11A-ARX。用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),将所得的菌株命名为BL21CYP11。此时使用的adx-adr片段是以质粒pKARX(Sawada等人,Eur.J.Biochem.265,950-956,1999)作为模板、使用引物bAdxR-1F(SEQ ID NO:21)和引物bAdx-2R(SEQ ID NO:22)、以及KOD plus聚合酶(东洋纺公司制造)进行PCR扩增得到的。此时的温度条件是:94℃/3分钟、(94℃/30秒,60℃/30秒,72℃/120秒)25个循环、72℃/5分钟。
使用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification Kit)(QIAGEN公司制造)对作为该反应的结果扩增出的1.85kb的adr-adx基因片段进行纯化,在用Spe I和Fba I进行消化后,用于上述的pCYP11A-ARX的构建。
比较例:利用CYP11A表达大肠杆菌进行的各种底物的转化反应
以4-胆甾烯-3-酮(4Chol)、胆固醇(Chol)、7-脱氢胆固醇(7-DHC)、麦角固醇(Ergo)、β-谷固醇(Sito)、豆固醇(Stigma)、菜油固醇(Cam)和链甾醇(Des)、(20S)-20-羟基胆甾-4-烯-3-酮(20-OH)、(22R)-22-羟基胆甾-4-烯-3-酮(22-OH)、(20R,22R)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮(R-diol)、(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮(S-diol)、羊毛固醇(Lano)作为底物,分别像实施例6那样进行反应,将反应液用乙酸乙酯1ml进行分液,提取反应产物和底物,进行HPLC分析,结果确认了与各底物对应的侧链开裂体的孕酮、孕烯醇酮或7-脱氢孕烯醇酮的生成。转化率分别为0%、2.6%、0.7%、0%、0.8%、0%、1.0%、1.2%、0%、0.4%、4.3%和0%,底物的残存分别为100%、99%、99.2%、100%、99.7%、100%、99.1%、99.6%、100%、99.7%、95%和100%。
此外,以(20S)-20-羟基-胆固醇、(22S)-22-羟基-胆固醇、(22R)-22-羟基-胆固醇、(20R,22R)-20,22-二羟基-胆固醇作为底物,分别像实施例6那样进行反应后,进行处理分析,结果确认了与各底物对应的侧链开裂体的孕烯醇酮的生成。累积量分别为16.3mg/l(转化:16.3%)、6.1mg/l(转化:6.1%)、28.0mg/l(转化:28.0%)、32.3mg/l(转化:32.3%)。此外,添加的底物分别有98.8%、92.6%、78.6%、51.6%残留。
与各底物对应的转化反应率总结于下表6中。
[表6]
表6:转化率(%)
4Chol | S-diol | R-diol | 20-OH | 22OH | Chol | Stigma | Lano | Sito | Cam | Des | 7-DHC | Ergo | |
CYP11 | 0 | 0 | 4.3 | 0 | 0.4 | 2.6 | 0 | 0 | 0.8 | 1 | 1.2 | 0.7 | 0 |
BP172 | 84 | 41.7 | 61.3 | 63.9 | 80.9 | 71.2 | 6.5 | 0 | 47.2 | 31.3 | 66.1 | 28.5 | 2.2 |
BP215 | 78 | 69.8 | 38.1 | 41 | 42.3 | 68.2 | 5.8 | 0 | 40.9 | 27.9 | 71.7 | 34.3 | 2.8 |
实施例13:SDS-PAGE
将BL21CYP11A、BP172以及BP215分别接菌于添加了氨苄青霉素50μg/ml(终浓度)的TB培养基2ml中,30℃、220rpm振荡培养16小时。将该前培养液250μl加入本培养用TB培养基25ml(氨苄青霉素50μg/ml<终浓度>、5-氨基乙酰丙酸40μg/ml<终浓度>、诱导剂:过夜表达自动诱导系统1(Overnight Express Autoinduction System1)<Merck公司制造>)中,25℃振荡培养24小时。将从该培养液通过离心分离回收的菌体悬浮于缓冲液(50mMKPB、2%甘油[pH 7.4])5ml中,作为菌体悬浮液。在该菌体悬浮液2ml中添加×10Bug Buster 66.7μl(Novagen公司制造)、核酸酶0.67μl(Novagen公司制造)、40mg/ml溶菌酶,30℃振荡20分钟来进行溶菌。将该菌体溶菌液作为全蛋白质液。此外,对菌体溶菌液进行离心分离后,将离心上清作为可溶性级分蛋白质液。不溶性级分蛋白质通过将菌体溶菌液离心分离后、完全除去离心上清、并用缓冲液洗涤3次后、再次悬浮于缓冲液来制备。将所述全蛋白质液、可溶性级分蛋白质液、不溶性级分蛋白质液分别与SDS-PAGE用样品缓冲液(BIO-RAD公司制造)20μl混合,作为SDS-PAGE电泳用样品。SDS-PAGE电泳用样品于95℃加热5min后,用聚丙烯酰胺凝胶(第一化学药品公司制造)进行电泳(300V、30mA、60分钟)。电泳后,将聚丙烯酰胺凝胶移至托盘中,添加适量的染色-脱色液(TAKARA Bio公司制造),进行染色以及脱色。结果示于图1。
工业实用性
通过使用本发明的新酶蛋白质,能够有效率地制造作为医药和医药中间体在工业上有用的化合物——孕烯醇酮等以及皮质醇。
附图说明
图1显示了用BL21CYP11A、BP172以及BP215进行SDS-PAGE的结果。
图2显示了皮质醇(ハイドロコルチコイド)的衍生物及其合成方法。
1.Faming Zhuanli Shenqing Gongkai Shuomingshu,1896090,17 Jan 2007
2.J.Am.Chem.Soc.,82,3696-701;1960
3.Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,87(4-5),319-325;2004;以及Annals of the New York Academy of Sciences,434(EnzymeEng.),106-9;1984 Ger.Offen.,3322120,02 Feb 1984
4.Ger.Offen.,3109459,23 Sep 1982;Journal of the American ChemicalSociety,81,4956-62;1959;以及Journal of the American Chemical Society,77,1028-32;1955
5.Huagong Shikan,20(5),30-32;2006、U.S.S.R.,819119,07 Apr 1981
6.US2658023(1953);J.Am.Chem.Soc.,77,763(1955);日本特公昭46-20033;及日本特公昭47-13112
7.J.Gen.Appl.Microbiol.,7,113(1961)
8.Appl.Microbiol.,8,345(1960)
图3示出了皮质醇的衍生物及其合成方法。
莫米松:Trtrahedron,55,3355(1999);
以及Eur.Pat.Appl.,165037,18 Dec 1985
曲安西龙:J.Org.Chem.,59(24),7534(1994);
以及Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.,11,81(1981)
地塞米松:Eur.Pat.Appl.,165037,18 Dec 1985
布地奈德:Huagong Shikan,20(5),20(2006);
以及Huaxue Gongye Yu Gongcheng,22(5),354(2005)
氟替卡松:日本特开昭61-1699;EP 165037B1;EP 574318B1;EP
1207166A2;WO 02/100878A1;以及EP 1526139A1
倍他米松(Betamethazone):Tetrahedron Lett.,33,4913(1992)
Claims (14)
1.以下(a)、(b)或(c)中任一项的蛋白质:
(a)蛋白质,其由SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列组成;
(b)蛋白质,其由在SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、并具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度Vmax为50mmol/分钟/mol以上;
(c)蛋白质,其由与SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸序列组成、并具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度Vmax为50mmol/分钟/mol以上。
2.具有以下理化性质的切断固醇侧链的酶:
(1)作用:作用于下述式(I)表示的固醇,通过切断固醇侧链部分的20位和22位的碳-碳键的活性来切断该键,从而生成下述式(II)表示的化合物;
(2)底物特异性:当使产生该酶的微生物在含100μg/ml的4-胆甾烯-3-酮或胆固醇的水溶液中于28℃反应5小时时,从4-胆甾烯-3-酮到孕酮的转化反应率为10%以上,且从胆固醇到孕烯醇酮的转化率为10%以上;
(3)最适pH:7.5~8.0;
(4)作用最适温度:15~20℃;
(5)热稳定性:于20℃保存140小时后,能保持30%以上的酶活性;
(6)分子量:从氨基酸序列推算的分子量为53~54KDa,且利用SDS电泳测定的分子量为50~56KDa;
在上式(I)中,
母核部分具有由类固醇类所具有的A、B、C、D环构成的结构,
其1位至17位(10位和13位除外)中任意的0个或1个以上位置上具有碳-碳不饱和键,
其1位至19位(10位和13位除外)中任意的0个或1个以上位置的碳上彼此独立地被式:-OX表示的基团或式:=O表示的氧代基取代,
在上述式-OX中,当X=H时表示羟基;当X=COR1时表示酰氧基,其中R1为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基;当X=R2时表示O烷基,其中R2为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基;当X=SO3M时表示硫酸酯类,其中M为氢原子、碱金属或碱土金属;当X为糖类的1位碳时表示O糖基;或X为与该碳相邻碳原子时表示环氧基;
在侧链部分,R为任选具有环状部分的碳原子数10以下的直链烷基、烯基或炔基,或任选具有环状部分的碳原子数10以下的支链烷基、烯基或炔基,
20位、21位和R内的任意0个或1个以上位置的碳上彼此独立地被式:-OY表示的基团或式:=O表示的氧代基取代,
在上述式-OY中,当Y=H时表示羟基;当Y=COR3时表示酰氧基,其中R3为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基;当Y=R4时表示O烷基,其中R4为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基;当Y=SO3M时表示硫酸酯类,其中M为氢原子、碱金属或碱土金属;当Y为糖类的1位碳时表示O糖基;或Y为与该碳相邻的碳原子时表示环氧基;
在上式(II)中,
母核部分的定义与式(I)的母核部分定义相同;
在侧链部分,21位的碳上被0个或1个式:-OY表示的基团或式:=O表示的氧代基取代,
在上述式-OY中,当Y=H时表示羟基;当Y=COR3时表示酰氧基,其中R3为氢原子或碳原子数10以下的烷基、烯基、炔基或芳香族烃基;当Y=R4时表示O烷基,其中R4为任选被氧原子取代的碳原子数10以下的烷基、烯基或炔基;当Y=SO3M时表示硫酸酯类,其中M为氢原子、碱金属或碱土金属;或Y为糖类的1位碳时表示O糖基。
3.DNA,其编码权利要求1所述的蛋白质。
4.以下(a)、(b)或(c)中任一项的DNA:
(a)DNA,其具有SEQ ID NO:1所述的碱基序列;
(b)DNA,其具有在SEQ ID NO:1所述的碱基序列中发生1个或数个碱基的缺失、取代和/或添加而得到的碱基序列,并编码具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度Vmax为50mmol/分钟/mol以上的蛋白质;
(c)DNA,其具有能够与具有SEQ ID NO:1所述的碱基序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列,并编码具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度Vmax为50mmol/分钟/mol以上的蛋白质。
5.一种融合蛋白质,其是使权利要求1或2所述的酶蛋白质、对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质、以及对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质。
6.一种重组载体,其包含权利要求3或4所述的DNA、以及使得该DNA编码的蛋白质能够在宿主细胞内表达的表达调控区。
7.一种转化体,其是将权利要求6所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。
9.制造下述式(II)所表示的化合物的方法,该方法包括使下述式(I)所表示的固醇与下述(a)~(c)中的任意接触:
(a)由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质、具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质、以及向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(b)由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度Vmax为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质以及向铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(c)使由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质或者由在SEQID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度Vmax为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质以及对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质。
式(I)以及式(II)中的定义与权利要求1中的定义相同。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其中,在权利要求8或9的方法中,再与固醇3位氧化异构酶、类固醇17α位羟化酶、类固醇21位羟化酶和类固醇11β位羟化酶接触,从而生成皮质醇。
11.根据权利要求8~10中任一项所述的方法,其中,上述式(I)表示的固醇是胆固醇、4-胆甾烯-3-酮、7-脱氢胆固醇、麦角固醇、β-谷固醇、豆固醇、菜油固醇、链甾醇、(20S)-20-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(22R)-22-羟基胆甾-4-烯-3-酮、(20R,22R)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮或(20R,22S)-20,22-二羟基胆甾-4-烯-3-酮。
12.根据权利要求8~11中任一项所述的方法,其中,上述式(II)表示的化合物是孕烯醇酮、孕酮或7-脱氢孕烯醇酮。
13.根据权利要求8~12中任一项所述的方法,其中,上述式(I)所表示的固醇是通过使选自葡萄糖、甘油、甲醇、乙醇、蔗二糖、乙酸、柠檬酸中的任意原料与具有同化该原料生成上述式(I)表示的固醇的能力的酵母接触而生成的。
14.一种从选自葡萄糖、甘油、甲醇、乙醇、蔗二糖、乙酸、柠檬酸中的任意原料制造皮质醇的方法,该方法包括用含所述原料的培养基培养酵母,
所述酵母具有从上述原料生成下述式(I)所表示的固醇的活性、以及生成固醇3位氧化异构酶、类固醇17α位羟化酶、类固醇21位羟化酶和类固醇11β位羟化酶的活性,且具有以下(A)~(E)中的任意特征:
(A)具有生成如下混合物的活性,该混合物是权利要求1或2所述的蛋白质、具有向该酶蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质以及具有向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(B)具有生成如下混合物的活性,该混合物是由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质、具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质以及向该铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(C)具有生成如下混合物的活性,该混合物是由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度Vmax为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,具有向该蛋白质传递电子的活性的铁氧还蛋白蛋白质以及向铁氧还蛋白蛋白质传递电子的铁氧还蛋白还原酶蛋白质的混合物;
(D)具有生成如下融合蛋白质的活性,该融合蛋白质是使由SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列组成的蛋白质或者由在SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成、且具有切断固醇侧链的20位和22位的键的活性、且作为上述活性的反应速度参数的最大速度Vmax为40mmol/分钟/mol以上的蛋白质,对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质以及对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质;
(E)具有生成如下融合蛋白质的活性,该融合蛋白质是使权利要求1或2所述的酶蛋白质、对该酶蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白蛋白质以及对该铁氧还蛋白蛋白质具有电子传递活性的铁氧还蛋白还原酶蛋白质结合得到的作为一个蛋白质发挥功能的融合蛋白质:
式(I)中的定义与权利要求1中的定义相同。
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