DE2152548A1 - Verfahren zur Erzeugung von phenolischen Aminosaeuren - Google Patents

Description

DR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN DR. M. KÖHLER DIPL-ING. C. GERNHARDT

MDNCHEN

TELEFON: 555476 TELEGRAMME: KARPATENT

HAMBURG

8000 MÖNCHEN 15,

NUSSBAUMSTRASSE 10

21. Oktober 1971

Y/. 4o 776/71 7/RS

Ajinomoto Co., Inc.
Tokyo (Japan)

Verfahren zur Erzeugung von phenolischen Aminosäuren

Die Erfindung besieht sich auf die Erzeugung von phenoliüchen Aminosäuren durch Erizymwirkung.

Aufgabe der Erfindung ist die Erzeugimg von pheno-Iisehen Aminosäuren nach einem biochemischen Verfahren bei niedrigen Kos bon au» laicht zur Verfugung stehenden Kühi.-riterialieri.lJin woitorer Zv/eei: der Erfindung iet die Erzeugung von ^h en ο J aminosäure η durch einfacliero und bequoiaere BeL^diuh^eu, al;5 dico bei bekannten Verfahren der FaJ.! j ivl.

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SAD ORsQiNAL

3,4-Dihydroxyphenyl-L-alanin (nachstehend als DOPA bezeichnet) wird zur Behandlung der Parkinson'sehen Krankheit verwendet, L-Tyrosin ist eine der wesentlichen Aminosäuren und 2,4-Dihydroxyphenyl-L-alanin ist als Nährmittel und Lebensmittelzusatz brauchbar.

DOPA kann aus Zwischenprodukten, v/ie Piperonylaldehyd, Vanillin, Tyrosin und Brenzcatechin synthetisch hergestellt werden, oder es kann durch Extraktion natürlicher Saaten erhalten v/erden. DOPA kann biochemisch aus Brenz- * catechin und L-Tyrosin mittels ß-Tyrosinase, die aus einem Mikroorganismus, der zu der Gattung Escherichia gehört, hergestellt werden. L-Tyrosin wird in technischem Umfang nur durch Extraktion von natürlichen Substanzen erzeugt. Es ist niemals bekannt geworden, daß 2,4-Dihydroxyphonyl-L-alanin biochemisch synthetisiert werden kann *

Es ist gefunden worden, daß, wenn eine I'henolverbindung der allgemeinen P or in el

in der R-, und R₂ Wasserstoff oder Hydroxylgruppen nind, mit Ammoniak und einer Säur5 ,ausgewählt aus der Grui.po, bestehend aus Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxales3igsäure, Apfelsäure, Fumarsäure-, I.Ialeinoäiireoxim, GIy-

oder. Estern oxylsäuro, Milchsäure oder Salaen/davon in. Gc^em.'art /on ß-Tyrosinase umgesetzt wird, phenolische Aminonäuron der allgemeinen Formel

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BAD

R2

O B.-V V-CH₂ -CHCOOH

m₂

in der R-, und Rp ^die gleiche Bedeutung, wie sie oben angegeben wurde, haben, in sehr hoher Ausbeute erzeugt werden kann.

Es ist bekannt, daß das Enzym ß-Tyrosinase die Zersetzung von L-Tyrosin zu Phenol, Brenztraubensäure und Ammoniak katalysiert. Wie angegeben, erzeugt ß-Tyrosinase auch DOPA aus Brenzcatechin und L-Tyrosin.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine geeignete Quelle von ß-Tyrosinase mit einer wäßrigen Lösung gemischt, die (a) eine Phenolverbindung, (b) Ammoniumionen und (c) Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxalessigsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Maleins&ureoxim, Glyoxylsäure, Milchsäure und Salze oder Derivate davon enthält, und die Mischung wird bei einem pH-Wert von 4 bis 11 stehengelassen, bis eine phenolische Aminosäure erzeugt int.

Die ß-Tyrosinasequelle kann aus einer Brühe bestehen, in der ein UikrοOrganismus gezüchtet ist, oder einem zellfreien Piltrat davon, einer wäßrigen Suspension von gemahlenen Zellen, einem Filtrat davon oder einer reinen Enzymbereitung bestehen.

Die Mikroorganismen, die fähig sind, das Enzym zu erzeugen, sind weit verbreitet und gehören zu den Gattungen Eseherichia, Aerobacter, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Protcua,Oitrobacter, Paracliolobactrum, Salmonella und Alcalißenes. Typische Arten sind Escherichia coli, Erwinia herbicola, Aerobacter aerogenes, Pseudoinonao

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S ORIGINAL

perlurida, Xanthomonas campestris, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Paracolobactruin coliforme, Salmonella gallinarum und Alcaligenes faecalis.

Die zum Züchten der Mikroorganismen angewendeten Medien können aus üblichen Medien bestehen, welche Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff und die üblichen geringeren Mengen an Nährstoffen enthalten und auch eine geeignete Menge von Tyrosin einschließen. Die Mikroorganismen sind mit Erfolg auf Medien gezüchtet worden, die Kohlenhydrate, wie Glukose, Fructose, Sucrose, Mannose, Maltose, Mannit, Xylose, Galaktose, Stärkehydrolysat und Melassen,enthalten. Organische Säuren, wie Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, (^-Ketoglutarsäure, Gluconsäure und Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol, Fettsäuren und Kohlenwasserstoffe sind auch als Hauptkohlenstoffquellen oder ergänzende Kohlenstoffquellen für ausgewählte Mikroorganismen geeignet. Die Konzentration der Kohlenstoffquellen in dem Medium liegt gewöhnlich zwischen o,l und lo$ Gew./ "Vol., bezogen auf Glukoseäquivalente.Stickstoff kann durch Ammoniumsalze von anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Essigsäure und Kohlensäure, durch Harnstoff und durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder im gasförmigen Zustand geliefert werden. Andere organische Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und HZ-Amin werden als zusätzliche oder ergänzende Stickstoffquellen angewendet.

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Das Medium soll auch anorganische Salze und geringere Mengen an organischen Nährstoffen enthalten, welche das Wachstum der Mikroorganismen fördern. Die anorganischen Salze können. Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Bisen(II)-sulfat, Hangansulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat einschließen. Bekannte organische wachstumsfördernde Substanzen umfassen Aminosäuren allgemein, Biotin, Vitamine, organische Säuren, Fettsäuren und Protein und Eiweiß enthaltende Substanzen. Sie können durch Substanzen zugeführt werden, welche das aktive Mittel unter den Züchtungsbedingungen ergeben, wie z.B. Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit,Magermilch, Chlorellaextrakt und Sojabohnenproteinhydrolysat.

Tyrosin soll zu dem Medium in- einer Menge von mehr als o,ol?o und vorzugsweise von o,o5 bis o,5f° in Teilen/ Vol. zugegeben werden. Das Tyrosin kann sich in der Form von organischen Nährstoffen, wie einer Aminosäuremischung, Polypepton oder Sojabohnenestrakt befinden.

Aminosäuren, wie Methionin, Glycin und Alanin, Vitamine, wie Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxalphosphat werden auch dem Züchtungsmedium zugegeben, um die Enzymaktivität zu verbessern. Die Konzentration der zugesetzten Aminosäuren liegt gewöhnlich zwischen o,ol und 57° Gew./Vol. als freie Aminosäuren, und die Vitamine sind in einor Menge von mehr als o,5 mg/dl wirksam.

Die Gärung oder Fermentiorung wird unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 4o°C ausgeführt. Vorzugsweise wire der pH-'.7ert des Züchtungsmediums auf 5,5 bis 8,5 während

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der Züchtung eingestellt. Die Züchtung wird allgemein Io Ms 72 Stunden ausgeführt.

Die Brühe kann als Enzymquelle, wie sie ist, ohne Entfernung der "bakteriellen Zellen benutzt v/erden. Ein zellfreies Piltrat der Züchtungsbrühe und eine Suspension von zerkleinerten bakteriellen Zellen, die durch Zerreiben, Autolyse oder Ultraschallschwingungen bereitet ist, werden auch als Enzymquelle gemäß der Erfindung verwendet. Rohes Enzym und reines Enzym, das durch Zentrifugieren, Aussalzen und Lösungsmittelfällung gewonnen ist, können auch zur Anwendung gelangen.

Die phenolischen Aminosäuren können dadurch hergestellt werden, daß man Phenolverbindungen, Aramoniumionen und Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxalessigsäure, Apfelsäure, Maleinsäurooxim, Glyoxylsäure, Milchsäure, Salz der Säuren oder Derivate davon dem Medium während der Züchtung zusetzt.

Die Phenolverbindungen, welche als Ausgangsmaterial bei dem Verfahren gemäß der Erfindung angewendet werden " können, schließen Brenzcatechin, Resorcin und Phenol ein.

Die Säuren, die als Quelle des Analinanteils der phenolischen Aminosäure dienen, sind Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxalessigsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure oder Milchsäure. Die Ammoniumionen können in einer Menge von o,l bis Io Gewichtsteilen zugegeben werden* Die Brenztraubensäure, Oxalessigsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure und Milchsäure können in Form der freien Säure des Ammonium-, Kafcriuia-, Kalium- oder Calciuraaalzes sein, es können jedoch auch die Ester, wie der Methy1-

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BAD ORIGINAL·

ester oder Äthylester, und andere Derivate zur Anwendung gelangen. Das Ammoniumsalz der betreffenden Säure wird am meisten bevorzugt. Die Menge der Säure, die in dem Reaktionssystem vorhanden ist, beträgt o,l bis 2o$ Gew./ Vol., bezogen auf die freie Säure.

Die Reaktion wird vorzugsweise bei einem pH-Y/ert von 4 bis 11 und einer Temperatur von Io bis 5o°C ausgeführt. Der pH-Wert des Reaktionssystems wird durch Zusatz von Calciumcarbonat, Ammoniak, Ätzalkali oder Phosphatpufferlösung aufrechterhalten.

Wenn Brenzcatechin und Resorcin als Phenolverbindung zur Erzeugung von DOPA und 2,4-Dihydroxyphenyl-L-alanin angewendet werden können,kann das Endprodukt stark erhöht werden, indem man ein Reduktionsmittel und/oder ein komplex- oder chelatbildendes Mittel dem Reaktionssystem zusetzt. Beispiele von geeigneten Reduktionsmitteln sind schwofelige Säure, Natriumsulfit, Kaliumsulfit, Ammoniumsulfit, Thioschwefelsäure, Kaliumthiosulfat, Natriumthiοsulfat, Ammoniumthiοsulfat, Cystein, ß-Mercaptoäthanol und Ascorbinsäure.

Beispiele von brauchbaren Komplexbildungsmitteln sind Äthylendiaraintetraessigsäure bzw. deren Natriumsalz (EDTA), Äthylendiamin, N-Oxyäthylendiamin, Asparginsäure, N-Dioxyäthylglycin, Nitrilotriacetat, Citronensäure und Thioglycolsäure. Das Reduktionsmittel und die Komplexoder Chelatbildungsmittel werden im allgemeinen in einer Menge von o,ol bis 1$ Gew./Vol. angewendet.

Y/enn Brenzcatechin als Phenolverbindung zur Herijteilung von DOPA angewendet wird, kann die Ausbeute vor:· DOPA stark erhöht worden, indem man Borsäure zu dem Reak-

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tionssystem zusetzt. Die Borsäure kann sich in der Form des Alkalisalzes oder Erdalkalisalzes "befinden und kann in äquimolarer Menge bis zu einem kleinen molaren Überschuß je Mol Brenzcatechin angewendet werden. Das Reduktionsmittel und/oder das Komplex- oder Ohelatbildungs-" mittel kann zusammen mit der Borsäure in dem Reaktionssystem vorhanden sein.

Die in der Reaktionsmischung hergestellten phenolischen Aminosäuren können nach üblichen Verfahren gewonnen werden, z.B. kann DOPA nach dem in Journal of Biological Chemistry, Bd. 239, Seite 291ο (1964) beschriebenen Verfahren gewonnen werden.

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Beispiel 1

Ein Kulturmedium, das 0,2 g/dl L-Tyrosin, 0,1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 g/dl Magnesiumsulfat, 0,7 g/dl Fumarsäure, 0,2 g/dl Glucose, 1,0 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Fleischextrakt und 0,01 g/dl Pyridoxin enthielt, v/urde hergestellt, derpH-Wert des Mediums mit einer KOH-Lösung auf 8,0 eingestellt und 5 Minuten lang "bei einer Temperatur von 110⁰C sterilisiert. 60 ml Ansätze des Mediums wurden mit Erwinia herbicola ATGC 21433, die vorher während einer Zeitdauer von 20 Stunden bei 28 C auf einer Peptonagar-Schräge gezüchtet worden war, geimpft und 24 Stunden lang unter Schütteln "bei 31⁰C gezüchtet.

Zwei Liter der Züchtungsbrühe wurden zur Sammlung der Bakterienzellen zentrifugiert, die Zellen wurden zu einer 2 1 Lösung, die 1,0 g/dl Aminoniumpyruvat, 10 g/dl Phenol und 1,0 g/dl Ammoniumacetat enthielt, zugegeben, und die Mischung wurde bei einem pH-\7ert von 8,0 bei 37°C 20 Stunden lang stehengelassen. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmisehung 0,8 g/dl L-Tyrosin enthielt.

100 γ; des- Kristalls wurden auf ein Filterpapier gestreut, mit einem Lösungosystem aus Butanol/Essigsäuro/V/asscr in einem Verhältnis von 4:2:1 entwickelt, und der erhaltene einzelne Fleck wurde mittels der liinhydrinreakbion und der Millon'sehen Reaktion als Tyrosin identifiziert. Durch l'.ieönen der optischen Drehung wurde bestfitigt, daß sich das Tyrosin zu 100$ in der L-Po2'in befand.

Eg v/urde unter Verwendung von 2,0 g/dl Oxalessigüäure und 2,0 g/dl Aiumord umace tat anstelle von 1,0 g/dl

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- Io -

Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Ammoniumacetat eine ähnliche Reaktion, wie vorstehend "beschrieben, ausgeführt, und es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 0»7 g/äl L-Tyrosin enthielt.

Beispiel 2

Erwinia herbicola ATCC 21433 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, Bakterienzellen, erhalten aus 4 liter der Brühe, wurden einer 21 Lösung, die 1,0 g/dl Brenztraubensäure, 1,0 g/dl Brenzcatechin, 1,0 g/dl Ammoniunacetat und 0,2 g/dl Kaliumsulfit enthielt und einen pH-Wert von 8,0 hatte,zugegeben, und die Mischung wurde während 24 Stunden bei 22⁰C umgesetzt. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 0,7 g/dl L-Tyrosin enthielt.

Der pH-Wert der 21 Reaktionsmischung wurde mit 3n-IIÖ1 auf einen Wert von 3,5 eingestellt, die Mischung wurde 5 Minuten lang auf 11O⁰C erhitzt und die Zellen vmrden durch Zentrifugierung entfernt. Der überstehende Teil wurde auf 300 ml eingeengt, der pH-Wert der konzentrierten Lösung wurde auf 1,0 eingestellt, und die Lösung wurde durch eine mit aktiver Holzkohle gefüllte Säule geleitet. 0,1 η-Salzsäure wurde in die Säule eingeführt, um Aminosäurenebenprodukte zu eluieren, und DOPA wurde mit verdünntem, 0,2$ Natriumsulfit enthaltenden Ammoniakwasser eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, der DOPA-Hiederschlag, der sich bildete, wurde durch Zugabe von Salzsäure aufgelöst und konzentriert. Der erhaltene DOPA-Hiederschlag wurde dreimal mit Wasser gewaschen, und es wurden 6g DOPA erhalten. Es wurde festgestellt, daß sich da.s DOPA gänzlich in der L-Form befand.

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BAD

Eine ähnliche Reaktion wurde unter Verwendung von 2,0 g/dl OxaH.essigsäure und 2,0 g/dl Ammoniumacetat statt 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Aminoniumacetat wiederholt, und die Reaktionsnisehung enthielt, v/ie festgestellt wurde, 0,6 g/dl DOPA.

Beispiel 3

Bakterienzellen von Erwinia herbicola ATCC 21433, erhalten aus 41 der Züchtungsbrühe, wurden einer 2 1 Lö~ siL._b ^u^ügeben, die 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat, 1,0 g/dl Resorcin, 1,0 g/dl Ammoniumacetat und 0,2 g/dl Natriumsulfit enthielt und einen pH-Wert von 8,0 hatte. Die Mischung wurde bei 22⁰C 24 Stunden lang umgesetzt. Die Reaktionsmischung enthielt 0,4 g/dl 2,4-Dihydroxyphenyl-L-alanin.

Durch Zugabe von Trichloressigsäure wurde Protein aus der Reaktionsmisclmng entfernt, die sich ergebende Lösung wurde mit dem Anionena,ustauschharz "Dowex-50"und dann mit aktiver Holzkohle behandelt; es wurde rohes, kristallines 2,4-Dihydroxyphenylalanin erhalten. Das rohe Kristall wurde mit wäßrigem Äthanol gewaschen und ergab 5,3 g reines Kristall. Durch Element ar ana.lyse und HMR-Spektralanalyse wurde festgestellt, daß das Kristall 2,4-Dihydroxyphenylalanin war. Durch optische Drehung wurde bestätigt, daß es sich in der L-Form befand.

Eine ähnliche Reaktion wurde durchgeführt, wobei an Stelle von 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Ammoniumacetat 2,0 g/dl Oxalessigsäure und 2,0 g/dl Ammoniumacetat verwendet wurden; es wurde festgestellt, daß

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die Reaktionsmischung 0,4- g/dl 2,4-Dihydroxyphenyl-L-alanin enthielt.

Beispiel 4

Aus 100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433 erhaltene Bakterien-zellen, die v/i8 in Beispiel 1 gezüchtet worden .war, wurden zu den folgenden Lösungen (I), (II), (III) und (IV) hinzugefügt und "bei P einer Temperatur von 37°C 24 Stunden lang umgesetzt.

Lösung (I)

Brenztraubensäure 1,0 g/dl

(1IH₄)₂SO₄ 1,5 g/dl

Phenol 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 0,5 g/dl

pH-Wert: .8,0 (eingestellt mittels ML OH)

Lösung (II)

Brenztraubensäure 1,0 g/dl

Phenol ■ 1,0 g/dl

pH-Wert:.8,0 (eingestellt mittels ITILOH)

Lösung (III)

Kaliumpyruvat 1,0 g/dl

Phenol 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels BH-OH)

Lösung (IV)

Kaliumpyruvat 1,0 g/dl

Phenol 1,0 g/dl

pH-Y/ert (eingestellt mittels KOH)

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— 1 ¹^

Es wurde festgestellt, daß !-Tyrosin in einer Menge von 0,7 g/dl in der Lösung (I), in einer Lie ng e von 0,9 g/dl in der lösung (II) und in einer Lienge von 0}9 g/dl in der lösung (III) produziert worden war; in der Lösung (IV) jedoch wurde auf Grund des Fehlens Ammoniumionen kein Tyrosin festgestellt.

Beispiel 5

Die in Tabelle 1 angegebenen Bakterien wurden in 60 ml Ansätzen eines Kulturmediums gezüchtet, das 0,2 g/dl Tyrosin, 0,1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 g/dl Llagnesiunsulfat, O₁G g/dl Glycerin, 0,5 g/dl 23ernsteinsilura, 2,0 g/dl ilofeextrakt, 0,5 g/dl Fleischextrakt lind 0,01 g/dl Pyridoxin enthielt; die Zucht ring wurde während 24 Stunden bei 31⁰O und einem pH-wert von 7,5 unter Schütteln ausgeführt.

Jeweils 100 ml Züchluingobrilhe wurden zur Isolierung der Bakterianzellen zentrifugiert; die erhaltenen Zellen wurden zu den nachstehend angegebenen 50 ml Lösungen (I), (II) und (III) zugegeben, und das Eeaktionssystem der Lösung (l) wurde 20 stunden lang bei 37⁰C! gehalten. Die Lösungen (H) und (III) wurden 20 stunden lang bei einer Temperatur von 20⁰O gehalten. Die i.Iengen an produzierton phonolischen Aminosäuren sind in Tabelle I aufgeführt.

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BAD ORIQINAt

-U-

Lösung (I)

Kaliumpyruvat 2,0 g/dl

Phenol 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels MLOH)

Lösung (II)	2,0 g/dl
Kaliumpyruvat	1,0 g/dl
Brenzcatechin	2,0 g/dl
Ammoniumac e tat	0,2 g/dl
ITa2SO5	HH4OH
pH-Wert: 0,0 (eingestellt mittels
Lösung (111)	2,0 g/dl
Kai i urapy r uv at	1,0 g/dl
Hesorein	2.0 ß/dl
Ammoniumacetat

JO- 0,2 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels HiLOH)

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Tabelle I

Verwendete Bakterien

Erwinia herbicola ATCC 21433

Cxtrobacter freundii ATCC 6750

Eseherichia coli ATCC 3655

Cxtrobacter freundii ATCC 8090

Proteus morganii IFO 3848 . ;

Proteus rairabilis ATCC 15290

Pseudomonas perlurida ATCC 490

Aerobacter aerogenes ATCC 7256

Salmor.olla gallinaruin ATCC 9148

Paracolobactrum coliforme ATCC 11605

Xanthomonas campestris ATCC 7381

Alcaligenes faecalis ATCC 8315

Menge an produzierter phenolisoher Aminosäure L-Tyrosin DOPA 2,4-DiOH-Phe (g/dl) (g/dl) (g/dl)

'·'. 1.2	.'·.' 0.8	0.7
0.9	0.6	0.5
0.8	.0.5	6.4
0.5	Ö.3	0.4
0.5	0.3	0.4
0.4	0.3	0.3
0,3	0.2	0.2
0.3	0.2	0.2
0.5	0,4'	0.2
0.4	0.3	0.2
0.4	0.2	0.1
0.3	0.1	0.1

Ähnliche Reaktionen wurden wiederholt, wobei statt Kaliumpyrurat ^^{η den} Lösungen (i) "bis (III) 2,0 g/dl Oxalesnigöäure verwendet v/urde. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

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Tabelle II

Menge an produziertem phenolischer Aminosäure

Verwendete Bakterien L-Tyrosin DOPA 2,4-DiOH-Phe

(g/dl) (g/dl) (g/dl)

Erwinia herbicola ATCC 2.1433

Citrobacter freundii ATCC 6750

Proteus mirabilis ATCC 15290

Pseudomonas perlurida ATCC 490

Aerobacter aerogenes ATCC 7256

Salmonella galliriarum ATCC 9148

Citrobacter freundii ATCC 8090

Paracolobactrum coliforme ATCC 11605

Xanthomas campestris ATCC 7381

Alcaligenes faecalis ATCC 8315 1.0
0.8

0.8
0.5
0.5
0.5
0.4
0.4
0.3
0.3

0.8 0.6

0.5 0.5 0.5 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2

0.6 0.5

0.5 0.5 0.5 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1

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Citrobacter froundii ATGC 6750 v/urde in gleicher weise wie in Beispiel 5 gezüchtet; 101 der Züchtungsbrühe wurden zur Sammlung der Bakterienzellen zentrifugiert, und die erhaltenen Zellen wurden durch Ultraschallwellen von 20 kHz 20 Minuten lang in einer 0,05 m Phosphatpufferlösung aufgebrochen. Die sich ergebende Lösung wurde zur Entfernung der Bakterienzellen zentrifugiert, das Enzym des überstehenden Seiles wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat ausgefällt und durch Behandlung mit Protamin,· DBAE-Cellulose und Cephadex~150 raffiniert . 50 mg (als Protein) des erhaltenen Enzymes wurden einer 100 ml Lösung, die ,1,0 g/dl Ammoniumacetat, 2,0 g/dl Ammoniumsulfat, 2,0 g/dl ITatriumpyruvat, 1,5 g/dl Phenol und 2 mg/dl Pyridoxalphosphat enthielt und einen pH-V/ert von 8,0 hatte^ zugegeben, und die Mischung wurde 20 Stunden lang bei einer Temperatur von 37⁰C gehalten. Es wurde festgestellt, daß die Mischung 1,6 g/dl L-Tyrosin enthielt.

Beispiel 7

Citrobaoter freundii Al¹CO 6750 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, gezüchtet, 0,7 g Phenol, 2,0g Kaliumpyruvat und 2,0g Ammoniumacetat wurden zu 100 ml der Kulturbrühe zugegeben, und der pH-V/ert der Mischung wurde auf 8,0 mit Ainmoniak-.vasser eingestellt. Die Mischung wurde bei 37⁰O bebrütet; jeweils 0,4 g Phenol wurden nach jeweils 2 Stunden lOnal nach der Inkubation der Mischung zugegeben. 10 g Brenztraubensäure und 1,0 g Aramoniunaoetat wurden nach 4 bzw. 8 Stunden nach Beginn

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der Bebrütung der Mischung zugegeben, und die Reaktion wurde insgesamt 42 Stunden lang ausgeführt. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 5,2 g/dl L-Tyrosin enthielt.

100 ml der, wie oben beschrieben, hergstellten Züchtungsbrühe v/urden mit 4,7 g Phenol, 4,0 g Kaliumpyruvat und 5,0 g Ammoniumacetat gemischt, und der pH-Wert der Mischung wurde auf 8,0 eingestellt. Die sich ergebende Mischung wurde 42 Stunden bei einer Temperatur von 37 C gehalten; die Reaktionsmischung enthielt, wie gefunden wurde, 1,8 g/dl L-Tyrosin.

Eine ähnliche Reaktion wurde wiederholt, wobei statt 2,0 g des anfänglich verY/endeten Acetates 4,0g des anfänglich verwendeten Ammoniumacetates und statt Kaliumpyruvat Oxalessigsäure verwendet wurden, die Reaktion wurde durchgeführt, wobei wie im Falle von Pyruvat die Substrate ergänzt wurden; die Reaktionsmischung enthielt 4,2 g/dl !-Tyrosin.

100 ml der Züchtungsbrühe wurden mit 4,7 g Phenol, 4,0 g Oxalessigsäure und 6,0 g Ammoniumacetat gemischt, der pH-Wert der Mischung wurde mittels Ammoniakwasser auf " 8,0 eingestellt, und die Reaktion wurde 42 Stunden lang bei einer Temperatur von 37⁰C ausgeführt. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 1,8 g/dl !-Tyrosin enthielt.

Aus den Ergebnissen der beiden oben beschriebenen Reaktionsreihen ist ersichtlich, daß die Reaktion gemäß der Erfindung durch die Substrate gehemmt werden kann.

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Beispiel 8

100 ml Züchtungsbrühe von Citrobacter freundii ATCC 6750, die in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 angegeben, hergestellt wurde, wurden mit 0,6 g Brenzcatechin, 2,0 g Natriumpyruvat, 2,0 g Ammoniumacetat, 0,2 g ITatriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, der pH-Wert der Mischung wurde mittels Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt, und dann ließ man das, Reaktionssystem bei einer Temperatur von 17°C reagieren.

Vier Stunden nach Beginn der Reaktion wurde das Brenzcatechin auf die ursprüngliche Menge ergänzt; während 42 Stunden wurden 2,8 g Brenzcatechin verbraucht. Acht Stunden nach Beginn der Reaktion wurden 1,0 g Natriumpyruvat und 1,0 g Ammoniumacetat und nach zwölf Stunden wurde..1,0 g Ammoniunacetat dem Reaktionssystem zugebenen. Es wurde festgestellt, daß die Reaktions-'mischung 2,5 g/dl DOPA enthielt.

100 ml Züchtungsbrühe von Citrobacter freundii ATCC 6750 wurden mit 3,0 g Natriumpyruvat, 4,0 g Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, der pH-Wert der sich ergebenden Mischung wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt, und das Reaktionsystem wurde 42 Stunden lang bei einer Temperatur von 17°C gehalten. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 0,4 g/dl DOPA enthielt.

Beispiel 9

Ein Kulturmedium wurde hergestellt, das 0,2 g/dl L-Tyroein, 0,1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 g/dl

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Magnesiumsulfat, 0,7 g/dl Fumarsäure, 0,6 g/dl Glycerin, 0,5 g/dl Hefeextrakt und 0,01 g/dl Pyridoxin enthielt, der pH-Wert des Mediums wurde mittels einer KOH-Lösung auf 7,5 eingestellt, und das ^Medium wurde 5 Minuten lang bei einer Temperatur von 11O⁰C in einem Autoclaven sterilisiert. Brwinia herbicola ATCC 21433, vorher auf einer Nährstoffagar-Schräge "bei 28⁰C 20 Stunden lang gezüchtet, wurde 60 ml des oben hergestellten Mediums eingeimpft und unter Schütteln 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 30⁰C gezüchtet.

100 ml der Züchtungsbrühe wurden zur Sammlung der BakteriBnzellen zentrifugiert, die Zellen wurden den nachstehenden 50 ml Lösungen (A), (B), (C),und (D) zugegeben, und die Lösungen wurden während eines Zeitraumes von 20 Stunden bei einer Temperatur von 22°C gehalten.

Lösung (A)

Ammoniumpyruvat 2,0 g/dl

Brenzcatechin 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

^a₂SO₃ 0,2 g/dl • pH-\7ert: 8,0 (mittels NH,OH)

H-

Löftung (B)

Ammoniumpyruvat 2,0 g/dl

Brenzcatechin 1,0 g/dl

Ammoniumacetat' 2,0 g/dl

EDTA 0,2 g/dl

pH-V/ert: 8,0 (eingestellt mittels NH.OH)

Losung (C)

Ammoniumpyruvat Brenzcatechin Ammoniumacοtat

2,0	g/dl
1,0	g/dl
2,0	g/dl
0,2	g/dl
0,2	G/dl

EDIA

pH-v/crt: ,8^,0 (eingestellt mittels IJII, OE)

209818/1 125

Lösung (I>)

Ammoniumpyruvat 2,0 g/dl

Brenzcatechin 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels HH.OH)

Die Mengen an in den Lösungen produziertem DOPA v/aren, wie folgt:

Reaktionssystem	Menge an produziertem DOPA
	(g/dl)
Lösung (A)	1,2
Lösung (B)	0,8
Lösung (C)	1,4
Lösung (D)	0,7

Bakterienzellen von Erwinia herbicola ATCC 21433, erhalten aus 100 ml der Züchtungsbrühe, wurden einer 50 ml Lösung, die 2,0 g/dl Ammoniumacetat, 2,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Resorcin enthielt, zugegeben; der pH-Wert der Mischung wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt; man ließ die Reaktion bei einer Temperatur von 17°C 42 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,2 g/dl Ha₃SO₃ und 0,2 g/dl EDTA fortschreiten. In der Reaktionsmischung, die Natriumsulfit und EDTA -enthielt, wurde L-2,4-Dihydroxyphenyl-L-alanin in einer Menge von 1/2 g/dl und in der Reaktionsmischung, die kein Natriumsulfit enthielt, in einer Menge von 0,4 g/dl produziert.

Beispiel 10

Bakterienzellen, erhalten aus 100 ml Züchtungsbrühe

209818/1125

der in Tabelle 3 angegebenen Bakterien wurden zu 30 ml Lösungen zugegeben, die 2,0 g/dl Oxalessigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glyoxylsäure, Milchsäure und Maleinoxim , 1,0 g/dl Phenol und 2,0 g/dl Ainmo niumac et at enthielten, die pH-Werte der Mischungen wurden auf 8,0 eingestellt und jede Mischung wurde 20 Stunden lang bei einer !Temperatur von 37 C gehalten. Die Mengenan in den Reaktionsmischungen produziertem L-Tyrosin sind in der nachstehenden Tabelle III angegeben.

209818/1125

Zl

Tabelle III

Menge an Tyrosin produziert aus (g/dl)

Oxal Malein- Pumar- G-Ityoxyl- Milch- Mal ei] -AcOH säure säure säure säure oxim

Erwinia lierbicola ATCC 21433

Citrobacter freundii ATCC 6750

Proteus mirabilis ATCC 15290

Pseudomonas perlurida ATCC 490

Salmonella gallinarum ATCC 9148.

Citrobacter freundii ATCC 8090

Paracolobactrum coliforme ATCC 11605 " ·

Xanthoraonas campestris ATCC 7381 1,50 0,62 0.38

0.48

0.95 0.52

1,08 0.78 0.30 0.45. 0.62 0.68 0.88 0.80 0.30

0.52 0.40 0.42

0.82 0.88 0.52

0.50 . 0.55 0.70

0.35 0.48 0.30

0.32 0.71 0.77

1.02 0.70 0.28 0.45. ,0.82 0.60

0.80 0.52 0.25 0.40

0.66 0.21 0.15 0.32

0.55 0.40

0.35 0.11

Alcaligenes faecalis ATCC 8315

Aerobacter aerogenes ATCC 7256

0.31 0.20 0.31 -0.21 0.21 0.11

0,42 0,20 0.45

0.48

0.20 0.15

209818/1125

Beispiel 11

100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433, hergestellt in gleicher Weise,wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde zentrifugiert, die erhaltenen Bakterienzellen wurden den nachstehenden Lösungen (A), (B) und (C) zugegeben, und die Mischungen wurden 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 37°C gehalten.

Lösung (A)

. Oxalessigsäure 2,0 g/dl

f Ammoniumacetat 2,0 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

Lösung (B)

Oxalessigsäure 2,0 g/dl

Phenol 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

Lösung (C)

Natriumpyruvat 2,0 g/dl

Phenol 1,0 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₁OH)

Die erhaltenen Reaktionsmischungen wurden hinsichtlich ihres Gehaltes an Brenztraubensäure und L-Tyrosin analysiert. Die Ergebnisse waren die folgenden:

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Beispiel 12

	Menge an .	L-Tyrosin (ff/dl)
Reaktionsmischung	Brenztraubensäure (s/dl)	0 0,9 1,3
Lösung (A) Lösung (B) Lösung (C)	1,1 0,3 0,5

Ein Enzym von Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 6 beschrieben, hergestellt; es wird im nachstehenden als Enzym (A) bezeichnet. Eine Oxalacetatdecarboxylase wurde . aus den Zellen von Citrobacter freundii ATCC 6750 gemäß der Arbeitsweise, wie in D. Herbert, Sym- posia Soc, Exp. Biol., Bd. 5, Seite 52 (1951) beschrieben, hergestellt; sie wird im folgenden als Enzym (B) bezeichnet. Aus den Zellen von Micrococcus . lysodeikticus wurde ebenfalls in der gleichen Y/eise wie im Falle von Citrobacter freundii eine Oxalacetatdecarboxylase hergestellt, die als Enzym (C) bezeichnet wird.

50 mg Enzym (A) (als Protein) und 50g Enzym (B) oder 50 mg Enzym (A) und 50 mg Enzym (C) wurden zu 100 ml wäßrigen Lösungen zugegeben, die 2,0 g/dl Oxalessigsäure, 1,0 g/dl Phenol, 1,0 g/dl Ammoniumacetat, 2,0 g/dl Ammoniumsulfat und 2 mg/dl Pyridoxalphosphat enthielt und einen pH-Wert von 8,0 hatte, und die Mischungen v/urden 20 Stunden lang bei einer Temperatur von 37⁰C gehalten.

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Die Reaktionsmischung der Enzyme (A) und (B) enthielt 1,2 g/dl L-Tyrosin und die Reaktionsmischung der Enzyme (A) und (C) enthielt 1,4 g/dl L-Tyrosin.

Beispiel 13

Erwinia herbicola ATCC 21433 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, gezüchtet, 100 ml der Züchtungsbrühe wurden mit 0,6 g Brenzcatechin, 2,0 g Milchsäure, 2,0 g Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, der pH-Wert der Mischung wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt und man ließ die Reaktion bei einer Temperatur von 17⁰C einsetzen. Nach Beginn der Reaktion wurde nach jeweils vier Stunden Brenzcatechin in dem Reaktionssystem ergänzt, um seine Konzentration auf 0,6 g/dl zu bringen, und die Bebrütung wurde 42 Stunden lang ausgeführt.

Ähnliche Bebrütungen wurden wiederholt, wobei Brenzcatechin ergänzt wurde, um seine Konzentration auf 0»3 g/dl, 1,0 g/dl und 1,5 g/dl zu bringen. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

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	dt -	,5	ver- l Brenz- (g/dl)	2152548
Brenzö'at echinkon- zentration nach Ergänzung (g/dl)		,2		Menge an pro duziertem DOPA (g/dl)
0,3	Menge an brauchten catechin	,6		1,25
0,6	2	,3		1,80
1,0	3			2,15
1,5	3	1,05
2

100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433 wurden mit 3,0 g Milchsäure, 4,0g Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, die sich ergebende Mischung wurde mit jeweils 1,0 g, 1,5 g, 2,0 g und 2,5 g Brenzcatechin gemischt; bei einem pH-Y/ert von 8,0 ließ man die Mischung während eines Zeitraumes von 42 Stunden bei einer Temperatur von 17⁰C reagieren. Die Mengen an in den Reaktionsmischungen produziertem DOPA waren, wie folgt:

Menge an zugegebenem Menge an produziertem Brenzcatechin (κ/dl) DOPA (g/dl)

1,0 0,84

1,5 0,65

2,0 0,34

2,5 0,21

Beispiel 14

Erwinia herbicola ATCC 21433 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 9 gezüchtet, Bakterienzellen wurden aus 2 1 der Züchtungsbrühe gewonnen,und die Zellen wurden

209818/1125

einer lösung zugegeben, die Brenz :atechin, wie in Tabelle IV angegeben, 3,0 g/dl Dl-Serin und 2,2 g/dl Borsäure enthielt. Der pH-Wert der Mischung wurde auf 8,0 mit Ammoniakwasser eingestellt, und die Mischung wurde bei 15⁰C 24 Stunden lang gerührt. Die Mengen an in den Re-. aktionsmischungen produziertem DOPA sind in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Menge an zugegebenem Borsäure Menge an produzier-Brenzcatechin ^% '"' (g/dl) tem DOPA (g/dl)

zu Anfang	während der	keine	0,72
	Bebrütung	keine	1,05
0,6	0	keine	0,42
1,0	0	keine	"0,22
1,5	' 0	vorhanden	2,40
2,0	0	keine	1,58
4,0	0
0,5	0,5 r. 3

* Ein liter der Reaktionsmiscliung, die 2,40 g/dl DOPA

enthielt, wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt; es wurden 11,2 g reines kristallines DOPA erhalten.

Beispiel 15

Bakterienzellen von Erwinia herbicola 21433, gezüchtet wie in Beispiel 9 und aus 2 1 Züchtungsbrühe isoliert,

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wurden zu einer 1 1 lösung zugegeben, die 4,0 g/dl Brenzcatechin, 3,0 g/dl Brenztraubensäure, 2,2 g/dl Borsäure und 2,0 g/dl Ammoniumphosphat enthielt und deren pH-Wert mittels Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt wurde, und die Mischung wurde bei 15⁰C 24 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung enthielt 2,8 g/dl DOPA. Die Reaktionsmischung wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt und ergab 13 g reines kristallines DOPA.

Beispiel 16

Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde auf einem Medium, wie in Beispiel 9 beschrieben, gezüchtet und unter Schütteln bei einer Temperatur von 27°C 24 Stunden lang gezüchtet. Die aus 100 ml Züchtungsbrühe isolierten Bakterienzellen wurden zu 50 ml der Lösungen (I) bis ("VII) zugegeben, deren Zusammensetzungen nachstehend angegeben sind; man ließ die Mischungen bei einer Temperatur von 2O⁰C 20 Stunden lang reagieren.

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- Zo -	Lösung (l)	2152548	4,0 g/dl
Brenz Qate chin		3,6 g/dl
Hat r i uinp y ruv at	4,0 g/dl
Ammoniumac e t at	2,2 g/dl
Borsäure	0,2 g/dl
Na2SO3	0,3 g/dl
EDl1A	mittels NH4OH)
pH-Wert: 8,0 (eingestellt
Lösung (II)	4,0 g/dl
Brenzcatechin	3,6 g/dl
Hatriumpyruvat	4,0 g/dl
Ammoniumacetat	0,2 g/dl
Ha2SO3	0,3 g/dl
EDTA	mittels IiH4OH)
pH-j/ert: 8,0 (eingestellt
Lösung (III)	1,0 g/dl
Brenzcatechin	3,6 g/dl
Natriumpyruvat	4,0 g/dl
Ammoniumacetat	0,2 g/dl
Na2SO3	0,3 g/dl
EDTA	mittels NH-OIi)
pH-Wert: 8,0 (eingestellt

Lösung (IV)

Brenzcatechin:

(viermal nach jeweils 4 St'.unden
• nach Beginn der Inkubation wurden
jeweils 0,5 g zugegeben)
Brenztraubensäure 3,6 g/dl

Aminoniuinacetat 4,0 g/dl

Na₂SO₃ - 0,2 g/dl

EDTA 0,3 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

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Lösimg (V)

Brenzcatechin 4,0 g/dl

Brenztraubensäure 3,6 g/dl

Ammoniumacetat 4,0 g/dl

Borsäure 2,2 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels ITILOH)

Lösung (VI)

Brenzcatechin 4,0 g/dl

Brenztraubensäure 3,6 g/dl

Ammoniumacetat 4,0 g/dl

Borsäure 2,2 g/dl

Na₂SO₅ 0,2 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels Essigsäure)

Lösung (VII)

Brenzcatechin 4,0 g/dl

Brenztraubensäure 3,6 g/dl

Ammoniumacetat 4,0 g/dl

Borsäure 2,2 g/dl

EDTA 0,3 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Reaktionsiaiaohung Menge an produziertem DOPA (g/Al)

Lösung (I) 2,52

Lösung (II) o,23

Lösung (III) 1,32

Lösung (IV) 1,80

Lösung (V) 1,60

Lösung (VI) . 1,86

Lösung (VII) 1,68

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Beispiel 17

Brenzcatechin und Borsäure wurden in Wasser gelöst, der pH-Wert der wäßrigen lösung wurde mit Ammoniakwasser· auf einen Wert von 8,0 eingestellt, und der sich "bildende Ammonium-Brenz latechin-Borsäure-Komplex-Hiederscblag wurtte durch Zentrifugieren isoliert. Der Niederschlag, äquivalent einer Menge von 4,0 g Brenzcatechin und 2,2 g Borsäure, wurde zu 100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCO 21433 zugegeben, ; dann wurden 3g Natriumpyruvat, 4g Ammoniumacetat * und 30 ml Wasser hinzugefügt und der pH-Wert der sich ergebenden Mischung wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt» Die Mischung wurde 40 Stunden lang unter Schütteln bei 20⁰C gebrütet; die Eeaktionsmischung enthielt 1,65 g/dl DOPA.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Λ.1 Verfahren zur Erzeugung phenolischer Aminosäuren der allgemeinen Formel

   CH₂-CH-COOH I ■'-.-■

   MH2 ' ^:

   in der R-, und Rp Wasserstoff oder Hydroxylgruppen sind, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) eine Phenolverbindung der allgemeinen Formel

   in der R-, und R« die obenangegebene Bedeutung haben, (b) Ammoniumionen und (c) ein oder mehrere Säuren, ausgewählt äug Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxalessigsäure, Apfelsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure und Milchsäure und/oder einem Salz oder Derivat einer der genannten Säuren in einer wäßrigen lösung in Gegenwart einer wirksamen Menge einer Quelle von ß-Tyrosinase bei einem pH-Wert von 4 bis 11 umsetzt, bis die phenolische Aminosäure der obengenannten Formel erzeugt ist.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von Io bis 5o°C ausgeführt wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrationen der Phenolverbindung,

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   '.'. 1ο· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Phenolverbindung aus Brenzcatechin besteht.

   11. Verfahren nach Anspruch lo, dadurch gekennzeichnet, daß das Brenzcatechin zusätzlich in Gegenwart von Borsäure umgesetzt wird.

   12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Borsäure sich in der freien Säureform oder in Porm des Alkali- oder Erdalkalisalzes der Säure befindet,

   13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Borsäure äquimolar je Mol Brenzcatechin ist.

   14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß die Phenolverbindung teilweise zu der lösung während der Reaktion zugesetzt wird;

   15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14» dadurch gekennzeichnet, daß ß-Tyrosinase verwendet wird, die durch Züchtung eines mikroorganisehen Stammes in einem Züchtungsmedium erzeugt ist.

   16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchtungsmedium Tyrosin enthält.

   17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Tyrosin in dem Züchtungemedium größer als o,ol?£ Gew./Vol. ist.

   18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Tyrosin in dem Züehtungsmediua in dem Bereich von o,o5 bis o,5$ Gew./VoI liegt.

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   der Ammoniumionen und der Säure in der Lösung o,l bis 2o ' Gew./Vol. betragen,

   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure sich in der freien Säureform, dem Ammonium-, Natrium-, Kalium- oder Calcium-BaIz der Säure oder in Form von Alkylestern der Säure befindet.

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Phenolverbindung in der Lösung aus Brenzcatechin oder Resorcin besteht.

   6. Verfahren nach Anspruch 5i dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung ein Reduktionsmittel und/oder ein Komplex- oder Chelatbildungsmittel enthält.

   7« Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel aus Bchwefeliger Säure, Natrtumsulfit, Kaliumsulfit, Ammoniumsulfit, Thioschwefeleäure, KaliumthioBulfat, Natriumthiosulfat, Ammoniumthiosulfat, Cystein., ß-Mercaptoäthanol und Ascorbinsäure besteht.

   8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Komplex- oder ChelatbildungBmittel aus Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diäthylamin, N-Oxyäthylendiamin, Triäthanolamin, Asparginsäure, H-Dioxyäthy lenglycin, ITitrüotriacetat, Citronensäure und Thioglykolsäure besteht.

   9· Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daßdie Konzentration des Recluktions^ mittels und Komplex- oder GhelatbildungsmitteIf o,öl bia 1 i» Gew./Vol. beträgt.

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   19· Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchtungsmedium auch eine Aminosäure und/oder ein Vitamin, ausgewählt aus Methionin, Glycin, Alanin, Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxalphosphat, enthält. ■ .

   2o· Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Aminosäure und des Vitamins o,öl bis 5$ Gew./Vol beträgt.

   21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 2o,

   * dadurch gekennzeichnet, daß der mikroorganische Stamm aus einer der Arten der Gattungen Escherichia, Aerobacter, Citrobacter, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Proteus, Salmonella, Paracolobactrum und Alcaligenes besteht.

   22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm aus einer der Arten, ausgewählt aus Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Erwinia herbicola, Pseudomonas perlurida, Xanthomonas campestris, Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum, Paracolobactrum coliforme und Alkaligenes faecalis besteht.

   ψ 23. Verfahren .nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm aus Escherichia coil ATCC 3655, Aerobacter aerogenes ATCC 7256, Citrobacter freundii ATCC 675o, Citrobacter freundii ATCC 8o9o, Erwinia herbicola ATCC 21433, Erwinia herbicola ATCC 21434, Pseudomonas perlurida ATCC 49o, Xanthomonas eampestris ATCC 7381, Proteus mirabilis ATCC 1529ο, Salmonella gallinarum ATCC 9148, Paracolobactrum coliforme ATCC Il6o5 und Alcaligenes faecalis ATCC 8315 bestellte

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