JPH01124393A

JPH01124393A - 有機化合物の製造方法

Info

Publication number: JPH01124393A
Application number: JP62281130A
Authority: JP
Inventors: Seiji Doi; 土井　清二; Koki Horikoshi; 弘毅掘越
Original assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 1987-11-09
Filing date: 1987-11-09
Publication date: 1989-05-17
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: EP0315949A2; JPH084515B2; EP0315949A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コ本発明は反応方法に関し、詳しくは有ｍ溶媒に耐性を有
する微生物に遺伝子工学的手法によって遺伝子を導入し
て形質転換せしめた微生物を用いて有用物質を生産する
反応方法に関する。

［従来の技術］従来、微生物を有機化合物と接触させて有用物質を生産
する方法としては、ノカルデイア・エスピーをヘキサン
またはヘキサデカンと接触させる例（Ｒ，Ｌ、Ｒａｙｍ
ｏｎｄ　（１９６７）、　　八ｐｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｖｏ１．１５゜ｐ８５７〜８８５）　、バクテリウ
ムＪＯＢ５をシクロペンタンまたはシクロヘキサンと接
触させる例（Ｊ　、Ｏｏｙａｍａ　。

Ｊ、Ｗ、Ｆｏｓｔａｒ（１９８５）、　Ａｎｔｏｎｉｅ
−ｖｏｎ　Ｄｅｅｎｗｅｎｌｏｏｋ。

ｖｏｌ、３１．ｐ４５〜６５）　、シュードモナス・エ
スピー。

アクロモバクタ−・エスピー、ノカルデイア・エスピー
をベンゼン、エチルベンゼン、トルエンまたはキシレン
と接触させる例（Ｄ、Ｃ１ｅｕｓ、　Ｎ、Ｗａｌｋｅｓ
（１９６４）、Ｊ、Ｇｅｎ、ＭｉｃｒｏｂｉａＬ、、ｖ
ｏｌ、３Ｂ、ｐｉ０７〜１２２）などの多くの報告があ
る。

しかし、炭化水素類は一般に微生物に対して強い毒性を
示すため、微生物をこれら化合物と接触させる場合、こ
れら化合物が微生物と直接接触しないように蒸気で供給
するか、あるいは毒性を示さない程度の低い濃度（０，
２％以下）に維持して行われる。そのため、炭化水素類
を基質として用いる醗酵においては、生産性が低く、し
かもこの基質を低濃度に制御することも容易でないため
、操作上も問題があった。さらに、水難溶性物質を用い
る場合は、その物質の溶解度が低いために、微生物によ
る反応において生産性が低くなる欠点があった。

［発明が解決しようとする問題点］そこで本発明者らは、炭化水素類等の有機溶媒を高濃度
に含む培地においても生育可能な微生物、すなわち炭化
水素類等の有機溶媒に対して耐性を有する微生物を有機
化合物と接触させて有用物質を生産させる方法について
検討を重ね、本発明を完成するに至った。

［問題点を解決するための手段］すなわち本発明は、シュードモナス属に属し、脂肪族炭
化水素類、脂環式炭化水素類、芳香族炭化水素類、アル
コール類、エーテル類、ケトン類およびそれらの話導体
のうちの１種もしくは２　ｆｆｆｉ以上に耐性を有する
微生物に遺伝子工学的手法によって遺伝子を導入して形
質転換せしめた微生物を有機化合物と接触させることを
特徴とする反応方法に関する。

シュードモナス属に属し、上記有機溶媒に耐性を有する
宿主微生物としては、シュードモナス・プチダ・バール
ＳＴＭ−６０３（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２２８）、シュード
モナス・エスピーＳＴＭ−８０１（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２
２６）およびシュードモナス・エスピーＳＴＭ−９０４
（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２２７）られる。シュードモナス・
プチダ・バールＳＴＭ−６０３の菌学的性質は特願昭８
２−４８６６２号明細書に詳しく記載されており、木菌
は、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−
９２２８として寄託されている。また、シュードモナス
・エスピーＳＴＭ−８０１およびシュードモナス・エス
ピーＳＴＭ−９０４の菌学的性質は特願昭６２−４８６
６３号明細書に詳しく記載されており、これらの菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−９２
２６，ＦＥＲＭ　Ｐ−９２２７としてそれぞれ寄託され
ている。

本発明では、これら微生物に遺伝子工学的手法によって
遺伝子を導入して形質転換せしめた微生物が用いられる
。このような形質転換株は、木′発明における反応の種
類を考慮して作成される。ここで、反応の種類としては
エポキシ化、水酸化。

脱水素などの酸化反応、アルデヒド還元、ケトン還元、
水素化などの還元反応、エステル、多糖類、ペプチドな
どの加水分解（トランスエステル化も含む）を行なう加
水分解反応、光学活性の異性化、立体異性化（シス−ト
ランス）などの異性化反応、グリコジル基、アシル基、
リン酸基等の転移を行なう転移反応、Ｃ−Ｃ：、　Ｃ−
０，Ｃ−Ｎ等の結合を脱離させるリアーゼ（脱離）反応
（たとえばβ−チロシナーゼの逆反応を利用してＣ−Ｃ
の合成４を行なうし一チロシンの合成反応）　、ｃ−ｃ
、　ｃ−ｏ。

Ｃ−Ｎ等の結合をもつ化合物の合成を行なうリガーゼ（
合成）反応等の各種反応を挙げることができる。

したがって、形質転換株としては、上記反応を行なうた
めに必要とされる遺伝子を遺伝子工学的手法によって上
記微生物に導入し、形質転換させることによって作成さ
れる。たとえば上記微生物に対しナフタレン分解性プラ
スミド、トルエン分解性プラスミド、カンファー・オク
タン分解性プラスミドなどの炭化水素分解性プラスミド
やベンゼン酸化酵素遺伝子を通常のシュードモナス菌用
形貿転換法（たとえばＣｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ、、９６，４７．１９８１）、接
合伝達法、遺伝子組換え技術（たとえばＭｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　（：ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、１９８２年）等
の手法を用いて導入して形質転換させ、得られた微生物
を酸化反応に・利用したり、β−チロシナーゼ遺伝子を
遺伝子組変え技術によって上記微生物に導入して形質転
換させた微生物をリアーセ反応に利用することができる
。さらには、ジアミノピメリン酸異性化酵素に対応する
遺伝子を含むＤＮＡ　　（たとえばＪ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、１６９．（４）、１４５４．１９８７　に記載
のプラスミドｐＤＦ３）より適当な制限酵素で必須部分
を切出し、その遺伝子断片の両端を好適な制限酵素（た
とえばＥｃｏＲＩ）で切断された切り口に変換し、一方
前述の有機溶媒耐性菌で安定に保持されつるプラスミド
ベクター（たとえばＲ５ＦＩＯＩＱ）を上記遺伝子断片
と同じ切り口となるように切断し、両遺伝子断片を連結
して作成した組換えプラスミドを導入して上記耐性菌を
形質転換せしめたものを用いてｍｅｓｏ体ジアミノピメ
リン酸を生産する等の異性化反応に利用することができ
る。

また、分岐鎖ケト酸脱水素酵素に対応する遺伝子を含む
プラスミド（たとえばＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、圭（
４）　、１６１９．１９８７に記載のプラスミドｐｓｓ
１−１）を利用して上記の如く耐性菌を形質転換させ、
得られた形質転換株を用いて分岐鎖ヒドロキシ酸を生産
する等の還元方法に利用することができる。同様に、Ｙ
−グルタミル−し−システィン合成酵素（ＧＳ）Ｉ−１
）およびグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ−２）に対応す
る遺伝子を含むＤＮＡ　　（たとえば「物質生産のため
の遺伝子工学」、日本農芸化学会編集、朝倉書店発行、
１９８３年、１８５頁記載のプラスミドｐＢＲ３２５−
ｇｓｈ　Ｉ　’・Ｉ＋　）を利用し、上記ジアミノピメ
リン酸の場合と同様にして耐性菌中で安定に保持されつ
るプラスミドベクターに該遺伝子を組込み、上記耐性菌
中に導入することによりグルタチオン生産菌を育種し、
これを用いてグルタチオンを合成する等のりガーゼ反応
に利用することができる。さらに、セリン−ヒドロキシ
メチル−トランスフェラーゼ（ＳＨＴａｓｅ）に対応す
る遺伝子を含むＤＮＡ　　（たとえば昭和６０年度日本
農芸化学会大会要旨集、第２９頁に記載のｐ８Ｒ３２２
−ｇｌｙＡ）を上記と同様の方法を用いて耐性菌に導入
してセリン生産菌を育種し、これを用いてセリンを生産
するなどの転移反応（ヒドロキシメチル基の転移）に利
用することかできる。

なお、上記有機溶媒耐性菌をエステルの加水分解やトラ
ンスエステル化反応などの加水分解反応に用いることが
できる。さらには、有機溶媒に耐性を有するという特性
を利用し、上記微生物を醗酵生産、たとえば脂溶性ビタ
ミン、脂溶性抗生物質、脂溶性ホルモン等の脂溶性物質
の製造に使用することも可能である。

上記の如く、本発明における反応は様々なものがあるが
、微生物の生育の有無から反応を増殖系反応と休止菌体
反応に分けることが出来、前者はさらに複雑な代謝系を
経て有用物質が生産される■酵生産と比較的単純な酵素
反応（系）を利用した変換反応に細分される。休止菌体
反応は専ら変換反応である。また、反応を反応媒質によ
って分類すると、緩衝液等の水を主体とする通常の反応
が行なわれる水系、水系と有機溶媒とが２相系をなした
状態で反応が行われる２相系および有機溶媒中に可能な
範囲で水を含ませ、微生物の生存に必要な水分を確保（
脱水しない）して反応を行なう微水系があるが、本発明
では主に水系を除く２種の反応系で行なわれる。

本発明において用いる微生物は、前記した如く、有機溶
媒の１種もしくは２種以上に耐性を有するものであり、
特に２種以上の有機溶媒に対して耐性を示すシュードモ
ナス属の微生物はこれまでに知られていない０次に、有
機溶媒の具体例を示す。脂肪族炭化水素類としてはペン
タン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、
ノナン、デカン、１−または２−ヘキセン、１−オクテ
ン、１−ドデセン、１，３−ペンタジェン、１．５−ヘ
キサジエン、１．７−オクタジエン等が、脂環式炭化水
素類としてはシクロペンタン、シクロヘキサン、メチル
シクロペンタン、メチルシクロヘキサン等が、芳香族炭
化水素類としてはトルエン、キシレン、スチレン、エチ
ルベンゼン、クロロベンゼン等が、アルコール類として
は１−ヘプタツール、１−オクタツール、１−デカノー
ル等が、エーテル類としてはｎ−ヘキシルエーテル。

ｎ−ブチルフェニルエーテル、ジフェニルエーテル、ジ
ベンジルエーテル、メトキシトルエン等が、ケトン類と
しては２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノ
ン、シクロヘキサノン等がそれぞれ挙げられる。

次に、前記微生物と接触させる有機化合物としては、水
溶性、脂溶性の区別なく様々のものを使用でき、たとえ
ば前記した脂肪族炭化水素類などの各種有機化合物やピ
ルビン酸、乳酸、フマル酸などの有機酸、酢酸エチル、
酢酸ブチル、酢酸オクチルなどのエステル類、さらには
糖類、アミノ酸類、核酸類、ステロイド類、テルペノイ
ド類およびその他の窒素化合物や硫黄化合物等を挙げる
ことができる。なお、たとえばＬ−チロシンを生産する
場合の如く、有機化合物のほかにアンモニア、その他の
無機化合物を適宜加える場合もある。

本発明の方法に使用する微生物を培養するために用いる
培地としては、該微生物が十分に増殖しつるものであれ
ばよく、通常は炭素源としてグルコース、シュークロー
ス、キシロース、　ａ粉、　ａ粉加水分解物などの糖類
、メタノール、エタノールなどのアルコール類、ベンゼ
ン、トルエン、キシレンなどの炭化水素類、コハク酸、
サリチル酸、トルイル酸などの有機酸類等があり、窒素
源としては肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母
、コーンステイープリカー、カザミノ酸、尿素、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硫酸
アンモニウム等がある。その他にリン酸塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩、鉄塩、カリウム塩、銅塩、マンガ
ン塩などの無機塩類を適宜加える。

反応を増殖系で行なう場合は、上記培地に微生物を培養
する際または培養中に前述の有機化合物を１回もしくは
数回に分割して加える。また、休止菌体反応の場合は、
上記培地に微生物を培養した培養液をそのまま、もしく
は遠心分離等の操作により固液分離して得た微生物、あ
るいは該微生物を適当な！ｙｉ街液等で洗浄したり、微
生物を常法により破砕処理したもの等を使用して前記有
機化合物と接触させる。なお、反応を２相系もしくは微
水系で行なう場合、前述した有機溶媒を使用すればよい
。２相系の場合には、反応系が２相を形成する範囲で有
機溶媒が添加されればよく、微水系の場合には、有機溶
媒中に可能な範囲で水を含ませたものが使用されればよ
い。また、有機溶媒が培地成分として含まれているとき
は、それを充当することもできる。

培養は好気的条件下、ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜８
、温度１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃にて行な
う。また、反応は好気または嫌気的条件下、ｐＨ２〜１
１、好ましくは４〜１０、温度５〜９０℃、好ましくは
２０〜５０℃にて目的とする反応が十分に行なわれるま
で行なう。

［実施例］次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

なお、実施例に用いた形質転換微生物は以下の方法によ
り作成した。

作成例１ナフタレン分解性プラスミド（ＮＡＨ）を保持するシュ
ードモナス・プチダＰｐＧ１０６４　（ｔｒｐ−）　（
Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｌｌ、Ｓ、Ａ、、７９，
８７４．　１９８２）を１０ｍｊのＬＢ培地（１％Ｂａ
ｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５零Ｂａｃｔｏ−Ｙｅ
ａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、０．５Ｘ　ＮａＣｊりに接種し
、３０℃で４時間静置培養を行なった。これにシュード
モナス・プチダ・バールＳＴＭ−６０３（ＦＥＲＭ　Ｐ
−９２２８）を上記と同じ培地で振どう培養して得た培
養液１０＋ｎｉｌを加え、緩やかに混合後、その４ｍＢ
をとり、ミリポアフィルタ−（孔径０．４５μ■）を通
すことによりフィルター上に菌体を捕集した。このフィ
ルターをＬＢ−寒天平板培地（寒天２％含有）上にのせ
、３０℃で１２時間培養した。

培養後、フィルター上の菌体を滅菌水１０１１１１！に
懸濁し、合成培地−寒天平板培地上に塗布した後、ナフ
タレン蒸気雰囲気下で培養を行なフた。２日後、生じた
コロニーを１００ｍｇのナフタレンを添加した合成培地
（組成は下記のとおり）　１０ｍｊ＋に接種し、さらに
トルエン５ｍｉ＋を添加して３０℃で２４時間培養した
ところ、明らかに生育、が認められた。−方、上記培地
にさらにトリプトファン２０ｍｇ／ｊ）を添加した培地
でシュードモナス・プチダＰｐＧ１０６４（ｔｒｐ−）
株およびシュードモナス・プチダ・バール５７Ｍ−６０
３株の培養を行なったが、いずれも生育しなかった。こ
のことから、シュードモナス・ブチタハールＳＴＭ−６
０３株が接合伝達によってＮへＨプラスミドを獲得した
ため、ナフタレンの資化能が発現し、上記培地で生育し
たことが明らかである。なお、シュードモナス・プチダ
・バール５７Ｍ−６０３株はナフタレン資化能を保有し
ないため、またシュードモナス・プチダＰｐＧ１０６４
　（ｔｒｐ−）株はトルエン耐性がないため、いずれも
上記条件下では生育しなかったものと考えられる。

１炙１亙且濾ＮＨ４ＣＲ５ｇＫＮ２Ｐ０４１　　ｇＮａ２８ＰＯ４・１２８２０　　　３　　ｇＭｇＳＯ４
・２Ｈ２００，２ｇ（：ａＣｊ’２’２Ｈ２００，０５ｇ脱イオン水　　　　　ＩｋｐＨ７，０このようにして得られたＮＡＨプラスミド保有シュード
モナス・プチダ・バール５７Ｍ−６０３株を以後シュー
ドモナス・プチダ・バールＳＴＭ−６０３（ＮＡＨ）と
記す。

作成例２カンファーおよびオクタン分解性プラスミド（（：八Ｍ
−ＯＣＴ）を保持するシュードモナス・プチダＡＣ３９
（ｔｒｐ−）　（Ｊ、Ｆｅｒｍａｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ
、　、５８．　（３）　、　１７５　。

１９８０）をプラスミド供与体として用い、作成例１と
同様の方法で接合伝達実験を行ない、カンファー蒸気雰
囲気下で合成培地−寒天平板培地上にコロニーを形成さ
せた。

このコロニーを１００＋ｎｇのカンファーを添加した合
成培地（前記した）ｌＯＩｎｊｌＩに接種し、さらにト
ルエン５ｍＲを添加して３０℃で２４時間培養したとこ
ろ、明らかに生育が認められた。一方、上記培地にさら
にトリプトファン２０ｍｇ／ｌを添加した培地でシュー
ドモナス・プチダＡｌｌ：５９　（ｔｒｐ−）株および
シュードモナス・プチダ・バール５７Ｍ−６０３株の培
養を行なったが、いずれも生育しなかった。このことか
ら、シュードモナス・プチダ・バール５７Ｍ−６０３株
は接合伝達によってにＡＭ−ＯＣＴプラスミドを獲得し
たことが明らかである。このようにして得られた［：Ａ
Ｍ−ＯＣＴプラスミドを保有するシュードモナス・プチ
ダ・バール５７Ｍ−６０３株を以後シュードモナス・プ
チダ・バールＳＴＭ−６０３（ＣＡＭ−０（：Ｔ）と記
す。

作成例３トルエン分解性プラスミド（ＴＯＬ）を保持するシュー
ドモナス・プチダｍｔ−２株（ＡＴＣＣ２３９７３）を
プラスミド供与体として用い、作成例１と同様の方法で
接合伝達実験を行ない、トルエン蒸気雰囲気下で合成培
地−寒天平板培地上にコロニーを形成させた。

このコロニーを１００μｐのトルエンを添加した合成培
地（前記した）　１０ｎ＋ｊ）に接種し、さらにシクロ
ヘキサン５ｍＰを添加して３０℃で２４時間培養したと
ころ、明らかに生育が認められた。

このようにして得られたＴＯＬプラスミドを保有するシ
ュードモナス・プチダ・バール５７Ｍ−６０３株を以後
シュードモナス・プチダ・バールＳＴＭ−６０３（ＴＯ
Ｌ）　　と記す。

作成例４ペンゼオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼングリコール
脱水素酵素遺伝子が広宿主域プラスミドＲ５ＦＩＯＩＯ
に組込まれたプラスミドｐＧＲ１０９（＾ｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、５１．　（６）　、１４８９．
１９８７）を用いて通常のシュードモナス画用形質転換
法（たとえば［：ｕｒｒ。

Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、９６
，４７，１９８１）にてシュードモナス・プチダ・バー
ル５７Ｍ−６０３株（ＦＥＢＭＰ−９２２８）の形質転
換を行なった。

ストレプトマイシン　５００μｓ／ｍβを含有するＬＥ
Ｉ培地に生育した菌体よりプラスミドを分離し、アガロ
ースゲル電気泳動法にてプラスミドｐＧＲ１０９を保持
するシュードモナス・プチダ・バール３７Ｍ−８０３株
であることを確認した。なお、このときのプラスミド分
離法および電気泳動法は常法（たとえばＭｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　［：ｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、１９８２年）に
従った。

作成例５ β−チロシナーゼ遺伝子が大腸菌用ベクターｐＢＲ３２
２に組込まれたプラスミド！１５１２０７４　　（特願
昭６１−１０１１２０号明細書参照＞２ｄｇを制限酵素
Ｅ　ｃ　ｏ’ＲＩにより部分切断（３７℃、２分間）し
た。

一方、広宿主域ベクターとして一般的に使用されるプラ
スミドＲ５ＦＩＯＩＯの２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩに
て完全に切断（３７℃、２時間）した後、ベクターの自
己閉環を防止するため、アルカリフォスファターゼ処理
を行なった。

上記２種の切断ＤＮＡを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
にて連結反応（４℃、２４時間）を行なった。この反応
液を用いて大腸菌０６００株に対して形質転換を行ない
、ストレプトマイシン５０μｇ／Ｌ　Ｌ−チロシン２　
ｍｇ／１ｌａＲを含有するＬＢ−寒天平板培地上にコロ
ニーを得た。これらのコロニーの中からし一チロシンを
分解してコロニーの周辺に透明な領域（クリアーゾーン
）を形成するコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを抽
出後、制限酵素解析を行ない、第１図に示したハイブリ
ッドプラスミドＲ５Ｆ２０７４を保持する１株を得た。

このようにして得られたプラスミドＲ５Ｆ２０７４を用
い、シュードモナス・プチダ・バール５ＴＲ−８０３株
（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２２８）を作成例４と同様にして形
質転換し、シュードモナス・プチダ・バールＳＴＭ−６
９３（Ｒ５Ｆ２０７４）株を得た。

実施例１作成例３で作成したシュードモナス・プチダ・バールＳ
ＴＭ−６０３（ＴＯＬ）株を４ｇ／２のｍ−トルイル酸
を炭素源として含有する合成培地２０１に接種した。同
時にテトラデセン２００μＰ、ヘキサン５ｒｎＲを添加
し、３０℃で２０時間培養を行ないエポキシ化反応を実
施した。

除菌後の培養終了液中のエポキシテトラデカンをガスク
ロマトグラフィー（ＦＩＤ検出、カラム・シリコンＧＥ
−５Ｅ３０　、ガスクロ工業株式会社製）で測定したと
ころ、ヘキサン相中にエポキシテトラデカンが８０Ｂ／
ｉｌ生産されていた。

実施例２作成例１で作成したシュードモナス・プチダ・バールＳ
ＴＭ−６０３（ＮＡＨ株を４　ｇ／ｐのサリチル酸を炭
素源として含有する合成培地２０＋ｎＪに接種し、同時
にテトラデセン２００μ！、トルエン５ｍｊ！を添加し
、３０℃で２０時間培養を行ないエポキシ化反応を実施
した。

除菌後の培養終了液について実施例１と同様の分析を行
なった結果、トルエン相中にエポキシテトラデカンが５
０ｍｇ／ｆ生産されていた。

このことは微生物の生育を阻止しない溶媒の添加系にお
いて、微生物を生育させながら物質生産が可能であるこ
とを示している。

実施例３作成例１，２および３で作成したシュードモナス・プチ
ダ・バールＳＴＭ−６０３（ＮＡＨ）　、シュードモナ
ス・プチダ・バールＳＴＭ−６０３（ＣＡＭ−ＯＣＴ）
　、シュードモナス・プチダ・バールＳＴＭ−６０３（
Ｔ（ＩＬ）をそれぞれ４　ｇ／ｐのサリチル酸、カンフ
ァー、ｍ−トルイル酸を炭素源として含む合成培地１０
０ｍＲに接種し、３０℃で２０時間培養した。培養終了
液より遠心分離機にて集菌し、５０ｍＭ−リン酸緩衝液
（ｐｌ（７，０）で洗浄後、菌濃度を分光光度計（波長
５５０ｎｍ）での濁度が１０になるように同一緩衝液に
懸濁した。この懸濁液１１にヘキサンとシクロヘキサン
の混合液（１：１）を１ｍＣエタノール５μ！９反応基
質としてオクテンまたはテトラデセンを１０ｔＬ１添加
し、３０℃にて休止菌体反応を実施した。２０時間反応
後、溶媒中のエポキシオクタン、エポキシテトラデカン
の生成量をガスクロマトグラフィーにて定量したところ
、第１表に示す結果を得た。なお、水相中には生産物は
検出されなかった。

第　　１　　表（単位：　ｍｇ＃’）実施例４シュードモナス・プチダ・バールＳＴＭ−６０３（ＴＯ
Ｌ）株を用い、反応系に添加する溶媒をトルエン。

キシーシン。エチルベンゼン、ジクロルベンゼン。

ｎ−ヘプタツール、ｎ−オクタツールを用い、反応基質
をテトラデセンとした他は実施例３と同一条件で反応を
行なった。溶媒中に生成したエポキシテトラデカンの測
定値を第２表に示す。

第　　２　　表（単位：＋ｎｇ＃）実施例５炭素源としてサリチル酸４　ｇ／ｐを含む合成培地１０
０ｍρにシュードモナス・プチダ・バールＳＴＭ−６０
３（ＮＡＨ）株を接種し、３０℃で２０時間培養した。

培養終了液より集菌し、洗浄した後、菌濃度が分光光度
計（波長５５０ｎｍ）での濁度が１０になるように５０
ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁した。この懸
濁液１　ｍｌにインドール１０ｍｇ、エタノール５μ２
およびクロロホルム１ｍｉ＋を添加し、３０℃にて振と
うしながら休止菌体反応を実施した。２０時間後、反応
液を遠心分離により菌体沈澱物、水相およびクロロホル
ム相に分けたところ、クロロホルム相のみが生成したイ
ンジゴにより青色を呈していた。

このクロロホルム相中のインジゴ含有量を分光光度計（
波長６００ｎｍ）での吸光度を指標として定量したとこ
ろ、２８０ｍｇ＃であった。

実施例６炭素源としてコハク酸４　ｇ／ｅを含有する合成培地１
００ｍｊ！にシュードモナス・プチダ・バールＳＴＭ−
６０３（ＮＡＨ）株を接種し、３０’ｅテ２４時間培養
した後、実施例３と同様にして菌体懸濁液１１を３木調
製し、それぞれに酢酸ｎ−ブチル、酢酸２−ブチル、酢
酸２−オクチルを２０Ｂ添加した。これを３０℃で１時
間振どう反応を行なった後、加水分解により生成する対
応アルコールをガスクロマトグラフィーで測定した。こ
の結果を第３表に示す。

第　　３　　表実施例７実施例６と同様の方法で菌体を培養した後、菌体を水飽
和２−ブタノール１　ｍｌに懸濁した菌体懸濁液３木を
調製した。ここに酢酸エチル５０μρを添加してエステ
ル交換反応を３０℃で２４時時間上うすることにより実
施した後、生成エステルをガスクロマトグラフィーで測
定したところ、酢酸２−ブチル７０ｍｇ／ｊ！の生成が
確認できた。

実施例８作成例４で得たシュードモナス・プチダ・バール５Ｔ）
１１−６０３　（１）ＧＲ１０９）をコハク酸４　ｇ／
ｆ！およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＲを含有
する合成培地で３０℃、２０時時間上う培養後、遠心分
離を行なって集菌した。菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐ）Ｉ　７．０）で洗浄後、分光光度計（波長５５０ｒ
＋ｍ）での濁度が１０になるように懸濁し、その１　ｍ
Ｒに対して５μＰのベンゼンを含有させたヘキサン１ｍ
βを添加して反応を開始した。３０℃で２０時時間上う
反応を行なった後、水相中の生成カテコール量をアミ゛
ノアンチピリン法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、７３，１６
．１９５９）で測定したところ、２５ｍｇ／ｆのカテコ
ール生成を確認した。

実施例９作成例５マ得たシュードモナス・プチダ・バールＳＴＭ
−６０３（Ｒ５Ｆ２０７４）をストレプトマイシン１１
００ｕ／ｉｌを含有するＬＢ培地（１０１Ｎ）　テ３０
ｔ、　２０時時間上う培養後、遠心分離を行なって集菌
した。

菌体を生理食塩水にて洗浄後、１０ｍρの反応液（ピル
ビン酸１０ｇ／ｉ）　、酢酸アンモニウム５　ｇ／Ｒ、
ＥＤＴＡＩｇ＃＋、亜硫酸ソーダ２ｇ／ｊ！　、　ｐＨ
８，０）　ニ懸濁し、さらにフェノール１００ｍｇを含
有するクロロホルム３ｍｌを添加して３０℃にて反応を
開始した。

２時間後の反応液の水相の一部をとり、シリカゲル薄層
クロマトグラフ上にスポットし、ブタノール：酢酸：水
＝４：２：１の溶媒で展開させ、ニンヒドリン溶液を噴
霧して発色させた。その結果、標準チロシンと同一のＲ
，値に明瞭な発色域が存在することを確認した。

［発明の効果コ本発明にしたがい有機溶媒耐性菌を使用して様々な態様
で反応を行うことにより有用物質を効率よく生産するこ
とができる。そのため、本発明は化成品、医薬、ａ薬等
の製造に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドＲ５Ｆ２０７４の構築法を示したフ
ローチャートである。第１図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）シュードモナス属に属し、脂肪族炭化水素類、脂
環式炭化水素類、芳香族炭化水素類、アルコール類、エ
ーテル類、ケトン類およびそれらの誘導体のうちの１種
もしくは２種以上に耐性を有する微生物に遺伝子工学的
手法によって遺伝子を導入して形質転換せしめた微生物
を有機化合物と接触させることを特徴とする反応方法。
（２）シュードモナス属に属する微生物が、シュードモ
ナス・プチダである特許請求の範囲第１項記載の方法。
（３）シュードモナス・プチダがシュードモナス・プチ
ダ・バールＳＴＭ−６０３（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２２８）
である特許請求の範囲第２項記載の方法。
（４）反応を水と有機溶媒からなる２相系もしくは有機
溶媒に少量の水を溶解させた微水系において行なう特許
請求の範囲第１項記載の方法。