DE2755171C3 - Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen

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DE2755171C3
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen weisen ein verbessertes Verhalten bezüglich der Herstellung von Methanol (Geschwindigkeit Ausbeute an Biomasse/Methanol, Affinität für Methanol) auf.
Bei Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch einzellige Organismen besitzt der Mikroorganismusstamm eine beträchtliche Bedeutung. Für die Verwendung eines gegebenen kohlenstoffhaltigen Substrats ist einerseits der biologische Wert des Produktes (nicht vorhandene Toxizität, Nährwert) und andererseits die ökonomischen Bedingungen der industriellen Produktion von Proteinen in kontinuierlicher Weise von dem Stamm abhängig. Dies sind insbesondere die kinetischen Leistungen des Stammes, die die Form der industriellen Einrichtung und damit der notwendigen Investitionen bestimmen. Ein Verfahren zur Herstellung von bakteriellem Protein aus Methanol mittels methylotropher Stämme ist beispielsweise in der DE-OS 20 59 277 beschrieben.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren ermöglicht es, verbesserte Stämme von methylotrophen Mikroorganismen zu verwenden, die das Methanol metabolisch über den Weg des Serins verwenden und auf eine große Anzahl von Mikroorganismen angewendet werden. Unter diesen werden beispielsweise folgende genannt:
Bacillus, Micrococcus, Arthrobacier,
Flavobacterium, Pseudomonas, Aeromonas,
Methylomonas, Rhodopseudomonas,
Methylococcus, Klcbsiella, Rhodospirillum,
Rhodomicrobium, Hyphomicrobium,
Acinetobacter, Achromobacter, Moraxella.
Die fakultativen methylotrophen Mikroorganismen, die das Methanol über den Weg des Serins verwenden, sind sehr verbreitet Diejenigen, die durch bekannte Methoden isoliert worden sind (aufeinanderfolgendes Aufnehmen aus einem Milieu mit Methanol als einziger kohlenstoffhaltiger Quelle), besitzen oft mittelständige kinetische Leistungen.
Einige sind in der Literatur beschrieben, und zwar insbesondere in folgenden Texten:
W. Harder, MM. Atwood, J. R. Quayle J. Gen.
ίο MicrobioL (1973) 78 155-163,
Asthana und Coil. Biotechnol. Bioeng.
(1971) 13,923 und (1971) 8,923,
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(1975) 1295-305.
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(1970)61205,
Hirsh u. a. Conti Archiv. Fm Fikrobiologie
(1964)43:358,
Ogata u. a. Coll. J. Ferment TechnoL
(1970)48:470.
Die bekannten Verfahren zum Isolieren von Stämmen durch kontinuierliche Selektion ermöglichen es, leistungsfähige Stämme zu isolieren, jedoch sind die Versuche langwierig (wenigstens 1 Monat an Experimentierarbeit im kontinuierlichen Fermentierer), schwierig und die Ergebnisse ungewiß. Andererseits verwirklicht man auf diese Weise nur eine Anreicherung und es ist unerläßlich, aus der erhaltenen komplexen
jo Flora den leistungsfähigsten Mikroorganismus zu isolieren.
Es wurde gefunden, daß die Widerstandsfähigkeit gegenüber Glycin bei den Stämmen, die Methanol über den Weg des Serins metabolisieren, gewöhnlich eine
j5 vermehrte Verwendung von Methanol mit sich bringt (Vergrößerung von μΐη, Abnahme des Ks für Methanol).
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem fakultativ methylotrophen Ausgangswildstamm eine Methanol Ober den Weg des Serins verwendende und gegenüber dem Ausgangsstamm hinsichtlich der Steigerung der Affinität für Methanol und hinsichtlich der Verringerung der Protein-Erzeugungszeit auf dem methanolhaltigen Substrat verbesserte, methylotrophe Mutante gewinnt,
wobei die Mutante unempfindlich bleibt gegenüber der Wirkung von Glycin bei Konzentrationen dieser Aminoessigsäure, die wenigstens zehnmal höher sind als diejenigen, die das Verhindern der Verwendung des Methanolsubstrats (Steigerung von Ks) bei dem wilden Stamm beginnen lassen,
oder wobei die Mutante in einem Milieu mit Methanolsubstrat und 0,5 bis 2% Glycin wachsen kann, während der entsprechende Ausgangswildstamm in Anwesenheit dieser Glycinkonzentrationen nicht wachsen kann,
und daß man diese Mutante aerob züchtet.
Die Verbesserung besteht demnach einerseits in einer Steigerung der Affinität für Methanol (Abnahme des Ks) und andererseits in einer Verringerung der Erzeugungszeit auf dem methanolhaltigen Substrat.
Das dem erfindiingsgemäOen Verfahren zugrundeliegende Prinzip besteht somit im Auswählen von gegenüber Glycin resistenten Mutationen aus fakultativen meihylutruphcn Stämmen. Die Kultur kann in folgender Weise vorgenommen werden:
Zunächst werden die Zellen der Wildstämme vorzugsweise in exponentiell Wachstumsphase aufgenommen und dann auf dem Selektionssieb (festes Milieu für methylotrophe Mikroorganismen +0,5 bis 2% Glycin) entweder direkt oder nach vorhenger Einwirkung eines physikalischen oder chemischen Mutationsmittels ausgebreitet
Alle auf diese Weise ausgewählten und gegenüber Glycin in einer Konzentration von 0,5 bis 2% widerstandsfähigen Stämme werden sodann aerob auf einem Methanol enthaltenden Substrat gezüchtet.
Die verbesserten Stämme werden in ein Kulturmilieu eingesetzt, das Mineralsalze, Stickstoff in anorganischer Form und Methanol in veränderlicher Konzentration von 0,1 bis 2% (Gewicht/Volumen) enthält Das Methanol, das durch Filtrieren sterilisiert wird, wird dem im Autoklav bei 1200C während 30 min behandelten Milieu zugesetzt Der pH-Wert wird zwischen 6 und 8 eingestellt
Die Kultivierung wird in sterilen Bechergläsern unter Rühren derart vorgenommen, daß die Belüftung nicht beschränkt wird, und bei Temperaturen, die zwischen 25 und 45° C variieren können.
Die Gewinnung der Zellen geschieht durch Zentrifugieren. Das Maß des spezifischen Wachstumsgrades wird festgestellt indem die Vergrößerung des Trockengewichtes der Zellen pro Volumeneintieit als Funktion der Zeit gemessen wird. Die Konzentration von Methanol in dem Kulturmilieu wird durch Gaschromatographie gemessen. jo
Die erhaltenen Stämme können nicht nur für die Synthese von Proteinen aus Methanol, sondern auch zur biologischen Entfernung von Meth-_jiol aus einem Abwasser, zur eventuellen Verminderung von Methanol in fermentierten Getränken und alltvnein für die gesamte Fermentierung unter Verwendung von Methanol gleichzeitig mit einem kohlenstoffhaltigen Substrat verwendet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Beispielen erläutert
Beispiel 1
Ein als zu der Art Pseudomonas stuzeri gehörend identifizierter Ausgangswildstamm wird auf folgendem Milieu kultiviert:
daß 108 bis 109 Zellen pro ml untergeht acht werden, bevor sie auf dem Milieu M\ mit 2,5% Agar versehen und mit 2% Glycin vervollständigt ausgebreitet werden.
Die Petrischalen werden in einen Wärmeschrank bei 300C angeordnet Das Auftreten von resistenten Mutanten ergibt sich am Ende von wenigen Tagen. Die Kolonien werden abgenommen und in flüssigem Milieu Μ eingeimpft,, um bezüglich ihrer methylotrophen Eigenschaften getestet zu werden.
Man erhält mehrere gegenüber Glycin resistente Mutanten. Das Studium der kinetischen Leistungen eines dieser Mutanten führte zu den nachfolgenden Ergebnissen auf dem Kulturmilieu M\.
Generationszeit
Xs Methanol
100 min
20 ppm
Die wirksame Produktion von Biomasse am Ende von 3 Tagen betrug bei dieser verbesserten Kultur 0,40 g pro 1 g Methanol.
Beispiel 2
Andere Mutanten des Ausgangswildstammes von Beispiel 1, die gegenüber 2% Glycin resistent waren, wurden durch eine Behandlung vor der Zellensuspension mit 2% Äthylmethansulfonat während 2 h bei 30" C und einem pH-Wert von 7,4 isoliert Man stellt die gleichen Verbesserungen wie bei dem Mutanten von Beispiel 1 fest, das heißt eine Verminderung der Generationszeit und insgesamt eine starke Abnahme von Ks:
Wilder Stamm Mutierter Stamm Wilder Stamm
g = 5 h 45 min
Ks = 830 ppm
Kulturmilieu (Mt)
NH4Cl 3 g
Na2HPO4 3 g
KH2PO4 0,5 g ό
CaCI2 0,01 g
FeSO4 0,001 g
ZnCI2 0,001 g
MnSO4 0,001 g
MgSO4 0,5 g «
CHjOH 5 g
Wasser I I
pH-Wert auf 6,8 eingestellt.
Die Temperatur der Kultur beträgt 300C.
Die Generationszeit dieses Stammes ist dann 120 min und seine scheinbare Affinitätskonstante für Methanol ist Ks = 1090 ppm.
Die wirksame Produktion von Biomasse am Ende von
drei Tagen der Kultivierung beträgt 0,30 g für Ig b.-,
Methanol.
Die wiederaufgenommene Zellensuspension dieser n = 4 h 20 min Kultur wird in physiologischem Wasser so verdünnt, Av = 450 ppm
g = 120 min
Ks = 1090 ppm
g = 88 min
Ks = 20 ppm
Beispiel 3
Die Behandlung von Beispiel 1 wird auf einem methylotrophen Ausgangswildstamm von Pseudomonas aeruginosa angewendet Man isoliert auf einem Selektiersieb (Milieu M\ + 0,5% Glycin) die gegenüber Glycin resistenten Mutanten.
Die kinetischen Leistungen dieser neuen Stämme (auf dem Milieu M\) werden im Verhältnis zu dem wilden Stamm stark verbessert.
Mutierter Stamm
g
Ks
3 h JO min 100 ppm
Beispiel 4
Die Behandlung von Beispiel 1 wird auf einen methylotrophen Stamm von Mici'ococcus Varians angewendet, wobei Stämme isoliert werden, die bezüglich Methanol verbesserte Leistungen in bezug auf den wilden Stamm aufweisen.
Wilder Stamm Mutierter Stamm
K = 3 h 30 min Av 150 ppm

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Proteinen aus Methanol unter Verwendung methylotropher Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem fakultativ methylotrophen Ausgangswildstamm eine Methanol über den Weg des Serins verwendende und gegenüber dem Ausgangsstamm hinsichtlich der Steigerung der Affinität für Methanol und hinsichtlich der Verringerung der Protein-Erzeugungszeit auf dem methanolhaltigen Substrat verbesserte, methyluthrope Mutante gewinnt,
wobei die Mutante unempfindlich bleibt gegenüber der Wirkung von Glycin bei Konzentrationen dieser Aminoessigsäure, die wenigstens zehnmal höher sind als diejenigen, die das Verhindern der Verwendung des Methanolsubsirats (Steigerung von Ks) bei dem wilden Stamm beginnen lassen,
oder wobei die mulante in einem Milieu mit Methanolsubstrat und 0,5 bis bis 2% Glycin wachsen kann, während der entsprechende Ausgangswildstamm in Anwesenheit dieser Glycinkonzentrationen nicht wachsen kann,
und daß man diese Mutante aerob züchtet.
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