DE1793806B1

DE1793806B1 - Verfahren zur herstellung von l-alanin

Info

Publication number: DE1793806B1
Application number: DE19651793806
Authority: DE
Inventors: Chibata Ichiro; Toshio Kakimoto; Joji Kato
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1964-11-24
Filing date: 1965-11-23
Publication date: 1976-11-04
Also published as: CH449043A; US3458400A; DE1518382A1; FR1476603A; DE1518382B2; GB1059668A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch enzymatische Decarboxylierung von L-Asparaginsäure.

L-Alanin kann bekanntlich mit Hilfe von Mikroorganismen erhalten werden, die L-Alanin durch Gärung erzeugen. Zum Zwecke einer gewerbsmäßigen Gewinnung ist dieses Verfahren aber nicht wirtschaftlich genug.

Wie beschrieben wurde, besitzt L-Asparaginsäure- ß - decarboxylase (L - Aspartat - 4 - carboxy - lyase EC 4.1.1.12) die Fähigkeit, die Decarboxylierung von L-Asparaginsäure in der ^-Stellung zu katalysieren, was zur Bildung von L-Alanin führt (Biokhimiya 14, [1949], 44). Bestimmte Stämme der Art Pseudomonas und Achromobacter erzeugen diese Decarboxylase (Journal of Bacteriology 80, [1960], 830; Biochem. J, 88 [1963], 578). Die Aktivität der von dem Pseudowichtigste Kohlenstolfquelle sowie andere geeignete Nährstoffe enthält, und Umsetzung der erhaltenen Gärbrühe mit L-Asparaginsäure gewonnen.

Ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Nährmedium enthält etwa 0,5 bis 2 % Dicarbonsäuren wie Fumarsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure oder deren Salze als einzige oder hauptsächliche Kohlenstoffquelle. Als Stickstorfquelle können anorganische Ammoniumsalze, z. B. das Chlorid, Phosphat oder Sulfat zugesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden aber mit den Ammoniumsalzen der obigen organischen Säuren erzielt. Außer diesen Nährstoffen können 1 bis 3% organische Stickstoff lief eranten wie Maisquellwasser, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydroiysat oder Harnstoff und geringe Mengen Mineralsalze wie Kaliumphosphat oder Magnesiumphosphat zu dem Nährmittel zugesetzt werden.

Die Bildung der L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase erreicht das Maximum, wenn das bakterielle Wachsturn in ein Stadium zwischen dem Ende der logarithmischen Phase und dem Anfang der stationären Phase tritt. Die besten Bedingungen für die Enzymbildung sind gegeben, wenn man die Gärung einen Tag lang unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 3O⁰C, vorzugsweise bei 30°C, durchführt.

Nach der Gärung wird L-Asparaginsäure zu der Gärbrühe zugesetzt und das Gemisch genügend lange bebrütet, um L-Asparaginsäure in L-Alanin umzuwandeln.

L-Asparaginsäure kann zu der Gärbrühe in einer Menge von mehr als 70 Prozent zugegeben werden. Da die Löslichkeit der L-Asparaginsäure in Wasser weniger als 1 Prozent beträgt, liegt der größte Teil der L-Asparaginsäure im Anfangsstadium in suspendierter Form in der Brühe vor und löst sich darin langsam bei fortschreitender Umsetzung. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird also durch die Pufferwirkung der allmählich in Lösung gehenden L-Asparaginsäure bequem in dem für die enzymatische Umwandlung

monas-Stamm erzeugten Decarboxylase war jedoch 40 günstigsten Bereich gehalten, der bei pH 4,5 bis 7, ins-

sehr gering, und außerdem wurde gleichzeitig noch ein anderes, L-Alanin decarboxylierendes Enzym gebildet, und der eingesetzte Achromobacter-Stamm war wegen seines schlechten Wachstums für die industrielle Gewinnung von L-Alanin schwer zugänglich.

Auch die aus der japanischen Patentveröffentlichung 28 951/1968 bekannte L-Alanin-Herstellung mit Hilfe der durch verschiedene Pseudomonas-Stämme und den Stamm Achromobacter polymorph erzeugten L-Asparaginsäure-/?-decarboxylase hat keinerlei wirtschaftliehe Bedeutung, da die erzielbare Decarboxylase-Aktivität nur etwa 4,6 bis 49,5, ausgedrückt als Qco2> beträgt (Qco2 = \A erzeugtes CO₂/Stunde/mg Mikroorganismenzellen).

Es wurde nunmehr gefunden, daß sich bei der Gärung von Achromobacter pestifer in Gegenwart einer Dicarbonsäure eine erheblich höhere Aktivität an L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase in den Zellen anbesondere 5 bis 6, liegt, wie bekannt und durch einige Vorversuche unschwer feststellbar ist.

In der Regel kann die Decarboxylierung bei einer Bebrütung von 2 bis 4 Tagen und einer Temperatur von 30 bis 40⁰C, vorzugsweise von 37° C, im wesentlichen zu Ende geführt werden.

Beim angegebenen Decaroxylierungsverfahren kann die Gärbrühe durch eine wäßrige Suspension lebender Zellen, die durch Filtration aus der Brühe isoliert wurden, oder durch Trockenzellen ersetzt werden. Es kann auch ein zellfreier Extrakt verwendet werden, der nach üblichen bekannten Verfahren, z. B. durch Extraktion nach Schallbehandlung oder durch Zerreiben der lebenden Zellen mit Quarzsand, gewonnene L-Asparaginsäure-/3-decarboxylase enthält.

Die Reaktionszeit der enzymatischen Decarboxylierung kann auf etwa ein Drittel verkürzt werden, wenn etwa 0,005 bis 2% eines oberflächenaktiven Stoffes, z. B. eines Fettsäureesters des Polyäthylen

sammelt. So erreicht beispielsweise die aus der Gärbrühe von Achromobacter pestifer des Stammes 60 glycols oder Polyäthylenglycolsorbitans, zu dem Reak-IAM 1446 gewonnene L-Asparaginsäure-ß-decarboxy- tionsgemisch zugesetzt werden.

lase-Aktivität bei 30C einen Q_Co₂-Wert von 1023. Außerdem werden keine anderen störenden Enzyme erzeugt, die eine Zersetzung oder Racemisierung von L-Alanin bewirken könnten.

Erfindungsgemäß wird L-Alanin in hoher Ausbeute durch Gärung von Achromobacter pestifer in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Dicarbonsäure als Das in dem Reaktionsgemisch erzeugte L-Alanin wird dann gereinigt durch Filtrieren des Gemisches, Behandeln des Filtrats mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz, z. B. einem Sulfonsäureharz, und Konzentrieren der behandelten Lösung. Auf diese Weise können mehr als 43 g reines L-Alanin in kristalliner Form aus 100 ml des Reaktionsgemisches ge-

wonnen werden. Eine so hohe Ausbeute wurde nach den früheren Verfahren niemals erzielt.

Für die nachfolgenden Beispiele wurden jeweils 120 ml eines wäßrigen Nährmediums bereitet. Die in den Beispielen 1 bis 6 eingesetzten Nährmedien enthielten die folgenden Bestandteile in %-Gewicht/Volumen:

Bestandteil	I	II	III
NH₄-Fumarat	0,5	0,5	0,5
Na-Fumarat	1,0	1,0	1,0
Maisquellwasser	2,2	0,55	—
KH₂PO₄	0,05	0,05	0,05
MgSO₄ · 7 H₂O	0,01	0,01	0,01
Pepton	—	1,8	0,9
Caseinhydrolysat	—	—	0,2

Beispiel 1

120 ml des Nährmediums I wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und in einen 500-ml-Schüttelkolben gegeben. Nach der Sterilisierung wurde Achromobacter pestifer IAM1446 auf das Nährmedium geimpft und dieses 26 Stunden unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bei 30⁰C bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt und die Mischung wurde 96 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 4,0 wurde das bebrütete Gemisch zum Sieden erhitzt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit einem Kationenaustauscherharz vom SuIfonsäuretyp geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat eingeengt und lieferte 21,2 g (88%) L-Alanin in kristalliner Form mit einem

Beispiel 2

Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde auf 120 ml des Nährmediums II (pH 7,0) geimpft. Dann wurde 26 Stunden lang unter Schütteln bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.

Beispiel 3

Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde wie in Beispiel 2 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurden 0,1 % Polyäthylenglycolstearat und 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37° C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse finden sich in Tabelle I.

Beispiel 4

Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde auf 120 ml des Nährmediums III (pH 5,5) geimpft. Dann wurde 20 Stunden bei 30° C bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 72 Stunden lang bei 37° C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.

spezifischen Drehwert von
6 NHCl).

[«] ¹S + 14,3° (c = 4, in

40

Beispiel 5

Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 4 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurde 0,1% PoIyäthylenglycolsorbitan-monolaurat und 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurd wie in Beispiel 1 behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt, wobei sich die Angaben über die theoretische Ausbeute (% d. Th.) auf die eingesetzte L-Asparaginsäure beziehen.

Tabelle I Beispiel

Gebildetes L-Alanin
Ausbeute

%d.Th.

Spez. Drehung [«]? (c = 4, 6 NHCl)

2	21,7	Beispiel 6	90
3	21,4	89
4	29,5	92
5	29,2	91

120 ml des Nährmediums III (pH 5,5) wurden mit Achromobacter pestifer IAM 1446 bzw. ATCC 23584 beimpft, worauf die Mischung bei 30° C 20 Stunden lang unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bebrütet wurde. Es wurden 120 ml Gärbrühe erhalten.

30 ml Gärbrühe wurden zentrifugiert. Die auf diese Weise gesammelten Mikrobenzellen wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurden die Mikrobenzellen in Wasser suspendiert und durch Ultraschall (10 kH) während einer Zeitspanne von 10 Minuten zerstört. Die wäßrige Suspen- +14,2°
+14,2°
+14,3°
+14,2°

sion der Mikrobenzellen wurde zur Entfernung von unlöslichen Materialien zentrifugiert, wobei eine überstehende Lösung mit einem Gehalt an L-Asparaginsäure-/?-decarboxylase erhalten wurde.
0,5 ml der überstehenden Lösung wurden einer Mischung aus 2 ml einer wäßrigen 10 mM L-Asparaginsäurelösung und 1 ml einer wäßrigen 1 M Acetatpufferlösung (pH 5,5) zugesetzt. Die Mischung wurde bei 30⁰C 10 Minuten inkubiert. Die Menge des durch die Mischung erzeugten Kohlendioxids wurde unter Verwendung eines Warburg-Manometers bestimmt und daraus die L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase-Aktivität berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind inder unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.

Die in Tabelle II angegebene Menge an L-Asparaginsäure wurde zu 120 ml der erhaltenen Gärbrühe zugesetzt, worauf die Mischung bei 37⁰C und einem pH-Wert von 5 bis 6 24 Stunden lang inkubiert wurde. Die Menge des in der Reaktionsmischung angereicherten L-Alanins wurde nach üblichen mikrobiologischen Methoden mit Leuconostoc citrovorum 8081 bestimmt. Dann wurde die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, zum Sieden erhitzt und filtriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wurde durch eine mit einem stark sauren Kationenaustauscher gefüllte Säule geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat zur Trockene eingedampft, wobei L-Alanin in kristalliner Form in den in Tabellen angegebenen Ausbeuten gewonnen wurde.

Beispiel 7

Es wurden 120 ml eines wäßrigen Nährmediums hergestellt, das folgende Bestandteile enthielt:

Natriumsuccinat 1,2% (Gew./Vol.)

Caseinhydrolysat 0,2 % (Gew./Vol.)

Pepton 0,9% (Gew./Vol.)

KH₂PO₄ 0,05 % (Gew./Vol.)

MgSO₄ · 7 H₂O 0,01 % (Gew./Vol.)

Das erhaltene Nährmedium wurde auf pH 7,0 eingestellt und in einen 500-ml-Kolben eingebracht. Nach Sterilisation wurde das Nährmedium mit einer Impf-

Tabelle II

kultur von Achromobacter pestifer IAM 1446 angeimpft und 26 Stunden wie in Beispiel 6 beschrieben bebrütet. Es wurden 120 ml Gärbrühe erhalten.

30 ml der Gärbrühe wurden gemäß Beispiel 6 auf gearbeitet, mit Asparaginsäure behandelt und auf L - Asparaginsäure -ß - decarboxylase - Aktivität untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.

Zu 120 ml der oben angegebenen Gärbrühe wurden

ίο 36 g L-Asparaginsäure zugegeben und wie in Beispiel 6 beschrieben wurde 72 Stunden lang inkubiert und weitergearbeitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Beispiel 8

Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß 120 ml eines wäßrigen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung hergestellt und verwendet wurden:

Natriummalat 1,2 % (Gew./Vol.)

Caseinhydrolysat 0,2 % (Gew./Vol.)

Pepton 0,9% (Gew./Vol.)

KH₂PO₄ 0,05% (Gew./Vol.)

MgSO₄ · 7 H₂O 0,01 % (Gew./Vol.)

Zur Bestimmung der Alanin-Bildung wurden statt 36 g Asparaginsäure nur 24 g Asparaginsäure in 120 ml Gärbrühe bebrütet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Bei	Achromobacter	Dicarbonsäure- Bebrü-	L-Asparagin-	ZugesetzteDecarb-	(Q	(D)	(E)	(F)	(G)
spiel	pestifer-Stamm	salz tungszeit	säure-^-decarb-	L-Aspa- oxylie-
		(h)	ox>lase-Aktivität	raginsäure rungszeit
			(A) (B)	(g) (W

6	IAM 1446	Fumarat	20	3069	1023	48	24	32,2	100	29,4	92	+14,2
						36	24	24,1	100	22,1	92	+14,3
	ATCC 23584	Fumarat	20	1034	272	24	24	16,2	100	14,7	92
7	IAM 1446	Succinat	26	1750	985	36	72	24,0	99,6	22,3	92,6
8	IAM 1446	Malat	26	1680	890	24	72	15,7	97,8	14,5	90,3

Bemerkungen:

(A) Qcoz/ml Gärbrühe (d. h. μΐ CO₂/h/ml Gärbrühe)

(B) Qcoi/mg Protein (d. h. μΐ CO₂/h/mg Protein in der Gärbrühe)

(C) Menge (g) an im Reaktionsgemisch angereicherten L-Alanin

(D) Umwandlung (%) von L-Asparaginsäure in L-Alanin

(E) Ausbeute (g) an kristallinem L-Alanin

(F) Ausbeute (% der Theorie) an L-Alanin, bezogen auf eingesetzte L-Asparaginsäure

(G) Spezifische Drehung [«]§" (<· = 4, 6 NHCl).

Die Ergebnisse zeigen, daß mit den erfindungsgemäß verwendbaren Stämmen von Achromobacter pestifer eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte L - Asparaginsäure - β - decarboxylase - Aktivität erzielbar ist, wobei als weiterer Vorteil hinzukommt, daß beim Verfahren der Erfindung kein störendes, das erhaltene L-Alanin zersetzende oder racemisierende Enzym gebildet wird.

Beispiel 9

Es wurden 120 ml eines wäßrigen Nährmediums hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt:

mit Natriumhydroxid neutralisierte Dicarbonsäure 1,2% Gew./Vol.

Caseinhydrolysat 0,2 % Gew./Vol.

Pepton 0,9% Gew./Vol.

KH₂PO₄ 0,05% Gew./Vol.

MgSO₄-7H₂O 0,01% Gew./Vol.

Das obige Medium wurde auf den in der folgenden Tabelle III angegebenen pH-Wert gebracht und in 500-ml-Schüttelflaschen eingebracht. Nach dem Sterilisieren wurde mit einer Impfkultur von Achromobacter pestifer IAM 1446 geimpft und das Medium bei 30³C die ebenfalls in der folgenden Tabelle angegebene Zeitspanne unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bebrütet. Es wurden 120 ml einer Fermentationsbrühe von Achromobacter pestifer IAM 1446 erhalten.

30 ml der Gärbrühe wurden zentrifugiert. Die auf diese Weise gesammelten Mikrobenzellen wurden gemäß Beispiel 6 in eine Lösung übergeführt, die L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase enthielt. 0,5 ml dieser Lösung wurden einer Mischung aus 2 ml einer wäßrigen 10 mM L-Asparaginsäurelösung und 1 ml einer wäßrigen 1M Acetatpufferlösung (pH 5,3) zugesetzt. Die Mischung wurde bei 30° C während einer

Zeitspanne von 10 Minuten inkubiert. Mit Hilfe eines Warburg-Manometers wurde die Menge an Kohlendioxid bestimmt, die durch die Mischung erzeugt wurde. Daraus läßt sich die L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase-Aktivität berechnen. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle III aufgeführt.

Fine Menge von L-Asparaginsäure, die in der folgenden Tabelle III angegeben ist, wurde zu 120 ml der wie vorstehend angegeben erhaltenen Gärbrühe zugefügt und das Gemisch bei 37° C bei pH 5,6 72 Stun- ίο inkubiert. Die Menge des in dem Reaktionsgemisch angesammelten L-Alanins wurde durch die übliche

mikrobiologische Untersuchung mit Leuconostoc citrovorum ATCC 8081 bestimmt. Der Prozentsatz der Umwandlung von L-Asparaginsäure in L-Alanin wird daraus berechnet. Dann wurde die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, zum Sieden erhitzt und filtriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wurde durch eine mit einem stark sauren Kationenaustauscher (vernetztes Polystyrolgerüst mit SO₃H-Gruppen) gefüllte Säule geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat zur Trockne eingedampft. Dabei erhielt man L-Alanin in kristalliner Form in den in Tabelle III aufgeführten Ausbeuten.

Tabelle III

Beispiel Dicarbonsäuren

pH

Zeitdauer

des

Züchtens

(h)

L-Asparaginsäure-

/J-Decarboxylase-

Aktivität

(A)

(B) Zugesetzte
L-Asparaginsäure

(g)

(C)

(D)

(E)

(F)

9a	Phthalsäure	7,2	72	595	432	6	4,0	99,6	3,5	87,2
9b	Isophthalsäure	8,4	72	1025	900	12	7,8	97,2	7,1	88,4
9c	Terephthalsäure	7,4	72	420	327	6	3,9	97,1	3,6	89,7
9d	Dipicolinsäure	8,2	72	491	315	6	4,0	99,6	3,7	92,2
9e	Oxalsäure	7,0	72	570	315	6	4,0	99,6	3,5	87,2
9f	Maleinsäure	7,0	64	850	560	12	7,7	95,9	7,2	89,7
H	Adipinsäure	7,0	48	1352	921	12	7,8	97,2	7,0	87,2
9h	Weinsäure	7,0	48	1207	890	12	7,8	97,2	7,2	89,7

Legende siehe Tabelle II.

609545/448

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch enzymatische Decarboxylierung von L-Asparaginsäure mit Hilfe einer durch Gärung eines L-Asparaginsäure - β - decarboxylase erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium erhaltenen Gärbrühe oder einer gereinigten Zubereitung derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Nährmedium, welches eine Dicarbonsäure oder ein Salz davon enthält, einen Stamm von Achromobacter pestifer züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Decarboxylierung in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels durchführt.