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Verfahren zur biochemischen Herstellung von 2-Keto-l-gulonsäure Die
vorliegendeErfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-l-gulonsäure
durch biologische Oxydation von 1-Idonsäure oder einem nicht toxischen 1-Idonat.
Der Ausdruck »nicht toxisches Idonat« umfaßt Metallsalze der Idonsäure, z. B. Salze
mit Alkalimetallen, Ammoniak und Aminen, die den Stoffwechsel des die Oxydation
bewirkenden Organismus nicht beeinträchtigen, sowie Ester einfacher Alkohole, z.
B. des Methanols und Äthanols. Ein Minimum an einfachen Testversuchen zeigt, ob
ein bestimmtes 1-Idonat toxisch ist oder nicht.
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Das Produkt der Erfindung, die 2-Keto-l-gulonsäure, ist eine sehr
wertvolle Verbindung. Dies geht aus der Tatsache hervor, daß 2-Keto-l-gulonsäure
ein Zwischenprodukt bei der gegenwärtig technisch angewandten Synthese der Ascorbinsäure
darstellt.
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Die biochemische Oxydation von 1-Idonsäure oder einem 1-Idonat zu
2-Keto-l-gulonsäure ist bereits bekannt. Zur Durchführung dieser Oxydation werden
in der Literatur die folgenden Mikroorganismen als geeignet angegeben: Pseudomonas
mildenbergii, Cyanococcus chromospirans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorscens
und Acetobacter suboxydans var. melanogenum.
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Es wurde nun gefunden, daß die Umwandlung von 1-Idonsäure zu 2-Keto-l-gulonsäure
mit einem Gemisch zweier Organismen ausgeführt werden kann. je eine lebende Kultur
dieser Organismen wurde bei der »American Type Culture Collection« in Washington,
D. C., unter den Nummern ATCC 11867 -bzw. ATCC 11868 hinterlegt.
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Es ist nicht sicher, ob diese beiden Organismen verschiedene Arten
oder einfach Varianten der gleichen Art darstellen. Bei beiden handelt es sich um
einen gramnegativen gradzelligen Organismus, und beide wandeln Nitrat in Nitrit
um. Beide Organismen erzeugen keine Endosporen, verflüssigen Gelatine nicht und
bilden kein Indol. Wenn das Gemisch auf Agarplatten bei 28° gezüchtet wird, kann
man zwei Arten von Kolonien beobachten. Die eine Kolonie ist hellgelb (ATCC 11867),
die andere farblos und durchscheinend (ATCC 11868). Wird das Gemisch bei 37° gezüchtet,
dann erhält man nur die farblose durchscheinende Art. Überraschenderweise wandelt
allein keiner der beiden Organismen 1-Idonsäure in merklicher Ausbeute in 2-Keto-l-gulonsäure
um, während mit dem Gemisch die Reaktion praktisch quantitativ verläuft.
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Es war nicht möglich, die Organismen in irgendeine der in Bergeys
Determinative Bacteriology, 6. Auflage, angeführten Klassifikationen einzuordnen.
Offensichtlich gehören die Organismen zu einer neuen Art oder vielleicht zu zwei
neuen Arten. Sicher ist jedoch, daß beide Organismen von allen bisher bekannten
Organismen verschieden sind, die die genannte Reaktion bewirken sollen. Es ist auch
sicher, daß zum ersten Mal ein Gemisch von Organismen für die Durchführung dieser
Gärung verwendet wird.
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Eine gemischte Kultur von ATCC 1.1867 und ATCC 11868 hat mehrere bemerkenswerte
Eigenschaften, die sie für die Herstellung von 2-Keto-1-gulonsäure in technischem
Maßstab außerordentlich geeignet machen. Die Umwandlung der 1-Idonsäure erfolgt
praktisch quantitativ, und das gebildete Produkt ist leicht zu reinigen. Das Gemisch
der Organismen ist leicht zu züchten. Wichtig ist außerdem, daß das Gemisch ohne
besonderes Anpassungsverfahren die Reaktion mit ausgezeichneter Ausbeute bewirkt.
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Ziel der Erfindung ist es, 2-Keto-l-gulonsäure herzustellen, indem
man 1-Idonsäure oder ein nicht toxisches 1-Idonat dem beim Züchten eines Gemisches
aus ATCC 11867 und ATCC 11868 erzeugten oxydierenden System aussetzt. Dieses Ziel
kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Beispielsweise kann das Gemisch unter
aeroben Bedingungen auf einem sonst sterilen, 1-Idonsäure oder 1-Idonat enthaltenden
Nährmedium gezüchtet werden. Es kann aber auch einem derartigen Medium, in dem eine
Kultur gezüchtet wurde, 1-Idonsäure oder ein 1-Idonat zugesetzt werden. Die Reaktion
kann auch durchgeführt werden, indem man 1-Idonsäure oder ein 1-Idonat der Einwirkung
einer Suspension von derart gezüchteten
Zellen oder einer zellfreien
Gärlösung, in der das Gemisch gezüchtet worden war, aussetzt. Das Gemisch kann auch
auf einem sonst sterilen festen oder halbfesten Nährboden kultiviert werden, dessen
Extrakt man dann zur Umwandlung verwendet. Andere Abwandlungen ergeben sich für
den Fachmann von selbst. All diese Verfahren fallen unter den Ausdruck »dem beim
Züchten eines Gemisches aus ATCC 11867 und ATCC 11868 erzeugten oxydierenden System
aussetzt«.
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Jeder einzelne Organismus oder das Gemisch der beiden Organismen kann
leicht auf den üblichen Nährmedien, die man gewöhnlich für das Studium von Bacterien
verwendet, gezüchtet werden. Zum Beispiel kann ein flüssiges Nährmedium verwendet
werden, das als Kohlehydratquelle Dextrose, anorganische Salze, z. B. Kaliumphosphat
und Magnesiumsulfat, eine Proteinquelle, z. B. Pepton, und wachstumsförderndle Substanzen,
z. B. Hefeextrakt, enthält. Die Kultivierung kann auch leicht auf üblichen Agar-Schrägnährböden
durchgeführt werden.
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Ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-l-gulon säure wird nachfolgend
beschrieben. Einer Lösung, die Nährstoffe wie Dextrose und Hefeextrakt enthält,
wird 1-Idonsäure oder ein nicht toxisches 1-Idonat zugesetzt. Anschließend wird
sie mit einer gemischten Kultur von ATCC 11867 und ATCC 11868, die zuvor auf Agar-Schrägnährböden
oder in einem flüssigen Nährmedium kultiviert wurde, geimpft. Die Gärlösung wird
unter aeroben Bedingungen bei etwa 25 bis 30° geschüttelt. Die zur Durchführung
der Reaktion erforderliche Zeit ist von der Impfstoffmenge abhängig. Im allgemeinen
wird eine gute Umwandlung in etwa 34 Stunden erzielt, wenn man zu 100 ccm eines
Gärgemisches 1 ccm eines 48 Stunden alten Impfstoffs zusetzt.
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Es wurde nun gefunden, daß das Fortschreiten der Reaktion mittels
eines Farbtestes mit o-Phenylendiamin-dihydrochlorid verfolgt werden kann. Es wird
angenommen, daß dieses Reagens unter den folgenden Bedingungen für 2-Keto-hexonsäuren
spezifisch ist. Das o-Phenylendiamin-dihydrochlorid wird in einer 2,5prozentigen
wäßrigen Lösung verwendet. Eine Probe des Reaktionsgemisches-wird so verdünnt, daß
sie 25 bis 100 y Produkt je ccm enthält. Die verdünnte Probe wird dann mit dem o-Phenylendiamin-dihydrochlorid
behandelt, wobei das Volumen des Reagens etwa halb so groß ist wie das der Probe.
Das Gemisch wird auf einem Wasserbad 1/2 Stunde erhitzt. Nach dem Abkühlen wird
das Gemisch in ein Beckmann-Spektrometer gebracht; die Messungen erfolgen bei 330
mI,. Bei dieser Wellenlänge besteht eine lineare Beziehung zwischen der Konzentration
der 2-Keto-1-gulonsäure und der optischen Dichte der von der Probe hervorgerufenen
Linie. Beispiel Eine Kultur eines Gemisches von ATCC 11867 und ATCC 11868
wurde 48 Stunden auf einer Nährlösung gezüchtet, die 0,25% Hefeextrakt enthielt.
Die Verwendung des Hefeextraktes ist zweckmäßig jedoch nicht notwendig. 1 ccm dieser
Brühe wurde als Impfstoff zu 100 ccm eines wäßrigen Gärgemisches zugesetzt, das
in Gewichtsprozent die folgende Zusammensetzung hatte: 2% Natriumsalz der 1-Idonsäure,
0,1% Dextrose, 0,50/a Hefeextrakt.
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Der nicht eingestellte p11-Wert dieses Gemisches betrug 7. Das Gemisch
wurde unter aeroben Bedingungen auf 28° gehalten. Nach Ablauf von 34 Stunden wurde
2-Keto-l-gulonsäure nach dem folgenden Verfahren isoliert: Die Gärlösung wurde durch
Eindampfen auf etwa ein Viertel ihres ursprünglichen Volumens konzentriert. Der
pH-Wert, der auf etwa 7,7 gestiegen war, wurde mit Essigsäure auf etwa 4 herabgesetzt.
Dann wurde Natriumhydroxyd zugesetzt, um den pH-Wert auf etwa 7,5 zu bringen. Diese
Methode wird angewandt, um die Bildung von Ammoniumsalzen zu verhindern, die sich
aus dem beim Stoffwechsel der stickstoffhaltigen Salze entstehenden Ammoniak bilden
könnten. Dann wurde so viel Methanol zugesetzt, daß 7011/o des Gesamtvolumens aus
Alkohol bestanden. Man erhielt einen Niederschlag aus dem Natriumsalz der 2-Keto-l-gulonsäure,
der durch Filtrieren gewonnen wurde. Die Ausbeute war praktisch quantitativ. Die
Behandlung des Salzes mit einer nicht oxydierenden starken Säure, z. B. Salzsäure,
ergab die freie Säure.
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Es sind viele naheliegende Ausführungsformen der Erfindung möglich.
Das vorstehende Beispiel dient nur zur Erläuterung und soll die Erfindung nicht
beschränken. Bezüglich der Zusammensetzung des Nährmediums sind weitgehende Änderungen
möglich, da die vorstehend aufgeführten Bestandteile für derartige Medien nicht
zwingend sind. Auf ähnliche Weise, wie oben an Hand des Natriumsalzes beschrieben,
kann 1-Idonsäure oder ein nicht toxisches 1-Idonat verwendet werden.