JP3203272B2 - 有機溶媒耐性微生物の分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は有機溶媒耐性微生物の分
離方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、石油による海上汚染が頻繁に起こ
り、問題となっている。このような問題を解決する手段
として、海上に流出した汚染石油に含まれる全ての炭化
水素を効率よくかつ容易に分解する微生物が望まれてい
るが、このような能力を十分に備えた微生物は未だ発見
されていない。石油に含まれる単一の炭化水素を資化、
分解する微生物としてはこれまでに、バチルス(Bacillu
s)属、アシネトバクター(Acinetobacter) 属、シュード
モナス(Pseudomonas) 属、モラキセラ(Moraxella) 属、
アルカジア(Arcadia) 属又はキャンジダ(Candida) 属に
属する数種類の微生物が土壌や海水から単離されている
が、これらは海上での汚染石油等の分解に必要とされる
食塩耐性、有機溶媒耐性等の耐性を備えておらず、満足
できるものではない。

【０００３】一方、海上に流出した汚染石油等を分解す
るためには、ケロシン、重油等の石油製品を効率よく分
解できることが要求されるとともに、これらの製品に含
まれている有機溶媒の一種であるヘキサン、ベンゼン、
トルエン、キシレン等の毒性に対する耐性、海水中に高
濃度で含まれる食塩に対する耐性、さらに、圧力に対す
る耐性も要求される。従来、このような耐性、特に有機
溶媒耐性を備えた微生物を分離するには、有機溶媒を含
む培地に試料を加えて培養し、培地に生育する微生物を
単離するという方法が採用されている。しかし、この方
法は、時間がかかるだけでなく、分離効率も極めて低い
という問題があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、試料から、短時間で、効率よく、有機溶媒耐性に優
れた微生物を分離する方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、試
料を水及び有機溶媒と混合し、振盪培養を行った後、培
養混合物を静置し、水相と有機溶媒相に分離し、有機溶
媒相の適量を培地に加えて培養し、生育する微生物を単
離することを特徴とする有機溶媒耐性微生物の分離方法
により達成された。本発明において振盪培養は、４〜３
０℃で１〜７日間行うことが好ましい。本発明に使用す
る水は特に限定されない。例えば、脱イオン水、蒸留
水、海水又は人工海水等を使用すればよい。使用する水
のｐＨは、好ましくは４〜９、さらに好ましくは５〜
８、最も好ましくは中性付近である。試料と混合する水
と有機溶媒の容積比は１：９〜９：１であることが好ま
しく、また試料は、水と有機溶媒の総量（１００容量
部）に対して１〜１０容量部（重量部）加えることが好
ましい。分離した有機溶媒相の適量を培養する培地とし
ては、寒天培地が挙げられる。有機溶媒相の培養は、有
機溶媒耐性微生物が生育する条件、例えば、２０〜４０
℃、好ましくは、３０℃で１〜１０日間行えばよい。本
発明で使用する有機溶媒は、その有機溶媒に対する耐性
を備えた微生物を分離するためのものであり、典型的に
は常温で液体の炭化水素であり、特に芳香族炭化水素、
脂肪族炭化水素、脂環式炭化水素が挙げられる。芳香族
炭化水素としては、炭素数６〜８のもの、例えば、ベン
ゼン、トルエン、キシレン等が、また脂肪族炭化水素と
しては、炭素数５〜１６のもの、例えば、ペンタン、ヘ
キサン、ヘプタン、オクタン等が、脂環式炭化水素とし
ては、炭素数５〜８のもの、例えば、シクロペンタン、
シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン等が
挙げられる。さらにこれらの有機溶媒の混合物、例え
ば、シンナーや石油ベンジン等も用いることができる。
このようにして単離した有機溶媒耐性微生物の判定は例
えば、次のように行うことができる。 前培養： 試験管に液体培地５mlを加え、１２０℃で２
０分間オートクレーブ殺菌する。単離した微生物を一白
金耳採り、殺菌した培地に接種し、３５℃の温度で１日
振盪培養を行ない前培養微生物懸濁液を調製する。 判定方法： 試験管に液体培地５mlを加え、上記条件で
殺菌する。殺菌した培地に上記微生物懸濁液の１００μ
l を接種し、さらに有機溶媒を５０μl 添加し、シリコ
ンゴム栓を付し、３０℃の温度で３日間振盪培養を行
う。振盪後、微生物無接種の対照と比べて培地の波長６
６０nmの吸光度の上昇が認められるものを有機溶媒微生
物と判定する。

【０００６】

【発明の効果】本発明によれば、試料から、有機溶媒耐
性に優れた微生物を、短時間で、効率よく分離すること
ができる。

【０００７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。なお％は他に明記しない限り重量％である。 （実施例１）有機溶媒耐性微生物の分離 ： 試料１ｇを試験管にい
れ、蒸留水あるいは人工海水（いずれもpH６）を５ml加
え、充分攪拌し、試料を分散させた。これに、有機溶媒
を全量が１０mlとなるように添加し、シリコンゴム栓を
付し、１０℃の温度で、７日間激しく振盪培養を行っ
た。この間、有機溶媒のなかで生存もしくは増殖可能な
微生物が有機溶媒相へ移行する。培養終了後、培養物を
分液ロートにいれ、１時間静置し、水相と有機溶媒相に
わけた。有機溶媒相１００μl をとり、寒天培地に塗抹
沈着させ、３０℃の温度で、７日間培養し、生育した微
生物を単離した。人工海水の組成 ： 塩化ナトリウム３％、塩化カルシウ
ム0.１％、塩化マグネシウム0.１％及び塩化カリウム0.
１％を含むもの。寒天培地の組成 ： プロテオースペプトン0.５％、フィ
トンペプトン0.２５％、塩化カルシウム0.１％、塩化マ
グネシウム0.０１％、塩化ナトリウム5.８％、亜硫酸ナ
トリウム５０ppm 及び寒天２％を含むもの。または酵母
エキス0.５％、トリプトン１％、塩化ナトリウム0.５％
及び寒天２％を含み、必要に応じて塩化カルシウム0.１
％および塩化マグネシウム0.０１％を添加したもの。液体培地の組成 ： 上記組成から寒天を除いたもの有機溶媒耐性微生物の判定 ：試験管に液体培地５mlを加
え、１２０℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。単離
した微生物を一白金耳採り、培地に接種し、３５℃の温
度で１日振盪培養を行ない、前培養微生物懸濁液を調製
した。試験管に液体培地の５mlを加え、上記条件で殺菌
した。殺菌した培地に上記微生物懸濁液の１００μl を
接種し、さらに有機溶媒を５０μl 添加し、シリコンゴ
ム栓を付して、３０℃の温度で、３日間振盪培養を行っ
た。振盪培養後、微生物無接種の対照と比べて培地の波
長６６０nmの吸光度の上昇が認められるものを有機溶媒
微生物と判定した。結果を表１に示す。分離源を種々検
討した結果、どの分離源でも本発明の方法により効率よ
く有機溶媒耐性微生物が分離されることがわかる。

【０００８】

【表１】 表１ 各種試料１ｇから分離される有機溶媒耐性微生物の数 ─────────────────────────────────── 土壌試料 深海試料 試料 ──────────── ────────────────── Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ Ｊ ─────────────────────────────────── 株数 10 ７ 11 16 19 37 48 52 ９ ４ ─────────────────────────────────── Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、理化学研究所の各地点で無作為に採
取した土壌試料。Ｅ，Ｆ，Ｇは、駿河湾の海底から採取
した泥試料。Ｈ，Ｉ，Ｊは、相模湾の海底から採取した
泥試料。水相は、ＡからＤまでが蒸留水、ＥからＪまで
が人工海水。

【０００９】この実施例において試料Ｇから分離された
微生物、すなわち、駿河湾の深さ１９４５メートルの海
底土より分離された微生物は新規微生物であり、フラボ
バクテリウム（Flavobacterium）属ＤＳ−７１１株と命
名された。このＤＳ−７１１株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に平成３年８月２７日付で寄託され、その
微生物受託番号は微工研条寄第４０１０号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４０１０）である。

【００１０】（実施例２）実施例１に従って、試料Ｇを
用いて、有機溶媒相と水相（人工海水）の比率を下記表
２のように変えて行い、単離される有機溶媒耐性微生物
の数を調べた。結果を表２に示す。効率よい分離は、
５：５の量比で得られるが、それ以外の量比の場合でも
有機溶媒耐性微生物が得られることがわかる。

【００１１】

【表２】 表２ 有機溶媒／水の比と分離された有機溶媒耐性微生物数の関係 ─────────────────────────────────── 使用有機溶媒 有機溶媒／水 分離された有機溶媒耐性 （Ｖ／Ｖ） 微生物数／試料１ｇ ─────────────────────────────────── ベンゼン １：９ １７ ３：７ ２９ ５：５ ４８ ７：３ ３２ ９：１ ４１ トルエン ５：５ ７９ キシレン ５：５ ９８ ───────────────────────────────────

【００１２】（実施例３）有機溶媒としてベンゼンを使
用し、ベンゼン：水（人工海水）を５：５とし、培養時
間を下記表３のごとく変化させた他は実施例１と同様に
して、分離される有機溶媒耐性微生物の数を調べた。結
果を表３に示す。培養日数は７日間が望ましいが、１日
の培養でも目的とする有機溶媒耐性微生物が多数採取さ
れることがわかる。

【００１３】

【表３】 表３ 培養時間と分離される有機溶媒耐性微生物数の関係 ─────────────────────────────────── 試料１ｇあたり分離される有機溶媒耐性微生物の数 培養時間（日）────────────────────────── 試料Ｆ 試料Ｇ ─────────────────────────────────── １ ２１ ３０ ２ ２６ ３２ ５ ２７ ３９ ７ ３７ ４８ ───────────────────────────────────

【００１４】（実施例４）有機溶媒としてベンゼンを使
用し、ベンゼン：水（人工海水）を５：５とし、培養温
度を下記表４のごとく変化させた他は実施例１と同様に
して、分離される有機溶媒耐性微生物の数を調べた。結
果を表４に示す。いずれの試料の場合でも、１０℃の温
度で培養することによって、最も多くの有機溶媒耐性微
生物が得られるが、４℃〜３０℃の温度範囲では、どの
場合でも効率よく有機溶媒耐性微生物が得られる。

【００１５】

【表４】 表４ 培養温度と分離される有機溶媒耐性微生物数の関係 ─────────────────────────────────── 試料１ｇあたり分離された有機溶媒耐性微生物の数 培養温度（℃）────────────────────────── 試料Ｆ 試料Ｇ ─────────────────────────────────── ４ ３１ ３４ １０ ３７ ４８ ２０ ２８ ２９ ３０ ２６ ２８ ───────────────────────────────────

【００１６】（実施例５）有機溶媒としてベンゼンを使
用し、ベンゼン：水（人工海水）を５：５とし、試料Ｇ
を用い、水相のpHを表５のごとく変化させた他は実施例
１と同様にして、分離される有機溶媒耐性微生物の数を
調べた。pHの調整は、水酸化ナトリウムおよび硫酸で行
った。結果を表５に示す。試料懸濁水相がpH５からpH８
までの範囲では、効率よく有機溶媒耐性微生物が得られ
た。これに対し、水相がpH３の酸性条件およびpH１０の
アルカリ条件の場合は、得られる有機溶媒耐性微生物の
数は激減した。従って、処理用水相のpHは、中性付近が
望ましいといえる。

【００１７】

【表５】 表５ 水相pHと分離された有機溶媒耐性微生物数の関係 ─────────────────────────────────── 試料１ｇあたり分離される溶媒耐性微生物の数 水相pH ────────────────────────── 試料Ｆ 試料Ｇ ─────────────────────────────────── （蒸留水を用いた場合） ３ ２ ７ ５ １４ １９ ６ １５ １９ ７ １２ ２０ ８ １０ １８ １０ ０ ２ （人工海水を用いた場合） ３ ４ ８ ５ ２９ ４１ ６ ３７ ４８ ７ ３３ ３９ ８ ３０ ３８ １０ ３ ９ ───────────────────────────────────

【００１８】（実施例６） ＤＳ−７１１株によるケロシン分解菌体の前培養 ：大型試験管に食塩１モルを含むＭ−培地
１０mlを入れ、シリコン栓を付し、滅菌した。滅菌後、
ＤＳ−７１１株の菌株を保存スラントから一白金耳かき
とり、培地に接種し、３７℃で一昼夜激しく振盪培養し
た。ケロシン分解実験 ：５００ml容のひだ付三角フラスコに
食塩１モルを含むＭ−培地１００mlを入れ、滅菌後、上
記前培養物懸濁液１mlを接種した。接種後、１０mlのケ
ロシンを重層し、３５℃で１週間、振盪培養した。培養
後、遠心分離を行い、菌体を除去し、さらに上澄を分液
漏斗に移し、残余のケロシン相と培地の水相とに分け、
各々に０.1ｇのオクタコサンを含むベンゼン５０mlを加
え、炭化水素を抽出した。抽出後、ベンゼンに無水硫酸
ナトリウムを加え、脱水後、濃縮し、ガスクロマトグラ
フィで炭素数６から１６までの個々の直鎖炭化水素を分
析した。結果を下記表６に示す。 ガスクロマトグラフィの条件：ガスクロマトグラフィ:
Shimadzu GC −14A 、検出器：Single-flame ionizatio
n detecter、カラム：ガラスカラム（2.1m×3.2m/m) 、
担体：silicone 10 ％ OV −101 、60/80 メッシュ ク
ロモソーブW AW-DMCS 、キャリヤーガス：Ｎ₂ （40〜50
ml/ 分) 、温度：35〜300 ℃（プログラム速度１０℃／
分）

【００１９】

【表６】 表６ ケロシンに含まれる炭化水素の分解 ─────────────────────────────────── 炭化水素量 対照区炭化水素 実験区炭化水素 （菌体無接種） （mg） ケロシン相 水相 ケロシン相 水相 ─────────────────────────────────── ｎ−ヘキサン 0.8 不検出 不検出 不検出 不検出 ｎ−ヘプタン 56 34 不検出 不検出 0.02 ｎ−オクタン 72 39 不検出 7 不検出 ｎ−ノナン 236 190 不検出 34 不検出 ｎ−デカン 312 245 不検出 70 不検出 ｎ−ウンデカン 320 270 0.04 85 1.4 ｎ−ドデカン 704 652 0.08 150 1.7 ｎ−トリデカン 596 501 0.09 134 2.4 ｎ−テトラデカン 364 332 0.09 78 1.7 ｎ−ペンタデカン 212 188 0.07 12 1.3 ｎ−ヘキサデカン 48 39 0.02 7 0.6 ─────────────────────────────────── 上記供試ケロシンに含まれる炭素数６から１６までの炭
化水素の全濃度は、ケロシン当たり２９.2容量％に相当
する。

【００２０】（実施例７） ＤＳ−７１１株による５％ｎ−ヘキサン添加ケロシンに
含まれる炭化水素の分解菌体の前培養 ：実施例６と同じ方法で行った。ケロシン分解試験 ：５００ml容のひだ付き三角フラスコ
に食塩１モルを含むＭ−培地１００mlを入れ、滅菌後、
ＤＳ−７１１株の前記培養物懸濁液１mlを接種した。接
種後、予めヘキサン濃度が５重量％となるように調製し
たケロシンを１０ml重層し、以下実施例６と同様の条件
で実験を行った。結果を表７に示す。

【００２１】

【表７】 表７ ケロシンに含まれる炭化水素の分解 ─────────────────────────────────── 炭化水素量 対照区炭化水素 実験区炭化水素 （菌体無接種） （mg） ケロシン相 水相 ケロシン相 水相 ─────────────────────────────────── ｎ−ヘキサン 500.8 224 不検出 210 0.25 ｎ−ヘプタン 56 34 不検出 不検出 0.02 ｎ−オクタン 72 39 不検出 11 不検出 ｎ−ノナン 236 190 不検出 55 不検出 ｎ−デカン 312 245 不検出 85 不検出 ｎ−ウンデカン 320 270 0.04 96 0.05 ｎ−ドデカン 704 652 0.08 167 0.09 ｎ−トリデカン 596 501 0.09 100 1.7 ｎ−テトラデカン 364 332 0.09 45 1.5 ｎ−ペンタデカン 212 188 0.07 16 2.3 ｎ−ヘキサデカン 48 39 0.02 9 0.9 ───────────────────────────────────

【００２２】（実施例８） ＤＳ−７１１株による重油の分解前培養 ：実施例６と同じ方法で行った。重油分解試験 ：５００ml容ひだ付き三角フラスコに食塩
１モルを含むＭ−培地を１００ml入れ、滅菌後、前記培
養物懸濁液を１ml接種し、さらに５mlのＣ−重油（出光
石油社製）を重層し、２８℃の温度で２週間緩やかに攪
拌培養した。培養後、遠心分離を行い、菌体を除去し、
上澄を分液漏斗に移し、ヘキサン１００mlを加え、炭化
水素を抽出し、抽出液を硫酸マグネシウムで脱水後、ケ
イ酸カラムクロマトグラフィ（ケイ酸／セライト＝９／
１、２０ｇ、カラム25mm×100mm 、溶出溶媒ｎ−ヘキサ
ン150 ml) によって炭化水素を溶出した。溶出液を一定
量となるまでロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、
炭素数９から１６の個々の直鎖炭化水素をガスクロマト
グラフィで分析した。結果を表８に示す。

【００２３】

【表８】 表８ 重油に含まれる炭化水素の分解 ─────────────────────────────────── 炭化水素量 対照区炭化水素 実験区炭化水素 （mg） （菌体無接種） ─────────────────────────────────── ｎ−ノナン 15 11 0.7 ｎ−デカン 21 16 0.8 ｎ−ウンデカン 25 22 1.1 ｎ−ドデカン 45 39 2.6 ｎ−トリデカン 49 41 2.4 ｎ−テトラデカン 40 36 2.2 ｎ−ペンタデカン 35 29 1.9 ｎ−ヘキサデカン 29 22 1.2 ─────────────────────────────────── ヘキサン、ヘプタン、オクタンについては測定せず。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−247272（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料を水及び有機溶媒と混合し、振盪培
   養を行った後、培養混合物を静置し、水相と有機溶媒相
   に分離し、有機溶媒相の適量を培地に加えて培養し、生
   育する微生物を単離することを特徴とする有機溶媒耐性
   微生物の分離方法。
2. 【請求項２】 振盪培養を４〜３０℃で１〜７日間行う
   ことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 培地が寒天培地であることを特徴とする
   請求項１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】 水と有機溶媒の容積比が１：９〜９：１
   であることを特徴とする請求項１〜３項のいずれか１記
   載の方法。
5. 【請求項５】 有機溶媒相の培養を２０〜４０℃で１〜
   １０日間行うことを特徴とする請求項１〜４項のいずれ
   か１記載の方法。
6. 【請求項６】 水が脱イオン水、蒸留水、海水又は人工
   海水であることを特徴とする請求項１〜５項のいずれか
   １記載の方法。
7. 【請求項７】 有機溶媒が炭化水素であることを特徴と
   する請求項１〜６項のいずれか１記載の方法。
8. 【請求項８】 炭化水素が芳香族炭化水素であることを
   特徴とする請求項１〜７項のいずれか１記載の方法。