DE1793806C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Alanin - Google Patents

Description

ao turn in ein Stadium zwischen dem Ende der logarithmischen Phase und dem Anfang der stationären Phase tritt. Die besten Bedingungen für die Enzymbildung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung sind gegeben, wenn man die Gärung einen Tag lang von L-A!anin durch enzymatische Decarboxylierung unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von von L-Asparaginsäure. 35 25 bis 30° C, vorzugsweise bei 30^cC, durchführt.

L-Alanin kann bekanntlich mit Hilfe von Mikro- Nach der Gärung wird L-Asparaginsäure zu der

Organismen erhalten werden, die L-Alanin durch Gärbrühe zugesetzt und das Gemisch genügend lange Gärung erzeugen. Zum Zwecke einer gewerbsmäßigen bebrütet, um L-Asparaginsäure in L-Alanin umzu-Gewinnung ist dieses Verfahren aber nicht wirtschaft- wandeln,
lieh genug. 30 L-Asparaginsäure kann zu der Gärbrühe in einer

Wie beschrieben wurde, besitzt L-Asparaginsäure- Menge von mehr als 70 Prozent zugegeben werden. β - decarboxylase (L - Aspartat - 4 - carboxy - lyase Da die Löslichkeit der L-Asparaginsäure in Wasser EC4.1.1.12) die Fähigkeit, die Decarboxylierung von weniger als 1 Prozent beträgt, liegt der größte Teil der L-Asparaginsäure in der ^-Stellung zu katalysieren, L-Asparaginsäure im Anfangsstadium in suspendierter was zur Bildung von L-Alantn führt (Biokhimiya 14, 35 Form in der Brühe vor und löst sich darin langsam bei [1949], 44). Bestimmte Stämme der Art Pseudomonas fortschreitender Umsetzung. Der pH-Wert des Reak- und Achromobacter erzeugen diese Decarboxylase tionsgemisches wird also durch die Pufferwirkung der (Journal of Bacteriology 80, [1960], 830; Biochem. allmählich in Lösung gehenden L-Asparaginsäure J. 88 [1963], 578). Die Aktivität der von dem Pseudo- bequem in dem für die enzymatische Umwandlung monas-Stamm erzeugten Decarboxylase war jedoch 40 günstigsten Bereich gehalten, der bei pH 4,5 bis 7, inssehr geling, und außerdem wurde gleichzeitig noch ein besondere 5 bis 6, liegt, wie bekannt und durch einige anderes, L-Alanin decarboxylierendes Enzym ge- Vorversuche unschwer feststellbar ist.
bildet, und der eingesetzte Achromobacter-Stamm war In der Regel kann die Decarboxylierung bei einer

wegen seines schlechten Wachstums für die industrielle Bebrütung von 2 bis 4 Tagen und einer Temperatur Gewinnung von L-Alanin schwer zugänglich. 45 von 30 bis 40°C, vorzugsweise von 37^CC, im wesent-

Auch die aus der japanischen Patentveröffentlichung liehen zu Ende geführt werden.

28 951/1968 bekannte L-Alanin-Herstellung mit Hilfe Beim angegebenen Decaroxylierungsverfahren kann

der durch verschiedene Pseudomonas-Stämme und den die Gärbrühe durch eine wäßrige Suspension lebender Stamm Achromobacter polymorph erzeugten L-Aspa- Zellen, die durch Filtration aus der Brühe isoliert raginsäure-ß-decirboxylase hat keinerlei wirtschaft- 50 wurden, oder durch Trockenzellen ersetzt werden. Es liehe Bedeutung, da die erzielbare Decarboxylase- kann auch ein zellfreier Extrakt verwendet werden, der Aktivität nur etwa 4,6 bis 49,5, ausgedrückt als Qcos, nach üblichen bekannten Verfahren, z. B. durch Exbeträgt (QcOi = μΐ erzeugtes CO₂/Stunde/mg Mikro- traktion nach Schallbehandlung oder durch Zerreiben Organismenzellen). der lebenden Zellen mit Quarzsand, gewonnene

Es wurde nunmehr gefunden, daß sich bei der Gä- 55 L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase enthält,
rung von Achromobacter pestifer in Gegenwart einer Die Reaktionszeit der enzymatischen Decarboxy-

Dicarbonsäure eine erheblich höhere Aktivität an lierung kann auf etwa ein Drittel verkürzt werden, L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase in den Zellen an- wenn etwa 0,005 bis 2% eines oberflächenaktiven sammelt. So erreicht beispielsweise die aus der Gär- Stoffes, z. B. eines Fettsäureesters des Polyäthylenbrühe von Achromobacter pestifer des Stammes 60 glycols oder Polyäthylenglycolsorbitans, zu dem Reak-IAM 1446 gewonnene L-Asparaginsäure-zi-decarboxy- tionsgemisch zugesetzt werden.

lasc-Aktivität bei 30 C einen Qro₂-Wert von 1023. Das in dem Reaktionsgemisch erzeugte L-Alanin

Außerdem werden keine anderen störenden Enzyme wird dann gereinigt durch Filtrieren des Gemisches, erzeugt, die eine Zersetzung oder Racemisierung von Behandeln des Filtrats mit einem stark sauren Ka-L-Alanin bewirken könnten. 65 üonenaustauscherharz, z. B. einem Sulfonsäureharz,

Erfindungsgemäß wird L-Alanin in hoher Ausbeute und Konzentrieren der behandelten Lösung. Auf diese durch Gärung von Achromobacter pestifer in einem Weise können mehr als 43 g reines L-Alanin in kristalwäßrigen Nährmedium, das eine Dicarbonsäure als liner Form aus 100 rrl des Reaktionsgemisches ge-

wonnen werden. Eine so hohe Ausbeute wurde nach den früheren Verfahren niemals erzieh.

Für die nachfolgenden Beispiele wurden jeweils 120 ml eines wäßrigen Nährmediums bereitet. Die in den Beispielen 1 bis 6 eingesetzten Nährmeiien enthielten die folgenden Bestandteile in %-Gewicht/Volumen:

Bestandteil	I	Il	1	III
NH4-Fumarat	0,5	0,5	0,5
Na-Fumarat	1,0	1,0	1,0
Maisquellwasser	2,2	0,55	—
KH2PO4	0,Ü5	0,05	0,05
MgSO4 · 7 H2O	0,01	0,01	0,01
Peprort	—	1,8	0.9
Caseinhydrolysat	—	—	0,2
	Beispiel

120 ml des Nährmediums I wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und in einen 500-ml-Schüttelkolben gegeben. Nach der Sterilisierune wurde Achromobacter pestifer IAM 1446 auf das Nährmedium geimpft und dieses 26 Stunden unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bei 30^:C bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 36 g !.-Asparaginsäure zugesetzt und die Mischung wurde 96 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 4,0 wurde das bebrütete Gemisch zum Sieden erhitzt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit einem Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat eingeengt und lieferte 21,2 g (88°,,) L-Alanin in kristalliner Form mit einem spezifischen Drehwert von [«] 'i + 14,3^C (c = 4, in 6 NHCl).

Beispiel 2

Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde auf 120 ml des Nährmediums II (pH 7,0) geimpft. Dann wurde 26 Stunden lang unter Schütteln bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37° C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.

Beispiel 3

Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde wie in Beispiel 2 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurden 0,1 % Polyäthylenglycolstearat und 36 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse finden sich in Tabelle 1.

Beispiel 4

Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde auf 120 ml des Nährmediums III (pH 5.5) geimpft. Dann wurde 20 Stunden bei 30⁰C bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 72 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Das bebrütets Gemisch wurde wie in Beispiel 1 behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.

Beispiel 5

Achromobacter pestifer IAM 1446 wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Ik-ispiel 4 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurde 0,1 °„ PoIyäthylenglycolsorbitan-monolaurat und 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37 C bebrütet. Das bebrütete Gemisch wurd wie in Beispiel 1 behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt, wobei sich die Angaben über die theoretische Ausbeute (°_n d. Th.) auf die eingesetzte L-Asparaginsäure beziehen.

Tabelle I

Beispiel	Gebildetes L-Alanin	Beispiel 6	%
	Ausbeute		90
	g		89
2	21,7	92
3	21,4	91
4	29,5
5	29,2

Spez. Drehung

(c = 4, 6 NHCl)

120 ml des Nährmediums IH (pH 5,5) wurden mit Achromobacter pestifer IAM 1446 bzw. ATCC 23584 beimpft, vorauf die Mischung bei 30 C 20 Stunden lang unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bebrütet wurde. Es wurden 120 ml Gärbrühe erhalten.

30 ml Gärbrühe wurden zentrifugiert. Die auf diese Weise gesammelten Mikrobenzcllcn wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurden die Mikrobenzellen in Wasser suspendiert und durch Ultraschall (1OkH) während einer Zeitspanne von 10 Minuten zerstört. Die wäßrige Suspen- + 14,2°
+ 14,2°
+ 14,3°
+ 14,2°

sion der Mikrobenzellen wurde zur Entfernung von unlöslichen Materialien zentrifugiert, wobei eine überstehende Lösung mit einem Gehalt an L-Asparaginsäure-/?-decarboxylase erhalten wurde.
0.5 ml der überstehenden Lösung wurden einer

(io Mischung aus 2 ml einer wäßrigen 1OmM L-Asparaginsäurelösung und 1 ml einer wäßrigen 1 M AcetatpufTerlösung (pH 5,5) zugesetzt. Die Mischung wurde bei 30"C 10 Minuten inkubiert. Die Menge des durch die Mischung erzeugten Kohlendioxids wurde unter

Verwendung eines Warburg-Manometers bestimmt und daraus die L-Asparaginsäure-/J-decarbo\ylase-Aktivitat berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind inder unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.

Die in Tabelle II angegebene Menge an L-Asparaginsäure wurde zu 120 ml der erhaltenen Gärbrühe zugesetzt, worauf die Mischung bei 37"C und einem pH-Wert von 5 bis 6 24 Stunden lang inkubiert wuröe. Die Menge des in der Reaktionsmischung angereicherten L-Alanins wurde nach üblichen mikrobiologischen Methoden mit Leucohostoc citrovorum 8081 bestimmt. Dann wurde die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, zum Sieden erhitzt und filtriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wurde durch eine mit einem stark sauren Kationenaustauscher gefüllte Säule geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat zur Trockene eingedampft, wobei L-Alanin in kristalliner Form in den in Tabelle II angegebenen Ausbeuten gewonnen wurde.

Beispiel 7

Es wurden 120 ml eines wäßrigen Nährmediums hergestellt, das folgende Bestandteile enthielt:

Natriumsuccinat 1,2 "„ (Gew./Vol.)

Caseinhydrolysat 0.2 "„ (Gew./Vol.)

Pepton 0.9 ",', (Gew. Vol.)

KH₂PO₄ 0,05"„ (Gew./Vöi.)

MgSO₄ · 7 H₂O 0,01 "„ (Gew., Vol.)

Das erhaltene Nährmedium wurde auf pH 7.0 eingestellt und in einen 500-ml-KoIben eingebracht. Nach Sterilisation wurde das Nährmedium mit einer Impf-

Tabelle II

kultur von Achromobacter pestifer IAM 1446 angeimpft und 26 Stunden wie in Beispiel 6 beschrieben bebrütet. Es wurden 120 ml Gärbrühe erhalten.

30 ml der Gärbrühe wurden gemäß Beispiel 6 auf gearbeitet, mit Asparaginsäure behandelt und auf L-Asparaginsäure-Zi-decarboxylase-Aktivität untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle II aufgeführt.

Zu 120 ml der oben angegebenen Gärbrühe wurden 36 g L-Asparaginsäure zugegeben und wie in Beispiel 6 beschrieben wurde 72 Stunden lang inkubiert und weitergearbeitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Beispiel 8

Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß 120 ml eines wäßrigen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung hergestellt und verwendet wurden:

Natriummalat 1.2",, (Gew..Vol.)

Caseinhydiolysat 0,2" (Gew. Vol.)

Pepton 0.9", (Gew. Vol.)

KHoPO₁ 0.05",, (Gew. Vol.)

MgSO₁ ■ 7 H₂O 0.01 "„ (Gew. Vol.)

Zur Bestimmung der Alanin-Bildung wurden statt 36 g Asparaginsäure nur 24 g Asparaginsäure in 120 ml Gärbrühe bebrütet Die erhaltenen Ergehnisse sind in Tabelle Il zusammengestellt.

Bei-	Achromobacter	Dicarbonsäure-	Bebrü-	L-Asparagin-	Zugesetzte Decarb-	(D)	(C)	(F)	(G)
<pel	pcstifcr-Stamm	salz	tungszeit	säurc-;7-decarb-	L-Aspa- oxylie-
			(h)	owlasc-Aktivilät	raginsäurc rungszeit
				(A) (B)	(g) (h) (C)

IAM 1446	Fumarat	20	3069	1023	48	24	32,2	100	29.4	92	:-14,2
					36	24	24,1	100	22,1	92	■i-14,3
ATCC 23584	Fumarat	20	1034	272	24	24	16,2	100	14.7	92
IAM 1446	Succinat	26	1750	985	36	72	24,0	99,6	22,3	92,6
IAM 1446	Malat	26	1680	890	24	72	15,7	97,8	14,5	90.3

Bemerkungen:

(A) Oco,/ml Gärbrühe (d. h. μΙ COj/tyml Gärbtühe)

(B) Ocf.ij/mg Protein (d. h. μΙ CO₂/h/mg Protein in der Gärbrühe)

(C) Menge (g) an im Reaktionsgemisch angereicherten L-Alanin

(D) Umwandlung (%) von L-Asparaginsäurc in L-Alanin

(E) Ausbeute (g) an kristallinem L-Alanin

(F) Ausbeute (% der Theorie) an L-Alanin, bezogen auf eingesetzte L-Asparaginsäure

(G) Spezifische Drehung [a]? (c = 4, 6 NHCl).

Die Ergebnisse zeigen, daß mit den erfindungsgemäß verwendbaren Stämmen von Achromobacter pestifer eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte L- Asparaginsäure -β-cecarboxylase - Aktivität erzielbar ist, wobei als weiterer Vorteil hinzukommt, daß beim Verfahren der Erfindung kein störendes, das erhaltene L-Alanin zersetzende oder racemisierende Enzym gebildet wird.

Beispiel 9

Es wurden 120 ml eines wäßrigen Nährmediunis hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt:

mit Natriumhydroxid neutralisierte Dicarbonsäure 1.2",, Gew.'Vol.

Caseinhydrolysat 0.2 "„ Gew. Vol.

Pcptoi ' '. 0.9"„ Gew./Vol.

K 11,PO₁ 0.05",, Gew.'Vol.

MgSCI₁ ■ 7 H„() 0,01 "_u Ge« Vol.

Das obige Medium wurde auf den in der folgenden Tabelle III angegebenen pH-Wert gebracht und in 500-ml-Schüttelflaschen eingebracht. Nach dem Sterilisieren wurde mit einer Impfkultur von Achromobacter pestifer IAM 1446 geimpft und das Medium bei 30 C die ebenfalls in der folgenden Tabelle angegebene Zeitspanne unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bebrütet. Es wurden 120 ml einer Fermentationsbrühc von Achromobacter pestifer IAM 1446

60 erhalten.

30 ml der Gärbriihc wurden zentrifugiert. Die auf diese Weise gesammelten Mikrobenzellen wurden gemäß Beispiel 6 in eine Lösung übergeführt, die l.-Asparaginsäure-/i-decarbo\\lase enthielt. 0.5 ml diescr Lösung wurden einer Mischung aus 2 ml einer wäßrigen 10 mM L-Asparaginsäiirclösung und 1 mi einer wäßrigen 1 M AcctatpufTcrlösung (pit 5.3) zugesetzt. Die Mischung wurde bei 30 C während einer

7 8

Zeitspanne von 10 Minuten inkubiert. Mit Hilfe eines mikrobiologische Untersuchung mit Leuconostoc ci-Warburg-Manometers wurde die Menge an Kohlen- trovorum ATCC 8081 bestimmt. Der Prozentsatz der dioxid bestimmt, die durch die Mischung erzeugt Umwandlung von L-Asparaginsäure in L-Alanin wird wurde. Daraus läßt sich die L-Asparaginsäure-/?-de- daraus berechnet. Dann wurde die Reaktionsmischung carboxylase-Aktivität berechnen. Die erhaltenen Werte 5 auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, zum Sieden ersind in Tabelle III aufgeführt. hitzt und nitriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat Eine Menge von L-Asparaginsäure, die in der fol- wurde durch eine mit einem stark sauren Kationengenden Tabelle 111 angegeben ist, wurde zu 120 ml austauscher (vernetztes Polystyrolgerüst mit SO₃H-der wie vorstehend angegeben erhaltenen Gärbrühe Gruppen) gefüllte Säule geschickt. Nach dem Eluieren zugefügt und das Gemisch bei 37" C bei pH 5,6 72 Stun- ίο mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat zur Trockne inkubiert. Die Menge des in dem Reaktionsgemisch eingedampft. Dabei erhielt man L-Alanin in kristalliner angesammelten L-Alanins wurde durch die übliche Form in den in Tabelle III aufgeführten Ausbeuten.

Tabelle	III	pH	Zeitdauer	L-Asparaginsäure-	(B)	Zugesetzte	(C)	(D)	(E)	(F)
Beispiel	Dicarbonsäuren		des	/3-Decarboxylase-	432	L-Aspara	4,0	99,6	3,5	87,2
			Züchtens	Aktivuät	900	ginsäure	7,8	97,2	7,1	88,4
			(h)	(A)	327	(g)	3,9	97,1	3,6	89,7
		7,2	72	595	315	6	4,0	99,6	3,7	92,2
9 a	Phthalsäure	8,4	72	1025	315	12	4,0	99,6	3,5	87,2
9b	Isophthalsäure	7,4	72	420	560	6	7,7	95,9	7,2	89,7
9c	Terephthalsäure	8,2	72	491	921	6	7,8	97,2	7,0	87,2
9d	Dipicolinsäure	7,0	72	570	890	6	7,8	97,2	7,2	89,7
9e	Oxalsäure	7,0	64	850		12
9f	Maleinsäure	7,0	48	1352	12
9g	Adipinsäure	7,0	48	1207	12
9h	Weinsäure

Leeende siehe Tabelle II.

Claims (2)

wichtigste Kohlenstoffquelle sowie andere geeignete Patentansprüche: Nährstoffe enthält, und Umsetzung der erhaltenen £ Gärbrühe mit L-Asparaginsäure gewonnen.

1. Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch Ein für das erfindurigsgemäße Verfahren geeignetes enzymatische Decarboxylierfng von L-Asparagin- 5 Nährmedium enthält etwa 0,5 bis 2% Dicarbonsäuren säure mit Hilfe einer durch Bärungeines L-Aspa- wie Fumarsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure oder raginsäure-/?-decarboxylase erzeugenden Mikro- deren Salze als einzige oder hauptsächliche Kohlenorgacismus in einem Nährmedium erhaltenen Gär- stoffquelle. Als Stickstoffquelle können anorganische brühe oder einer gereinigten Zubereitung der- Ammoniumsalze, z. B. das Chlorid, Phosphat oder selben, dadurch gekennzeichnet, daß io Sulfat zugesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden man in dem Nährmedium, welches eine Dicarbon- aber mit den Ammoniumsalzen der obi§;n organischen säure oder ein Salz davon enthält, einen Stamm von Säuren erzielt. Außer diesen Nährstoffen können 1 bis Achromobacter pestifer züchtet. 3% organische Stickstofflieferanten wie Maisquell-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- wasser, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinzeichnet, daß man die enzymatische Decarboxy- 15 hydrolysat oder Harnstoff und geringe Mengen Minelierung in Gegenwart eines oberflächenaktiven ralsalze wie Kaliumphosphat oder Magnesiumphosphat Mittels durchführt. zu dem Nährmittel zugesetzt werden.

Die Bildung der L-Asparaginsäure-/?-decarboxylase erreicht das Maximum, wenn das bakterielle Wachs-