JPH07100026B2 - フラボバクテリウム属に属する新規微生物 - Google Patents
フラボバクテリウム属に属する新規微生物Info
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- JPH07100026B2 JPH07100026B2 JP3252195A JP25219591A JPH07100026B2 JP H07100026 B2 JPH07100026 B2 JP H07100026B2 JP 3252195 A JP3252195 A JP 3252195A JP 25219591 A JP25219591 A JP 25219591A JP H07100026 B2 JPH07100026 B2 JP H07100026B2
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- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/20—Flavobacterium
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/85—Flavobacterium
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フラボバクテリウム
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する新規微生
物に関する。さらに詳しく言うと、本発明は、炭化水素
分解性、亜硫酸耐性、食塩耐性、有機溶媒耐性及び圧力
耐性を有する新菌種フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ａに関する。
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する新規微生
物に関する。さらに詳しく言うと、本発明は、炭化水素
分解性、亜硫酸耐性、食塩耐性、有機溶媒耐性及び圧力
耐性を有する新菌種フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ａに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、石油による海上汚染が頻繁に起こ
り、問題となっている。このような問題を解決する手段
として、海上に流出した汚染石油に含まれる全ての炭化
水素を効率良くかつ容易に分解する微生物が望まれてい
るが、このような能力を十分に備えた微生物は未だ発見
されていない。石油に含まれる単一の炭化水素を資化、
分解する微生物としては、これまでに、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、ア
ルカヂア（Ａｒｃａｄｉａ）属またはキャンヂダ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ）属に属する数種類の微生物が土壌や海水か
ら単離されているが、これらは海上での汚染石油等の分
解に必要とされる食塩耐性、有機溶媒耐性等の耐性を備
えておらず、満足できるものではない。
り、問題となっている。このような問題を解決する手段
として、海上に流出した汚染石油に含まれる全ての炭化
水素を効率良くかつ容易に分解する微生物が望まれてい
るが、このような能力を十分に備えた微生物は未だ発見
されていない。石油に含まれる単一の炭化水素を資化、
分解する微生物としては、これまでに、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、ア
ルカヂア（Ａｒｃａｄｉａ）属またはキャンヂダ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ）属に属する数種類の微生物が土壌や海水か
ら単離されているが、これらは海上での汚染石油等の分
解に必要とされる食塩耐性、有機溶媒耐性等の耐性を備
えておらず、満足できるものではない。
【０００３】海上に流出した汚染石油等を分解するため
には、ケロシン、重油等の石油製品を効率よく分解でき
ることが要求されるとともに、これらの製品に含まれて
いる有機溶媒の一つであるヘキサンの毒性に対する耐
性、海水中に高濃度で含まれる食塩に対する耐性、さら
に、圧力に対する耐性も要求される。このような耐性を
すべて備えた微生物は、これまでに発見されていない。
には、ケロシン、重油等の石油製品を効率よく分解でき
ることが要求されるとともに、これらの製品に含まれて
いる有機溶媒の一つであるヘキサンの毒性に対する耐
性、海水中に高濃度で含まれる食塩に対する耐性、さら
に、圧力に対する耐性も要求される。このような耐性を
すべて備えた微生物は、これまでに発見されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、炭化水素分解性、食塩耐性、有機溶媒耐性等に優れ
た微生物を提供することにある。
は、炭化水素分解性、食塩耐性、有機溶媒耐性等に優れ
た微生物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】海洋科学技術センターで
は、有人潜水艇「しんかい２０００」や「しんかい６５
００」を開発し、これにより最大６５００メートルの深
海の泥を採取できるようになった。本願発明者らは、こ
の有人潜水艇によって採取された深海泥の中から、上記
条件を兼ね備えた微生物を見出すべく鋭意研究を重ねた
結果、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属に属する新規微生物が上記条件を兼ね備えてい
ることを見出し、その発見に基づいて本発明を完成させ
た。
は、有人潜水艇「しんかい２０００」や「しんかい６５
００」を開発し、これにより最大６５００メートルの深
海の泥を採取できるようになった。本願発明者らは、こ
の有人潜水艇によって採取された深海泥の中から、上記
条件を兼ね備えた微生物を見出すべく鋭意研究を重ねた
結果、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属に属する新規微生物が上記条件を兼ね備えてい
ることを見出し、その発見に基づいて本発明を完成させ
た。
【０００６】即ち、本発明は、炭化水素分解性、亜硫酸
耐性、食塩耐性、有機溶媒耐性及び圧力耐性を有する新
菌種フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）ｓｐ．Ａを提供するものである。この新規微生物の
ひとつとして、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株が挙げられ
る。このフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の単離は下記の方法
によって行う。
耐性、食塩耐性、有機溶媒耐性及び圧力耐性を有する新
菌種フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）ｓｐ．Ａを提供するものである。この新規微生物の
ひとつとして、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株が挙げられ
る。このフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の単離は下記の方法
によって行う。
【０００７】即ち、予め深海海底土を２％濃度のヘキサ
ンで処理し、さらに処理後、５０％のケロシンで処理す
る。ケロシン相に移行した親油性の細胞をプロテオース
ペプトンＮｏ．３ ０．１％、フィトン０．０５％、塩
化カルシウム０．１％、亜硫酸ナトリウム０．００５
％、塩化マグネシウム０．０１％からなる培地（Ｍｏｒ
ｉｙａ培地と命名し、下「Ｍ−培地」と記す。）を基準
に、さらにケロシン０．１％、食塩１モル及び寒天１．
５％を添加した寒天培地で培養し、コロニーの数株を得
る。これらの株についてさらにケロシン１．０％及び食
塩１モルを含むＭ−培地で培養し、培養後の細胞の増殖
が最も優れたものを選択した。これが、本発明の新規微
生物であるフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株である。このｓ
ｐ．Ａ ＤＳ−７１１株は、駿河湾の深さ１９４５メー
トルの海底土より単離された微生物であり、工業技術院
微生物工業技術研究所に平成３年８月２７日付で寄託さ
れ、その微生物受託番号は、微工研菌寄第１２４４９号
（Ｐ−１２４４９）（以下、「ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１
株」と記す。）である。
ンで処理し、さらに処理後、５０％のケロシンで処理す
る。ケロシン相に移行した親油性の細胞をプロテオース
ペプトンＮｏ．３ ０．１％、フィトン０．０５％、塩
化カルシウム０．１％、亜硫酸ナトリウム０．００５
％、塩化マグネシウム０．０１％からなる培地（Ｍｏｒ
ｉｙａ培地と命名し、下「Ｍ−培地」と記す。）を基準
に、さらにケロシン０．１％、食塩１モル及び寒天１．
５％を添加した寒天培地で培養し、コロニーの数株を得
る。これらの株についてさらにケロシン１．０％及び食
塩１モルを含むＭ−培地で培養し、培養後の細胞の増殖
が最も優れたものを選択した。これが、本発明の新規微
生物であるフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株である。このｓ
ｐ．Ａ ＤＳ−７１１株は、駿河湾の深さ１９４５メー
トルの海底土より単離された微生物であり、工業技術院
微生物工業技術研究所に平成３年８月２７日付で寄託さ
れ、その微生物受託番号は、微工研菌寄第１２４４９号
（Ｐ−１２４４９）（以下、「ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１
株」と記す。）である。
【０００８】次に本発明の微生物の菌学的性質、その培
養法について詳細に説明する。本発明の微生物は、上記
ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の他、その自然的及び人工的
変異株をも含むものである。ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株
は、次の菌学的性質を有する。 （１）形態 大きさが（０．５〜０．７）×（１．０〜２．０）μｍ
の短桿菌である。胞子は形成しない。運動性が有り、周
べん毛を有する。グラム染色は陰性である。 （２）生理学的性質 硝酸塩の還元 ：陰性 デンプンの加水分解 ：陰性 色素の生成 ：有り（コロニー：オレンジ−ピンク） オキシダーゼ ：陽性 カタラーゼ ：陽性 生育範囲 ：ｐＨ５．０〜９．５（最適７．０〜８．０） 温度１２〜２４℃（最適３５〜３７℃） 酸素要求性 ：絶対好気性 Ｏ−Ｆテスト ：酸化 糖類からの酸及び ：無し ガスの生成 （３）その他の性質 塩化ナトリウム耐性 ：３モル濃度の塩化ナトリウムで生育 ＤＮＡのＧＣ含量 ：６７．４ｍｏｌ％ フォスファターゼ ：陽性 ゼラチン加水分解 ：陰性 カゼイン加水分解 ：陽性 ツイーン２０加水分解 ：陽性 ツイーン８０加水分解 ：陽性 炭化水素分解性 ：ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ− ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン、ｎ−ドデナ ン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカン、ｎ−ペン タデカン、ｎ−ヘキサデカン 亜硫酸耐性 ：１００００ｐｐｍ ▲１０▼有機溶媒耐性 ：ベンゼン、トルエン、キシレン ▼１１▲圧力耐性 ：４００ａｔｍ 以上の菌学的性質を、フラボバクテリウム属に属する公
知種のマリノティピカム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｍａｒｉｎｏｔｙｐｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１９２６
０株と比較した時、ＡＴＣＣ１９２６０株は、炭化水素
分解性、亜硫酸耐性、食塩耐性、有機溶媒耐性及び圧力
耐性を殆ど示さなかった事から、バージーのマニュアル
第８巻の分類方法に従い、本発明の新規微生物は、フラ
ボバクテリウム属に属する新菌種であると同定し、フラ
ボバクテリウムｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株と命名した。
養法について詳細に説明する。本発明の微生物は、上記
ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の他、その自然的及び人工的
変異株をも含むものである。ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株
は、次の菌学的性質を有する。 （１）形態 大きさが（０．５〜０．７）×（１．０〜２．０）μｍ
の短桿菌である。胞子は形成しない。運動性が有り、周
べん毛を有する。グラム染色は陰性である。 （２）生理学的性質 硝酸塩の還元 ：陰性 デンプンの加水分解 ：陰性 色素の生成 ：有り（コロニー：オレンジ−ピンク） オキシダーゼ ：陽性 カタラーゼ ：陽性 生育範囲 ：ｐＨ５．０〜９．５（最適７．０〜８．０） 温度１２〜２４℃（最適３５〜３７℃） 酸素要求性 ：絶対好気性 Ｏ−Ｆテスト ：酸化 糖類からの酸及び ：無し ガスの生成 （３）その他の性質 塩化ナトリウム耐性 ：３モル濃度の塩化ナトリウムで生育 ＤＮＡのＧＣ含量 ：６７．４ｍｏｌ％ フォスファターゼ ：陽性 ゼラチン加水分解 ：陰性 カゼイン加水分解 ：陽性 ツイーン２０加水分解 ：陽性 ツイーン８０加水分解 ：陽性 炭化水素分解性 ：ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ− ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン、ｎ−ドデナ ン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカン、ｎ−ペン タデカン、ｎ−ヘキサデカン 亜硫酸耐性 ：１００００ｐｐｍ ▲１０▼有機溶媒耐性 ：ベンゼン、トルエン、キシレン ▼１１▲圧力耐性 ：４００ａｔｍ 以上の菌学的性質を、フラボバクテリウム属に属する公
知種のマリノティピカム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｍａｒｉｎｏｔｙｐｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１９２６
０株と比較した時、ＡＴＣＣ１９２６０株は、炭化水素
分解性、亜硫酸耐性、食塩耐性、有機溶媒耐性及び圧力
耐性を殆ど示さなかった事から、バージーのマニュアル
第８巻の分類方法に従い、本発明の新規微生物は、フラ
ボバクテリウム属に属する新菌種であると同定し、フラ
ボバクテリウムｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株と命名した。
【０００９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。 実施例１ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の採取工程 深海海底土から採取した海水懸濁堆積土の５ｍＬに１０
０μＬのｎ−ヘキサンを添加し、４℃の温度で１週間、
穏やかに振盪を行った。振盪後、さらに５ｍＬのケロシ
ンを重層し、再び室温で、２日間激しく振盪培養した。
培養後、培養物を３０分間静置し、ケロシン層と水層を
分離し、ケロシン層の５０μＬを食塩１モル及び寒天
１．５％を含むＭ−寒天培地に塗沫し、２０〜３０℃の
温度で５日間静置培養を行った。培養後、生育した多く
のコロニーを釣菌し、単離後ケロシン１％及び食塩１モ
ルを含むＭ−培地に各々接種し、３０℃で２日間振盪培
養を行った。これらの操作の後、多くのコロニーの中で
最もよい増殖を示したのが、本発明のｓｐ．Ａ ＤＳ−
７１１株であった。 実施例２ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株によるケロシン分解 菌体の前培養：大型試験管に食塩１モルを含むＭ−培地
１０ｍＬを入れ、シリコン栓を付し、滅菌した。滅菌
後、ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の菌株を保存スラントか
ら一白金耳かきとり、培地に接種し、３７℃で一昼夜激
しく振盪培養した。
明する。 実施例１ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の採取工程 深海海底土から採取した海水懸濁堆積土の５ｍＬに１０
０μＬのｎ−ヘキサンを添加し、４℃の温度で１週間、
穏やかに振盪を行った。振盪後、さらに５ｍＬのケロシ
ンを重層し、再び室温で、２日間激しく振盪培養した。
培養後、培養物を３０分間静置し、ケロシン層と水層を
分離し、ケロシン層の５０μＬを食塩１モル及び寒天
１．５％を含むＭ−寒天培地に塗沫し、２０〜３０℃の
温度で５日間静置培養を行った。培養後、生育した多く
のコロニーを釣菌し、単離後ケロシン１％及び食塩１モ
ルを含むＭ−培地に各々接種し、３０℃で２日間振盪培
養を行った。これらの操作の後、多くのコロニーの中で
最もよい増殖を示したのが、本発明のｓｐ．Ａ ＤＳ−
７１１株であった。 実施例２ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株によるケロシン分解 菌体の前培養：大型試験管に食塩１モルを含むＭ−培地
１０ｍＬを入れ、シリコン栓を付し、滅菌した。滅菌
後、ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の菌株を保存スラントか
ら一白金耳かきとり、培地に接種し、３７℃で一昼夜激
しく振盪培養した。
【００１０】ケロシン分解実験：５００ｍＬ容のひだ付
三角フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地１００ｍＬを
入れ、滅菌後、上記前培養物懸濁液１ｍＬを接種した。
接種後、１０ｍＬのケロシンを重層し、３５℃で１週
間、振盪培養した。培養後、遠心分離を行い、菌体を除
去し、さらに上澄を分液漏斗に移し、残余のケロシン相
と培地の水相とに分け、各々に０．１ｇのオクタコサン
を含むベンゼン５０ｍＬを加え、炭化水素を抽出した。
抽出後、ベンゼンに無水硫酸ナトリウムを加え、脱水
後、濃縮し、ガスクロマトグラフィで炭素数６から１６
までの個々の直鎖炭化水素を分析した。結果を下記表１
に示す。
三角フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地１００ｍＬを
入れ、滅菌後、上記前培養物懸濁液１ｍＬを接種した。
接種後、１０ｍＬのケロシンを重層し、３５℃で１週
間、振盪培養した。培養後、遠心分離を行い、菌体を除
去し、さらに上澄を分液漏斗に移し、残余のケロシン相
と培地の水相とに分け、各々に０．１ｇのオクタコサン
を含むベンゼン５０ｍＬを加え、炭化水素を抽出した。
抽出後、ベンゼンに無水硫酸ナトリウムを加え、脱水
後、濃縮し、ガスクロマトグラフィで炭素数６から１６
までの個々の直鎖炭化水素を分析した。結果を下記表１
に示す。
【００１１】ガスクロマトグラフィの条件：ガスクロマ
トグラフィ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−１４Ａ、検出
器：Ｓｉｎｇｌｅ−ｆｌａｍｅ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ
ｄｅｔｅｃｔｅｒ、カラム：ガラスカラム（２．１ｍ
×３．２ｍ／ｍ）、担体：ｓｉｌｉｃｏｎｅ １０％
ＯＶ−１０１、６０／８０メッシュ クロモソーブＷＡ
Ｗ−ＤＭＣＳ、キャリヤーガス：Ｎ２（４０〜５０ｍｌ
／分）、温度：３５〜３００℃（プログラム速度１０℃
／分） 上記供試ケロシンに含まれる炭素数６から１６までの炭
化水素の全濃度は、ケロシン当たり２９．２容量％に相
当する。 実施例３ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株による５％ｎ−ヘキサン添加
ケロシンに含まれる炭化水素の分解 菌体の前培養：実施例２と同じ方法で行った。
トグラフィ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−１４Ａ、検出
器：Ｓｉｎｇｌｅ−ｆｌａｍｅ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ
ｄｅｔｅｃｔｅｒ、カラム：ガラスカラム（２．１ｍ
×３．２ｍ／ｍ）、担体：ｓｉｌｉｃｏｎｅ １０％
ＯＶ−１０１、６０／８０メッシュ クロモソーブＷＡ
Ｗ−ＤＭＣＳ、キャリヤーガス：Ｎ２（４０〜５０ｍｌ
／分）、温度：３５〜３００℃（プログラム速度１０℃
／分） 上記供試ケロシンに含まれる炭素数６から１６までの炭
化水素の全濃度は、ケロシン当たり２９．２容量％に相
当する。 実施例３ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株による５％ｎ−ヘキサン添加
ケロシンに含まれる炭化水素の分解 菌体の前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００１２】ケロシン分解試験：５００ｍＬ容のひだ付
き三角フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地１００ｍＬ
を入れ、滅菌後、ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の前記培養
物懸濁液１ｍＬを接種した。接種後、予めヘキサン濃度
が５重量％となるように調製したケロシンを１０ｍＬ重
層し、以下実施例２と同様の条件で実験を行った。結果
を表２に示す。
き三角フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地１００ｍＬ
を入れ、滅菌後、ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の前記培養
物懸濁液１ｍＬを接種した。接種後、予めヘキサン濃度
が５重量％となるように調製したケロシンを１０ｍＬ重
層し、以下実施例２と同様の条件で実験を行った。結果
を表２に示す。
【００１３】 実施例４ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株による重油分解 前培養：実施例２と同じ方法で行なった。
【００１４】重油分解試験：５００ｍＬ容ひだ付き三角
フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地を１００ｍＬ入
れ、滅菌後、前記培養物懸濁液を１ｍＬ接種し、さらに
５ｍＬのＣ−重油（出光石油社製）を重層し、２８℃の
温度で２週間緩やかに攪拌培養した。培養後、遠心分離
を行い、菌体を除去し、上澄を分液漏斗に移し、ヘキサ
ン１００ｍＬを加え、炭化水素を抽出し、抽出液を硫酸
マグネシウムで脱水後、ケイ酸カラムクロマトグラフィ
（ケイ酸／セライト＝９／１、２０ｇ、カラム２５ｍｍ
×１００ｍｍ、溶出溶媒ｎ−ヘキサン１５０ｍＬ）によ
って炭化水素を溶出した。溶出液を一定量となるまでロ
ータリーエバポレーターで減圧濃縮し、炭素数９から１
６の個々の直鎖炭化水素をガスクロマトグラフィで分析
した。結果を下記表３に示す。
フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地を１００ｍＬ入
れ、滅菌後、前記培養物懸濁液を１ｍＬ接種し、さらに
５ｍＬのＣ−重油（出光石油社製）を重層し、２８℃の
温度で２週間緩やかに攪拌培養した。培養後、遠心分離
を行い、菌体を除去し、上澄を分液漏斗に移し、ヘキサ
ン１００ｍＬを加え、炭化水素を抽出し、抽出液を硫酸
マグネシウムで脱水後、ケイ酸カラムクロマトグラフィ
（ケイ酸／セライト＝９／１、２０ｇ、カラム２５ｍｍ
×１００ｍｍ、溶出溶媒ｎ−ヘキサン１５０ｍＬ）によ
って炭化水素を溶出した。溶出液を一定量となるまでロ
ータリーエバポレーターで減圧濃縮し、炭素数９から１
６の個々の直鎖炭化水素をガスクロマトグラフィで分析
した。結果を下記表３に示す。
【００１５】 実施例５ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の食塩耐性試験 前培養：大型試験管にＭ−培地を１０ｍＬ入れ、ｓｐ．
Ａ ＤＳ−７１１株の保存スラントから菌体を一白金耳
かきとり、接種した。接種後、３７℃の温度で一昼夜、
激しく振盪培養を行った。
Ａ ＤＳ−７１１株の保存スラントから菌体を一白金耳
かきとり、接種した。接種後、３７℃の温度で一昼夜、
激しく振盪培養を行った。
【００１６】食塩耐性試験：大型試験管に食塩濃度が下
記の表４に示すように０〜３．５モルの濃度になるよう
に調整したＭ一培地の１０ｍＬを入れ、滅菌後、上記前
培養物懸濁液を０．０２５ｍＬ接種し、３７℃の温度で
５日間激しく撹拌培養した。培養後、菌体の増殖を波長
６６０ｎｍによる吸光度（Ｏ．Ｄ６６０）で測定した。
結果を下記表４に示す。
記の表４に示すように０〜３．５モルの濃度になるよう
に調整したＭ一培地の１０ｍＬを入れ、滅菌後、上記前
培養物懸濁液を０．０２５ｍＬ接種し、３７℃の温度で
５日間激しく撹拌培養した。培養後、菌体の増殖を波長
６６０ｎｍによる吸光度（Ｏ．Ｄ６６０）で測定した。
結果を下記表４に示す。
【００１７】 上記の結果から、ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株は、３．０
モルの食塩濃度においても増殖できることが理解され
る。 実施例６ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の有機溶媒耐性試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
モルの食塩濃度においても増殖できることが理解され
る。 実施例６ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の有機溶媒耐性試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００１８】有機溶媒耐性試験：大型試験管に食塩１モ
ルを含むＭ−培地を５ｍＬ加え、滅菌した。滅菌後、上
記前培養物懸濁液０．０２５ｍＬを接種し、さらに下記
表５に示す濃度となるように種々の有機溶媒を培地に重
層した。重層後、２８℃の温度で５日間、激しく振盪
し、培養を行った。培養後、３０分間静置し、有機溶媒
の層と培地の層を分離させた。培地の層の０．１ｍＬを
０．９ｍＬの生理的食塩水に加え、１０倍に希釈し、得
られた希釈液をさらに、同じ操作で１０倍ずつ適宜希釈
していき１０倍から１０６倍の希釈液を調製した。この
各希釈液の０．１ｍＬを食塩１モル及び寒天１．５％を
含むＭ−寒天培地に塗沫し、３７℃の温度で２日間培養
し、培養後形成するコロニーの数を測定し、希釈倍率を
乗じて、培養液中の生菌数を計算し、生菌数濃度を培地
１ｍＬあたりの細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）として求め
た。結果を下記表５に示す。
ルを含むＭ−培地を５ｍＬ加え、滅菌した。滅菌後、上
記前培養物懸濁液０．０２５ｍＬを接種し、さらに下記
表５に示す濃度となるように種々の有機溶媒を培地に重
層した。重層後、２８℃の温度で５日間、激しく振盪
し、培養を行った。培養後、３０分間静置し、有機溶媒
の層と培地の層を分離させた。培地の層の０．１ｍＬを
０．９ｍＬの生理的食塩水に加え、１０倍に希釈し、得
られた希釈液をさらに、同じ操作で１０倍ずつ適宜希釈
していき１０倍から１０６倍の希釈液を調製した。この
各希釈液の０．１ｍＬを食塩１モル及び寒天１．５％を
含むＭ−寒天培地に塗沫し、３７℃の温度で２日間培養
し、培養後形成するコロニーの数を測定し、希釈倍率を
乗じて、培養液中の生菌数を計算し、生菌数濃度を培地
１ｍＬあたりの細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）として求め
た。結果を下記表５に示す。
【００１９】 実施例７ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の混合有機溶媒に対する耐性
試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００２０】耐性試験：実施例６と同じ方法で行った。
尚、菌体接種後に培地へ重層する混合有機溶媒は下記の
表に示す濃度となるように調製した。結果を下記表６に
示す。 実施例８ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の圧力耐性試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
尚、菌体接種後に培地へ重層する混合有機溶媒は下記の
表に示す濃度となるように調製した。結果を下記表６に
示す。 実施例８ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の圧力耐性試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００２１】圧力耐性試験：１２ｍｍ×７５ｍｍの試験
管にシリコンキャップを付し、滅菌した。さらに、食塩
１モルを含むＭ−培地５０ｍＬにＯ．Ｄ６６０が０．０
２となるように、前記培養物懸濁液を１ｍＬ接種し、こ
れを上記滅菌試験管に注射器で無菌的に充填した。次
に、これをチタン製高圧培養装置（離合社製）に装着
し、前記培養装置内を水道水で満たし、高圧培養容器用
ポンプで下記表７に示した圧力に加圧した。加圧後、３
５℃の温度で１週間、静置し、培養を行った。培養後、
培地内の菌体の増殖をＯ．Ｄ６６０で測定するととも
に、実施例６で説明した方法で培地中の生菌数濃度を測
定した。結果を下記表７に示す。
管にシリコンキャップを付し、滅菌した。さらに、食塩
１モルを含むＭ−培地５０ｍＬにＯ．Ｄ６６０が０．０
２となるように、前記培養物懸濁液を１ｍＬ接種し、こ
れを上記滅菌試験管に注射器で無菌的に充填した。次
に、これをチタン製高圧培養装置（離合社製）に装着
し、前記培養装置内を水道水で満たし、高圧培養容器用
ポンプで下記表７に示した圧力に加圧した。加圧後、３
５℃の温度で１週間、静置し、培養を行った。培養後、
培地内の菌体の増殖をＯ．Ｄ６６０で測定するととも
に、実施例６で説明した方法で培地中の生菌数濃度を測
定した。結果を下記表７に示す。
【００２２】 増殖（Ｏ．Ｄ６６０）のかっこ内の数値は、菌体無接種
の場合を示す。また初期菌体濃度は、Ｏ．Ｄ６６０＝
０．０１（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）であった。 実施例９ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の亜硫酸耐性試験 前培養：大型試験管に食塩１モルを含む亜硫酸無添加Ｍ
一培地の１０ｍＬを入れ、滅菌した。滅菌後、ｓｐ．Ａ
ＤＳ−７１１株の保存スラントから、菌体を一白金耳
かきとり接種し、３７℃の温度で一昼夜、激しく振盪培
養した。
の場合を示す。また初期菌体濃度は、Ｏ．Ｄ６６０＝
０．０１（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）であった。 実施例９ ｓｐ．Ａ ＤＳ−７１１株の亜硫酸耐性試験 前培養：大型試験管に食塩１モルを含む亜硫酸無添加Ｍ
一培地の１０ｍＬを入れ、滅菌した。滅菌後、ｓｐ．Ａ
ＤＳ−７１１株の保存スラントから、菌体を一白金耳
かきとり接種し、３７℃の温度で一昼夜、激しく振盪培
養した。
【００２３】亜硫酸耐性試験：大型試験管に食塩２モル
を含む亜硫酸無添加２倍濃縮のＭ−培地の５ｍＬを入
れ、滅菌した。さらに、あらかじめ滅菌しておいた１０
％酸性亜硫酸ナトリウム（ｐＨ８．０に調整したもの）
溶液及び滅菌蒸留水を用いて、全量が１０ｍＬでしかも
下記表８に示す亜硫酸濃度になるように無菌的に調製し
た。調整後、前記培養物懸濁液０．０２５ｍＬを接種
し、３７℃の温度で３日間激しく振盪培養した。培養後
の菌体の増殖をＯ．Ｄ６６０で測定した。結果を表８に
示す。
を含む亜硫酸無添加２倍濃縮のＭ−培地の５ｍＬを入
れ、滅菌した。さらに、あらかじめ滅菌しておいた１０
％酸性亜硫酸ナトリウム（ｐＨ８．０に調整したもの）
溶液及び滅菌蒸留水を用いて、全量が１０ｍＬでしかも
下記表８に示す亜硫酸濃度になるように無菌的に調製し
た。調整後、前記培養物懸濁液０．０２５ｍＬを接種
し、３７℃の温度で３日間激しく振盪培養した。培養後
の菌体の増殖をＯ．Ｄ６６０で測定した。結果を表８に
示す。
【００２４】
【００２５】
【発明の効果】本発明の微生物は、炭化水素に対して優
れた分解作用を示す。また、一般的に微生物にとって有
毒である亜硫酸や、食塩、さらにヘキサンを含めた各種
の有機溶媒に対しても耐性を兼ね備えているので、海上
等に流出したケロシンや重油等の汚染石油製品を有効に
分解することができる。さらに、海上での石油製品の分
解に限らず、それ以外の種々の環境下において、種々の
汚染有機溶媒を有効に分解することができる。
れた分解作用を示す。また、一般的に微生物にとって有
毒である亜硫酸や、食塩、さらにヘキサンを含めた各種
の有機溶媒に対しても耐性を兼ね備えているので、海上
等に流出したケロシンや重油等の汚染石油製品を有効に
分解することができる。さらに、海上での石油製品の分
解に限らず、それ以外の種々の環境下において、種々の
汚染有機溶媒を有効に分解することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｅ０２Ｂ 15/10 Ｚ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:20）
Claims (1)
- 【請求項１】 炭化水素分解性、亜硫酸耐性、食塩耐
性、有機溶媒耐性及び圧力耐性を有するフラボバクテリ
ウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＡＤＳ−
７１１株。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3252195A JPH07100026B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | フラボバクテリウム属に属する新規微生物 |
| US07/950,586 US5342778A (en) | 1991-09-30 | 1992-09-25 | Microorganism belonging to the genus flavobacterium designated ferm BP-4010 |
| DE69232789T DE69232789D1 (de) | 1991-09-30 | 1992-09-30 | Mikroorganismus des Stammes Flavobacterium, Kohlenwasserstoff-Emulgator und -Lösungsmittel, und Trennverfahren für organische lösungsmitteltolerante Mikroorganismen |
| EP92402680A EP0536046B1 (en) | 1991-09-30 | 1992-09-30 | Microorganism belonging to the genus flavobacterium, hydrocarbon emulsifier and solubilizer and separation method for organic-solvent tolerant microorganism |
| US08/242,853 US5518726A (en) | 1991-09-30 | 1994-05-16 | Hydrocarbon emulsifier or solubilizer composition produced by Flavobacterium FERM BP-4010 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3252196A JPH0798143B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | 炭化水素乳化及び可溶化剤 |
| JP3252195A JPH07100026B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | フラボバクテリウム属に属する新規微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0680A JPH0680A (ja) | 1994-01-11 |
| JPH07100026B2 true JPH07100026B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=26540593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3252195A Expired - Fee Related JPH07100026B2 (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | フラボバクテリウム属に属する新規微生物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5342778A (ja) |
| EP (1) | EP0536046B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07100026B2 (ja) |
| DE (1) | DE69232789D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5714378A (en) * | 1995-03-31 | 1998-02-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Pseudomonas chlororaphis microorganism polyurethane degrading enzyme obtained therefrom and method of using enzyme |
| FR2767677B1 (fr) * | 1997-09-04 | 1999-11-05 | Moria Sa | Microkeratome pour chirurgie optalmologique |
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| US20110195505A1 (en) * | 2009-10-08 | 2011-08-11 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Bacterial strains for butanol production |
| RU2547175C1 (ru) * | 2013-10-29 | 2015-04-10 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина" | Способ получения биоэмульгатора |
| CN108083450B (zh) * | 2017-12-10 | 2021-03-02 | 陈云兰 | 一种稀土废水用复合剂 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3268413A (en) * | 1962-12-31 | 1966-08-23 | British Petroleum Co | Cultivation of micro-organisms on a hydrocarbon feedstock in the form of small particles dispersed into a fluid phase under the action of ultra-sonic waves |
| DE1792003C3 (de) * | 1967-07-19 | 1973-11-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., Tokio | Verfahren zur Abtrennung der nach der Fermentation zurückbleibenden Koh lenwasserstoffe und Mikroorganismenzellen aus einer Fermentationsflussigkeit |
| US3642577A (en) * | 1968-09-04 | 1972-02-15 | Mobil Oil Corp | Growing hydrocarbon-utilizing microorganisms |
| FR2078300A5 (ja) * | 1970-02-05 | 1971-11-05 | Mobil Oil Corp | |
| US3674506A (en) * | 1970-03-18 | 1972-07-04 | Gen Mills Inc | Forming a filled edible casing |
| US3898959A (en) * | 1970-07-27 | 1975-08-12 | Mobil Oil Corp | Process for the growth of hydrocarbon-consuming microorganisms |
| US3904476A (en) * | 1973-05-29 | 1975-09-09 | Mobil Oil Corp | Treatment of cells of a hydrocarbon-consuming microorganism |
| IT1139177B (it) * | 1980-09-19 | 1986-09-24 | Elf Aquitaine | Microemulsione di sostanze nutritive |
| US4410625A (en) * | 1982-02-04 | 1983-10-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Salt-tolerant microbial xanthanase and method of producing same |
| DE3580697D1 (de) * | 1984-04-16 | 1991-01-10 | Univ Pennsylvania | Pseudomonas-bakterien, emulgierende zusammensetzung die pseudomonas-bakterien enthaelt und verfahren zur herstellung einer pseudomonas-bakterien enthaltenden zusammensetzung. |
| JPS6269983A (ja) * | 1985-09-24 | 1987-03-31 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | ビルジ資化微生物の育種方法 |
| US4985363A (en) * | 1987-03-05 | 1991-01-15 | Research Development Corporation | Microorganism capable of growing in 50% or more organic solvent |
| JP2562139B2 (ja) * | 1987-03-30 | 1996-12-11 | 新技術事業団 | 微生物の培養法 |
| JPH084515B2 (ja) * | 1987-11-09 | 1996-01-24 | 出光興産株式会社 | 有機化合物の製造方法 |
-
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- 1991-09-30 JP JP3252195A patent/JPH07100026B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-09-25 US US07/950,586 patent/US5342778A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-30 DE DE69232789T patent/DE69232789D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-30 EP EP92402680A patent/EP0536046B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-16 US US08/242,853 patent/US5518726A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0680A (ja) | 1994-01-11 |
| EP0536046B1 (en) | 2002-09-25 |
| US5342778A (en) | 1994-08-30 |
| US5518726A (en) | 1996-05-21 |
| EP0536046A2 (en) | 1993-04-07 |
| DE69232789D1 (de) | 2002-10-31 |
| EP0536046A3 (en) | 1993-09-01 |
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