DE1793806C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Alanin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-AlaninInfo
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Description
ao turn in ein Stadium zwischen dem Ende der logarithmischen Phase und dem Anfang der stationären Phase
tritt. Die besten Bedingungen für die Enzymbildung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung sind gegeben, wenn man die Gärung einen Tag lang
von L-A!anin durch enzymatische Decarboxylierung unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von
von L-Asparaginsäure. 35 25 bis 30° C, vorzugsweise bei 30cC, durchführt.
L-Alanin kann bekanntlich mit Hilfe von Mikro- Nach der Gärung wird L-Asparaginsäure zu der
Organismen erhalten werden, die L-Alanin durch Gärbrühe zugesetzt und das Gemisch genügend lange
Gärung erzeugen. Zum Zwecke einer gewerbsmäßigen bebrütet, um L-Asparaginsäure in L-Alanin umzu-Gewinnung
ist dieses Verfahren aber nicht wirtschaft- wandeln,
lieh genug. 30 L-Asparaginsäure kann zu der Gärbrühe in einer
lieh genug. 30 L-Asparaginsäure kann zu der Gärbrühe in einer
Wie beschrieben wurde, besitzt L-Asparaginsäure- Menge von mehr als 70 Prozent zugegeben werden.
β - decarboxylase (L - Aspartat - 4 - carboxy - lyase Da die Löslichkeit der L-Asparaginsäure in Wasser
EC4.1.1.12) die Fähigkeit, die Decarboxylierung von weniger als 1 Prozent beträgt, liegt der größte Teil der
L-Asparaginsäure in der ^-Stellung zu katalysieren, L-Asparaginsäure im Anfangsstadium in suspendierter
was zur Bildung von L-Alantn führt (Biokhimiya 14, 35 Form in der Brühe vor und löst sich darin langsam bei
[1949], 44). Bestimmte Stämme der Art Pseudomonas fortschreitender Umsetzung. Der pH-Wert des Reak-
und Achromobacter erzeugen diese Decarboxylase tionsgemisches wird also durch die Pufferwirkung der
(Journal of Bacteriology 80, [1960], 830; Biochem. allmählich in Lösung gehenden L-Asparaginsäure
J. 88 [1963], 578). Die Aktivität der von dem Pseudo- bequem in dem für die enzymatische Umwandlung
monas-Stamm erzeugten Decarboxylase war jedoch 40 günstigsten Bereich gehalten, der bei pH 4,5 bis 7, inssehr
geling, und außerdem wurde gleichzeitig noch ein besondere 5 bis 6, liegt, wie bekannt und durch einige
anderes, L-Alanin decarboxylierendes Enzym ge- Vorversuche unschwer feststellbar ist.
bildet, und der eingesetzte Achromobacter-Stamm war In der Regel kann die Decarboxylierung bei einer
bildet, und der eingesetzte Achromobacter-Stamm war In der Regel kann die Decarboxylierung bei einer
wegen seines schlechten Wachstums für die industrielle Bebrütung von 2 bis 4 Tagen und einer Temperatur
Gewinnung von L-Alanin schwer zugänglich. 45 von 30 bis 40°C, vorzugsweise von 37CC, im wesent-
Auch die aus der japanischen Patentveröffentlichung liehen zu Ende geführt werden.
28 951/1968 bekannte L-Alanin-Herstellung mit Hilfe Beim angegebenen Decaroxylierungsverfahren kann
der durch verschiedene Pseudomonas-Stämme und den die Gärbrühe durch eine wäßrige Suspension lebender
Stamm Achromobacter polymorph erzeugten L-Aspa- Zellen, die durch Filtration aus der Brühe isoliert
raginsäure-ß-decirboxylase hat keinerlei wirtschaft- 50 wurden, oder durch Trockenzellen ersetzt werden. Es
liehe Bedeutung, da die erzielbare Decarboxylase- kann auch ein zellfreier Extrakt verwendet werden, der
Aktivität nur etwa 4,6 bis 49,5, ausgedrückt als Qcos, nach üblichen bekannten Verfahren, z. B. durch Exbeträgt
(QcOi = μΐ erzeugtes CO2/Stunde/mg Mikro- traktion nach Schallbehandlung oder durch Zerreiben
Organismenzellen). der lebenden Zellen mit Quarzsand, gewonnene
Es wurde nunmehr gefunden, daß sich bei der Gä- 55 L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase enthält,
rung von Achromobacter pestifer in Gegenwart einer Die Reaktionszeit der enzymatischen Decarboxy-
rung von Achromobacter pestifer in Gegenwart einer Die Reaktionszeit der enzymatischen Decarboxy-
Dicarbonsäure eine erheblich höhere Aktivität an lierung kann auf etwa ein Drittel verkürzt werden,
L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase in den Zellen an- wenn etwa 0,005 bis 2% eines oberflächenaktiven
sammelt. So erreicht beispielsweise die aus der Gär- Stoffes, z. B. eines Fettsäureesters des Polyäthylenbrühe
von Achromobacter pestifer des Stammes 60 glycols oder Polyäthylenglycolsorbitans, zu dem Reak-IAM
1446 gewonnene L-Asparaginsäure-zi-decarboxy- tionsgemisch zugesetzt werden.
lasc-Aktivität bei 30 C einen Qro2-Wert von 1023. Das in dem Reaktionsgemisch erzeugte L-Alanin
Außerdem werden keine anderen störenden Enzyme wird dann gereinigt durch Filtrieren des Gemisches,
erzeugt, die eine Zersetzung oder Racemisierung von Behandeln des Filtrats mit einem stark sauren Ka-L-Alanin
bewirken könnten. 65 üonenaustauscherharz, z. B. einem Sulfonsäureharz,
Erfindungsgemäß wird L-Alanin in hoher Ausbeute und Konzentrieren der behandelten Lösung. Auf diese
durch Gärung von Achromobacter pestifer in einem Weise können mehr als 43 g reines L-Alanin in kristalwäßrigen
Nährmedium, das eine Dicarbonsäure als liner Form aus 100 rrl des Reaktionsgemisches ge-
wonnen werden. Eine so hohe Ausbeute wurde nach den früheren Verfahren niemals erzieh.
Für die nachfolgenden Beispiele wurden jeweils 120 ml eines wäßrigen Nährmediums bereitet. Die in
den Beispielen 1 bis 6 eingesetzten Nährmeiien enthielten die folgenden Bestandteile in %-Gewicht/Volumen:
| Bestandteil | I | Il | 1 | III |
| NH4-Fumarat | 0,5 | 0,5 | 0,5 | |
| Na-Fumarat | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Maisquellwasser | 2,2 | 0,55 | — | |
| KH2PO4 | 0,Ü5 | 0,05 | 0,05 | |
| MgSO4 · 7 H2O | 0,01 | 0,01 | 0,01 | |
| Peprort | — | 1,8 | 0.9 | |
| Caseinhydrolysat | — | — | 0,2 | |
| Beispiel |
120 ml des Nährmediums I wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und in einen 500-ml-Schüttelkolben
gegeben. Nach der Sterilisierune wurde Achromobacter pestifer IAM 1446 auf das Nährmedium
geimpft und dieses 26 Stunden unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bei 30:C
bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 36 g !.-Asparaginsäure
zugesetzt und die Mischung wurde 96 Stunden bei 370C bebrütet. Nach Einstellen des pH-Wertes auf
4,0 wurde das bebrütete Gemisch zum Sieden erhitzt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde durch eine
Säule mit einem Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem
Ammoniak wurde das Eluat eingeengt und lieferte 21,2 g (88°,,) L-Alanin in kristalliner Form mit einem
spezifischen Drehwert von [«] 'i + 14,3C (c = 4, in
6 NHCl).
Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde auf 120 ml des Nährmediums II (pH 7,0) geimpft. Dann wurde
26 Stunden lang unter Schütteln bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und
das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37° C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.
Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde wie in Beispiel 2 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe
wurden 0,1 % Polyäthylenglycolstearat und 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde
24 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Die
erhaltenen Ergebnisse finden sich in Tabelle 1.
Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde auf 120 ml
des Nährmediums III (pH 5.5) geimpft. Dann wurde 20 Stunden bei 300C bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden
48 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 72 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Das bebrütets
Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.
Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde unter den
gleichen Bedingungen wie in Ik-ispiel 4 der Gärung
unterworfen. Zu der Gärbrühe wurde 0,1 °„ PoIyäthylenglycolsorbitan-monolaurat
und 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37 C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurd wie in
Beispiel 1 behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt, wobei sich die
Angaben über die theoretische Ausbeute (°n d. Th.)
auf die eingesetzte L-Asparaginsäure beziehen.
| Beispiel | Gebildetes L-Alanin | Beispiel 6 | % |
| Ausbeute | 90 | ||
| g | 89 | ||
| 2 | 21,7 | 92 | |
| 3 | 21,4 | 91 | |
| 4 | 29,5 | ||
| 5 | 29,2 | ||
(c = 4, 6 NHCl)
120 ml des Nährmediums IH (pH 5,5) wurden mit Achromobacter pestifer IAM 1446 bzw. ATCC 23584
beimpft, vorauf die Mischung bei 30 C 20 Stunden lang unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen
pro Minute) bebrütet wurde. Es wurden 120 ml Gärbrühe erhalten.
30 ml Gärbrühe wurden zentrifugiert. Die auf diese Weise gesammelten Mikrobenzcllcn wurden mit einer
physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurden die Mikrobenzellen in Wasser suspendiert
und durch Ultraschall (1OkH) während einer Zeitspanne von 10 Minuten zerstört. Die wäßrige Suspen-
+ 14,2°
+ 14,2°
+ 14,3°
+ 14,2°
+ 14,2°
+ 14,3°
+ 14,2°
sion der Mikrobenzellen wurde zur Entfernung von unlöslichen Materialien zentrifugiert, wobei eine überstehende
Lösung mit einem Gehalt an L-Asparaginsäure-/?-decarboxylase erhalten wurde.
0.5 ml der überstehenden Lösung wurden einer
0.5 ml der überstehenden Lösung wurden einer
(io Mischung aus 2 ml einer wäßrigen 1OmM L-Asparaginsäurelösung
und 1 ml einer wäßrigen 1 M AcetatpufTerlösung (pH 5,5) zugesetzt. Die Mischung wurde
bei 30"C 10 Minuten inkubiert. Die Menge des durch die Mischung erzeugten Kohlendioxids wurde unter
Verwendung eines Warburg-Manometers bestimmt und daraus die L-Asparaginsäure-/J-decarbo\ylase-Aktivitat
berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind inder unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.
Die in Tabelle II angegebene Menge an L-Asparaginsäure
wurde zu 120 ml der erhaltenen Gärbrühe zugesetzt, worauf die Mischung bei 37"C und einem
pH-Wert von 5 bis 6 24 Stunden lang inkubiert wuröe. Die Menge des in der Reaktionsmischung angereicherten
L-Alanins wurde nach üblichen mikrobiologischen Methoden mit Leucohostoc citrovorum 8081 bestimmt.
Dann wurde die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, zum Sieden erhitzt und filtriert.
Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wurde durch eine mit einem stark sauren Kationenaustauscher
gefüllte Säule geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat zur Trockene
eingedampft, wobei L-Alanin in kristalliner Form in den in Tabelle II angegebenen Ausbeuten gewonnen
wurde.
Es wurden 120 ml eines wäßrigen Nährmediums hergestellt, das folgende Bestandteile enthielt:
Natriumsuccinat 1,2 "„ (Gew./Vol.)
Caseinhydrolysat 0.2 "„ (Gew./Vol.)
Pepton 0.9 ",', (Gew. Vol.)
KH2PO4 0,05"„ (Gew./Vöi.)
MgSO4 · 7 H2O 0,01 "„ (Gew., Vol.)
Das erhaltene Nährmedium wurde auf pH 7.0 eingestellt und in einen 500-ml-KoIben eingebracht. Nach
Sterilisation wurde das Nährmedium mit einer Impf-
kultur von Achromobacter pestifer IAM 1446 angeimpft
und 26 Stunden wie in Beispiel 6 beschrieben bebrütet. Es wurden 120 ml Gärbrühe erhalten.
30 ml der Gärbrühe wurden gemäß Beispiel 6 auf gearbeitet, mit Asparaginsäure behandelt und auf
L-Asparaginsäure-Zi-decarboxylase-Aktivität untersucht.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.
Zu 120 ml der oben angegebenen Gärbrühe wurden 36 g L-Asparaginsäure zugegeben und wie in Beispiel 6
beschrieben wurde 72 Stunden lang inkubiert und weitergearbeitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in
Tabelle II aufgeführt.
Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß 120 ml
eines wäßrigen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung hergestellt und verwendet wurden:
Natriummalat 1.2",, (Gew..Vol.)
Caseinhydiolysat 0,2" (Gew. Vol.)
Pepton 0.9", (Gew. Vol.)
KHoPO1 0.05",, (Gew. Vol.)
MgSO1 ■ 7 H2O 0.01 "„ (Gew. Vol.)
Zur Bestimmung der Alanin-Bildung wurden statt 36 g Asparaginsäure nur 24 g Asparaginsäure in 120 ml
Gärbrühe bebrütet Die erhaltenen Ergehnisse sind in Tabelle Il zusammengestellt.
| Bei- | Achromobacter | Dicarbonsäure- | Bebrü- | L-Asparagin- | Zugesetzte Decarb- | (D) | (C) | (F) | (G) |
| <pel | pcstifcr-Stamm | salz | tungszeit | säurc-;7-decarb- | L-Aspa- oxylie- | ||||
| (h) | owlasc-Aktivilät | raginsäurc rungszeit | |||||||
| (A) (B) | (g) (h) (C) | ||||||||
| IAM 1446 | Fumarat | 20 | 3069 | 1023 | 48 | 24 | 32,2 | 100 | 29.4 | 92 | :-14,2 |
| 36 | 24 | 24,1 | 100 | 22,1 | 92 | ■i-14,3 | |||||
| ATCC 23584 | Fumarat | 20 | 1034 | 272 | 24 | 24 | 16,2 | 100 | 14.7 | 92 | |
| IAM 1446 | Succinat | 26 | 1750 | 985 | 36 | 72 | 24,0 | 99,6 | 22,3 | 92,6 | |
| IAM 1446 | Malat | 26 | 1680 | 890 | 24 | 72 | 15,7 | 97,8 | 14,5 | 90.3 | |
Bemerkungen:
(A) Oco,/ml Gärbrühe (d. h. μΙ COj/tyml Gärbtühe)
(B) Ocf.ij/mg Protein (d. h. μΙ CO2/h/mg Protein in der Gärbrühe)
(C) Menge (g) an im Reaktionsgemisch angereicherten L-Alanin
(D) Umwandlung (%) von L-Asparaginsäurc in L-Alanin
(E) Ausbeute (g) an kristallinem L-Alanin
(F) Ausbeute (% der Theorie) an L-Alanin, bezogen auf eingesetzte L-Asparaginsäure
(G) Spezifische Drehung [a]? (c = 4, 6 NHCl).
Die Ergebnisse zeigen, daß mit den erfindungsgemäß
verwendbaren Stämmen von Achromobacter pestifer eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte
L- Asparaginsäure -β-cecarboxylase - Aktivität
erzielbar ist, wobei als weiterer Vorteil hinzukommt, daß beim Verfahren der Erfindung kein störendes, das
erhaltene L-Alanin zersetzende oder racemisierende Enzym gebildet wird.
Es wurden 120 ml eines wäßrigen Nährmediunis hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt:
mit Natriumhydroxid neutralisierte Dicarbonsäure 1.2",, Gew.'Vol.
Caseinhydrolysat 0.2 "„ Gew. Vol.
Pcptoi ' '. 0.9"„ Gew./Vol.
K 11,PO1 0.05",, Gew.'Vol.
MgSCI1 ■ 7 H„() 0,01 "u Ge« Vol.
Das obige Medium wurde auf den in der folgenden Tabelle III angegebenen pH-Wert gebracht und in
500-ml-Schüttelflaschen eingebracht. Nach dem Sterilisieren
wurde mit einer Impfkultur von Achromobacter pestifer IAM 1446 geimpft und das Medium bei 30 C
die ebenfalls in der folgenden Tabelle angegebene Zeitspanne unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen
pro Minute) bebrütet. Es wurden 120 ml einer Fermentationsbrühc
von Achromobacter pestifer IAM 1446
60 erhalten.
30 ml der Gärbriihc wurden zentrifugiert. Die auf
diese Weise gesammelten Mikrobenzellen wurden gemäß Beispiel 6 in eine Lösung übergeführt, die
l.-Asparaginsäure-/i-decarbo\\lase enthielt. 0.5 ml diescr
Lösung wurden einer Mischung aus 2 ml einer wäßrigen 10 mM L-Asparaginsäiirclösung und 1 mi
einer wäßrigen 1 M AcctatpufTcrlösung (pit 5.3) zugesetzt.
Die Mischung wurde bei 30 C während einer
7 8
Zeitspanne von 10 Minuten inkubiert. Mit Hilfe eines mikrobiologische Untersuchung mit Leuconostoc ci-Warburg-Manometers
wurde die Menge an Kohlen- trovorum ATCC 8081 bestimmt. Der Prozentsatz der dioxid bestimmt, die durch die Mischung erzeugt Umwandlung von L-Asparaginsäure in L-Alanin wird
wurde. Daraus läßt sich die L-Asparaginsäure-/?-de- daraus berechnet. Dann wurde die Reaktionsmischung
carboxylase-Aktivität berechnen. Die erhaltenen Werte 5 auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, zum Sieden ersind
in Tabelle III aufgeführt. hitzt und nitriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat
Eine Menge von L-Asparaginsäure, die in der fol- wurde durch eine mit einem stark sauren Kationengenden
Tabelle 111 angegeben ist, wurde zu 120 ml austauscher (vernetztes Polystyrolgerüst mit SO3H-der
wie vorstehend angegeben erhaltenen Gärbrühe Gruppen) gefüllte Säule geschickt. Nach dem Eluieren
zugefügt und das Gemisch bei 37" C bei pH 5,6 72 Stun- ίο mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat zur Trockne
inkubiert. Die Menge des in dem Reaktionsgemisch eingedampft. Dabei erhielt man L-Alanin in kristalliner
angesammelten L-Alanins wurde durch die übliche Form in den in Tabelle III aufgeführten Ausbeuten.
| Tabelle | III | pH | Zeitdauer | L-Asparaginsäure- | (B) | Zugesetzte | (C) | (D) | (E) | (F) |
| Beispiel | Dicarbonsäuren | des | /3-Decarboxylase- | 432 | L-Aspara | 4,0 | 99,6 | 3,5 | 87,2 | |
| Züchtens | Aktivuät | 900 | ginsäure | 7,8 | 97,2 | 7,1 | 88,4 | |||
| (h) | (A) | 327 | (g) | 3,9 | 97,1 | 3,6 | 89,7 | |||
| 7,2 | 72 | 595 | 315 | 6 | 4,0 | 99,6 | 3,7 | 92,2 | ||
| 9 a | Phthalsäure | 8,4 | 72 | 1025 | 315 | 12 | 4,0 | 99,6 | 3,5 | 87,2 |
| 9b | Isophthalsäure | 7,4 | 72 | 420 | 560 | 6 | 7,7 | 95,9 | 7,2 | 89,7 |
| 9c | Terephthalsäure | 8,2 | 72 | 491 | 921 | 6 | 7,8 | 97,2 | 7,0 | 87,2 |
| 9d | Dipicolinsäure | 7,0 | 72 | 570 | 890 | 6 | 7,8 | 97,2 | 7,2 | 89,7 |
| 9e | Oxalsäure | 7,0 | 64 | 850 | 12 | |||||
| 9f | Maleinsäure | 7,0 | 48 | 1352 | 12 | |||||
| 9g | Adipinsäure | 7,0 | 48 | 1207 | 12 | |||||
| 9h | Weinsäure | |||||||||
Leeende siehe Tabelle II.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch Ein für das erfindurigsgemäße Verfahren geeignetes
enzymatische Decarboxylierfng von L-Asparagin- 5 Nährmedium enthält etwa 0,5 bis 2% Dicarbonsäuren
säure mit Hilfe einer durch Bärungeines L-Aspa- wie Fumarsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure oder
raginsäure-/?-decarboxylase erzeugenden Mikro- deren Salze als einzige oder hauptsächliche Kohlenorgacismus
in einem Nährmedium erhaltenen Gär- stoffquelle. Als Stickstoffquelle können anorganische
brühe oder einer gereinigten Zubereitung der- Ammoniumsalze, z. B. das Chlorid, Phosphat oder
selben, dadurch gekennzeichnet, daß io Sulfat zugesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden
man in dem Nährmedium, welches eine Dicarbon- aber mit den Ammoniumsalzen der obi§;n organischen
säure oder ein Salz davon enthält, einen Stamm von Säuren erzielt. Außer diesen Nährstoffen können 1 bis
Achromobacter pestifer züchtet. 3% organische Stickstofflieferanten wie Maisquell-
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- wasser, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinzeichnet,
daß man die enzymatische Decarboxy- 15 hydrolysat oder Harnstoff und geringe Mengen Minelierung
in Gegenwart eines oberflächenaktiven ralsalze wie Kaliumphosphat oder Magnesiumphosphat
Mittels durchführt. zu dem Nährmittel zugesetzt werden.
Die Bildung der L-Asparaginsäure-/?-decarboxylase
erreicht das Maximum, wenn das bakterielle Wachs-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6631864 | 1964-11-24 | ||
| JP6631864 | 1964-11-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1793806B1 DE1793806B1 (de) | 1976-11-04 |
| DE1793806C2 true DE1793806C2 (de) | 1977-06-23 |
Family
ID=
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