DE2152548C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Hydroxyphenylalaninen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-HydroxyphenylalaninenInfo
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Description
OH
in der Ri und R2 die vorstehende Bedeutung
haben,
(b) 0,1 bis 20% GewyVol. Ammoniumionen und
(c) einer oder mehreren der Säuren: Pyruvinsäure, Oxalessigsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäure,
Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure und Milchsäure oder deren Salze
bei Temperaturen von 10 bis 500C und bei einem
pH-Wert von 4 bis 11 in Gegenwart einer /?-Tyrosinase umsetzt, die mit Hilfe der Mikroorganismen
Escherichia coli ATCC 3655,
Aerobacter aerogenes ATCC 7256,
Citrobacter freundii ATCC 6750,
Citrobacter freundii ATCC 8090,
Erwinia herbicola ATCC 21433,
Erwinia herbicola ATCC 21434,
Pseudomonas perlurida ATCC 490,
Xanthomonas campestris ATCC 7381,
Proteus mirabilis ATCC 15290,
Salmonella gallinarum ATCC 9148,
Paracolobacirum coliforme ATCC 11605 und
Alcaligenes faecalis ATCC 8315
hergestellt worden ist.
Aerobacter aerogenes ATCC 7256,
Citrobacter freundii ATCC 6750,
Citrobacter freundii ATCC 8090,
Erwinia herbicola ATCC 21433,
Erwinia herbicola ATCC 21434,
Pseudomonas perlurida ATCC 490,
Xanthomonas campestris ATCC 7381,
Proteus mirabilis ATCC 15290,
Salmonella gallinarum ATCC 9148,
Paracolobacirum coliforme ATCC 11605 und
Alcaligenes faecalis ATCC 8315
hergestellt worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phenolverbindung teilweise
während der Reaktion zur Lösung zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung ein Reduktionsmittel
und/oder ein Komplex- oder Chelatbildungsmittel in einer Konzentration von 0,01 bis 1 % Gew./Vol.
enthält.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Hydroxyphenylalaninen.
L.-3.4- Dihydroxyphenylalanin (nachstehend als DOPA bezeichnet) wird zur Behandlung der Parkinsonschen
Krankheit verwendet, L-Tyrosin ist eine der wesentlichen Aminosäuren und L-2,4-Dihydroxyphenylalanin
ist als Nährmittel und Lebensmittelzusatz brauchbar.
DOPA kann aus Zwischenprodukten, wie Piperonylaldehyd.
Vanillin, Tyrosin und Brenzcatechin synthetisch hergestellt werden, oder es kann durch Extraktion
natürlicher Saaten erhalten werden. DOPA kann biochemisch aus Brenzcatechin und L-Tyrosin mittels
0-Tyrosinase, die aus einem Mikroorganismus, der zur
Gattung Escherichia gehört, hergestellt werden. L-Tyrosin wird in technischem Umfang nur durch Extraktion
von natürlichen Substanzen erzeugt. Es ist neu, daß L-2,4-Dihydroxypheny!alanin biochemisch synthetisiert
werden kann.
Es ist bekannt, daß das Enzym /?-Tyrosinase die
Zersetzung von L-Tyrosin zu Phenol, Brenztraubensäure und Ammoniak katalysiert. Wie angegeben, erzeugt
jS-Tyrosinase auch DOPA aus Brenzcatechin und L-Tyrosin.
Aufgabe der Erfindung ist die Erzeugung von L-Hydroxyphenylalaninen nach einem biochemischen
Verfahren bei niedrigen Kosten aus leicht zur Verfugung stehenden Rohmaterialien und durch einfachere
und bequemere Behandlungen, als dies bei bekannten Verfahren der Fall ist.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von L-Hydroxyphenylalaninen
der allgemeinen Formel
Ri R2
OH -<f >—CH2-CH-COOH
OH -<f >—CH2-CH-COOH
NH2
in der Ri und R? Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe
bedeuten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige Lösung aus:
(a) 0,1 bis 20% GewVVol. eine Phenolverbindung der allgemeinen Formel
OH
4, in der R1 und Rj die vorstehende Bedeutung haben,
(b) 0,1 bis 20% Gew./Vol. Ammoniumionen und
(c) einer oder mehreren der Säuren: Pyruvinsäure, Oxalessigsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäure,
Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure und Milch-
-,(I säure oder deren Salze
bei Temperaturen von 10 bis 500C und bei einem
pH-Wert von 4 bis 11 in Gegenwart einer j3-Tyrosinase
umsetzt, die mit Hilfe der Mirkoorganismen
Escherichia coli ATCC 3655,
-,-, Aerobacter aerogenes ATCC 7256, Citrobacter freundii ATCC 6750, Citrobacter freundii ATCC 8090, Erwinia herbicola ATCC 21433, Erwinia herbicola ATCC 21434, „ii Pseudomonas perlurida ATCC 490,
-,-, Aerobacter aerogenes ATCC 7256, Citrobacter freundii ATCC 6750, Citrobacter freundii ATCC 8090, Erwinia herbicola ATCC 21433, Erwinia herbicola ATCC 21434, „ii Pseudomonas perlurida ATCC 490,
Xanthomonas campestris ATCC 7381, Proteuf mirabilis ATCC 15290,
Salmonella gallinarjm ATCC 9148, Paracolobactrum coliforme ATCC 11605 und
„, Alcaligenes faecalis ATCC 8315,
hergestellt worden ist.
Die Quelle von /?-Tyrosinase kann aus einer Brühe bestehen, in der ein Mikroorganismus gezüchtet ist,
oder einem zellfreien Filtrat davon, einer wäßrigen
Suspension von gemahlenen Zellen, einem Filtrat davon oder einer reinen Enzymbereitung bestehen.
Die zum Züchten der Mikroorganismen angewendeten Medien können aus üblichen Medien bestehen,
welche Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff und die üblichen geringeren Mengen an
Nährstoffen enthalten und auch eine geeignete Menge von Tyrosin einschließen. Die Mikroorganismen sind
mit Erfolg auf Medien gezüchtet worden, die Kohlenhydrate, wie Glukose, Fructose, Sucrose, Mannose,
Maltose, Mannit, Xyiose, Galaktose, Stärkehydrolysat und Melassen, enthalten. Organische Säuren, wie
Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, «-Ketoglutarsäure, Gluconsäure und Pyruvinsäure
(Brenztraubensäure), Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol, Fettsäuren und
Kohlenwasserstoffe sind auch als Hauptkohienstoffquellen oder ergänzende Kohlenstoffquellen für ausgewählte
Mikroorganismen geeignet. Die Konzentration der Kohlenstoffquellen in dem Medium liegt gewöhnlich
zwischen 0,1 und 10% GewVVol., bezogen auf Glukoseäquivalente. Stickstoff kann durch Ammoniumsalze
von anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure,
Essigsäure und Kohlensäure, durch Harnstoff und durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder im
gasförmigen Zustand geliefert werden. Andere organische Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie Maisquellflüssigkeit,
Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und NZ-Amin werden als zusätzliche oder ergänzende
Stickstoffquellen angewendet.
Das Medium soll auch anorganische Salze und geringere Mengen an organischen Nährstoffen enthalten,
welche das Wachstum der Mikroorganismen fördern. Die anorganischen Salze können Dikaliumhydrogenphosphat,
Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat Mangansulfat,
Zinksulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat einschließen. Bekannte organische wachstumsfördernde Substanzen
umfassen Aminosäuren allgemein, Biotin, Vitamine, organische Säuren, Fettsäuren und Protein
und Eiweiß enthaltende Substanzen. Sie können durch Substanzen zugeführt werden, welche das aktive Mittel
unter den Züchtungsbedingungen ergeben, wie z. B. Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit,
Magermilch, Chlorellaextrakt und Sojabohnenproteinhydrolysat.
Tyrosin soll zu dem Medium in einer Menge von mehr als 0,01% und vorzugsweise von 0,05 bis 0,5% in
Teilen/Vol. zugegeben werden. Das Tyrosin kann sich in
der Form von organischen Nährstoffen, wie einer Aminosäuremischung, Polypepton oder Sojabohnenextrakt
befinden.
Aminosäuren, wie Methionin, Glycin und Alanin, Vitamine, wie Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxalphosphat
werden auch dem Züchtungsmedium zugegeben, um die Enzymaktivität zu verbessern. Die Konzentration
der zugesetzten Aminosäuren liegt gewöhnlich zwischen 0,01 und 5% Gew./Vol. als freie Aminosäuren,
und die Vitamine sind in einer Menge von mehr als 0,5 mg/dl wirksam.
Die Gärung oder Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 40"C ausgeführt. Vorzugsweise
wird der pH-Wert des Ziiehtungsmediums auf 5,5 bis 8,5 während der Züchtung eingestellt. Die Züchtung wird
allgemein während 10 bis 72 Stunden ausgeführt.
Die Brühe kann als F.n/ymquelle, wie sie ist, ohne
Entfernung der bakteriellen Zellen benutzt werden. Ein zellfreies Filtrat der Züchtungsbrühe und eine Suspension
von zerkleinerten bakteriellen Zellen, die durch Zerreiben, Autolyse oder Ultraschallschwingungen
bereitet irt, werden aus als Enzymquelle gemäß der
Erfindung verwendet. Rohes Enzym und reines Enzym, das durch Zentrifugieren, Aussalzen und Lösungsmittelfällung
gewonnen ist, können auch zur Anwendung gelangen.
Die L-Hydroxyphenylalanine können dadurch hergestellt werden, daß man Phenolverbindungen, Ammoniumionen
und Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxalessigsäure, Äpfelsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure,
Milchsäure, Salz der Säuren oder Derivate davon dem Medium während der Züchtung zusetzt.
Die Phenol verbindungen, welche als Ausgangsmaterial
bei dem Verfahren gemäß der Erfindung angewendet werden können, schließen Brenzcatechin, Resorcin
und Phenol ein.
Die Säuren, die als Quelle des Alaninanteils der
L-Hydroxyphenylalanine dienen, sind Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxalessigsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure,
MaleLnsäureoxim, Glyoxylsäure oder Milchsäure. Die Ammoniumionen können in einer Menge von
0,1 bis 10 Gewichtsteilen zugegeben werden. Die Brenztraubensäure, Oxalessigsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure,
Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure und Milchsäure können in Form der freien Säure, des Ammonium-,
Natrium·, Kalium- oder Calciumsalzes vorliegen, es können jedoch auch die Ester, wie der Methylester oder
Äthylester, und andere Derivate zur Anwendung gelangen. Das Ammoniumsalz der betreffenden Säure
wird bevorzugt. Die Menge der Säure, die in dem Reaktionssystem vorhanden ist, beträgt 0,1 bis 20%
GewVVol, bezogen auf die freie Säure.
Die Reaktion wird bei einem pH-Wert von 4 bis 11
und einer Temperatur von 10 bis 50°C ausgeführt. Der pH-Wert des Reaktionssystems wird durch Zusatz von
Calciumcarbonat, Ammoniak, Ätzalkali oder Phosphatpufferlösung aufrechterhalten.
Wenn Brenzcatechin und Resorcin als Phenolverbindung zur Erzeugung von DOPA und L-2,4-Dihydroxyphenylalanin
angewendet werden, kann die Menge an Endprodukt stark erhöht werden, wenn man ein
Reduktionsmittel und/oder ein komplex- oder chelatbildendes Mittel dem Reaktionssystem zusetzt. Beispiele
von geeigneten Reduktionsmitteln sind schwefelige Säure, Natriumsulfit, Kaliumsulfit, Ammoniumsulfit,
Thioschwefelsäure, Kaliumthiosulfat, Natriumthiosulfat,
Ammoniumthiosulfat, Cystein, /J-Mercaptoäthanol und
Ascorbinsäure.
Beispiele von brauchbaren Komplexbildungsmitteln sind Äthylendiamintetraessigsäure bzw. deren Natriumsalz
(EDTA), Äthylendiamin, N-Oxyäthylendiamin, Asparginsäure, N-Dioxyäthylglycin, Nitrilotriacetat, Citronensäure
und Thioglycolsäure. Das Reduktionsmittel und die Komplex- oder Chelatbildungsmittel werden im
allgemeinen in einer Menge von 0,01 bis 1% Gew./Vol. angewendet.
Wenn Brenzcatechin als Phenolverbindung zur Herstellung von DOPA angewendet wird, kann die
Ausbeute von DOPA stark erhöht werden, indem man Borsäure dem Reaktionssystem zusetzt. Die Borsäure
kann sich in der Form des Alkalisalzes oder Erdalkalisal zes befinden und kann in äquiinolarcr Menge bis zu
einem kleinen molaren Überschuß je Mol Brenzcatechin angewendet werden. Das Reduktionsmittel und/
oder das Komplex- oder Chelatbildungsmittel kann
zusammen mit der Borsaure in dem Reaktionssystem vorhanden sein.
Die in der Reaktionsmischung hergestellten L-Hydroxyphenylalanine
können nach üblirhen Verfahren gewonnen werden, z. B. kann DOPA nach dem in Journal of Biological Chemistry, 3d. 239, 1964, Seite
2910, beschriebenen Verfahren gewonnen werden.
Ein Kulturmedium, das 0,2 g/dl L-Tyrosin, 0,1 g/dl Kaliumtiihydrogenphosphat, 0,05 g/dl Magnesiumsulfat,
0,7 g/dl Fumarsäure, 0,2 g/dl Glucose, 1,0 g/d! Hefeextrakt, 0,5 g/dl Fleischextrakt und 0,01 g/dl Pyridoxin
enthielt, wurde hergestellt, der pH-Wert des Mediums mit einer KOH-Lösung auf 8.0 eingestellt und 5 Minuten
bei einer Temperatur von 110°C sterilisiert.
60 ml Ansätze des Mediums wurden mit Erwinia herbicola ATCC 21433, die vorher während einer
Zeitdauer von 20 Stunden bei 2*° C auf einer
Peptonagar-Schräge gezüchtet worden war, geimpft und 24 Stunden unter Schütteln bei 31CC gezüchtet.
Zwei Liter der Züchtungsbrühe wurden zur Sammlung der Bakterienzellen zentrifugiert, die Zellen
wurden zu einer 2-1-Lösung, die 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat, 10 g/dl Phenol und 1,0 g/dl Ammoniumacetat
enthielt, zugegeben und das Gemisch bei einem pH-Wert von 8,0 bei 37°C 20 Stunden stehengelassen.
Es wurde festgestellt, daß das Reaktionsgem. ,ch 0,8 g/dl
L-Tyrosin enthielt.
10Oy des festen Reaktionsproduktes wurden auf ein
Filterpapier gestreut, mit einem Lösungssyste,n aus Butanol/Essigsäure/Wasser in einem Verhältnis von
4:2:1 entwickelt, und der erhaltene einzelne Fleck wurde mittels der Ninhydrinreaktion und der Millonschen
Reaktion als Tyrosin identifiziert. Durch Messen der optischen Drehung wurde bestätigt, daß das Tyrosin
zu 100% in der L-Form vorlag.
Es wurde unter Verwendung von 2,0 g/dl Oxalessigsäure und 2,0 g/dl Ammoniumacetat anstelle von
1,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Ammoniumacetat
eine ähnliche Reaktion, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt, und es wurde festgestellt, daß das Reaktionsgemisch 0,7 g/dl L-Tyrosin enthielt.
Erwinia herbicola ATCC 21433 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet,
Bakterienzellen, erhalten aus 4 Liter der 3rühe, wurden
2 Liter einer Lösung, die 1,0 g/dl Brenztraubensäure, 1,0 g/dl Brenzcatechin, 1,0 g/dl Ammoniumacetat und
0,2 g/dl Kaliumsulfit enthielt und einen pH-Wert von 8,0 hatte, zugegeben, und das Gemisch während 24 Stunden
bei 22° C umgesetzt. Es wurde festgestellt, daß das Reaktionsgemisch 0,7 g/dl L-Tyrosin enthielt.
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit
3 n-HCl auf einen Wert von 3,5 eingestellt, das Gemisch 5 Minuten auf 110°C erhitzt und die Zellen wurden
durch Zentrifugierung entfernt. Der überstehende Teil wurde auf 300 ml eingeengt, der pH-Wert der
konzentrierten Lösung wurde auf 1,0 eingestellt, und die Lösung wurde durch eine mit aktiver Holzkohle gefüllte
Säule geleitet. 0,1 η-Salzsäure wurde in die Säule eingeführt, um Aminosäurenebenprodukte zu eluieren;
DOPA wurde mit verdünntem, 0,2% Natriumsulfit enthaltendem Ammoniakwasser eluiert. Das Eluat
wurde konzentriert, der DOPA-Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Zugabe von Salzsäure aufgelöst
und konzentriert. Der erhaltene DOPA-Niederschlag wurde dreimal mit Wasser gewaschen, und es wurden
6 g DOPA erhalten. Es wurde festgestellt, daß sich das DOPA gänzlich in der L-Form befand.
Eine ähnliche Reaktion wurde unter Verwendung von 2.0 g/dl Oxalessigsäure und 2,0 g/dl Ammoniumacetat
statt 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Ammoniumacetat wiederholt; das Reaktionsgemisch enthielt
in diesem Fall 0,6 g/dl DOPA.
Bakterienzellen von Erwinia herbicola ATCC 21433, erhalten aus 4 Liter der Züchtungsbrühe, wurden 2 Liter
einer Lösung zugegeben, die 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat, 1,0 g/dl Resorcin, 1,0 g/dl Ammoniumacetat und
0,2 g/dl Natriumsulfit enthielt und einen pH-Wert von 6,0 hatte. Das Gemisch wurde bei 22°C 24 Stunden
umgesetzt. Das Reaktionsgemisch enthielt 0.4 g/dl L-2,4-Dihydroxyphenylalanin.
Durch Zugabe von Trichloressigsäure wurde Protein aus der Reaktionsmischung entfernt, die sich ergebende
Lösung wurde mit einem Anionenaustauschharz und dann mit aktiver Holzkohle behandelt; es wurde rohes,
kristallines 2,4-Dihydroxyphenylalanin erhalten. Die
rohen Kristalle wurden mit wäßrigem Äthanol gewasehen
und ergaben 5,3 g reines Produkt von 2,4-Dihydroxyphenylalanin. Durch optische Drehung wurde
bestätigt, daß es sich in der L-Form befand.
Eine ähnliche Reaktion wurde durchgeführt, wobei an Stelle von 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl
Ammoniumacetat 2,0 g/dl Oxalessigsäure und 2,0 g/dl Ammoniumacetat verwendet wurden; es wurde festgestellt,
daß die Reaktionsmischung 0,4 g/dl L-2,4-Dihydroxyphenylalanin enthielt.
B e i s ρ i e I 4
Aus 100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433 erhaltene Bakterienzellen, die wie in
Beispiel 1 gezüchtet worden war, wurden zu den folgenden Lösungen (I), (II), (III) und (IV) hinzugefügt
und bei einer Temperatur von 37°C 24 Stunden umgesetzt.
Lösung(l) | 1,0 g/dl |
r, Brenztraubensäure | 1,5 g/dl |
(NH4J2SO4 | 1,0 g/dl |
Phenol | 0,5 g/dl |
Ammoniumacetat | |
pH-Wert: 8,0(eingestellt mittels NH4OH) | |
",Il Lösung (II) |
1,0 g/dl |
Brenztraubensäure | 1,0 g/dl |
Phenol | |
pH-Wert: 8,0(eingestellt mittels NH4OH) | |
Lösung (III) | 1,0 g/dl |
Kaliumpyruvat | 1,0 g/dl |
Phenol | 2,0 g/dl |
Ammoniumacetat | |
„ο pH-Wert: 8,0(eingestellt mittels NH4OH) | |
Lösung (IV) | 1,0 g/dl |
Kaliumpyruval | 1,0 g/dl |
Phenol | |
„-, pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels KOH) | |
Es wurde festgestellt, daß L-Tyrosin in einer Menge von 0,7 g/dl in der Lösung (I). in einer Menge von
0,9 g/dl in der Lösung (II) und in einer Menge von 0,9 g/dl in der Lösung (III) produziert worden war; in
der Lösung (IV) jedoch wurde auf Grund des Fehlens von Ammoniumionen kein Tyrosin festgestellt.
Die in Tabelle I angegebenen Bakterien wurden in 60 ml Ansätzen eines Kulturmediums gezüchtet, das
0,2 g/dl Tyrosin, 0,1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 g/dl Magnesiumsulfat, 0,6 g/dl Glycerin, 0,5 g/dl
Bernsteinsäure, 2,0 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Fleischextrakt und 0,01 g/dl Pyridoxin enthielt; die Züchtung
wurde während 24 Stunden bei 310C und einem
pH-Wert von 7,5 unter Schütteln ausgeführt.
jeweils 100 ml Züchtungsbrühe wurden, zur Isolierung
der Bakterienzellen zentrifugiert; die erhaltenen Zellen wurden zu den nachstehend angegebenen 50 ml Lösungen
(I). (II) und (III) zugegeben, und das Reaktionssystem der Lösung (I) wurde 20 Stunden bei 37°C
gehalten. Die Lösungen (II) und (III) wurden 20 Stunden bei einer Temperatur von 20cC gehalten. Die Mengen
an produzierten phenolischen Aminosäuren sind in Tabelle I aufgeführt.
Lösung (I)
Kaliumpyruvat 2,0 g/dl
Phenol 1,0 g/dl
Ammoniumacetat 2,0 g/dl
pH-Wert: 8,0(eingestellt mittels NH4OH)
Lösung (II)
Kaliumpyruvat 2,0 g/dl
Brenzcatechin 1,0 g/dl
Ammoniumacetal 2,0 g/dl
Na2SOj 0,2 g/dl pH-Wert: 8,0(eingestellt mittels NH4OH)
Lösung (III)
Kaliumpyruvat 2,0 g/dl
Resorcin 1,0 g/dl
Ammoniumacetat 2,0 g/dl
Na2SO1 0,2 g/dl pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NH4OH)
Verwendete Bakterien
Menge an produzierter phenolischer Aminosäure
!.-Tyrosin DOPA
2,4-Dihydroxyphenylalanin
(g/dl)
(g/dl) (g/dl)
Erwinia herbicola 1,2 0,8 0,7
ATCC 21433
Citrobacter freundii 0,9 0,6 0,5
ATCC 6750
Escherichia coli 0,8 0,5 0,4
ATCC 3655
Citrobacter freundii 0,5 0,3 0,4
ATCC 8090
Proleus morganii 0,5 0.3 0,4
IFO 3848
Proleus mirabilis 0,4 0,3 0,3
ATCC 15 290
Verwendete Bakterien
Menge ;m produzierter phenolisdicr Aminosäure
I.-Tyrosin DOPA 2,4-Dihydroxy- phenylaliinin
(g/dl)
Pscudomonas perluridu 0,3
ATCC 490
Aerobacter aerogencs 0,3
ATCC 7256
Salmonella gallinarum 0,5
ATCC 9148
Paracoiobacirum 0,4
coliforme
ATCC 11 605
Xanthomonas 0,4
campestris
ATCC 7381
Alcaligenes faecalis 0,3
ATCC 8315
(g/dl
0.2 0,2 0,4 0,3
0,2 0,1
(g/dl ι
0.2 0,2 0,2 0,2
0,1
0,1
Ähnliche Reaktionen wurden wiederholt, wobei statt Kaliumpyruvat in den Lösungen (I) bis (I'i) 2,0 g/dl
Oxalessigsäure verwendet wurde Die Frgebnisse sind
in Tabelle II aufgeführt.
Verwendete Bakterien
Menge an produzierter phenolischer Aminosäure
L-Tyrosin DOPA 2,4-Dihydroxyphenylalanin
(g/d!)
(g/dl) (g/dl)
Erwinia herbicola 1,0 0,8 0,6
ATCC 21433
Citrobacter freundii 0,8 0,6 0,5
ATCC 6750
Proteus mirabilis 0,8 0,5 0,5
ATCC 15290
Pseudomonas perlurida 0,5 0,5 0,5
ATCC 490
Aerobacter aerogenes 0,5 0,5 0,5
ATCC 7256
Salmonella gallinarum 0,5 0,3 0,3
ATCC 9148
Citrobacter freundii 0,4 0,2 0,3
ATCC 8090
coliforme
ATCC 11605
Xanthomas campestris 0,3 0,2 0,2
ATCC 7381
Alcaligenes faecalis 0,3 0,2 0,1
ATCC 8315
Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 5 gezüchtet; 10 Liter der
Züchtungsbrühe wurden zur Sammlung der Bakterien-
zellen zentrifugiert, und die erhaltenen Zellen wurden durch Ultraschallwellen von 20 kHz 20 Minuten in einer
0,05 m Phosphatpufferlösung aufgebrochen. Die sich ergebende Lösung wurde zur Entfernung der Bakterienzellen
zentrifugiert, das Enzym des überstehenden Teiles wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat
ausgefällt und durch Behandlung mit Protamin und Cellulose-Ionenaustauscher raffiniert. 50 mg (als Protein)
des erhaltenen Enzymes wurden einer 100-ml-Lösung, die 1,0 g/dl Ammoniumacetat, 2,0 g/dl Ammoniumsulfat,
2,0 g/dl Natriumpyruvat, 1,3 g/dl Phenol und 2 mg/dl Pyridoxalphosphat enthielt und einen pH-Wert
von 8,0 hatte, zugegeben und das Gemisch 20 Stunden bei einer Temperatur von 37°C gehalten. Es wurde
festgestellt, daß die Mischung 1,6 g/dl L-Tyrosin enthielt.
Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, gezüchtet, 0,7 g
Phenol, 2,0 g Kaliumpyruvat und 2,0 g Ammoniumacetat
wurden zu 100 ml der Kulturbriihe zugegeben, und der
pH-Wert der Mischung wurde auf 8,0 mit Ammoniakwasser eingestellt. Das Gemisch wurde bei 37° C
bebrütet; jeweils 0,4 g Phenol wurden nach jeweils 2 Stunden lOmal nach der Inkubation der Mischung
zugegeben. 10 g Brenztraubensäure und 1,0 g Ammoniumacetat wurden nach 4 bzw. 8 Stunden nach Beginn
der Bebrütung der Mischung zugegeben, und die Reaktion wurde insgesamt 42 Stunden lang ausgeführt.
Es wurde festgestellt, daß das Reaktionsgemisch 5,2 g/dl L-Tyrosin enthielt.
100 ml der, wie oben beschrieben, hergestellten
Züchtungsbrühe wurden mit 4,7 g Phenol, 4,0 g Kaliumpyruvat und 5,0 g Ammoniumacetat gemischt, und der
pH-Wert der Mischung wurde auf 8,0 eingestellt. Die sich ergebende Mischung wurde 42 Stunden bei einer
Temperatur von 370C gehalten; das Reaktionsgemisch enthielt 1,8 g/dl L-Tyrosin.
Eine ähnliche Reaktion wurde wiederholt, wobei statt
2,0 g des anfänglich verwendeten Acetates 4,0 g des anfänglich verwendeten Ammoniumacetates und statt
Kaliumpyruvat Oxalessigsäure verwendet wurden, die Reaktion wurde durchgeführt, wobei wie im Falle von
Pyruvat die Substrate ergänzt wurden; die Reaktionsmischung enthielt 4,2 g/dl L-Tyrosin.
100 ml der Züchtungsbrühe wurden mit 4,7 g Phenol, 4,0 g Oxalessigsäure und 6,0 g Ammoniumacetat gemischt,
der pH-Wert der Mischung wurde mittels Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt, und die Reaktion
wurde 42 Stunden bei einer Temperatur von 37°C ausgeführt Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung
1,8 g/dl L-Tyrosin enthielt.
Aus den Ergebnissen der beiden obenbeschriebenen Reaktionsreihen ist ersichtlich, daß die Reaktion gemäß
der Erfindung durch die Substrate gehemmt werden kann.
100 ml Züchtungsbrühe von Citrobacter freundii ATCC 6750, die in gleicher Weise, wie in Beispiel 5
angegeben, hergestellt wurde, wurden mit 0,6 g Brenzcatechin, 2,0 g Natriumpyruvat, 2,0 g Ammoniumacetat,
0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, der
pH-Wert der Mischung wurde mittels Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt, und dann ließ man das
Reaktionssystem bei einer Temperatur von 17° C reaeieren.
Vier Stunden nach Beginn der Reaktion wurde das Brenzcatechin auf die ursprüngliche Menge ergänzt;
während 42 Stunden wurden 2,8 g Brenzcatechin verbraucht. Acht Stunden nach Beginn der Reaktion
wurden 1,0 g Natriumpyruvat und 1,0 g Ammoniumacetat und nach zwölf Stunden wurde 1,0 g Ammoniurruicetat
dem Reaktionssystem zugegeben. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 2,5 g/dl DOPA
enthielt.
100 ml Züchtungsbrühe von Citrobacter freundii ATCC 6750 wurden mit 3,0 g Natriumpyruvat, 4,0 g
Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, der pH-Wert der sich ergebenden Mischung
wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt, und das Reaktionssystem wurde 42 Stunden bei einer Temperatur
von 17°C gehalten. Es wurde festgestellt, daß die
Reaktionsmischung 0,4 g/dl DOPA enthielt.
Ein Kulturmedium wurde hergestellt, das 0,2 g/dl L-Tyrosin, 0,1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat,
0,05 g/dl Magnesiumsulfat, 0,7 g/dl Fumarsäure, 0,6 g/dl Glycerin, 0,5 g/dl Hefeextrakt und 0,01 g/dl Pyridoxin
enthielt, der pH-Wert des Mediums wurde mittels einer KOH-Lösung auf 7,5 eingestellt, und das Medium wurde
5 Minuten bei einer Temperatur von 1100C in einem
Autoklav sterilisiert. Erwinia herbicola ATCC 21433, vorher auf einer Nährstoffagar-Schräge bei 28°C 20
Stunden gezüchtet, wurde 60 ml des oben hergestellten Mediums eingeimpft und unter Schütteln 24 Stunden bei
einer Temperatur von 30° C gezüchtet.
100 ml der Züchtungsbrühe wurden zur Sammlung der Bakterienzellen zentrifugiert, die Zellen wurden den
nachstehenden 50 ml Lösungen (A), (B), (C) und (D) zugegeben, und die Lösungen wurden während eines
Zeitraumes von 20 Stunden bei einer Temperatur von 22° C gehalter.
Lösung (A) | 2,0 g/dl |
Ammoniumpyruvat | 1,0 g/dl |
Brenzcatechin | 2,0 g/dl |
Ammoniumacetat | 0,2 g/dl |
Na2SO3 | |
pH-Wert:8,0(mittels NH4OH) | |
Lösung (B) | 2,0 g/dl |
Ammoniumpyruvat | 1,0 g/dl |
Brenzcatechin | 2,0 g/dl |
Ammoniumacetat | 0,2 g/dl |
EDTA | |
pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NH4OH) | |
Lösung (C) | 2,0 g/dl |
Ammoniumpyruvat | 1,0 g/dl |
Brenzcatechin | 2,0g/dI |
Ammoniumacetat | 0,2 g/dl |
Na2SO3 | 0,2 g/dl |
EDTA | |
pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH4OH) | |
Lösung (D) | 2,0 g/dl |
Ammoniumpyruvat | 1,0 g/dl |
Brenzcatechin | 2,0 g/dl |
Ammoniumacetat | |
pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NH4OH) | |
Die Mengen an in den Lösungen produzierten DOPA waren, wie folgt:
Reaklionssystem
Lösung(A)
Lösung (B)
Lösung (C)
Lösung (D)
Lösung (B)
Lösung (C)
Lösung (D)
Menge an
produziertem
DOPA (g/dl)
produziertem
DOPA (g/dl)
1,2
0,8
1,4
0,7
0,8
1,4
0,7
Bakterienzellen von Erwinia herbicola ATCC 21433, erhalten aus 100 ml der Züchtungsbrühe, wurden einer
50 ml Lösung, die 2,0 g/dl Ammoniumacetat, 2,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Resorcin enthielt,
zugegeben; der pH-Wert des Gemisches wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt; man ließ die
Reaktion bei einer Temperatur von 17°C42 Stunden in
Gegenwart oder Abwesenheit von 0,2 g/dl NajSOs und
0,2 g/dl EDTA fortschreiten. In der Reaktionsmischung,
die Natriumsulfit und EDTA enthielt, wurde L-2,4-DihydroxyphE:nylalanin
in einer Menge von 1,2 g/dl und in der Reaktionsmischung, die kein Natriumsulfit enthielt,
in einer Menge von 0,4 g/dl produziert.
Beispiel 10
Bakterienzellen, erhalten aus 100 ml Züchtungsbrühc der in Tabelle 3 angegebenen Bakterien wurden zu
30-ml-Lösungen zugegeben, die 2,0 g/dl Oxalessigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glyoxylsäure, Milchsäure und
Maleinoxim, 1,0 g/dl Phenol und 2,0 g/dl Ammoniumacetat enthielten, die pH-Werte der Mischungen
wurden auf 8,0 eingestellt und jede Mischung wurde 20 Stunden bei einer Temperatur von 37°C gehalten. Die
Mengen an in den Reaktionsmischungen produzierten L-Ty,osin sind in der nachstehenden Tabelle III
angegeben.
Menge an | Tyrosin produziert aus (g/dl) | Glyoxyl | Milch | Malein |
Oxal | Malein- Fumar | säure | säure | oxim |
essigsäure | säure saure | |||
Erwinia herbicola, ATCC 21433 1,50 0,62 0,38 0,48 0,95 0,52
Citrobacter freundii, ATCC 6750 1,08 0,78 0,30 0,45 0,62 0,68
Proteus mirabilis, ATCC 15 290 0,88 0,80 0,30 0,50 0,55 0,70
Pseudomonas perlurida, ATCC 490 0,52 0,40 0,42 0,35 0,48 0,30
Salmonella gallinarum, ATCC 9148 0,82 0,88 0,52 0,32 0,71 0,77
Citrobacter freundii, ATCC 8090 1,02 0,70 0,28 0,45 0,82 0,60
Paracolobactrum coliforme, ATCC 11605 0,80 0,52 0,25 0,40 0,55 0,40
Xanthomonas campestris, ATCC 7381 0,66 0,21 0,15 0,32 0,35 0,11
Alcaligenes faecalis, ATCC 8315 0,31 0,20 0,31 0,21 0,21 0,11
Aerobacter aerogenes, ATCC 7256 0,42 0,20 0,45 0,48 0,20 0,15
Beispiel 11
100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433, hergestellt in gleicher Weise, wie in Beispiel 1
beschrieben, wurde zentrifugiert, die erhaltenen Bakterienzellen vurden den nachstehenden Lösungen (A)1(B)
und (C) zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 37°C gehalten.
Lösung (A) (Vergleichsversuch)
Oxalessigsäure 2,0 g/dl
Oxalessigsäure 2,0 g/dl
Ammoniumacetat 2,0 g/dl
pH-Wert: 8,0(eingesteht mittels NH4OH)
Lösung (B)
Oxalessigsäure 2,0 g/dl
Phenol 1,0 g/dl
Ammoniumacetat 2,0 g/dl
pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH4OH)
Lösung (C)
Natriumpyruvat 2,0 g/dl
Phenol 1,0 g/dl
pH-Wert:8,0 (eingestellt mittels NH4OH)
Die erhaltenen Reaktionsmischungen wurden hinsichtlich ihres Gehaltes an Brenztraubensäure und
L-Tyrosin analysiert Die Ergebnisse waren die folgenden:
Reaktionsmischung
Menge an
Brenztraubensäure L-Tyrosin
(g/dl) (g/dl)
Lösung (A)
Lösung (B)
Lösung (C)
Lösung (B)
Lösung (C)
1,1
0,3
0,5
0,3
0,5
Beispiel 12
0,9
1,3
Ein Enzym von Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 6
beschrieben, hergestellt; es wird im nachstehenden als Enzym (A) bezeichnet Eine Oxalacetatdecarboxylase
wurde aus den Zellen von Citrobacter freundii ATCC 6750 gemäß der Arbeitsweise, wie in D. Herbert,
Symposia Soc. Exp. Biol, Bd. 5, (1951) Seite 52
beschrieben, hergestellt; sie werden im folgenden als Enzym (B) bezeichnet Aus den Zellen von Micrococcus
lysodeikticus wurde ebenfalls in der gleichen Weise wie im Falle von Citrobacter freundii eine Oxalacetatdecarboxylase
hergestellt, die als Enzym (C) bezeichnet wird.
50 mg Enzym (A) (als Protein) und 50 g Enzym (B) oder 50 mg Enzym (A) und 50 mg Enzym (C) wurden zu
100 ml wäßrigen Lösungen zugegeben, die 2,0 g/dl Oxalessigsäure, l,0g/di Phenol, 1,0 g/d! Ammoniumacetat,
2,0 g/dl Ammoniumsulfat und 2 mg/dl Pyridoxal-
phosphat enthielt und einen pH-Wert von 8,0 hatte; die
Gemische wurden 20 Stunden bei einer Temperatur von 37°C gehalten.
Die Reaktionsgemische der Enzyme (A) und (B) enthielten 1,2 g/dl L-Tyrosin und die der Enzyme (A)
und (C) enthielten 1,4-g/dl L-Tyrosin.
Beispiel 13
Erwinia herbicola ATCC 21433 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, gezüchtet, 100 ml
der Züchtungsbrühe wurden mit 0,6 g Brenzcatechin, 2,0 g Milchsäure, 2,0 g Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumsulfit
und 0,2 g EDTA gemischt, der pH-Wert der Mischung wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt
und man ließ die Reaktion bei einer Temperatur von 17°C einsetzen. Nach Beginn der Reaktion wurde
nach jeweils vier Stunden Brenzcatechin in dem Reaktionssystem ergänzt, um seine Konzentration auf
0,6 g/dl zu bringen, und die Bebrütung wurde 42 Stunden lang ausgeführt.
Ähnliche Bebrütungen wurden wiederholt, wobei Brenzcatechin ergänzt wurde, um seine Konzentration
auf 0,3 g/dl, 1,0 g/dl und 1,5 g/dl zu bringen. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Brenzcatechinkonzentration nach
Ergänzung
Ergänzung
(g/dl)
Menge an verbrauchtem Brenzcatechin
(g/dl)
Menge an
produziertem
DOPA
(g/dl)
2,5
3,2
3,6
2,3
3,2
3,6
2,3
1,25
1,80
2.15
1,05
1,80
2.15
1,05
100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433 wurden mit 3,0 g Milchsäure, 4,0 g Ammoniumacetat,
0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, die sich ergebende Mischung wurde mit jeweils 1,0 g, 1,5 g,
2,0 g und 2,5 g Brenzcatechin versetzt; bei einem pH-Wert von 8,0 ließ man die Gemische während eines
Zeitraumes von 42 Stunden bei einer Temperatur von 17°C reagieren. Die Mengen an in den Reaktionsmischungen
produziertem DOPA waren, wie folgt:
Menge an zugegebenem
Brenzcatechin (g/dl)
Brenzcatechin (g/dl)
Menge an produziertem
DOPA (g/dl)
DOPA (g/dl)
0,84
0,65
0,34
0,21
0,65
0,34
0,21
Beispiel 14
Bakterienzellen von Erwinia herbicola 21433, gezüchtet wie im Beispiel 9 und aus 2 Liter Züchtungsbrühe
isoliert, wurden zu einer 1-Liter-Lösung zugegeben, die
4,0 g/dl Brenzcatechin, 3,0 g/dl Brenztraubensäure, 2,2 g/dl Borsäure und 2,0 g/dl Ammoniumphosphat
enthielt und deren pH-Wert mittels Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt wurde, und die Mischung wurde bei
15° C 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch enthielt 2,8 g/dl DOPA. Die Reaktionsmischung wurde
in gleicher Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt und ergab 13 g reines kristallines DOPA.
Zu Vergleichszwecken wurden 2,2 g/dl Borsäure nicht der vorgenannten Züchtungsbrühe zugesetzt und
die Reaktion auf die gleiche Weise ausgeführt.
Die sich ergebende Reaktionsmischung enthielt nur 0,6 g/dl DOPA.
Beispiel 15
Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde auf einem Medium, wie im Beispiel 9 beschrieben, unter Schütteln
bei einer Temperatur von 27°C 24 Stunden gezüchtet. Die aus 100 ml Züchtungsbrühe isolierten Bakterienzellen
wurden zu 50 ml der Lösungen (I) bis (VIl) zugegeben, deren Zusammensetzungen nachstehend
angegeben sind; man ließ die Mischungen bei einer Temperatur von 20°C 20 Stunden reagieren.
Lösung (1) | 4OH) | 4,0 g/dl |
Brenzcatechin | 3,6 g/dl | |
jo Natriumpyruvat | 4.0 g/dl | |
Ammoniumacetat | 2,2 g/dl | |
Borsäure | 0,2 g/dl | |
Na2SOi | 0,3 g/dl | |
EDTA | ||
pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NH | 4OH) | |
Lösung(ll) | 4,0 g/dl | |
Brenzcatechin | 3,6 g/dl | |
Natriumpyruvat | 4,0 g/dl | |
κι Ammontumacetat | 0,2 g/dl | |
Na2SOi | 0,3 g/dl | |
EDTA | ||
pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NH | 4OH) | |
j-, Lösung (III) | 1,0 g/dl | |
Brenzcatechin | 3,6 g/dl | |
Natriumpyruvat | 4,0 g/dl | |
Ammoniumacetat | 0,2 g/dl | |
Na2SO3 | 0,3 g/dl | |
in EDTA | ||
pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NH | ||
Lösung (IV) | ||
Brenzcatechin: | ||
ι -, (viermal nach jeweils | ||
4 Stunden nach Beginn der | 4OH) | |
Inkubation wurden jeweils | ||
0,5 g zugegeben) | 3,6 g/dl | |
Brenztraubensäure | 4,0 g/dl | |
-,Ii Ammoniumacetat | 0,2 g/dl | |
Na2SO3 | 0,3 g/dl | |
EDTA | 4OH) | |
pH-Wert: 8,0(eingestellt mittels NH | ||
,-, Lösung (V) | 4,0 g/dl | |
Brenzcatechin | 3,6 g/dl | |
Brenztraubensäure | 4,0 g/dl | |
Ammoniumacetat | 2,2 g/dl | |
Borsäure | ||
Wi pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH | ||
Lösung (VI) | 4,0 g/dl | |
Brenzcatechin | 3,6 g/di | |
Brenztraubensäure | 4,0 g/dl | |
h-j Ammoniumacetat | 2,2 g/dl | |
Borsäure | 0,2 g/dl | |
Na2SO3 | ||
pH-Wert:8,0(eingestellt mittels Essigsäure)
15 16
Lösung (VII) Borsäure 2,2 g/dl
Brenzcatechin 4,0 g/dl EDTA 0,3 g/dl
Brenztraubensäure 3,6 g/dl pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH4OH)
Ammoniumacatat 4,0 g/dl
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.
Tabelle IV
Tabelle IV
Reaktionsmischung | Menge an | Beispiel 16 |
produziertem | ||
DOPA (g/dl) | ||
Lösung (I) | 2,52 | |
Lösung (II) | 0,23 | |
Lösung (III) | 1,32 | |
Lösung (IV) | 1,80 | |
Lösung (V) | 1,60 | |
Lösung (VI) | 1,86 | |
Lösung (VII) | 1,68 | |
Brenzcatechin und Borsäure wurden in Wasser gelöst, 100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC
der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde mit 21433 zugegeben; dann wurden 3 g Natriumpyruvat, 4 j
Ammoniakwasser auf einen Wert von 8,0 eingestellt, r, Ammoniumacett und 300 ml Wasser hinzugefügt unc
und der sich bildende Ammonium-Brenzcatechin-Bor- der pH-Wert der sich ergebenden Mischung wurde mi
säure-KompIex-Niederschlag wurde durch Zentrifugie- Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt. Die Mischunj
ren isoliert Der Niederschlag, äquivalent einer Menge wurde 40 Stunden unter Schütteln bei 20° C bebrütet; di<
von 4,0 g Brenzcatechin und 2,2 g Borsäure, wurde zu Reaktionsmischung enthielt 1,65 g/dl DOPA.
Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Hydroxyphenylalaninen der allgemeinen Formel
CH2-CH-COOH
NH,
NH,
in der Ri und R2 Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe
bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung aus:
(a) 0,1 bis 20% Gew./Vol. einer Phenolverbindung der allgemeinen Formel
(a) 0,1 bis 20% Gew./Vol. einer Phenolverbindung der allgemeinen Formel
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9265870A JPS4834237B1 (de) | 1970-10-21 | 1970-10-21 | |
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JP12871370A JPS4814955B1 (de) | 1970-12-30 | 1970-12-30 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2152548A1 DE2152548A1 (de) | 1972-04-27 |
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1971
- 1971-10-21 DE DE19712152548 patent/DE2152548C3/de not_active Expired
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- 1971-10-21 GB GB4906771A patent/GB1321201A/en not_active Expired
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---|---|
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---|---|---|---|
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