DE1518382A1

DE1518382A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Alanin

Info

Publication number: DE1518382A1
Application number: DE1965T0029829
Authority: DE
Inventors: Chibata Ichiro; Toshito Kakimoto; Joji Kato
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1964-11-24
Filing date: 1965-11-23
Publication date: 1972-03-02
Also published as: DE1518382B2; US3458400A; GB1059668A; CH449043A; DE1793806B1; FR1476603A

Description

DR. MÜLLER-BORE DlPL.-lNG. GRALFS DR. MANITZ

PATENTANWÄLTE *0 I

Braunschweig, 22. November 1965 Unser Zeichen: Bg/Na - T

TANABE 3EIIAKIJ CO. , LIMITED

?1, Donhomachi 3-chome, Higashi-ku, Osaka / Japan

Verfahren zur Herstellung von L-Alanin

Priorität: Japon Nr. 66318/64 vom 24. November 1964

Dip Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tj-ΛΊ ?nin durch en37/matische Decarboxylierung von L-Asparaginsäure.

L-ΛL^nin ist eine Aminosäure mit erheblicher Bedeutung nuf pharmazeutischem G-ebiet und auch in der Nahrungsmittelindustrie als Ausgangsmaterial zahlreicher chemischer Verbindungen. Bekanntlich kann diese Aminosäure mit Hilfe von Mikroorganismen erhalten werden, file L-Alnnin durch Gärung erzeugen. Zum Zwecke einer gewerbsmäßigen Gewinnung ist dieses Verfahren aber

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nicht wirtschaftlich genug.

Wie beschrieben wurde, besitzt L-Asparaginsäure-ßdecarboxylase die Fähigkeit, L-/Vspararinsäure katalytisch in der ß-Stellung zu decarboxylieren, was zur Bildung von L-Alanin führt (Biokhimi;v8 1⁷>, 315 (194-8)). Bestimmte Stämme der Art Pseudomonas und Achromobacter erzeugen diese DecarboxylfRe (Journal of Bacteriology 80, 8^0 (i960); Biochimica et Biophysica Acta 6_2, 3^5 (1963)). Die von dem ersten Stamm erzeugte Decarboxylase-Aktivitat war jedoch so gering, daß die Hochstaktivität den Wert von 60 für '-Iqq bei 35°C nicht überschritt. (°qq ill COp erzeugt/Stunde/mg Protein). Außerdem bildet der genannte Stamm der Art Pseudomonas, Pseudomonas reptilivora gleichzeitig noch ein anderes Enzj'm, durch das L-Alanin decarboxyliert wird. Endlich wer der letztere Stamm, Achromobacter d-15 wegen seines schlechten Wachstums für die industrielle Gewinnung von L-Alanin schwer zugänglich. ■

Es wurde aber gefunden, daß bei der Gärung von Pneudomonas dacunhae oder Achromobacter pestifer in Gegenwart einer organischen Säure sich eine erheblich höhere Aktivität an L-Asparaginsäure-ß-deearboxylase

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in den Zellen ansammelt. So erreicht beispielsweise die aus der Gärbrühe von Pseudomonas dacunhae gewonnene L-Asperaginsäure-ß-decarboxylase-Aktivität bei 30°C einen ^η _ηίΛ -Wert von 1824 und die von Acromobacter pestifer einen Wert von 1023· Außerdem erzeugen beide keine anderen störenden Enzvme, die eine Zersetzung oder Racemisiemnp von L-Alanin beivirken könnten.

Erfindungs^emäß wird L-Alanin in hoher Ausbeute durch G\'*runr- von Pseudomonas dacunhae oder Achromobarter pestifer in einem wässrigen Nährmedium, das eine ο r rc an i sehe Säure als wichtigste Kohlenstoffquelle sowie andere geeignete Nährstoffe enthält, und Umsetzung der erhaltenen. Gärbrühe mit L-Asparaginsäure gewonnen.

Ein zur erfindungsgemaßen Verwendung geeignetes Medium enthält etwa 0,5 bis 2 % dibasische organische Carbonsäuren wie Fumarsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure oder deren Salze als einzige oder hauptsächliche Kohlenstoffnuelle. Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, z.B. das Chlorid, Phosphat oder Suelfat zugesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden aber mit den Ammoniumsalzen der obigen organischen Säuren erzielt. Außer diesen Nährstoffen können 1 bis 3 %

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organische Stickstofflieferanten wie Maiseinweichwasser, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat oder Harnstoff und geringe Mengen Mineralsalze wie Kaliumphosphat, Magnesiumphosphat usw. zu dem Nährmedium zugesetzt werden.

Die Bildung der L-Asparaginsäure-ß-decarboxylnse erreicht das Maximum, Wenn das bakterielle Wachstum in ein Stadium zwischen dem Ende der lognrithmisehen Phase und dem Anfang der stationären Phase tritt. Eine maximale Enzymbildung kann erreicht werden, indem man die Gärung einen Tag lang unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 30°C und vorzugsweise bei JO⁰C durchführt.

Nach der Gärung wird L-Asparaginsäure zu der Gärbrühe zugesetzt und das Gemisch genügend lange bebrütet, um L-Asparaginsäure in L-Alanin umzuwandeln.

L-Asparaginsäure kann.zu der Gärbrühe, in einer Menge .von mehr als 70 Prozent zugegeben werden. Da die Löslichkeit der L-Asparaginsäure in Wasser weniger als 1 Prozent beträgt, liegt der größte Teil der L-Asparaginsäure im Anfangsstadium in suspendierter Form in der Brühe vor und löst sich beim Fortschreiten der Umsetzung

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langsam darin. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird also durch die Pufferwirkung der allmählich in Lösung gehenden L-Asparaginsäure bequem in dem für die enzymatische Umwandlung günstigsten Bereich, geholten.

Gewöhnlich kann die Decarboxylierung bei einer Bebrütung von 2 bis 4 Tagen und einer Temperatur von 30 bis 40⁰C, vorzugsweise von 37 C, im wesentlichen zu Ende geführt werden.

Bei den obigen Decarboxylierungsverfahren kann die Gärbrühe durch eine wässrige Suspension lebender Zellen, die durch Filtration aus der Brühe isoliert wurden, oder durch Trockenzellen ersetzt werden. Es kann auch ein zellfreier Extrakt verwendet werden, der nach gewöhnlichen Verfahren wie z.B. durch Extraktion nach Schallbehandlung oder durch Zerreiben der lebenden Zellen mit Quartzsand gewonnene L-Asparaginsäure-ß-

pdcsKKxacnÄ decarboxylase enthält.

Die Reaktionszeit der enzymatischen Decarboxylierung kann auf etwa ein Drittel verkürzt werden, wenn etwa •0,005 bis P- % eines oberflächenaktiven Stoffes, wie z.B. eines Fettsäureesters des Polyoxyäthylen oder Polyoxyäthylen.

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sorbitan zu dem Reaktionsgemisch, zugesetzt werden.

Das in dem Reaktionsgemisch erzeugte L-Alanin wird dann gereinigt durch. Filtrieren des Gemisches, Behandeln des Filtrats mit einem starken Kationenaustauscherharz_; wie beispielsweise einem Sulfonsäureharz, Dowex-50 oder Ambprlite IR-120, und Konzentrieren der behandelten Lösung. Es können so mehr als 43 g reines L-Alanin in kristalliner Form aus 100 ml des Reaktionsgemisches gewonnen werden. Eine so hohe Ausbeute wurde nach den früheren Verfahren niemals erzielt.

Beispiel 1

Es wurden 120 ml eines wässrigen Nährmediums hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt:

Ammoniumsalζ der Fumarsäure 0,5 %

Natriumsalz der Fumarsäure 1,0 %

Maiseinweichwasser 2,2 %

KH₂PO₄ 0,05 %

MgSO₄.7H₂O 0,01 %

Das obige Nährmedium wurde auf einen pH-Wert von 7>0 eingestellt und in einen 5OO ml - Schüttelkolben gegeben.

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Nach der Sterilisierung wurde ein Stamm von Pseudomonäs dacünhae auf das Medium geimpft und dieses 26 Stunden unter Schütteln (140 mal Schütteln pro Minute) bei 30°0 bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt und das Gemisch bei 37°C bebrütet. Innerhalb von 96 Stunden konnte eine 100%ige Umwandlung in L-Alanin erreicht werden. Fach Einstellen des pH-Wertes auf 4,0 wurde das bebrütete Gemisch zum Sieden erhitzt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit Amberlite IR-120 geschickt (Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp). Nach dem Eluieren mit wässrigem Ammoniak wurde das Eluat konzentriert und lieferte 29,2 g L-Alanin in kristalliner Form

= + 14,3° (C = 4-, in 6n HCl)

Beispiel ?

Ein Stamm von Achromobacter pestifer wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurden 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt,und das Gemisch wurde 96 Stunden bei 37⁰O bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1

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behandelt und ergab ?1,2 g L-Alanln-Kristalle. .,Λ 25 ₌ +14,3° (C = 4, in 6n HCl)

Beispiel 3

Ein Stamm von Pseudomonas dacunhae wurde auf

120 ml eines wässrigen Nährmediums (pH 7,0) geimpft, das die folgenden Bestandteile enthielt:

Ammoniumsalz der Fumarsäure ~ 0,5 % Natriumsalz der Fumarsäure 1,0 % Maiseinweichwasser 0,55 %

Pepton 1,8 %

0,05 %

MgSO^.7H₂O 0,01 %

Es wurde 26 Stunden bei 30⁰C unter Schütteeln (140 mal pro Minute) bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt,und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behändelt_/; und es wurden 29,5 C L-illanin in kristalliner Form erhalten.

= + 14,2° (C = 4, in 6n HCl)

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Beispiel 4

Ein Stamm von Achromobacter pestifer wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurden 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 21,7 g L-Alanin in kristalliner Form anfielen.

* [·'., ψ = + 14,2° (C = 4, in 6n HGl) Beispiel 5

Ein Stamm von Pseudomonas dacunhae wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurden 0,1 % Polyoxyäthylen-sorbitan-monolaurat und 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt,und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete·Gemisch wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt und lieferte 29,1 g L-Alanin in kristalliner Form.

ψ = + 14,2°.. (G = 4, in 6n HCl)

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Beispiel 6

Ein Stamm von Achromobacter pestifer wurde wie in Beispiel 3 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbr"he wurden 0,1 % Polyoxyäthylen-stearat und *6 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde,, wie in Beispiel 1 beschrieben,behandelt, und es wurden 21,4 g L-Alanin in kristalliner Form erhalten.

ίΰψ = + 14,2° (G = 4, in 6n HGl) Beisjiel 7 ·

Ein Stamm von Pseudomonas dacunhae wurde auf 120 ml eines wässrigen Währmediums (t>H 5,5) geimpft, das die folgenden Bestandteile enthielt:

Ammonimsalz der Fumarsäure 0,5 % Natriumsalz der Fumarsäure 1,0 % Caseinhydrolysat 0,2 %

Pepton 0,9 %

0,05 %

MgSO₄.7H₂O 0,01 %

es wurde 20 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 84 g L-Asparaginsäure zugesetzt,

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und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt und lieferte 51,2 g L-Alanin in kristalliner Form.

_i2° (C = 4, in 6n HGl)

Beispiel 8

Ein Stamm von Achromobacter pestifer wurde wie in Beispiel 7 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurde 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt,und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 29,5 S L-Alanin in kristalliner Form anfielen.

= + 14,3° (C = 4, in 6n HCl)

Beispiel 9

Ein Stamm von Pseudomonas dacunhae wurde unter den Bedingungen des Beispiels 7 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurden 0,1 % Polyoxyäthylen-sorbitan monolaurat und 84 g L-Asparaginsäure zügesetzt,und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Das

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bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt und ergab 51,5 g L-Alanin in kristalliner Form.

[<Q ψ = + 14,2° (C = 4, in 6n HCl)

Beispiel 10

Ein Stamm von Achromobacter pestifer wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 7 der Gärung unterworfen. Zu. der Gärbrühe wurde 0,1 % Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat und 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt,und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37°G bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt und lieferte 29,2 g L-Alanin-Kristalle.

[c€j ψ = + 14,2° (C = 4, in 6n HCl)

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahrener Herstellung von L-*Alanin, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus vom Stamm Pseudomonas dacunhae oder Achromobacter pestifer in einem wässrigen Uährmedium, das eine dibasische organische Carbonsäure oder deren Salz als hauptsächliche Kohlenstoffquelle und andere geeignete Nährstoffe enthält, der Gärung unterworfen wird, L-Asparaginsäure mit der gewonnenen G-ärbrühe oder ihrer Raffinierten wässrigen Zubereitung bebrütet Hund L-Alanin aus dem Eeaktionsgemiseh isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die raffinierte wässrige Zubereitung eine wässerige Suspension von aus der Brühe gewonnenen lebenden Zellen, eine wässrige Suspension getrockneter, lebender Zellen oder ein zellfreier Extrakt λ ist, der aus lebenden Zellen hergestellte L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase enthält.

3. "Verfahren zur Herstellung von L-Alanin, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus vom Stamm Pseudomonas dacunhae oder Achromobacter pestifer

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in einem -wässrigen Nährmedium, das 0,5 bis 2 Prozent.einer dibasischen organischen Carbonsäure oder deren Ammoniumsalz als hauptsächliche Kohlenstoff quelle, 1 bis 5 Prozent eines Stickstofflieferanten und eine geringe Menge Mineralsalze enthält, bei 25 bis 30⁰C einen Tag der Gärung unterworfen wird, L-Asparaginsäure zu der erhaltenen Gärbrühe zugesetzt, das Gemisch 2 bis 4 Tage bei 30 bis 40⁰C bebrütet, filtriert, das Filtrat mit einem starken Kationenaustauscherharz behandelt und die behandelte Lösung konzentriert wird.

Verfahren nach Anspruch 3₅ dadurch gekennzeichnet, daß ein geeigneter oberflächenaktiver Stoff zu dem Reaktionsgemisch, das die Brühe und Asparaginsäure enthält,angesetzt wird, der eine starke Wirksamkeit entfaltet_? ssfecsias indem er die zur Umwandlung von L-Äsparaginsäure in L-Alanin erforderliche Zeit

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