DE2163964C2

DE2163964C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren

Info

Publication number: DE2163964C2
Application number: DE2163964A
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Zushi Kanagawa Enei; Hiroshi Yokohama Kanagawa Matsui; Hidetsugu Kawasaki Kanagawa Nakazawa; Shinji Tokio/Tokyo Okumura
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1970-12-22
Filing date: 1971-12-22
Publication date: 1986-10-09
Also published as: DE2163964A1; JPS4946917B1; FR2119018B1; FR2119018A1; US3808101A; GB1374454A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren der allgemeinen Formel

zur Durchführung dieses bekannten Verfahrens erforderlich.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten L-Aminosäuren zu schaffen, das technisch einfach und wirtschaftlich durchgeführt werden kann und die gewünschten L-Aminosäuren in hoher Ausbeute liefert

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst werden kann, daß Indol ίο oder 5-Hydroxyindol in Anwesenheit von Ammoniumionen mit Brenztraubensäure oder einem Salz der Brenztraubensäure umgesetzt wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren der allgemeinen Formel

15

20

CH₂CH-COOH (I)

NH₂

40

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet,

durch Umsetzung einer organischen, ein N-Atom enthaltenden heterocyclischen Verbindung mit Tryptophanase oder einer Tryptophanase-Quelle in wäßriger Lösung und Gewinnung der so hergestellten L-Aminosäuren.

L-Tryptophan der vorstehend angegebenen Formel (I) mit R = H ist eine der essentiellen Aminosäuren. 5-Hydroxy-L-iryptophan der vorstehend angegebenen Formel (I) mit R=OH wird als Arzneimittel verwendet.

Es ist bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen L-Tryptophan bilden, wenn sie in einem Medium gezüchtet werden, das einen Vorläufer von Tryptophan, wie Indol oder Anthranilsäure, enthält. Die mit diesen bekannten Verfahren erzielbaren Konzentrationen an L-Tryptophan in dem Kulturmedium sind jedoch sehr gering. Die Bildung von 5-Hydroxy-L-tryptophan auf biologischem Wege war bisher überhaupt noch nicht bekannt.

In der FR-PS 20 19 791 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan aus Indol unter Verwendung bestimmter Mikroorganismen der Gattung Hansenula und Candida beschrieben. Die für die Durchführung dieses bekannten Verfahrens erforderlichen Behandlungszeiten sind jedoch lang und es sind große Apparaturen

CH₂CH-COOH
NH₂

(D

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet,

durch Umsetzung einer organischen, ein N-Atom enthaltenden heterocyclischen Verbindung mit Tryptophanase oder einer Tryptophanase-Quelle in wäßriger Lösung und Gewinnung der so hergestellten L-Aminosäuren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das dafür bekannte Indol oder 5-Hydroxyindol der Formel

30

35

(H)

worin R H bzw. OH bedeutet, in Anwesenheit von Ammoniumionen mit Brenztraubensäure oder einem Salz der Brenztraubensäure umsetzt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, L-Aminosäuren der vorstehend angegebenen Formel (I) in mindestens ebenso hohen Ausbeuten wie in dem aus der FR-PS 20 19 791 bekannten Verfahren, dafür aber bei kürzerer Zeit der enzymatischen Reaktion und mit geringerem apparativem Aufwand herzustellen. Darüber hinaus stellt das erfindungsgemäße Verfahren einen lange gesuchten zweiten Weg zur Herstellung von L-Aminosäuren der Formel (I) dar.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung liegen bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens das Indol oder Hydroxyindol, die Ammoniumionen und die Brenztraubensäure oder das Salz der Brenztraubensäure in einer Menge von 0,1 bis 10,0 g/dl in der wäßrigen Lösung vor.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung enthält die wäßrige Lösung zusätzlich Inosin.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird die Umsetzung in Gegenwart von Vitamin Ββ und/oder in Gegenwart eines Reduktionsmittels durchgeführt.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Tryptophanase wird vorzugsweise durch Kultivierung eines Tryptophanase bildenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das Tryptophan oder 5-Hydroxytryptophan enthält, gebildet. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung kann dieses Kulturmedium ein oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, ent-

halten.

Als Mikroorganismus wird vorzugsweise ein solcher der Gattung Escherichia, Aerobacter, Citrobacter, Erwinia, Pseudomonas oder Proteus verwendet

Bekanntlich katalysiert das Enzym Tryptophanase die Zersetzung von L-Tryptophan zu Indol, Ammoniak und Brenztraubensäure. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine reine Enzympräparation verwendet werden, vorzugsweise werden jedoch Tryptophanase-Quellen verwendet Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Tryptophanase-Quellen kann es sich handeln um eine Brühe, in der ein Mikroorganismus kultiviert wird, der das Enzym bilden kam:, oder ein zellfreies Filtrat dieser Brühe, eine wäßrige Suspension der Zellen oder von vermahlenen Zellen oder ein Filtrat davon.

Mikroorganismen, die das Enzym Tryptophan&se bilden können, sind weit verbreitet und sie gehören beispielsweise zu den Gattungen Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Pseudomonas, Citrobacter und Proteus. Typische Beispiele für geeignete Species sind Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Erwinia herbicola, Pseudomonas perlurida, Proteus merabilis und Citrobacter freundii.

Das zur Kultivierung der Mikroorganismen verwendete Medium kann ein übliches Medium sein, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und die gebräuchlichen übrigen Nährstoffe sowie auch eine geeignete Menge Tryptophan oder 5-Hydroxytryptophan enthält. Die Kultivierung der Mikroorganismen erfolgt zweckmäßig in Medien, die Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Maltose, Mannit, Xylose, Galactose, Stärkehydrolysat oder Melasse, enthalten. Als Hauptkohlenstoffquelle oder als zusätzliche Kohlenstoffquelle für ausgewählte Mikroorganismen geeignet sind organische Säuren, wie Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, «-Ketoglutarsäure, Gluconsäure und Brenztraubensäure, Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol, Fettsäuren und Kohlenwasserstoffe.

Die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Medium liegt normalerweise zwischen 0,1 und 10 g/dl, bezogen auf Glukoseäquivalente. Stickstoff kann in Form von Ammoniumsalzen von anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Essigsäure und Kohlensäure, Harnstoff, und Ammoniak in wäßriger Lösung oder in gasförmigem Zustand vorgesehen sein. Andere organische Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und NZ-Amine werden als zusätzliche Stickstoffquellen verwendet.

Das Medium sollte auch anorganische Salze und geringe Mengen organische Nährstoffe enthalten, die das Wachstum der Mikroorganismen fördern. Die anorganischen Salze können Dikaliumhydrogenphosphat, KaIiumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(H)sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat umfassen. Bekannte organische wachstumsfördernde Substanzen umfassen Aminosäuren im allgemeinen, Biotin, Vitamine, organicrtha Couren EiWtcänron UnH QuKctan-7f»n Hip Prntpin

enthalten. Sie können durch Substanzen, welche das aktive Mittel unter den Kultivierungsbedingungen ergeben, wie z. B. Fleischextrakt, Peptone, Hefeextrakt, Maisquellwasser. Magermilch, Chlorellaextrakt und Sojabohnenproteinhydrolysat, bereitgestellt werden.

Tryptophan bzw. 5-Hydroxytryptophan sollte dem Medium in einer Menge von mehr als 0,01 g/dl und vorzugsweise zwischen 0,05 bis 0,5 g/dl zugegeben werden. Das Tryptophan kann in Form von organischen Nährstoffen, wie Aminosäuremischungen, Polypepton oder Sojabohnenextrakt, eingesetzt werden.
Wird der Mikroorganismus, der fähig ist, Tryptophanase zu bilden, in den obengenannten Medien in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels kultiviert, ist die Enzymaktivität der erhaltenen Tryptophanase sehr hoch.

Geeignete oberflächenaktive Mittel sind nichtionische, anionische, kationische oder amphotere oberflächenaktive Mittel, wobei anionische oberflächenaktive Mittel bevorzugt werden. Beispiele für geeignete oberflächenaktive Mittel sind:

Kationische oberflächenaktive Mittel:
Cetyltrimethylammoniuir.halogenid

Anionische oberflächenaktive Mittel:
Laurylalkoholsulfonat
Alkylarylsulfonat

Amphotere oberflächenaktive Mittel:
Imidazolin

Nichtionische oberflächenaktive Mittel:
Polyoxyäthylenalkylphenoläther
Polyoxyäthylenaikyläther
Polyoxyäthytensorbitanmonoalkylester
Sorbitanalkylmonoester
Polyoxyäthylenalkylaryläther
Fettalkylolamid
Polyoxyäthylentrielat

Die oberflächenaktiven Mittel können gewöhnlich in dem Kulturmedium in einer Menge von 0,1 bis 10 g/dl vorliegen.

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 40⁰C durchgeführt. Es wird bevorzugt, den pH-Wert des Kulturmediums während der Kultivierung auf 5,5 bis 8,5 einzustellen. Das Kultivieren wird gewöhnlich 10 bis 72 Stunden durchgeführt.
Die Brühe kann als solche als Enzymquelle verwendet werden, ohne daß daraus die Bakterienzellen entfernt werden. Ein zellfreies Filtrat der Kulturbrühe, eine Zellsuspension und eine Suspension von zerquetschten Bakterienzellen, hergestellt durch Zerreiben, Autolyse oder Ultraschallschwingungen, können bei dem Verfahren gemäß der Erfindung gleichfalls als Enzymquellen verwendet werden. Rohe Enzyme und reine Enzyme, die durch Zentrifugieren, Aussalzen und Lösungsmittelausfällung erhalten werden, können gleichfalls verwendet werden.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel II, die als Ausgangsmaterial bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind Indol und 5-Hydroxyindol, und sie können in einer Menge von 0,1 bis 20 g/dl zugegeben werden.

Die Säuren, die als Quelle für den Alaninanteil der Aminosäuren der allgemeinen Formel 1 verwendet werden, sind Brenztraubensäure sowie deren Salze. Sie können in Form der freien Säure, als Salze, wie als Ammonium-, Natrium-, Kalium- oder Calciumsalz, verwendet werden. Das Ammoniumsalz der genannten Säure wird bevorzugt verwendet.

Die Säure liegt vorzugsweise in dem Reaktionssystem in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-°/o/Vol. als freie

Säure vor. Die Ammoniumionen können in einer Menge von 0,1 bis 20 g/dl zugegeben werden.

Die Reaktion wird bevorzugt bei einem pH-Wert von 5 bis 10 und bei einer Temperatur von 10 bis 50⁰C durchgeführt Der pH-Wert des Reakiionssystems kann durch Zugabe von Calciumcarbonaf, Ammoniak, Ätzalkali oder Phosphatpufferlösung aufrechterhalten werden.

Die Ausbeute an Endprodukt kann durch Zugabe von Vitamin Bc wie Pyridoxalphosphat, Pyridoxal oder Pyridoxin und/oder eines Chelatbildner, zu dem Reaktionssystem bedeutend erhöht werden. Beispiele für geeignete Reduktionsmitte! sind schweflige Säure, Natriumsulfit, Kaliumsulfit Ammoniumsulfit, Thioschwefelsäure, Kaliumthiosulfat, Natriumthiosulfat, Ammoniumthiosulfat, Cystein, ^-Mercaptoäthanol und Ascorbinsäure. Das Vitamin Ββ und das Reduktionsmittel werden im allgemeinen in einer Menge zwischen etwa 0,01 und 1 g/dl verwendet

Die Ausbeute an Endprodukt kann durch die Zugabe von Inosin zum Reaktionssystem stark erhöht werden. Das gebildete L-Tryptophan und das Inosin reagieren z. B. in dem Reaktionssystem unter Bildung eines Niederschlags eines Tryptophan-Inosin-Komplexes.

Der Komplex kann leicht in Tryptophan und Inosin umgewandelt werden, wenn dieser in einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert unter 4 oder über 10 behandelt wird.

Die in der Reaktionsmischung gebildeten Aminosäuren können durch gebräuchliche Verfahren gewonnen werden.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium, das 2 g/l L-Tryptophan, 5 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄ · 7H₂O, 2 ppm Fe- und Mn-Ionen, 2 g/l Glycerin, 2 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Casaminsäure enthielt und einen pH-Wert von 7,0 zeigte, wurde hergestellt. Jeweils 60 ml Medium wurden mit einer Schlinge von Bakterien, wie dies in der nachstehenden Tabelle I angegeben ist, geimpft und bei 31°C 20 Stunden unter Schütteln kultiviert.

1 1 der Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu sammeln, die Zellen wurden zu 11 Lösung zugegeben, die 20 g Indol, 24 g des Natriumsalzes der Brenztraubensäure und 40 g Ammoniumacetat, (der pH-Wert betrug 8,0) enthielt. Die Reaktionslösung wurde bei 37°C 20 Stunden gerührt Die Mengen an L-Tryptophan, die in der Reaktionsmischung gefunden wurden, sind in der nachstehenden Tabelle I aufgeführt.

Eine wäßrige Natriumhydrcxydlösung wurde zu 1 1 der Reaktionsmischung von Eschcrichia coli ATCC 10 798 gegeben, um den Niederschlag an Tryptophan zu lösen, und die erhaltene Lösung wurde in Gegenwart von Diatomeenerde filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wurde mit Salzsäure auf 4,0 eingestellt und die Lösung wurde in eine mit aktiver Holzkohle gefüllte Kolonne eingeführt Das auf der aktiven Holzkohle adsorbierte L-Tryptophan wurde mit 2n-Ammoniakwasser eluiert Das Eluat wurde zur Trockene konzentriert die erhaltenen Kristalle mit Aceton gewaschen und 5,2 g reines kristallines L-Tryptophan wurden erhalten.

/■7'	Tabelle I	Menge des Endprodukts
*'&.*	Verwendete Bakterien	L-Tryptophan (g/I)
		Lösung A
iw		8,0
	Proteus mirabilis
j: ■;	ATCC 15 290	3,4
	Pseudomonas perlurida
	ATCC 490	4,4
	Aerobacter aerogenes ATCC
	8724	4,0
	Enterobacter aerogenes
	ATCC 7256	6,0
	Aerobacter liquefaciens
	ATCC 14 460	5,2
	Escherichiacoli ATCC 10 798

Beispiel 2	2,0 ml/dl
Ein Grundmedium, enthaltend	0,05 g/dl
Maisquellwasser	0,05 g/dl
KH₂PO₄	2 ppm
MgSO₄ · 7H₂O	0,2 g/dl
Fe-und-Mn-Ionen	2,0 g/dl
Glycerin
Hefeextrakt
pH-Wert 7,5 (mit KOH)

wurde hergestellt und jeweils 2,0 g/dl L-Tryptophan (Medium A) und 0,2 g/dl 5-Hydroxy-L-tryptophan (Medium B) wurden zu dem Grundmedium zugegeben. Jeweils 60 ml des Mediums wurden mit einem Löffel voll Proteus mirabilis ATCC 15 290 geimpft, das vorher auf einer Schrägagarbouillon bei 30⁰C 20 Stunden lang kultiviert worden war. Die Medien A und B wurden bei 31°C 20 Stunden lang unter Schütteln kultiviert.

Jeweils 2,0 g/dl des Natriumsalzes der Brenztraubensäure, 4,0 g/dl Natriumacetat und 2,0 g/dl Indol wurden zu den kultivierten Brühen A und B zugegeben und der pH-Wert der Brühen mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt. Die Mischungen wurden bei 37° C 40 Stunden gerührt. Die Menge an in den Reaktionsmischungen gebildetem L-Tryptophan sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II	Menge an gebildetem L-Tryptophan
Reaktionsmischer	8,5 g/l 4,5 g/l Beispiel 3
Medium A Medium B

Ein Kulturmedium, das 0,2 g/dl L-Tryptophan, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,05 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 2 ppm Mn-und-Fe-Ionen, 2 ml/dl Maisquellwasser, 1 g/dl Hefeextrakt und 0,5 g/dl Casaminsäure enthielt, wurde hergestellt und der pH-Wert des Mediums mit einer KOH-Lösung auf 7,5 eingestellt. Proteus morganii IFO 3848 wurde auf das Medium eingeimpft und bei 31°C 20 Stunden kultiviert Jeweils 100 ml der Kulturbrühe wurden zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu sammeln, die Zellen wurden zu den nachstehend angegebenen 100 ml Lösungen A, B, C und D zugegeben und die Lösungen wurden bei 37° C 44 Stunden lang gehalten.

65 Lösung (A) Indol Brenztraubensäure
pH-Wert8,0(mit NH₄OH)

1,5 g/dl
1,5 g/dl

Lösung (B)
Indol

Natriumsalz der
Brenztraubensäure
Ammoniumacetat
pH-Wert 8,0(mit NH₄OH)

Lösung (C)
Indol

Calciumsalzder
Brenztraubensäure
Ammoniumacetat
pH-Wert 8,0(mit NH₄OH)

Lösung (D)
Indol

Natriumsalz der
Brenztraubensäure
Ammoniumchlorid
pH-Wert 8,0(mit NH₄OH)

1,5 g/dl

1.5 g/dl 3.0 g/dl

1.5 g/dl

1,5 g/dl 3,0 g/dl

1,5 g/dl

1,5 g/dl 3,0 g/dl

Die Mengen an in den Lösungen gebildetem L-Tryptophan sind nachstehend angegeben:

Tabelle ill

Reaktionssystem

Menge an gebildetem L-Tryptophan

Lösung (A)
Lösung (B)
Lösung (C)
Lösung (D)

4.5 g/i

9.6 g/l 8,0 g/l 7,5 g/l

Beispiel 4

Bakterienzellen von Proteus morganii IFO 3848, die aus 30 1 Kulturbrühe erhalten wurden, die wie in Beispiel 3 angegeben zubereitet wurde, wurden 15 min lang in einer 0,05 m-Phosphatpufferlösung eines pH-Werts von 6,0 mit Ultraschallwellen von 20 KHz behandelt. Die behandelte Zellsuspension wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat gemischt um das Enzym Protein auszufällen, und das Enzym wurde durch Behandlung mit Protamin, einem schwach basischen Anionenaustauscher und einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid gereinigt

40 mg des erhaltenen Proteins des Enzyms wurden zu einer 100-ml- Lösung zugegeben, die folgende Bestandteile enthielt:

der Kulturbrühe wurden mit 2,0 g Indol, 2,0 g des Natriumsalzes der Brenztraubensäure und 2,0 g Ammoniumacetat gemischt und der pH-Werl der Mischung mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt. Die Mischungen wurden 44 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mg Pyridoxylphosphat, 10 mg Pyridoxal oder 10 mg Pyridoxin bei 37^GC gehalten. Es wurden die nachstehend angegebenen Mengen an L-Tryptophan gebildet:

Anwesenheil von
Vitamin Bb-Reihen

Menge an

gebildetem L-Tryptophan

keine

Pyridoxalphosphat
Pyridoxal
Pyridoxin

5,5 g/l

10,5 g/l

7,0 g/l

8,5 g/l

Beispiel 6

Kulturmedien (A), (B) und (C) der folgenden Zusammensetzung wurden hergestellt:

Jeweils 60 ml der Kulturmedien wurden mit Proteus AO mirabilis ATCC 15 290 geimpft, der auf einer Schrägagarbouillon kultiviert worden war, und bei 31 °C 20 Stunden unter Schütteln kultiviert.

Die aus 10 ml der Kulturbrühen (A) und (B) erhaltenen Bakterienzellen wurden zu jeweils 10 m! Lösung, enthaltend 3 g/dl Indol, 3 g/dl Natriumsalz der Brenztraubensäure und 3 g/dl Ammoniumacetat eines pH-Werts von 8,0 zugegeben und bei 37⁰C 20 Stunden umgesetzt

Die Mengen an gebildetem L-Tryptophan waren folgende:

Bestandteile	Medium	Medium	f /
	(A)	(B) ,.	I f
L-Tryptophan g/dl	0,2	0,2
KH₂PO₄ (g/dl)	0,5	0,5
MgSO₄ ■ 7H₂O (g/dl)	0,05	0,05
Maisquell wasser (ml/dl)	6,0	6,0
Sojabohnenproteinhydrolysat	2,0	2,0
(g/dl)
Indol (g/dl)	0	0,05
nichtionisches Detergens	0	1,0
pH-Wert	7,5	7,5

Indol Natriumsalz der Brenztraubensäure	2,0 g/dl 2,0 g/dl	Bakterien kultiviert in	55	Medium (A)	Menge an gebildetem
Ammoniumacetat	4,0 g/dl		Medium (B)	L-Tryptophan
Na₂SO₃	0,2 g/dl
Äthylendiamintetraessigsaures			20,0 g/l
Natrium (EDTA)	0,1 g/dl	23,8 g/l
Pyridoxalphosphat	0,01 g/dl
pH-Wert 8,0 (mit NH₄OH)		Beispiel 7

Die Reaktionsmischung wurde bei 37° C 20 Stunden gehalten.

Es wurde gefunden, daß die Reaktionsmischung 6,4 g/l L-Tryptophan enthielt

Beispiel 5

Proteus morganii IFO 3848 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, kultiviert Jeweils 100 ml

Aerobacter aerogenes ATCC 8724 wurde in einem Medium kultiviert das die in Tabelle IV angegebenen Mengen an L-Tryptophan, 0,5 g/dl KH₂PO₄, 0,05 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 6JO ml/dl Maisquellwasser und 2,0 g/dl Sojabohnenproteinhydrolysat enthielt rnit einem pH-Wert von 7,5 in Gegenwart eines nichtionischen Detergens wie dies in der Tabelle angegeben ist kultiviert Bakterienzellen, die aus 10 ml Kulturbrühen erhalten

ίο

wurden, wurden zu den Lösungen, die 3 g/dl Indol, 3 g/dl Natriumsalz der Brenztraubensäure und 3 g/dl Ammoniumacetat enthielten und einen pH-Wert von 8,0 aufwiesen, zugegeben, und die Mischungen wurden bei 37° C 20 Stunden stehengelassen.

Das in den Reaktionsmischungen gebildete L-Tryptophan ist in der nachstehenden Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Tabelle V (Fortsetzung)

Detergens

Menge an dem Menge an gebildetem L-Tryptophan

Kulturmedium (g/l)

zugegebenen Menge an dem Kulturmedium

Detergens zugegebenen L-Tryptophan

(g/dl) 0,2 g/dl 0,6 g/dl

10

15

16 25 28 28

11
24
44
46 kationisch:
Katinol HTB
AnstexC-160

anionisch:
LiponalF-103
Punox P-80

amphoter;
Lipomin LH

ohne Detergens

Menge des gebildeten	Aerobacter
L-Tryptophans(g/1)	aerogene
Proteus	11
mirabilis	14
11	12
13	10
11
13

20

Aus den Ergebnissen der Beispiele 6 und 7 ist ersichtlich, daß die Inhibierung der Enzymproduktion durch Indol durch die Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln zum Kulturmedium stark inhibiert wird.

Beispiel 8

• Proteus mirabilis ATCC 15 290 bzw. Aerobacter aerogenes ATCC 8724 wurde in einem Medium, das 0,6g/di L-Tryptophan, 0,5 g/dl KH₂PO₄, 0,05 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 6 ml g/dl Maisquellwasser und 2 g/dl Sojabohnenproteinhydrolysat enthielt und einen pH-Wert von 7,5 aufwies, in Gegenwart von 5 g/dl eines oberflächenaktiven Mittels, wie dies in der Tabelle IV angegeben ist, bei 31 ° C 20 Stunden kultiviert. Die Reaktion wurde durch Bakterienzellen, die aus 10 ml Kulturbrühe wie in Beispiel 6 erhalten wurden, bewirkt.

Die Mengen an in den Reaktionsmischungen gebildetem L-Tryptophan sind in der nachstehenden Tabelle V zusammengestellt.

Beispiel 9

18

Proteus mirabilis ATTC 15 290 wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 8 angegeben, kultiviert, jedoch in Abwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels. Die aus 10 ml Kulturbrühe erhaltenen Bakterienzellen wurden zu den folgenden 10-ml-Lösungen (I), (II), (III) und (IV) zugegeben und die Lösungen bei 37° C 20 Stunden stehengelassen.

Lösung (1)

Indol 3 g/dl

Natriumsalz der Brenztraubensäure 3 g/dl

Ammoniumacetat 3 g/dl pH-Wert 8,0 (mit NH₄OH)

Lösung (II)

Indol 3 g/dl

Natriumsalz der Brenztraubensäure 3 g/dl

Ammoniumacetat 3 g/dl

Pyridoxalphosphat 10 mg/dl

Tabelle V	Menge des gebildeten	Aerobacter	45	pH-Wert 8,0 (mit NH₄OH)	3g/d!
Detergens	L-Tryptophans (g/l)	aerogene		Lösung (III)	3 g/dl
	Proteus			Indol	3 g/dl
	mirabilis			Natriumsalz der Brenztraubensäure	0,2 g/dl
		30		Ammoniumacetat
		42	50	Na₂SO₃
nichtionisch:	37	25		pH-Wert 8,0 (mit NH₄OH)
LiponoxMCKN-1	44	42			3 g/dl
Nissan Nonion NS-230 N-3	31	20		Lösung (IV)	3 g/dl
Nissan Nonion NS-230 N-4	46	30		Indol	3 g/dl
Nissan Nonion ST-221 N-Il	29	25	55	Natriumsalz der Brenztraubensäure	0,2 g/dl
Nissan Nonion N-12	34	28		Ammoniumacetat	10 mg/dl
Triton XN-100 N-32	40	21		Na₂SO₃
SorpolW-150	33	24		Pyridoxalphosphat
Nonal N-37	27	32 1 O		pH-Wert 8,0 (mit NH₄OH)	Die Mengen an L-Tryptophan, die in den Reaktions
Nonal310N-38	30	18	60		lösungen gebildet wurden, waren folgende
Pegnol 14-0 N-39	40 01	9
Pegnoll500N-42 ο«, χ,.λμ τ¹ on XT ac	Zl	28
Sorbon T-20 N-45	18	28
Tohol N-270 N-50	37	8		Reaktionssystem Menge an gebildetem
Nonal 104 N-51	39	25	65	L-Tryptophan (g/l)
Nonal 208 N-52	13	28
Nonal 813 N-53	32	26		Lösung (I) 36
Pegnol 16LN-59	37			Lösung (II) 45
Triton N-100	33		Lösung (III) 40
Tween 80	Lösung (IV) 51

11

Beispiel 10

Bakterienzellen, die aus 100 ml Kulturbriihe von Enterobacter aerogenes ATCC 8724 erhalten wurden, wurden zu folgenden 100-ml-Lösungen zugegeben und bei 37° C 20 Stunden umgesetzt.

	Lösung	(II)	(111)	(IV) _\|0
	(I)	3,0	6,6	6,6
Indol (g/dl)	3,0	4,0	7,1	7,1
Natriumsalz der	4,0
Brenztraubensäure (g/dl)		4,0	7,0	7,0 15
Ammoniumacetat (g/dl)	4,0	4,0	0	11,0
Inosin (g/dl)	0	8,0	8,0	8,0
pH-Wert	8,0

In den Reaktionsmischungen, denen Inosin zugegen war, wurde ein L-Tryptophan-Inosin-Komplex ausgefällt. Der Niederschlag und die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in Wasser suspendiert und der pH-Wert der Suspension mit konzentrierter Salzsäure auf 1,0 eingestellt. Die Feststoffe wurden durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde in eine mit einem Kationenaustauschharz der NH4-Form gefüllte Kolonne eingeführt und das in der Kolonne adsorbierte L-Tryptophan mit Ammoniakwasser eluiert. Das Eluat wurde unter verringertem Druck konzentriert, um L-Tryptophan-Kristalle zu erhalten.

Es wurden folgende Mengen an L-Tryptophan in den Reaktionslösungen gebildet:

Reaktionssystem

Menge an gebildetem
L-Tryptophan (g/l)

Lösung (I)
Lösung (I I)
Lösung (111)
Lösung (I V)

36 56 68 91

Beispiel 11

35 40

Bakterienzellen, die aus 100 ml Kulturbrühe von Proteus mirabilis ATCC 15 290 erhalten wurden, wurden zu Lösungen, die 2 g/dl 5-Hydroxyindol, 2 g/dl Natriumsalz der Brenztraubensäure und 2 g/dl Ammoniumacetat enthielten und einen pH-Wert von 8,0 aufwiesen, in Gegenwart oder Abwesenheit von 3 g/dl Inosin zugegeben und die Lösungen wurden 20 Stunden bei 37° C aufbewahrt

Die Reaktionsmischungen enthielten folgende Mengen an 5- Hydroxy- L-Tryptophan:

Inosin

Menge an gebildetem
5-Hydroxy-L-Tryptophan (g/l)

nicht anwesend
anwesend

60

12 28

65

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren der allgemeinen Formel

CH₂CH — COOH (1)

NH₂

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet,

durch Umsetzung einer organischen, ein N-Atom enthaltenden heterocyclischen Verbindung mit Tryptophanase oder einer Tryptophanase-Quelle in wäßriger Lösung und Gewinnung der so hergestellten L-Aminosäuren,

dadurch gekennzeichnet, daß man das dafür bekannte Indol oder 5-Hydroxyindol in Anwesenheit von Ammoniumionen mit Brenztraubensäure oder einem Salz der Brenztraubensäure umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Indol oder 5-Hydroxyindol, die Ammoniujnionen und die Brenztraubensäure oder das Salz der Brenztraubensäure in einer Menge von 0,1 bis 10,0 g/dl in der wäßrigen Lösung vorliegen.

3. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung zusätzlich Inosin enthält.