JPH0680A - フラボバクテリウム属に属する新規微生物 - Google Patents

フラボバクテリウム属に属する新規微生物

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JPH0680A
JPH0680A JP3252195A JP25219591A JPH0680A JP H0680 A JPH0680 A JP H0680A JP 3252195 A JP3252195 A JP 3252195A JP 25219591 A JP25219591 A JP 25219591A JP H0680 A JPH0680 A JP H0680A
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Hokkaido Sugar Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 炭化水素分解性、亜硫酸耐性、食塩耐性、有
機溶媒耐性及び圧力耐性を有するフラボバクテリウム
（Flavobacterium）属に属する新規微生物。フラボバク
テリウム（Flavobacterium）属ＤＳ−７１１株微工研菌
寄第１２４４９号である前記新規微生物。 【効果】 本発明の新規微生物は、炭化水素に対して優
れた分解作用を示す。また、一般的に微生物に対して有
毒である亜硫酸や、食塩、さらにヘキサンを含めた各種
の有機溶媒に対しても耐性を兼ね備えているので、海上
等に流出したケロシンや重油等の汚染石油製品を有効に
分解することができる。さらに、海上での石油製品の分
解に限らず、それ以外の種々の環境下において、種々の
汚染有機溶媒を有効に分解することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フラボバクテリウム
（Flavobacterium）属に属する新規微生物に関する。さ
らに詳しく言うと、本発明は、炭化水素分解性、亜硫酸
耐性、食塩耐性、有機溶媒耐性及び圧力耐性を有するフ
ラボバクテリウム（Flavobacterium）属に属する新規微
生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、石油による海上汚染が頻繁に起こ
り、問題となっている。このような問題を解決する手段
として、海上に流出した汚染石油に含まれる全ての炭化
水素を効率良くかつ容易に分解する微生物が望まれてい
るが、このような能力を十分に備えた微生物は未だ発見
されていない。石油に含まれる単一の炭化水素を資化、
分解する微生物としては、これまでに、バチルス（Baci
llus) 属、アシネトバクター(Acinetobacter) 属、シュ
ードモナス(Pseudomonas) 属、モラキセラ(Moraxella)
属、アルカヂア(Arcadia) 属またはキャンヂダ(Candid
a) 属に属する数種類の微生物が土壌や海水から単離さ
れているが、これらは海上での汚染石油等の分解に必要
とされる食塩耐性、有機溶媒耐性等の耐性を備えておら
ず、満足できるものではない。
【０００３】海上に流出した汚染石油等を分解するため
には、ケロシン、重油等の石油製品を効率よく分解でき
ることが要求されるとともに、これらの製品に含まれて
いる有機溶媒の一つであるヘキサンの毒性に対する耐
性、海水中に高濃度で含まれる食塩に対する耐性、さら
に、圧力に対する耐性も要求される。このような耐性を
すべて備えた微生物は、これまでに発見されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、炭化水素分解性、食塩耐性、有機溶媒耐性等に優れ
た微生物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】海洋科学技術センターで
は、有人潜水艇「しんかい２０００」や「しんかい６５
００」を開発し、これにより最大６５００メートルの深
海の泥を採取できるようになった。本願発明者らは、こ
の有人潜水艇によって採取された深海泥の中から、上記
条件を兼ね備えた微生物を見出すべく鋭意研究を重ねた
結果、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属に属す
る新規微生物が上記条件を兼ね備えていることを見出
し、その発見に基づいて本発明を完成させた。
【０００６】即ち、本発明は、炭化水素分解性、亜硫酸
耐性、食塩耐性、有機溶媒耐性及び圧力耐性を有するフ
ラボバクテリウム（Flavobacterium）属に属する新規微
生物を提供するものである。この新規微生物のひとつと
して、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属ＤＳ−
７１１株が挙げられる。このフラボバクテリウム（Flav
obacterium）属ＤＳ−７１１株の単離は下記の方法によ
って行う。
【０００７】即ち、予め深海海底土を２％濃度のヘキサ
ンで処理し、さらに処理後、５０％のケロシンで処理す
る。ケロシン相に移行した親油性の細胞をプロテオース
ペプトンＮｏ.3 0.１％、フィトン０.0５％、塩化カル
シウム０.1％、亜硫酸ナトリウム０.005％、塩化マグネ
シウム0.01％からなる培地（Moriya培地と命名し、以下
「Ｍ−培地」と記す。）を基準に、さらにケロシン0.1
％、食塩１モル及び寒天1.5 ％を添加した寒天培地で培
養し、コロニーの数株を得る。これらの株についてさら
にケロシン１.0％及び食塩１モルを含むＭ−培地で培養
し、培養後の細胞の増殖が最も優れたものを選択した。
これが、本発明の新規微生物であるフラボバクテリウム
（Flavobacterium）属ＤＳ−７１１株である。このＤＳ
−７１１株は、駿河湾の深さ１９４５メートルの海底土
より単離された微生物であり、工業技術院微生物工業技
術研究所に平成３年８月２７日付で寄託され、その微生
物受託番号は、微工研菌寄第１２４４９号(P−12449)(
以下、「ＤＳ−７１１株」と記す。) である。
【０００８】次に本発明の微生物の菌学的性質、その培
養法について詳細に説明する。本発明の微生物は、上記
ＤＳ−７１１株の他、その自然的及び人工的変異株をも
含むものである。ＤＳ−７１１株は、次の菌学的性質を
有する。 （１）形態 大きさが（０.5〜０.7）×（１.0〜２.0）μｍの短桿菌
である。胞子は形成しない。運動性が有り、周べん毛を
有する。グラム染色は陰性である。 （２）生理学的性質 硝酸塩の還元 ：陰性 デンプンの加水分解 ：陰性 色素の生成 ：有り（コロニー：オレンジ−
ピンク） オキシダーゼ ：陽性 カタラーゼ ：陽性 生育範囲 ：ｐＨ５.0〜９.5（最適７.0〜
８.0） 温度１２〜４２℃（最適３５〜３７℃） 酸素要求性 ：絶対好気性 Ｏ−Ｆテスト ：酸化 糖類からの酸及び ：無し ガスの生成 （３）その他の性質 塩化ナトリム耐性 ：３モル濃度の塩化ナトリウム
で生育 ＤＮＡのＧＣ含量 ：６７.4 mol％ フォスファターゼ ：陽性 ゼラチン加水分解 ：陰性 カゼイン加水分解 ：陽性 ツイーン20加水分解 ：陽性 ツイーン80加水分解 ：陽性 以上の菌学的性質からをバージーのマニュアル第８巻の
分類方法に従って、フラボバクテリウム（Flavobacteri
um）属に属する新規の菌株であると判断し、フラボバク
テリウム（Flavobacterium）属ＤＳ−７１１株と命名し
た。
【０００９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。 実施例１ ＤＳ−７１１株の採取工程 深海海底土から採取した海水懸濁堆積土の５ｍＬに１０
０μＬのｎ−ヘキサンを添加し、４℃の温度で１週間、
穏やかに振盪を行った。振盪後、さらに５ｍＬのケロシ
ンを重層し、再び室温で、２日間激しく振盪培養した。
培養後、培養物を３０分間静置し、ケロシン層と水層を
分離し、ケロシン層の５０μＬを食塩１モル及び寒天1.
5 ％を含むＭ−寒天培地に塗沫し、２０〜３０℃の温度
で５日間静置培養を行った。培養後、生育した多くのコ
ロニーを釣菌し、単離後ケロシン１％及び食塩１モルを
含むＭ−培地に各々接種し、３０℃で２日間振盪培養を
行った。これらの操作の後、多くのコロニーの中で最も
よい増殖を示したのが、本発明のＤＳ−７１１株であっ
た。 実施例２ ＤＳ−７１１株によるケロシン分解 菌体の前培養：大型試験管に食塩１モルを含むＭ−培地
１０ｍＬを入れ、シリコン栓を付し、滅菌した。滅菌
後、ＤＳ−７１１株の菌株を保存スラントから一白金耳
かきとり、培地に接種し、３７℃で一昼夜激しく振盪培
養した。
【００１０】ケロシン分解実験：５００ｍＬ容のひだ付
三角フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地１００ｍＬを
入れ、滅菌後、上記前培養物懸濁液１ｍＬを接種した。
接種後、１０ｍＬのケロシンを重層し、３５℃で１週
間、振盪培養した。培養後、遠心分離を行い、菌体を除
去し、さらに上澄を分液漏斗に移し、残余のケロシン相
と培地の水相とに分け、各々に０.1ｇのオクタコサンを
含むベンゼン５０ｍＬを加え、炭化水素を抽出した。抽
出後、ベンゼンに無水硫酸ナトリウムを加え、脱水後、
濃縮し、ガスクロマトグラフィで炭素数６から１６まで
の個々の直鎖炭化水素を分析した。結果を下記表１に示
す。
【００１１】ガスクロマトグラフィの条件：ガスクロマ
トグラフィ: Shimadzu GC −14A 、検出器：Single−fl
ame ionization detecter 、カラム：ガラスカラム（2.
1m×3.2m/m) 、担体：silicone 10 ％ OV −101 、60/8
0 メッシュ クロモソーブWAW−DMCS、キャリヤーガ
ス：Ｎ2 （40〜50ml/ 分) 、温度：35〜300 ℃（プログ
ラム速度１０℃／分） 表１ ケロシンに含まれる炭化水素の分解 炭化水素量 対照区炭化水素 実験区炭化水素 （菌体無接種） （mg） ケロシン相 水相 ケロシン相 水相 ｎ−ヘキサン 0.8 不検出 不検出 不検出 不検出 ｎ−ヘプタン 56 34 不検出 不検出 0.02 ｎ−オクタン 72 39 不検出 7 不検出 ｎ−ノナン 236 190 不検出 34 不検出 ｎ−デカン 312 245 不検出 70 不検出 ｎ−ウンデカン 320 270 0.04 85 1.4 ｎ−ドデカン 704 652 0.08 150 1.7 ｎ−トリデカン 596 501 0.09 134 2.4 ｎ−テトラデカン 364 332 0.09 78 1.7 ｎ−ペンタデカン 212 188 0.07 12 1.3 ｎ−ヘキサデカン 48 39 0.02 7 0.6 上記供試ケロシンに含まれる炭素数６から１６までの炭
化水素の全濃度は、ケロシン当たり２９.2容量％に相当
する。 実施例３ ＤＳ−７１１株による５％ｎ−ヘキサン添加ケロシンに
含まれる炭化水素の分解 菌体の前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００１２】ケロシン分解試験：５００ｍＬ容のひだ付
き三角フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地１００ｍＬ
を入れ、滅菌後、ＤＳ−７１１株の前記培養物懸濁液１
ｍＬを接種した。接種後、予めヘキサン濃度が５重量％
となるように調製したケロシンを１０ｍＬ重層し、以下
実施例２と同様の条件で実験を行った。結果を表２に示
す。
【００１３】 表２ ケロシンに含まれる炭化水素の分解 炭化水素量 対照区炭化水素 実験区炭化水素 （菌体無接種） （mg） ケロシン相 水相 ケロシン相 水相 ｎ−ヘキサン 500.8 224 不検出 210 0.25 ｎ−ヘプタン 56 34 不検出 不検出 0.02 ｎ−オクタン 72 39 不検出 11 不検出 ｎ−ノナン 236 190 不検出 55 不検出 ｎ−デカン 312 245 不検出 85 不検出 ｎ−ウンデカン 320 270 0.04 96 0.05 ｎ−ドデカン 704 652 0.08 167 0.09 ｎ−トリデカン 596 501 0.09 100 1.7 ｎ−テトラデカン 364 332 0.09 45 1.5 ｎ−ペンタデカン 212 188 0.07 16 2.3 ｎ−ヘキサデカン 48 39 0.02 9 0.9 実施例４ ＤＳ−７１１株によるの重油分解 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００１４】重油分解試験：５００ｍＬ容ひだ付き三角
フラスコに食塩１モルを含むＭ−培地を１００ｍＬ入
れ、滅菌後、前記培養物懸濁液を１ｍＬ接種し、さらに
５ｍＬのＣ−重油（出光石油社製）を重層し、２８℃の
温度で２週間緩やかに攪拌培養した。培養後、遠心分離
を行い、菌体を除去し、上澄を分液漏斗に移し、ヘキサ
ン１００ｍＬを加え、炭化水素を抽出し、抽出液を硫酸
マグネシウムで脱水後、ケイ酸カラムクロマトグラフィ
（ケイ酸／セライト＝９／１、２０ｇ、カラム25mm×10
0mm 、溶出溶媒ｎ−ヘキサン150mL)によって炭化水素を
溶出した。溶出液を一定量となるまでロータリーエバポ
レーターで減圧濃縮し、炭素数９から１６の個々の直鎖
炭化水素をガスクロマトグラフィで分析した。結果を下
記表３に示す。
【００１５】 表３ 重油に含まれる炭化水素の分解 炭化水素量 対照区炭化水素 実験区炭化水素 （mg） （菌体無接種） ｎ−ノナン 15 11 0.7 ｎ−デカン 21 16 0.8 ｎ−ウンデカン 25 22 1.1 ｎ−ドデカン 45 39 2.6 ｎ−トリデカン 49 41 2.4 ｎ−テトラデカン 40 36 2.2 ｎ−ペンタデカン 35 29 1.9 ｎ−ヘキサデカン 29 22 1.2 ヘキサン、ヘプタン、オクタンについては測定せず。 実施例５ ＤＳ−７１１株の食塩耐性試験 前培養：大型試験管にＭ−培地を１０ｍＬ入れ、ＤＳ−
７１１株の保存スラントから菌体を一白金耳かきとり、
接種した。接種後、３７℃の温度で一昼夜、激しく振盪
培養を行った。
【００１６】食塩耐性試験：大型試験管に食塩濃度が下
記の表４に示すように０〜３.5モルの濃度になるように
調整したＭ−培地の１０ｍＬを入れ、滅菌後、上記前培
養物懸濁液を0.０２５ｍＬ接種し、３７℃の温度で５日
間激しく攪拌培養した。培養後、菌体の増殖を波長６６
０ｎｍによる吸光度（O.D660) で測定した。結果を下記
表４に示す。
【００１７】 表４ 食塩濃度と菌体の増殖 食塩濃度（モル）０ １.0 １.5 ２.0 ２.5 ３.0 ３.5 増殖（O.D660) 1.22 １.34 １.22 １.02 １.00 ０.99 ０.02 上記の結果から、ＤＳ−７１１株は、3.0 モルの食塩濃
度においても増殖できることが理解される。 実施例６ ＤＳ−７１１株の有機溶媒耐性試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００１８】有機溶媒耐性試験：大型試験管に食塩１モ
ルを含むＭ−培地を５ｍＬ加え、滅菌した。滅菌後、上
記前培養物懸濁液０.025mLを接種し、さらに下記表５に
示す濃度となるように種々の有機溶媒を培地に重層し
た。重層後、28℃の温度で５日間、激しく振盪し、培養
を行った。培養後、３０分間静置し、有機溶媒の層と培
地の層を分離させた。培地の層の０.1mLを0.9mL の生理
的食塩水に加え、10倍に希釈し、得られた希釈液をさら
に、同じ操作で10倍ずつ適宜希釈していき10倍から106
倍の希釈液を調製した。この各希釈液の0.1mL を食塩１
モル及び寒天1.5％を含むＭ−寒天培地に塗沫し、３７
℃の温度で２日間培養し、培養後形成するコロニーの数
を測定し、希釈倍率を乗じて、培養液中の生菌数を計算
し、生菌数濃度を培地１ｍＬあたりの細胞数（cells/m
L) として求めた。結果を下記表５に示す。
【００１９】 表５各種有機溶媒を添加した培地におけるＤＳ−７１１株の増殖（×108cells/mL) 濃度（v/v ％) ０ 1 5 10 ヘキサン 1.22 1.24 1.10 増殖せず ベンゼン 1.35 増殖せず 増殖せず トルエン 1.29 1.30 増殖せず キシレン 1.32 1.30 増殖せず 実施例７ ＤＳ−７１１株の混合有機溶媒に対する耐性試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００２０】耐性試験：実施例６と同じ方法で行った。
尚、菌体接種後に培地へ重層する混合有機溶媒は下記の
表に示す濃度となるように調製した。結果を下記表６に
示す。 表６各種混合有機溶媒の添加培地におけるＤＳ−７１１株の増殖（×108cells/mL) 混合溶媒 増殖 ベンゼン１％、ヘキサン１％、トルエン１％及びキシレン１％ 1.28 ベンゼン１％、ヘキサン５％、トルエン５％及びキシレン５％ 0.23 ベンゼン１％、ヘキサン10％、トルエン10％及びキシレン10％ 増殖せず 溶媒無添加 1.22 実施例８ ＤＳ−７１１株の圧力耐性試験 前培養：実施例２と同じ方法で行った。
【００２１】圧力耐性試験：１２mm×75mmの試験管にシ
リコンキャップを付し、滅菌した。さらに、食塩１モル
を含むＭ−培地５０ｍＬにO.D660が０.0２となるよう
に、前記培養物懸濁液を１ｍＬ接種し、これを上記滅菌
試験管に注射器で無菌的に充填した。次に、これをチタ
ン製高圧培養装置（離合社製）に装着し、前記培養装置
内を水道水で満たし、高圧培養容器用ポンプで下記表７
に示した圧力に加圧した。加圧後、３５℃の温度で１週
間、静置し、培養を行った。培養後、培地内の菌体の増
殖をO.D660で測定するとともに、実施例６で説明した方
法で培地中の生菌数濃度を測定した。結果を下記表７に
示す。
【００２２】 表７ 圧力(atm) 増殖（O.D660) 生菌体濃度（cells/mL) 1 0.389(0.004) 6×107 200 0.191(0.005) 2×107 400 0.022(0.005) 2×106 増殖（O.D660) のかっこ内の数値は、菌体無接種の場合
を示す。また初期菌体濃度は、O.D660＝0.01（１×106c
ells/mL)であった。 実施例９ ＤＳ−７１１株の亜硫酸耐性試験 前培養：大型試験管に食塩１モルを含む亜硫酸無添加Ｍ
−培地の１０ｍＬを入れ、滅菌した。滅菌後、ＤＳ−７
１１株の保存スラントから、菌体を一白金耳かきとり接
種し、３７℃の温度で一昼夜、激しく振盪培養した。
【００２３】亜硫酸耐性試験：大型試験管に食塩２モル
を含む亜硫酸無添加２倍濃縮のＭ−培地の５ｍＬを入
れ、滅菌した。さらに、あらかじめ滅菌しておいた１０
％酸性亜硫酸ナトリウム（ｐＨ８.0に調整したもの) 溶
液及び滅菌蒸留水を用いて、全量が10mLでしかも下記表
８に示す亜硫酸濃度になるように無菌的に調製した。調
整後、前記培養物懸濁液０.0２５ｍＬを接種し、３７℃
の温度で３日間激しく振盪培養した。培養後の菌体の増
殖をO.D660で測定した。結果を表８に示す。
【００２４】 表８ 亜硫酸イオン(ppm) 0 25 50 250 500 10000 増殖（O.D660) 1.2 1.5 1.45 1.12 1.05 0.85
【００２５】
【発明の効果】本発明の微生物は、炭化水素に対して優
れた分解作用を示す。また、一般的に微生物にとって有
毒である亜硫酸や、食塩、さらにヘキサンを含めた各種
の有機溶媒に対しても耐性を兼ね備えているので、海上
等に流出したケロシンや重油等の汚染石油製品を有効に
分解することができる。さらに、海上での石油製品の分
解に限らず、それ以外の種々の環境下において、種々の
汚染有機溶媒を有効に分解することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｅ０２Ｂ 15/10 Ｚ 9231−2Ｄ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:20）

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 炭化水素分解性、亜硫酸耐性、食塩耐
    性、有機溶媒耐性及び圧力耐性を有するフラボバクテリ
    ウム（Flavobacterium) 属に属する新規微生物。
  2. 【請求項２】 フラボバクテリウム（Flavobacterium）
    属ＤＳ−７１１株微工研菌寄第１２４４９号である請求
    項１に記載の新規微生物。
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