DE3882156T2 - Pseudomonasstamm. - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft neue Mikroorganismen, die aus der Erde isoliert wurden. In weiteren Einzelheiten betrifft die Erfindung neue Mikroorganismen, die gegenüber einem oder mehreren Kohlenwasserstoffen, Alkoholen, Äthern, Ketonen und deren Derivaten oder Mischungen tolerant sind.
- Als herkömmliche Beispiele von Mikroorganismenkulturen in einem Medium, das Kohlenwasserstoffe oder deren Derivate enthält, gibt es viele Berichte über das Wachstum von Nocardia sp. in einem Medium, das Hexan oder Hexadecan enthält [R.L. Raymond, Appl. Microbiol., vol. 15, pp. 857-865 (1967)], das Wachstum des Bakterienstamms JOB5 in einem Medium das Cyclopentan oder Cyclohexan enthält [J. Ooyama, J.W. Foster, Antonie von Leenwenlook, vol. 31, Seiten 45-65 (1965)], das Wachstum von Pseudomonas sp., Achromobacter sp., und Nocardia sp. in einem Medium, das Benzol, Äthylbenzol, Toluol oder Xylol enthält [D. Cleus und N. Walkes, J. Gen. Microbial, vol. 36, Seiten 107-122 (1964)], usw.. In jedem der obigen Fälle werden diese Mikroorganismen jedoch so gezüchtet, dass sie mit Kohlenwasserstoffen in niedrigen Konzentrationen oder in Form von Dampf in Kontakt kommen, da die Kohlenwasserstoffe im allgemeinen für Mikroorganismen toxisch sind. Das heisst wenn die Fermentation ausgeführt wird, indem diese Kohlenwasserstoffe als Substrate verwendet werden, wird sie ausgeführt, indem diese Verbindungen in Form von Dampf zugeführt werden, so dass diese Verbindungen nicht mit den Mikroorganismen direkt in Berührung gebracht werden können, oder indem die Verbindungen bei niedrigen Konzentrationen gehalten werden (0,2% oder weniger), bei welchen sich keine toxische Wirkung zeigt. Demzufolge gibt es bei der Fermentation, bei der Kohlenwasserstoffe als Substrate verwendet werden, nicht nur Probleme mit der niedrigen Produktivität sondern auch Probleme mit dem Verfahren, da es schwierig ist, das Substrat auf die niedrigen Konzentrationen einzustellen. Zudem gibt es im Falle der Verwendung von kaum wasserlöslichen Substanzen den Nachteil, dass sich die Produktivität der mikrobiellen Reaktion wegen der niedrigen Löslichkeit der Substanzen verschlechtert.
- Um die vorhergehenden Probleme zu lösen, haben die vorliegenden Erfinder ausführlich Erdmaterial untersucht, um einen Mikroorganismus zu finden, welcher in einem Medium, das ein Lösungsmittel wie z.B. Kohlenwasserstoff und ähnliches in hohen Konzentrationen enthält, wachsen kann, das heisst ein Mikroorganismus der Lösungsmitteln wie z.B. Kohlenwasserstoff oder ähnlichem gegenüber tolerant ist. Als Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder Mikroorganismen mit der obenerwähnten Toleranz gefunden und die vorliegende Erfindung vollendet.
- Zusätzlich zum schon anerkannten Stand der Technik wurden verschieden Pseudomonas sp. Stämme beschrieben, die organischen Verbindungen, einschliesslich Kohlenwasserstoffen gegenüber tolerant sind, z.B.:
- EP-A-076953 beschreibt Pseudomonasstämme mit einem übertragbaren Plasmid, das fähig ist, halogenierte aromatische Verbindungen in Dampfform abzubauen.
- US-A-4349633 beschreibt Mikroorganismen einschliesslich eine Pseudomonasart, z.B. Ps. putida die Ölablagerungen z.B. in Sand abbauen können.
- US-A-4352886 beschreibt einen Ps. putida-Stamm der Phenole abbauen kann.
- EP-A-0211546 beschreibt verschiedene Mikroorganismen z.B. Ps. putida, welche toxische, halogenierte Kohlenwasserstoffe abbauen können.
- FR-A-2187911 beschreibt verschiedene Pseudomonasarten z.B. Ps. putida mit übertragbaren Plasmiden.
- EP-A-0099020 scheint gewisse Pseudomonasstämme zu beschreiben, die in Gegenwart von ungefähr 0,1-0,2% substituierten Naphthalensulfonsäuren gezüchtet werden.
- J. Agric. Food Chem. 1982, 30, 274-277 beschreibt den Abbau von toxischem 3,4-Dichloroanilin, einem Degradationsprodukt eines Herbizids im Boden, durch Ps. putida.
- Keines der obigen beschreibt Pseudomonasstämme die gegenüber hochkonzentrierten Kohlenwasserstoffen tolerant sind, besonders gegenüber Toluol in einer Konzentration von 0,3% oder mehr.
- Die vorliegende Erfindung sieht einen Mikroorganismus vor, der dem Genus Pseudomonas angehört und einen oder mehrere aliphatische Kohlenwasserstoffe, alizyklische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Äther und Ketone toleriert, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Toluol in einer Konzentration von 0,3% oder mehr toleriert und Pseudomonas putida var. STM-603, oder ein Stamm der Pseudomonas sp. STM-801, oder Pseudomonas sp. STM-904 ist oder davon abstammt.
- Der Mikroorganismus ist vorzugsweise gegenüber Toluol tolerant und vorzugsweise auch gegenüber einem oder mehreren aus der Gruppe p-Xylol, Styrol, und Cyclohexan bei einer Konzentration von bis zu 50 vol%.
- In einer bevorzugten Form beinhalten die tolerierten Verbindungen eine oder mehrere der obigen Verbindungen oder Hexan, Heptan, Octan, Isooctan, Nonan, Decan, 1- oder 2-Hexen, 1-Octen, 1-Dodecen, 1,3-Pentadien, 1,5-Hexadien, 1,7-Octadien, Cyclopentan, Methylcyclopentan, Methylcyclohexan, Äthylbenzol, Chlorbenzol, 1-Heptanol, 1-Octanol, 1-Decanol, n-Hexyläther, n-Butylphenyläther, Diphenyläther, Dibenzyläther, Methoxytoluol, 2-Pentanon, 2-Hexanon, 2-Heptanon und Cyclohexanon in einer Konzentration von 0,3% oder mehr, vorzugsweise bis zu 50%.
- Die Erfindung schliesst ein mikrobiologisches Kulturverfahren ein, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur einen Mikroorganismus nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche in einer Gesamtkonzentration von 0,3 vol% oder mehr enthält.
- In einer bevorzugten Form beinhaltet die Kultur irgendeine der obenerwähnten tolerierten Verbindungen in einer Gesamtkonzentration von bis zu 50 vol%.
- Die Erfindung beinhaltet auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Erfindung in der industriellen Fermentation, Abwasserbehandlung oder im Protein-Engineering.
- Da Mikroorganismen, die dem Stamm der Pseudomonas putida oder Pseudomonas sp. angehören, gemäss der vorliegenden Erfindung Lösungsmittel, die Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Äther, Ketone und deren Derivate oder deren gewöhnlich verwendete Mischungen beinhalten, ausgezeichnet tolerieren, kann die Verunreinigung dieser Mikroorganismen mit Fäulniserregern verhindert werden, indem dieselben in Gegenwart der obigen Lösungsmittel gezüchtet werden. Da in diesem Falle Hitzeabtötung nicht nötig ist, können thermolabile Zusatzstoffe verwendet werden. Falls beim Züchten diese Lösungsmittel als Substrat verwendet werden, kann das Substrat in hohen Konzentrationen zugeführt werden. Es können so Produktivitätssteigerungen erwartet werden. Zusätzlich, falls die Substratkonzentration wie oben beschrieben hoch ist, wird die Kontrolle über die Zugabe des Substrats einfacher. Auch falls toxische Substanzen, die in diesen Lösungsmitteln gelöst sind, für die Züchtung verwendet werden, wird die Konzentrationskontrolle möglich. Ähnlich auch falls kaum wasserlösliche Substanzen, die in diesen Lösungsmitteln gelöst sind, verwendet werden, können sie hochkonzentriert verwendet werden. Also in dieser Hinsicht tragen die vorliegenden Mikroorganismen zur Produktivitätssteigerung bei.
- Des weiteren sind die vorliegenden Stämme als Resistenzgenquelle verwendbar und durch die Verwendung der vorliegenden Stämme wird Zellfusion von lösungsmitteltolerierenden Mikroorganismen, die nützliche Substanzen herstellen und die Züchtung der besagten Mikroorganismen mit Gentechnologieverfahren ermöglicht. Da die vorliegenden Stämme solch ausgezeichnete Eigenschaften haben, wie oben aufgeführt, können sie weitverbreitet verwendet werden, im Bioreaktorgebiet, in der Abwasserbehandlung, im Protein-Engineering, usw.
- Als spezifische Beispiele der vorliegenden Mikroorganismen können Pseudomonas putida STM-603, Pseudomonas sp. STM-801 und Pseudomonas sp. STM-904 aufgezählt werden. Diese Stämme können in einem Medium wachsen, das aliphatische Kohlenwasserstoffe, alizyklische Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Äther, Ketone, aromatische Kohlenwasserstoffe, welche besonders toxisch sind und deren Derivate in einer Konzentration von bis zu 0,3% oder mehr enthält. Zusätzlich können diese Stämme sogar in einem Medium wachsen, das die obigen Verbindungen in einer Konzentration von bis zu 50% oder mehr enthält. Beim Züchten dieser Mikoorganismen kann somit ein Substrat in grossen Mengen zugeführt werden, wobei die Produktivitätssteigerung und die Kontrolle der Substratkonzentration einfacher werden und die Verhinderung der Fäulniserregerkontamination ermöglicht wird. Des weiteren wird die Produktivitätssteigerung bei der mikrobiellen Reaktion und die Kontrolle über die Konzentration der toxischen Substanzen dadurch ermöglicht, dass kaum wasserlösliche Substanzen in den verschiedenen Kohlenwasserstoffen gelöst werden. Zudem ermöglichen diese Mikroorganismen mittels Anwendung von Zellfusion und Genrekombinationstechnologie das Züchten von lösungsmitteltolerierenden Mikroorganismen, die nützliche Substanzen herstellen und auch als Versorgungsquelle von Resistenzgenen verwendbar sind.
- Diese Stämme, d.h. STM-603, STM-801 und STM-904 wurden erhalten, indem Erde, die von den vorliegenden Erfindern im ganzen Land gesammelt wurde, in einem Medium, das 0,1% Glukose, 0,25% Hefeextrakt, 0,5% Pepton und 50% Lösungsmittel (aliphatische Kohlenwasserstoffe, alizyklische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Äther und Ketone) enthält, zur Kultur angelegt wurde und dann die gebildeten Kolonien isoliert wurden.
- Als spezifische Lösungsmittelbeispiele können Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Isooctan, Nonan, Decan, 1- oder 2-Hexen, 1-Octen, 1-Dodecen, 1,3-Pentadien, 1,5-Hexadien, 1,7-Octadien, usw. als aliphatische Kohlenwasserstoffe; Cyclopentan, Cyclohexan, Methylcyclopentan, Methylcyclohexan, usw. als alizyklische Kohlenwasserstoffe; Toluol, Xylol, Styrol, Äthylbenzol, Chlorbenzol, usw. als aromatische Kohlenwasserstoffe; 1-Heptanol, 1-Octanol, 1-Decanol, usw. als Alkohole; n-Hexyläther, n-Butylphenyläther, Diphenyläther, Dibenzyläther, Methoxytoluol, usw. als Äther; und 2-Pentanon, 2-Hexanon, 2-Heptanon, Cyclohexanon, usw. als Ketone aufgezählt werden.
- Hiernach werden die bakteriologischen Eigenschaften der vorliegenden Stämme, d.h. STM-603, STM-801 und STM-904 sowie die Identifikationsergebnisse derjenigen angegeben.
- a. Form und Grösse der Zelle:
- Stäbchen, 0.7 1.0/2 4u
- b. Polymorphismus der Zelle: -
- c. Beweglichkeit: +
- d. Sporulation: -
- e. Gram-Färbung: negativ
- a. Bouillon-Agarplattenkultur:
- Kreisförmige Kolonien, 0,5 bis 1mm, mit glänzend fleischfarbiger Oberfläche.
- b. Bouillon-Schrägagarkultur:
- Auf der Oberfläche des Mediums gewachsen.
- c. Bouillon-Flüssigkultur
- gewachsen
- d. Bouillon-Gelatinestechkultur
- Es findet keine Gelatineverflüssigung statt.
- a. Nitratreduktion: negativ
- b. Stärkehydrolyse: negativ
- c. Poly-β-hydroxybutyrathydrolyse: negativ
- d. Tween 80-Hydrolyse: negativ
- e. Argininhydrolyse: positiv
- f. Pigmentbildung (King B medium):
- gelblichgrünes, wasserlösliches Fluorochrom wird gebildet.
- g. Oxydase: positiv
- h. Katalase: positiv
- i. Wachstumsbereich:
- pH: 5.0 9.5
- Temperatur: Kein Wachstum bei 41ºC.
- j. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
- k. O-F-Test: oxidativ
- l. Citratverwendung: positiv
- m. Lävanherstellung aus Sucrose: negativ
- n. DNase-Produktion: negativ
- o. Acylamidaseproduktion: negativ
- p. Assimilation:
- D-Glukose +
- D-Fruktose +
- D-Xylose +
- D-Maltose -
- Sucrose -
- Lactose -
- D-Trehalose -
- Mannitol -
- 2-Ketogluconsäure +
- L-Valin +
- β-Alanin +
- DL-Arginin +
- Acetamid -
- Mesoinosit -
- Benzylamin +
- Geraniol -
- Auf der Grundlage der obigen bakteriologischen Eigenschaften wurde die Auslese gemäss "Bergey's Manual of Determinativ Bacteriology" (8th ed., 1975) ausgeführt. Das Ergebnis war, dass diese Eigenschaften mit denen der Pseudomonas putida vereinbar waren. Pseudomonas putida toleriert hingegen keine Kohlenwasserstoffe. Die Toleranz eines Standardstamms der Pseudomonas putida und des vorliegenden Stamms STM-603 gegenüber verschiedenen Lösungsmitteln wurde untersucht. Die Ergebnisse werden in Tafel 1 gegeben. TAFEL 1 Lösungsmittel Pseudomonas putida IFO 3738 Toluol p-Xylol Styrol
- Aus den Tatsachen, dass der Stamm STM-603 und Pseudomonas putida gemeinsame morphologische, physiologische und bakteriologische Eigenschaften haben, sich aber in ihrem Verhalten gegenüber Lösungsmitteltoleranz wie oben beschrieben unterscheiden, wurde der vorliegende Stamm als ein neuer Stamm der Pseudomonas putida erkannt und als Pseudomonas putida var. STM-603 bezeichnet. Der vorliegende Stamm wurde beim "Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology" unter der Eintrittsnummer FERM BP-1751 (Bikoken-kinki Nr. 9228) hinterlegt.
- a. Form und Grösse der Zelle:
- Stäbchen, 0.7 1.0 x 2 15µ
- b. Polymorphismus der Zelle: -
- c. Beweglichkeit: + oder -
- d. Sporulation: -
- e. Gram-Färbung: negativ
- a. Bouillon-Agarplattenkultur:
- Kreisförmige Kolonien, 0,5 bis 1mm, mit glänzend fleischfarbiger Oberfläche.
- b. Bouillon-Schrägagarkultur:
- Auf der Oberfläche des Mediums gewachsen.
- c. Bouillon-Flüssigkultur
- gewachsen
- d. Bouillon-Gelatinestechkultur
- Es findet keine Gelatineverflüssigung statt.
- a. Nitratreduktion: negativ
- b. Stärkehydrolyse: negativ
- c. Poly-β-hydroxybutyrathydrolyse: negativ
- d. Tween 80-Hydrolyse: negativ
- e. Argininhydrolyse: positiv
- f. Pigmentbildung (King B medium):
- gelblichgrünes, wasserlösliches Fluorochrom wird gebildet.
- g. Oxydase: positiv
- h. Katalase: positiv
- i. Wachstumsbereich:
- pH: 5.0 9.0
- Temperatur: Kein Wachstum bei 41ºC.
- j. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
- k. O-F-Test: oxidativ
- l. Citratverwendung: positiv
- m. Lävanherstellung aus Sucrose: negativ
- n. DNase-Produktion: negativ
- o. Acylamidaseproduktion: negativ
- p. Assimilation:
- D-Glukose +
- D-Fruktose +
- D-Xylose +
- D-Maltose -
- Sucrose -
- Lactose -
- D-Trehalose -
- Mannitol -
- 2 -Ketogluconsäure +
- L-Valin +
- β-Alanin +
- DL-Arginin +
- Acetamid -
- Mesoinosit -
- Benzylamin +
- Geraniol -
- a. Form und Grösse der Zelle:
- Stäbchen, 0.7 1.0 x 3 15µ
- b. Polymorphismus der Zelle: -
- c. Beweglichkeit: + oder -
- d. Sporulation: -
- e. Gram-Färbung: negativ
- a. Fleischsaftagarplattenkultur:
- Kreisförmige Kolonien 0.5 bis 1mm mit glänzend fleischfarbiger Oberfläche.
- b. Fleischsaftschrägagarkultur:
- Auf der Oberfläche des Mediums gewachsen.
- c. Fleischsaftflüssigkultur:
- Gewachsen
- d. Fleischsaftgelatinestechkultur:
- Es findet keine Gelatineverflüssigung statt.
- a. Nitratreduktion: negativ
- b. Stärkehydrolyse: negativ
- c. Poly-β-hydroxybutyrathydrolyse: negativ
- d. Tween 80-Hydrolyse: negativ
- e. Argininhydrolyse: positiv
- f. Pigmentbildung (King B medium):
- Nicht gebildet
- g. Oxydase: positiv
- h. Katalase: positiv
- i. Wachstumsbereich:
- pH: 5.0 9.0
- Temperatur: Kein Wachstum bei 41ºC.
- j. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
- k. O-F-Test: oxidativ
- l. Citratverwendung: positiv
- m. Lävanherstellung aus Sucrose: negativ
- n. DNase-Produktion: negativ
- o. Acylamidaseproduktion: negativ
- p. Assimilation:
- D-Glukose +
- D-Fruktose +
- D-Xylose +
- D-Maltose -
- Sucrose -
- Lactose -
- D-Trehalose -
- Mannitol -
- 2-Ketogluconsäure +
- L-Valin +
- β-Alanin +
- DL-Arginin +
- Acetamid -
- Mesoinosit -
- Benzylamin +
- Geraniol -
- Auf der Grundlage der bakteriologischen Eigenschaften, wie sie oben, (2) und (3), angegeben werden, wurde die Auslese gemäss "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (8th ed., 1975) ausgeführt. Als Ergebnis fand man, dass diese Stämme STM-801 und STM-904 ähnlich wie der bekannte Stamm Pseudomonas putida waren. Deshalb haben die vorliegenden Erfinder einen weiteren ausführlichen Vergleich zwischen den bakteriologischen Eigenschaften der vorliegenden Stämme STM-801 und STM-904 und einem Standardstamm der Pseudomonas putida IFO 3738 ausgeführt und die folgenden Ergebnisse erhalten (siehe auch Tafel 2):
- (1) Die Zellgrösse der Pseudomonas putida ist 0,7 bis 1,0u mal 2 bis 4u, während die des STM-801 und STM-904 je 0,7 bis 1,0u mal 2 bis 15u und 0,7 bis 1,0u mal 3 bis 15u sind. Das heisst, die Grösse der vorliegenden Stämme ist 3 bis 4 mal die der Pseudomonas putida.
- (2) Im Falle von Pseudomonas putida waren alle Zellen beweglich. Bei STM-801 und STM-904 waren einige beweglich, die anderen aber nicht.
- (3) Im Falle von Pseudomonas putida bildet sich grünlich gelbes, wasserlösliches Fluorochrom. Bei STM-801 und STM-904 bildet der erstere das gleiche Pigment wie oben, nicht aber der letztere.
- (4) Pseudomonas putida zeigt überhaupt keine Toleranz gegenüber Toluol, p-Xylol und Styrol wohingegen STM-801 und STM-904 Toleranz zeigen.
- Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Stämme STM-801 und STM-904 neuen Spezies entsprechen, da sie offensichtlich anders als Pseudomonas putida sind und da es keine bekannte Spezies gibt, die diesen Stämmen entsprechen. Deshalb haben die vorliegenden Erfinder die Stämme STM-801 und STM-904 als Pseudomonas sp. STM-801 und Pseudomonas sp. STM 904 bezeichnet. TAFEL 2 Pseudomonas putida IFO 3738 (1) Zellgrösse (2) Beweglichkeit (3) Pigmentbildung (4) Lösungsmitteltoleranz: Toluol P-xylol Styrol gelblichgrünes wasserlösliches Fluorochrom + oder - nicht gebildet
- Die besagten Pseudomonas sp. STM-801 und Pseudomonas sp. STM-904 wurden beim "Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology" unter den Eintrittsnummern FERM BP-1741 (Bikoken-kinki Nr. 9226) und FERM BP-1750 (Bikoken-kinki Nr. 9227) hinterlegt.
- Als Kulturmedium für diese Stämme wird ein gewöhnliches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein anorganisches Ion, usw. enthält, verwendet.
- Als Kohlenstoffquelle kann alles was assimiliert werden kann, verwendet werden, zum Beispiel Zucker, wie z.B. Glukose, Fruktose, Xylose, Stärkehydrolysat, usw., Kohlenwasserstoffe wie z.B. Toluol, p-Xylol, usw., Alkohole wie z.B. Methanol, Äthanol, usw., usw.. Als Stickstoffquelle werden Hefeextrakt, Trockenhefe, Pepton, Fleischextrakt, Maisbeizflüssigkeit, Casaminosäuren, Ammoniumchlorid, Urea, Natriumnitrat, usw. verwendet. Als anorganisches Ion werden Phosphorsäureion, Magnesiumion, Eisenion, Calciumion, Kaliumion, Kupferion, Manganion, usw. verwendet.
- Die Kultur wird bei pH 5 bis 9 bei 20 bis 40ºC aerob wachsen gelassen.
- Pseudomonas putida var. STM-603, Pseudomonas sp. STM-801, Pseudomonas sp. STM-904 und verschiedene bekannte Stämme wurden in die für die Stämme vorgeschriebenen Medien eingeimpft (pH7,0). Dann wurden je 5ml der verschiedenen in Tafel 3 angegebenen Lösungsmittel zu den 5ml Portionen der besagten Medien gegeben. Nach dem Wachsenlassen der resultierenden Medien bei 37ºC während 48 Stunden, wurde das Wachstum aller Stämme verglichen. Die Ergebnisse werden in Tafel 3 gegeben. TAFEL 3 Vergleich der Lösungsmitteltoleranz der verschiedenen Stämme Cyclohexan Toluol p-Xylol Styrol Pseudomonas putida var. STM-603 Pseudomonas sp. Pseudomonas aruginosa IFO-3924 Pseudomonas fluorescens IFO-3507 Pseudomonas putida IFO-3738 Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC-12815 Arthrobacter globiformu IFO-3062 Agrobacterium tumefaciens IFO-3058 Escherichia coli IFO-3806 Bacillus cereus IFO-3131 Bacillus coagulans IFO-3557 -: nicht gewachsen + gewachsen (0.D&sub6;&sub6;&sub0;> 0.50) Bouillon-Flüssigmedium: Pseudomonas, Arthrobacter, Agrobacterium und Bacillus LB Medium: Escherichia
- Ein Medium, das durch Zugabe von 1,01 destilliertem Wasser zu 1,0g Glukose, 2,5g Hefeextrakt und 5,0g Pepton zubereitet wurde und auf pH 7,2 eingestellt wurde, wurde in 100ml Portionen in geriffelte 500ml-Erlenmeyerkolben gegeben, in welche Pseudomonas putida var. STM-603 eingeimpft wurde, ohne dass der besagte Kolben sterilisiert wurde. Nachdem je 30ml Toluol in die Kolben gegeben wurde, wurden die Kulturen bei 37ºC 48 Std. wachsen gelassen. Das Ergebnis war 1,2mg/ml Pseudomonas putida var. STM-603 Zellmasse, wobei keine Kontamination mit und kein Wachstum von anderen Mikroorganismen beobachtet wurde.
- Es wurde das gleiche Medium wie in Beispiel 1 zubereitet, in 5ml Portionen in grosse Versuchsröhrchen gegeben und bei 121ºC während 15 min. dampfsterilisiert. Dann wurden die Pseudomonas putida var. STM-603 in die grossen Versuchsröhrchen eingeimpft und dazu wurden je 5ml der verschiedenen Lösungsmittel wie in Tafel 4 angegeben hinzugefügt. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer Schüttelvorrichtung wachsen gelassen. Der Wachstumszustand nach 48 Stunden wird in Tafel 4 angegeben. Das Wachstum wird durch Messung der Trübung überwacht (Wellenlänge: 660nm, ein Kolorimeter "Spectronic 21" hergestellt von Bausch & Lomb Corp.). TAFEL 4 Toleranz des Pseudomonas putida var. STM-603 gegenüber verschiedenen Lösungsmitteln Lösungsmittel Wachstumszustand Aliphatische Kohlenwasserstoffe: n-Pentan n-Hexan n-Heptan n-Octan Isooctan n-Nonan n-Decan 1- oder 2-Hexen 1-Octen 1-Dodecen 1,3-Pentadien 1,5-Hexadien 1,7-Octadien Alizyklische Kohlenwasserstoffe: Cyclopentan Methylcyclopentan Cyclohexan Methylcyclohexan Butylcyclohexan Cyclooctan Aromatische Kohlenwasserstoffe: Toluol p-Xylol o-, m-p-Xylol Chlorbenzol o-Dichlorbenzol 1,2,4-Trichlorbenzol Brombenzol Äthylbenzol Propylbenzol Styrol Alkohole: 1-Heptanol 1-Octanol 1-Decanol Äther: n-Hexyläther n-Butylphenyläther Diphenyläther Dibenzyläther Methoxytoluol ±: gewachsen (0< 0.D&sub6;&sub6;&sub0;< 0.50) +: gewachsen (0.D&sub6;&sub6;&sub0;> 0.50)
- Das gleiche Medium wie das von Beispiel 1 wurde zubereitet, in 5ml Portionen in grosse Versuchsröhrchen gegeben und bei 121ºC während 15 min. dampfsterilisiert. Dann wurden Pseudomonas putida var. STM-603 in die Versuchsröhrchen eingeimpft, zu denen je 0,25ml der verschiedenen in Tafel 5 angegebenen Lösungsmittel gegeben wurde. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer Schüttelvorrichtung wachsen gelassen. Das Wachstum wurde durch Messung der Trübung überwacht (Wellenlänge: 660nm, ein Kolorimeter "Spectronic 21" hergestellt von Bausch & Lomb Corp.) TAFEL 5 Lösungsmittel Stamm Ketone: 2-Pentanon 2-Hexanon 2-Heptanon Cyclohexan -: nicht gewachsen ±: gewachsen (0< O.D&sub6;&sub6;&sub0;< 0.50) +: gewachsen (O.D&sub6;&sub6;&sub0;> 0.50)
- Ein Medium, das durch Zugabe von 1,01 destilliertem Wasser zu 1,0g Glukose, 2,5g Hefeextrakt und 5,0g Pepton zubereitet wurde, wurde auf pH 7,2 eingestellt und in 100ml Portionen in 500ml-Riffelkolben gegeben, in welche Pseudomonas sp. STM-801 eingeimpft wurde, ohne dass die Kolben sterilisiert wurden. Nachdem je 30ml Toluol zu den Kolben zugegeben wurden, wurde die Kultur bei 37ºC während 48 Std. wachsen gelassen. Daraus resultierte eine Zellmasse von 1,1mg/ml Pseudomonas sp. STM-801, wobei keine Kontamination mit und kein Wachstum von anderen Mikroorganismen beobachtet wurde.
- Es wurde das gleiche Medium wie in Beispiel 1 zubereitet, in 5ml Portionen in grosse Versuchsröhrchen gegeben und bei 121ºC während 15 Minuten damfpsterilisiert. Dann wurden Pseudomonas sp. STM-801 und Pseudomonas sp. STM-904 in die grossen Versuchsröhrchen eingeimpft, zu welchen je 5ml der verschiedenen in Tafel 6 angegeben Lösungsmittel hinzugefügt wurden. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer Schüttelvorrichtung wachsen gelassen. Der Wachstumszustand nach 48 Stunden wird in Tafel 6 angegeben. Das Wachstum wurde durch Messung der Trübung überwacht (Wellenlänge: 660nm, ein Kolorimeter "Spectronic 21" hergestellt von Bausch & Lomb Corp.). TAFEL 6 Toleranz der Pseudomonas sp. STM-801 und Pseudomonas sp. STM-904 gegenüber verschiedenen Lösungsmitteln Wachstumszustand Lösungsmittel Aliphatische Kohlenwasserstoffe: n-Pentan n-Hexan n-Heptan n-Octan Isooctan n-Nonan n-Decan 1- oder 2-Hexen 1-Octen 1-Dodecen 1,3-Pentadien 1,5-Hexadien 1,7-Octadien Alizyklische Kohlenwasserstoffe: Cyclopentan Methylcyclopentan Cyclohexan Methylcyclohexan Butylcyclohexan Cyclooctan Aromatische Kohlenwasserstoffe: Toluol p-Xylol o-, m-p-Xylol Chlorbenzol o-Dichlorbenzol 1,2,4-Trichlorbenzol Brombenzol Äthylbenzol Propylbenzol Styrol Alkohol: 1-Heptanol 1-Octanol 1-Decanol Äther: n-Hexyläther n-Butylphenyläther Diphenyläther Dibenzyläther Methoxytoluol ±: gewachsen (0< 0.D&sub6;&sub6;&sub0;< 0.50) +: gewachsen (0.D&sub6;&sub6;&sub0;> 0.50)
- Es wurde das gleiche Medium wie in Beispiel 6 zubereitet, in 5ml Portionen in die grossen Versuchsröhrchen gegeben und bei 121ºC während 15 Minuten dampfsterilisiert. Dann wurden Pseudomonas sp. STM-801 und Pseudomonas sp. STM-904 in die Versuchsröhrchen eingeimpft und zu jedem wurden je 0,25ml der verschiedenen in Tafel 7 angegebenen Lösungsmittel hinzugefügt. Die Kultur wurde bei 37ºC in einer Schüttelvorrichtung wachsen gelassen. Der Wachstumszustand nach 48 Stunden wird in Tafel 7 angegeben. Das Wachstum wurde durch Messen der Trübung überwacht (Wellenlänge: 660nm, ein Kolorimeter "Spectronic 21" hergestellt von Bausch & Lomb Corp.) TAFEL 7 Wachstumszustand Lösungsmittel Ketone: 2-Pentanon 2-Hexanon 2-Heptanon Cyclohexan -: nicht gewachsen ±: gewachsen (0< 0.D&sub6;&sub6;&sub0;< 0.50) +: gewachsen (0.D&sub6;&sub6;&sub0;> 0.50)
Claims (9)
1. Mikroorganismus der zum Genus Pseudomonas gehört und eine
oder mehrere aliphatische Kohlenwasserstoffe, alizyklische
Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, Alkohole,
Äther und Ketone toleriert, dadurch gekennzeichnet, dass der
Mikroorganismus Toluol in einer Konzentration von 0,3% oder mehr
toleriert und Pseudomonas putida var. STM-603 oder ein Stamm der
Pseudomonas sp. STM-801, oder Pseudomonas sp. STM-904 ist oder
davon abstammt.
2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, welcher Toluol bei einer
Konzentration von 50 vol% toleriert.
3. Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welcher
p-Xylol bei einer Konzentration von 50 vol% toleriert.
4. Mikroorganismus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3,
welcher Styrol bei einer Konzentration von 50 vol% toleriert.
5. Mikroorganismus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4,
welcher Cyclohexan bei einer Konzentration von 50 vol%
toleriert.
6. Mikroorganismus nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche,
welcher Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Isooctan, Nonan, Decan, 1-
oder 2-Hexan, 1-Octen, 1-Dodecen, 1,3-Pentadien, 1,5-Hexadien,
1,7-Octadien, Cyclopentan, Methylcyclopentan, Methylcyclohexan,
Äthylbenzol, Chlorobenzol, 1-Heptanol, 1-Octanol, 1-Decanol,
n-Hexyläther, n-Butylphenyläther, Diphenyläther, Dibenzyläther,
Methoxytoluol, 2-Pentanon, 2-Hexanon, 2-Heptanon und
Cyclohexanon bei einer Gesamtkonzentration von 0,3% oder mehr,
vorzugsweise bis zu 50% toleriert.
7. Ein mikrobiologisches Kulturverfahren, dadurch
gekennzeichnet, dass die Kultur einen Mikroorganismus nach
irgendeinem der vorangehenden Ansprüche in einer
Gesamtkonzentration von 0,3% oder mehr enthält.
8. Ein Verfahren nach Anspruch 7, worin die Kultur irgendeine
der besagten tolerierten Verbindungen, wie in Anspruch 1 oder 6
beansprucht, in einer Gesamtkonzentration von bis zu 50 vol%
enthält.
9. Verwendung eines Mikroorganismus nach irgendeinem der
Ansprüche 1 bis 6 in der industriellen Fermentation,
Abwasserbehandlung oder im Protein-Engineering.
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