DE1812710A1

DE1812710A1 - Verfahren zur Herstellung von Zitronensaeure durch Fermentation

Info

Publication number: DE1812710A1
Application number: DE19681812710
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Iizuka; Kazumitsu Ishii; Yoshikazu Nakajima; Junichi Shimizu
Original assignee: IIZUKA HOROSHI; SHIBAURA SEITO KK
Current assignee: IIZUKA HOROSHI; SHIBAURA SEITO KK
Priority date: 1967-12-19
Filing date: 1968-12-04
Publication date: 1969-07-03
Also published as: FR1595297A; DE1812710B2; DE1812710C3; US3622455A; GB1218476A; BE724553A

Description

DR. R. ΓΓ-s:"':■··>: !F. DER

DIPL-L,- .".. JLLER 1812710

8 MtK<:ul;N 80 /
Lucile-Giuha-üuafle 38
Teleton 443755

Dr.vdB/S

SHIBATJRA. SBITO KABUSHIKI KAISHA, 4, No. 6. 1-chome, Tori Nihonbashi, öhuo-ku, Tokyo (Japan) Hiroshi Iizuka, H, No. 5. 4-chome, Nishiochiai, Shin^uku-ku, Tokyo (Japan;

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch

Fermentation "

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Fermentation. Insbesondere bezieht sioh diese Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure in einer Kultur eines Stammes einer neuen Spezies Candida oleophila, der zur Gattung Candida gehört, in einem flüssigen, Zucker enthaltenden Kulturmedium unter aeroben Bedingungen, um Zitronensäure oder deren Salze in einer hohen Ausbeute in diesem Medium zu erzeugen und die Zitronensäure aus der KulturlÖeung zu gewinnen· Zweck vorliegender Erfindung ist es, die Zitronensäure oder ihre Salze in wirtschaftlicher Weise zu gewinnen.

Es wurde während der Studien über Petroleum assimilierbare Hefen und ihre Stoffwechselprodukte eine neue Spezies von Hefe gefunden, welche in großer Menge aus Kohlenhydraten als Kohlenstoff~

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quelle Zitronensäure bildet,.

Gegenstand vorliegender !Srfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure oder ihren Salzen mit dem kennzeichnenden Merkmal, daS ein zu einer neuen Spesiea gehäsrader Btaiam, Cjandida oleoj>hila nova : g%aoiaea unter agroben Bedingungen in einem Kulturmedium gesichtet wird₉ welches assimilierbare Kohlenhydrate und übliche Meutralisierungsiaittal, wis Oalclumoarbonat, in Verbindung mit anderen anorganischen- uad organischen Stoffen enthält und eine ^ro0e lienga Si trat erzeugt, welches aus der- £ul turf Ills aigke it gewonnen wird»

Die· taxonomischeu Chajcakterlstika äicasas MikroorganisinuB sind die

1) Wachstum in Malzextrakts Haet* drei $agea bei 25° C ovale od»,r läaglioh oval® Seilen la step ,aröüenordnuiig voi (2»5τ·5»Ο) χ (3₉Ο^5»Ό)/1 · Bs bildet «ion ©in klebriger₉ ausgedehnter Siag oder Belag auf der Oberfläche da® Kultun&editzsss aus» Dieser Hing oder Belag ist glatt ®ά®τ mnzlig und hell-bräunlich oramafarben» Keine Asooaporaa-j, jedoch Pseudomyceibildungo

2) Aufstreichimpfung auf Malzagars Mash 4rei Tagen bei 25° O iat die Aufatreioblapfung glatt und hell-bräunlich cremefarbig·" Dia ^orm der Zellen ist die gleiche wie in falle des Halsextrakts·

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Keine Aecosporen-, jedoch faeudomvcelbildung.

3) Plattenkulturί Pseudomycel bildet eioh gut auf Kartoffelagar.

4) Physiologische Eigenschaftenι

i) Optimale WaohBtumabedingungen: pH 5#2, Temperatur 30° 0, aerob.

ii) Assimilation von Kaliumnitrat: keine. "

iii) Koagulation von Milch; keine«

iv) Oemophile Eigenschaft (in 10 S&gern NaOl-Mediurn): keine.

v) Gelatineverflüeeigungi keine, vi) VitaminbedUrfnis$ keine, vii) Bildung von Karotinoidpigmenteni keine.

5) Assimilierbare Stickstoffquellen: Pepton, Aramoniumsulfat und Harnstoff. |

6) Fermentation; keine.

7) Zuokerassimilation:

Qlukoee +

Gralactose +

Sucrose +

Maltose

Lactose -

Stark» - - 4 -

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>y\\.^!ti\-s

θ) Äthanol ale einsige Kohlenotoffquell·! gutes Wacheturn.

9} Kerosin ale einzige Kohlenstoffquellet gutes Wachstum.

10) Arfcutinspaltungi keine·

11) Verteilung« Dieser Mikroorganismus verteilt sich in Heizpetroleumtanlce und dgl.

Die oben erwähnten taxonomisehen Eigenechaften stehen im Gegensatz zu dem, was in dem Buoh τοη Lodder und Kreger-vanitiJ ^W5?he Yeast¹¹ (1952) beschrieben ist, doch ist,obwohl der neue Mikroorganismus in die Gattung -Candida einklaeeifieiert worden iet, nichts in der entsprechenden Beschreibung dieser Spesiee erwähnt,, »it weichen der vorliegende Organismus identlflsiert werden kann. Anscheinend ist er eng verwandt mit der bekannten Spezies Candida rugoaa« doch unterscheidet er sioh klar von diesen in der Zuoker- _r assimilierungsfähigkeit und in der Bildung des klebrigen Ringe oder Belags im Felle der MaIsejctraktkultur.

Demgemäß wurde der naoh vorliegender Erfindung verwendbare Mikroorganismus ale neue Spesiee betrachtet, der zur Gattung Omndtda gehurt und den der Harne "Candida oleophila» gegeben worden iet.

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8AO ORIGINAL

Bine Kultur dee lebenden Mikroorganismus wurde am 13 ο November 1968 unter der ATCO-Immer 20 177 niedergelegt.

Nach der vorliegenden Erfindung kann jeder beliebige Stamm, der zu Candida olecphila gehört, für das vorliegende Verfahren verwendet werden. Es kann auch weiterhin jeder Organismus für das Yerfahren vorliegender Erfindung verwendet werden, ^ der als Mutante oder Variantejron Candida olejphila anerkannt werden kann und die oben erwähnten hauptsächlichsten mykologisohen Charakteristika besitzt.

Bei der üblichen industriellen Herstellung von Zitronensäure durch Fermentation wurden bisher Schimmelpilze verwendet und ale Kulturmedium meistens die Oberflächenkultur verwendet. Jedoch gewinnijdie submerse Züohtung immer mehr praktische Bedeutung. In der Submerskultur mit Schm Sohimmelpilzen sind jedoch wegen der Eigenschaften dieser Stämme* zu denen Aapergillua niger als ein { " typischer Stamm gehört, in höherem HaBe störanfällige Techniken für den fermentationsbetrieb erforderlich, wie sich äüö folgendem ergibtι

1) Die Fähigkeit des Stamme, Säure herzustellen, let sehr unsicher, und die Behandlung der fermentation ist nicht leicht.

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2) Ee besteht dl· Veigung, andere Säuren ale Zitronensäure herzustellen.

3) Bor niedrige pH-Wert des Mediums bei der Zitronensäureferaentation erfordert einen säurefesten Fermenter.

4) Was die zu verwendenden Zucker anbetrifft, weil eine Zuckerlösung τοη höherer Reinheit gefordert wird, ist es unerläßlich, die Nährmittelquelle unter Verwendung von Rohssuoker, entsalzter Melasse oder verzuckertem Stärkesirup genau eu regulieren.

5) Die Fermentationsdauer neigt da&u, sich in weiten Grenzen su verändern·

6) Um hohe Ausbeuten zu erhalten» let es ex* forderlich, die Fermentation unter ZufUgung von Methanol, Kallumferrocyanid oder dgl· auszuüben.

Nach dem Verfahren vorliegender Erfindung but Herstellung von Zitronensäure unter Verwendung eines zu Candida oleophila gehörenden Stammes können die genannten Schwierigkeiten und dl· störanfälligen lernentationseinrichtungen vermieden und die Gewinnung von Zitronensäure in sehr einfacher Weise erreicht wurden.

Die Kulturbedingungen der einen zu Oandida oleophila gehörenden Stami verwendeten fermentation

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SAD OR(GtNAL

urin auch die Bedingungen für die Gewinnung der Zitronensäure aus der Sulturflüssigkelt nach vorliegender Erfindung sind die folgendem

Dae nach vorliegender Brfindung verwendete flüssige Kulturmedium enthält außer Saooharlden eine Übliche Menge einer Stickstoffquelle, anorganische Salze (HährealBo), Vitamine und dgl· Die in dem flüssigen Medium vorsugeweiee ver- d

wendeten Kohlehydrate sind beispielweise Glukose, Fruktose, verssuokerter Stärkesirup» bewährte Melasse· Sogar schwaree Rohrsuckermelasse, von welcher gedacht wurde, daß ihre Verwendung für die Zitronensäure fermente tion adt AspergillUft schwierig sei, kann vorteilhaft in

säure nach vorliegender Erfindung uegewaade^t werden, und »war ohne Behandlung, wie eine Entsalzung, oder Zugabe von Kaliumferrocyanid oder Methanol.

Eb ist bisher in der Zitronensäurefernentaföon nit SöhiBnaelpileen ausgeführt worden, daß Rest«· Buoker sich veraehrt und die Ausbeuten an Zitronensäure durch Busäteliohen Zucker veraindert werden, wenn die Koneentration der Saooharide im Mediua höher ale 150 g pro Liter 1st (Presoott und Sonnt "Industrial Microbiology", J. Auflage (1959), Seite 535, fell· 18).

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Wenn ein zu Oandida oleoghila gehörender Stamm nach vorigegender Erfindung verwendet wird,
erhöht sich die Ausbeute an"Zitronensäure bei
bedeutend höheren Anfangszuckerkonssentrationen (200 g Zuoker/1 Medium), wie aue nachstehender Tabelle 1 ersiohtlioh ist.

Anfangszucker- koriisentration

■-■«'■■·■ Tabelle 1

Kultur TageJEemp.

Verbrauch
ter
Zucker

Auebeute an Zitronensäure

bezogen auf eingeh ν versetzten brauchten Zucker *·-*-·"*-

100 g/l 200 g/l

4 7

28° C 28° C

99,0 98,6

56,0 64,9

56,6

Die Ergebnisse in Tabelle 1 werden unter folgenden Bedingungen erhalten:

Der Xmpfstoff wurde durch Übertragung eines Stammes von Oandida oleopbila auf Hefe-MalB-Agarmedium und dann auf ein flüssiges Hefe-Malz-Hedium hergestellt· 2,5 ml-Anteile des erhaltenen Impfstoffes werden jeweils in eine 500 ml fassende
Sohtlttelflasche eingeimpft, welch jede 25 ml des nachstehenden Fermentationamediums enthält»

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BAD ORIQiNAL Glukoee 11Og oder 220 g

Peρton 5 g

Hefeextrakt 3 g Malzextrakt 3 g H^O ergänzt auf 1 1.

Nach Zugabe τοη öalciumcarbonat in einer Menge von 1,5 g, wenn die Konsentration an Glukose 100 g/l beträgt, oder 3,0 g, wenn die Konzen« tration an Glukose 200 g/l in jeder Flaeohe beträgt, wird die Fermentation bei einer Temperatur von 28° C und 135 3ohüttelungen/min mit einer Amplitude von 5 cm durchgeführt.

Tür daa Medium nach vorliegender Erfindung anwendbare Stickstoffquellen Bind beispielsweise anorganische und organische Ammoniumsalze, wie z.B. Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumohlorid, Ammoniumsulfat oder Ammoniumaoetat, Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maiseinweiohwässer, Fischmehl und dessen Verarbeitungsprodukte, Sojabohnenkuohen und seine Verarbeitungsprodukte und dgl. Diese können einzeln oder in Hisohungen yon zwei oder mehr Produkten verwendet werden.

Bei der einen Stamm von Candida oleophila nach vorliegender Erfindung verwendeten Zitronensäurefermentation gibt es ein Optimum bezüglich der dtioketoffhöhe zwischen ungefähr 0,5 und unge-

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- ιυ -

fähr 1,0 g assimilierbaren Stickstoffs pro Liter Hediura in Verbindung mit der Menge der assimilierbaren Stickstoff aufweisenden Quelle und der Ausbeute an Zitronensäure, wie aus der nachstehenden Tabelle 2 ersichtlich ist« Um die Stickstoffhöhe des Mediums in der Submerekultur zu kontrollieren, kann die Erhaltung der maximalen Anzahl von Zellen des besagten Organismus in dem Medium auf etwa 8 χ 10⁸ bis -1 χ 1O⁹ Zellen/ml dienen.

	Tabelle 2	der Stickstoffquelle	Zitronensäure ausbeute (s/i)
Wirkung der	Konzentration	die Zitronensäureausbeute	104 120 116 88
auf		Restlicher Zucker (g/l)
*) 'll-kpnz. (mg/1)	65,4 1,6 1,6 2,0
465 697 950 2 200

*)
'Konzentration von assimilierbarem Stickstoff

Die Ergebnisse in Tabelle 2 werden unter folgenden Bedingungen erhalten.

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SAO ORiGiNAt

Die Versuohe wurden mit 300 ml Sobüttölflüsohen durchgeführt, von denen jede 25 ml des folgenden Fermentationsmediums enthielt:

Glukose 200 g

0,2 g

₄7HgO 0,2 g HnS(VnH₂O 0,2 g Thiamin-H01 2 mg Nicotinsäure 0,2 mg

Harnstoff wurde zugefügt, um eine Stickstoff.-konzentratlon wie in Tabelle 2 angegeben au erhalten«und mit Wasser auf 1 000 ml aufgefüllt.

Der Impfstoff des Stammes von Candida oleophila wurde in ^ede Flasche eingeimpft und dann nach Zugabe von jeweils 2,5 g Oalciumcarbonat die Schüttelkultür bei einer temperatur von 28° C sieben Tage lang 135 Schüttelungen pro Hinute bei einer Amplitude von 5 cm ausgesetzt. !Cabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

Ale anorganische Baisse, die zu dem flüssigen Medium zugefügt werden können, kann man Phosphate und Kagnesiumsalze rervenden, die für das v/achstum des Mikroorganismus erforderlich Bind.

- 12 -

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~ 12 -

Außer den oben erwähnten Beatandteilen können

MaiaeinweichwäBBer, Hefeejctrakte und Vitamin®, wie beispielsweise Ihiasiin und Nikotinsäure_f zu dem Medium zugefügt werden. Auch kann man C&lciumcarbonat verwenden, um die hergestellten Säuren zu neutralisiere»»

Die Züchtung nach vorliegender Erfindung wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen zwischen ungefähr 22 und ungefähr 33° und bei pH-W©rten zwischen ungefähr 4,0 und 8,0 während einer Dauer von ungefähr 3 bie 7 Sagen durchgeführt.

V/äs daa aerobe Züchtungsvsrfahren anbetrifft, so kann eine Oberflächen-, Sehüttel-» oder submerse Züchtung verwendet werden§ Jedoch iet die submeree Züchtung unter Rtüaran und Belüftung üblich.

Bie Belüftungsmenge beträgt etwa das 1/8-bie 2-fache des Volumens des Mediums pro Minute» und die Behälteraüohtung kann bei atmosphärischem oder erhöhtem Druck geführt werden.

Mach der vorliegenden Brfinduüg fällt die hergestellte Zitronensäure am JSnde der Fermentation in Form von Calciumnitrat in dem Kulturmedium durch d ae Hinzufügen von oalciumcarbonat an.

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BAD ORIGINAL.

Um die Zitronensäure aus der KuIturflüeaigkeit au gewinnen, ist ee üblich, das Calciumnitrat und die in dem Kulturmedium suspendierten HefezeHeη gleichzeitig mittels Filtration zu sammeln. Nuoh Waschen wird dem Filterkuchen eine geeignete Menge Schwefelsäure augefügt, um die Zitronensäure in Freiheit zu setzen und aufzulösen, und anschließend das unlösliche, aus Calciumsulfat und Hefezellen bestehende Material durch Filtration abzutrennen. "

Nach Behandlung mit Bntfärbungskohle oder Ionenaußtauschharzen wird das Filtrat konzentriert und die ausgeschiedene Zitronensäure gesammelt. Hach einem wahlweise anwendbaren Verfahren werden Caloiumzitrat und Hefezellen aus dem Medium gleichzeitig durch Filtration abgetrennt. Nach Waschen wird der Filterkuchen in V/aeser suspendiert und zur Suspension eine gewisse Menge Ohlorwasserstoffsuure hinzugefügt, um Zitronensäure in Freiheit zu setzen, und dann werden die Hefezellen durch Filtration abgetrennt· Nach Entfärbung mit Aktivkohle oder i Ionenaustauschharz für die Entfärbung wird das Filtrat mit konzentrierten wässrigen Ammoniak versetzt, so daß die Heaktionslösung schwach alkalisch reagiert, dann zum Sieden erhitzt und schließlich das ausgefüllte Caloiumzitrat gesammelt.

In der nach dem Verfahren vorliegender Erfindung erhaltenen FermentationsflUseigkeit bildet sich

-H-

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.»■■■i..^<- BAD

-H-

kaura Oxalsäure und auoh die Brseuguiag toe anderen organischen Säuren ala Zitronensäure wurde im Gegensatz zu der herkömmlichen eine zur Aspergillus-Art gehörenden glchimmolpllss verwendendenZitroneneäure-Ferraentation kaum beobachtet.

Die mit vorliegender Erfindung technischen Fortschritte und Wirkuagan werden folgt zusammengefaßt:

1) Die nach vorliegender Erfindung verwendeton zu Candida oleophila gehörenden Stämme weisen eine in hohem Maße beständige Fähigkeit zur Säureherstellung auf, und die Behandlung der Mikroorganismen ist ganss leicht.

2) Nach vorliegender Erfindung Ieöhtoö Anfang©- zuckerkonaentrationen von ungefähr 170 g/l anwendbar und die Fermentation innerhalb ungefähr 96 Stunden beendet eein$ deshalb kann ein geringerer operativer Aufwand für dae vorliegende Verfahren verwendet werden verglichenmit dem,» der bei den herkömmlichen Verfahren für die Herstellung von Zitronensäure durch Fermentation erforderlich war.

3) Bach vorliegender Erfindung kann die Fermentation zufriedenstellend bei einem pH-Wert von ungefähr 6 anstatt bei niedrigeren pH-V/erten, die beim Stand der Seehnik üblich

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ÖAO ORtQlNAL

warmer reicht werden, und man kann weiterhin preiswertere Materialien für das bei dem beanspruchte Verfahren verwendbare Jermentationagefäö verwenden.

4) Bezüglich der nach dem vorliegenden Verfahren der Kulturflüeaigkeit zugesetzten Zucker können Glukoae, Fruktose, verzuckerter Stärkesirup, bewahrte Melassen, schwarze Eübenzuoker- g raelassen, schwarze itohrzuokermelassen allein oder in Mischung von zwei oder mehreren verwendet werden.

5) Wenn gemäß vorliegender Erfindung ein Oligosaccharid, wie beispielsweise bewährte heiasaen, schwarze Rübenzuekermelassen, schwarze Hohrzuckermelassen und Rohzucker in dem Medium verwendet werden, können sowohl Inversione-als auch Sterilisationsbehandlungen gleichzeitig mit einer starken Säure oder mit einer Entkationisierungsbehandlung

bei einer Temperatur von oberhalb 80° 0 g

ausgeführt werden.

6) Hach vorliegender Erfindung kann man schwarze Kohrzuckermelassen, von denen man annahm, daß sie bei der Verwendung in der Zitronensäurefermentation mit einem au Aeperglllua niger gehörenden Stamm «ehr große Schwierigkeiten verursachen, ohne Durchführung von Reinigungebehandlungen, wie beispielsweise

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j '8AD

Entsalzung, Behandlung nit Kaliumferrooyunld, Behandlung und Züfttgung von Methanol» verwenden, um in zufriedenstellender Weise Zitronensäure zu erhalten.

7) Nach vorliegender Erfindung werden andere Säuren als Zitronensäure, Insbesondere Oxalsäure, während des Torf ahrens zur Herstellung der Säure kaum erzeugt, im Gegensatz zum Stande der Technik, bei dem zu Aspergillua nlger gehörende Stämme verwendet werden, und außerdem ist demgemäß die Gewinnung von Zitronensäure ganz leicht.

8) Das beanspruchte Verfahren kann entweder diskontinuierlich oder kontinuierlich durohgeführt werden·

9) Haoh der vorliegenden Brflndung kann man Zitronensäure oder ihre Salze in wirtschaftlicher Weise erhalten.

Beispiel 1

Der Impfstoff wird durch Inkubation eines zu Candida oleophila gehörenden Stammes bei 28° C nach 24 Stunden mittels einer SohUttelkultur in 500 ml fassenden Sakaguchi-PlaeQhen hergestellt, von denen jede 100 ml der alt Dampf sterilisierten und die nachfolgende Zueaamen-

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BAD ORIGINAL

setzung aufweisenden KulturflUssigkeit ent hält:

Gewicht/Yol.-#

Glukose 5

Harnstoff 0,2

KH₂PO₄ 0,02

₄₂0 0,02

HnSO₄-IiH₂O 0,025

Hefeextrakte 0,5 %

pH 6,0

400 ml des oben erhaltenen Impfstoffes werden für die Beimpfung des Fermentationsmediums verwendet.

Das Fermentationsmedium wird bereitet durch Auflösen von 2 400 g Glukose, 2,4 g KH₂PO₄, 2,4 g MgSO₄'7H₂O und 3,0 g HnSO₄-IiH₂O in ungefähr 9 1 Wasser, Sterilisieren der erhaltenen Lösung mit Dampf bei 120° C während 15 Minuten in einem 30 1 Permentationsgefaß

und nach Abkühlung auf 28° C durch Zufügen von I

10 g Harnstoff, 60 g Maiseinwsichwasser und 1 300 g CaCO.,. Jede dieser drei 3t*etanzen ist vor der Zugabe zu der Lösung sterilisiert worden. Schließlich wird mit wasser auf 11,6 aufgefüllt und dann die Mischung gerührt, um so viel wie möglich in Lösung zu bringen. Das so erhaltene Kulturmedium wird mit dem oben

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BAD

- 18 erhaltenen Impfstoff gelupft.

In der- Kauptfermentationsatufe wird die Anfangsauolfierkonisentration auf 20 Gewichtsteile pro VoI*-$ and der anfängliche pH-Wert der Flüssigkeit auf 6,8 eingestellt.

Alsbald nach der Beimpfung beginnt die Fermentation unter einer BelUftun^sgeachwindlgkelt von 4 l/m und einer Rtihrgeachwindigkeit von 400 Umdrehungen/inin bei 28° 0. Diese Bedingungen werden bi3 aur Vervollständigung der Fermentation aufrechterhalten.

Nach 24stündiger Kultivierung erreicht die Hikroorganieraenbewaohaung das Maximum von 1 χ 10' Zellen/ml. Danach eaiamelt sich die Zitronensäure in der KuIturflüssigkeit sohneil als Calciumealz,und die Fermentation let nach einer Geaamtdauer von 96 Stunden vervollständigt.

Die Zitronensäure- und Zuckerbestimmung in der Flüssigkeit während der Fermentation iet In !Tabelle 3 gezeigt.

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8AD

Kulti- seit	- HeBt- zucker (fi/l)	Zitronen säure (fi/1)	Ausbeute in fr, auf dem ver brauchten Zucker beruhend
O	200
24 .	175	8,7	35
48	105	59,5	62,6
72	38	121,8	75,2
96	3	152,7	77,5

Nach Abtrennung dee so erhaltenen Calciuiazi träte, der Hefezellea und dee überschüssigen Calciumcarbonate¹ durch Filtration und anschließendem Waschen v/ird die Zitronensäure aus dem Filterkuchen duroh Zufügung von Schwefelsäure in Freiheit gesetzt und dann die Hefezellen und das ausgefällte Calciumsulfat abfiltriert· Nach der Neutralisierung mit Kalkmilch wird das FiItrat zum Sieden erhitzt, um Oalciumzitrat auszufallen.

!Die Ausbeute an Caloiumzltrat ist wie folgt ι

Rohee Calciumnitrat

Reinheit (als wasserfreie Zitronensäure berechnet)

Ausbeute, auf den etugeftigten Zuckern beruhend (als wasserfreie Zitronensäure)

2 530 g 65,8 $

69,5 $ - 20 -

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BAD ORJGWAL Beispiel 2

Öchwarse PhilippinearohrsuokermelaBsen (Gesamtaucker 58,4 #, Aeche 8,68 #, assimilierbarer Stiekotoff 0,097 #·) werden mit Wasser auf das awe if ache Volumen verdünnt und dann mit Schwefelsäure bis aur Erreichung eines pH-V/ertes von 1,5 versetzt. 3Ja.cn ßer Inversion und Sterilisierung bei einer temperatur von ungefähr 85^ 0 während 40 lünutea wird die Lösung durch'Zugabe -you Kalkmilch auf einen pH-l/ert von 6,8 neutralisiert· Nactot iibfiltrieren des auegefallenen Oaloiumsulfats wird das IPiItrat als Zuckerquelle für die j?erraentation verwendet. Es werden 4-00 ml dee entsprechend Beispiel 1 inlcubierten Impf~ stoffes verwendet. Die 2 400 g Zucker, berechnet als Glukose, enthaltende Henge der schwarzen Rohrzuckermelassen wird in ein 30 1 fassendes Permentationegefäß Überführt, welches zuvor mit Dampf sterilisiert und auf 28° 0 abgekühlt worden war. Man fugt vorher sterilisierte 12 g Harnstoff und 1 240 g Calciumcarbonat und dann sterilisiertes Wasser hinzu, so daß das Gesamtvolumen 11,6 beträgt, worauf die Beimpfung mit dem Impfstoff erfolgt. Die Anfangszuckerkonzentration des Mediums beträgt 20 Gewichtsteile pro VoI»-$.

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909827/1108 8AO ORtQiNAL

Nach der Beimpfung wird die Fermentation unter den Bedingungen einer Belüftungegeachwindigkeit von 4 l/min und einer fiührgeechwindigkeit von 400 Umdrehungen/min bei 28° 0 ausgeführt.

Nach 24ßtündiger Kultivierung erreicht die Anzahl der Zellen des Maximum von 8 χ 10 Zellen pro ml, und die Zitronensäure eammelt sich in dem Medium schnell als Calciumsalz an. Nach 96etündiger Inkubation ist die Fermentation vervollständigt.

Die Untersuchungen während der Kultivierung sind in. der nachstehenden Tabelle 4 dargelegt;

!Tabelle 4

Kultivie- runga- zeit Cötd.)	Rest zucker (ß/1)	Zitronen säure (s/l·)	Ausbeute in Jw, auf dem ver brauchten Zucker beruhend
O	200
24	182	4,0	22,2
48	145	26,1	47,5
72	48	89,2	58,7
96	13	121,5	65,0

Nach Abtrennung des Calciumnitrate, der Hefezellen und des überschüssigen Calciumcarbonate (in der KuIturlösung) durch ^titration und

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nach waschen wird die Zitronensäure mm üem filter kuchen durch Zufügung von Chlorwiisaerstoffsäurs in Freiheit gesetzt und naoh Abfiltrieren der Hefezellen das Plltrat mit konzentriertem Ammoniak neutralisiert und anschließend, zum Sieden erhitzt, um das Calciumnitrat auszufällen. Die Ausbeute an Calciumnitrat ist wie folgt:

Rohes Calciumnitrat 2 100 g Reinheit (berechnet als

wasserfreie Zitronensaure) 65<4 >i

Ausbeute, auf den zugefügten Zuckern beruhend (berechnet als Zitronensäure ) 57»1 5*

- Patentansprüche- - 23 -

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Claims

- 23 Patentansprüche

1· Verfahren aur Herstellung von Zitronensäure oder ihren balken, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm, der der neuen Spezies Candida oloophila nova apeciea augehört, unter aeroben Bedingungen An

einer Kulturflüssigkeit züchtet, welche ^

assimilierbare Kohlenhydrate und übliche lißutralisierungsjBittel, wie Calciumcarbonat, in "Verbindung mit anderen anorganischen und organischen Bestandteilen enthält, um eine große Menge von Zitrat anzusammeln und daß man das Zitrat aus der Kulturflüssigkeit gewinnt.

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer !Temperatur im Bereich von 22 bis 33° C auegeführt wird.

3, Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem pH-Wert im Bareich von 4 bis 8 durch anfängliche Zugabe oder gelegentliche Zugaben von einer geeigneten Henge eines NeutraliBierungBinittele ausgeführt wird.

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4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, daduroh gekennzeichnet, daß die Kultivierung einem Fermentationsgefäß mit einer eingestellten fielüftungsgeschwindigkeit ausgeführt wird, die ungefähr dem 1/8- bis annähernd 2-fachen Plttssigkeitsvolumen prp Minute entspricht·

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4» da» durch gekennzeichnet, daß die Anfangszuckerkonzentration in der KulturfItiesigkeit oberhalb 100 g/l, insbesondere oberhalb 170 g/l, berechnet als Glukose, liegt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dag die Anfangskonzentration des assimilierbaren Stickstoffs in der KuIturflüssigkeit auf eine geeignete Höhe im Bereich von 0,5 biß 1,0 g pro Liter eingestellt wird, so daQ das Populationsmaximum der kultivierten Zellen in der Flüssigkeit in einen Bereich von 8,0 bis 10 χ 10⁸ Zellen/ml fällt.

7· Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in einer KuIturflüssigkeit ausgeführt wird, die bewährte Piß lassen, schwarze liübenzuckercelaBsen, schwarze Rohrauckermelassen oder Rohzucker enthält, welche gleichzeitig durch Behandlung mit einer starken.Säure und Kationenaustauschharz bei einer temperatur von ungefähr 80 C sowohl hydrolysiert als auch sterilisiert werden.

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