DD221905A1

DD221905A1 - Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten

Info

Publication number: DD221905A1
Application number: DD83256281A
Authority: DD
Inventors: Herrmann Seim; Heinz Loester; Reiner Claus; Hans P Kleber; Erich Strack
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-11-03
Filing date: 1983-11-03
Publication date: 1985-05-08
Also published as: EP0148132A3; EP0148132B1; ATE46189T1; KR850004502A; EP0148132A2; DE3479670D1; DD221905B1; US5028538A; JPS60137295A; CA1244788A; KR870002073B1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verfahren zur Herstellung von L(-)-Carnitin. Sie hat das Ziel, in ökonomisch vorteilhafter Weise die Herstellung dieser Verbindung auf biochemischen Weg zu ermöglichen. Die Aufgabe besteht darin, ein neues und technisches gangbares Verfahren aufzuzeigen, um L(-)-Carnitin aus leicht zugänglichen Ausgangsstoffen herzustellen, wobei die Reaktionsbedingungen und die Abtrennung von Begleitstoffen unkompliziert sein sollen. Die Aufgabe wird gelöst durch den Einsatz von Bakterien, die Crotonobetain in L(-)-Carnitin verwandeln.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von L(-)-Carnitin und seinen Derivaten

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des optisch - aktiven L(-)- bzw. R(-)-Carnitins aus einer optisch - inaktiven Vorstufe. L(-)-Carnitin (3-Hydroxy-4-trimethylarainobutyrat) ist ubiquitär im !Pierreich verbreitet und auch in Pflanzen nachgewiesen worden. Es spielt bei der Oxidation von langkettigen Fettsäuren in den Mitochondrien eine entscheidende Rolle. Die Energiegewinnung aus der Hauptenergiereserve der Säugetiere und des Menschen, den langkettigen Fettsäuren, via mitochondriale ß-Oxidation ist an das Vorhandensein von L(-)-Carnitin gebunden. Die innere Mitochondrienmembran ist für die aktivierten Fett-

ι.

säuren in Form von Acyl-Coenzym A nicht permeabel, so daß die Übertragung der Fettsäure auf das L(-)-Carnitin erfolgen muß, da die Acyl-L(-)-carnitine die Permeabilitätsschranke überwinden können. Dieser Schritt ist Geschwindigkeits-bestimmend für den Ablauf der ß-Oxidation.

Kommt es zu einem Mangel an L(-)-Carnitin, so wird die mitochondriale ß-Oxidation stark gehemmt, es bilden sich L(-)-Carnitinmangel-Syndrome heraus, die in den Kliniken durch Substitutionstherapie mit L(-)-Carnitin behandelt werden (Übersicht: "Carnitine biosynthesis, metabolism, and functions." Hrsg.: R₀A. Frenkel and J.D. McGarry,

, 1 9A\(\ 1 Γι

Academic Press 1980)·

Da die notwendigen L(-)-Carnitin-Mengen nicht bereitgestellt werden konnten, wurde vielfach mit dem racemischen DL-Carnitin substituiert, das zwangsläufig bei der chemischen Totalsynthese des Carnitins anfällt. Dieses DL-Carnitin enthält aber die unphysiologische D(+)-Komponente und es zeigten sich Nebenwirkungen, die nach Anwendung' von reinem L(-)-Carnitin nicht auftraten (Gurr· Ther. Res. 28 (1980), 195-198).

Es ist auch bekannt, daß die für die Funktion des L(-)-Carnitins notwendigen Transferasen, die Carnitin-Acetyl-Transferase (BC 2.3.1.7) und die Carnitin-Palraitoyl-Transferase (EC 2.3.1.21) rein L(-)-spezifisch sind, während das D-Isomere hemmend wirkt. Durch Applikation von D-Carnitin kann es außerdem zur Depletion von L(-)-Carnitin aus dem Herz- oder Skelettmuskel kommen, wie bei Versuchstieren nachgewiesen wurde (Life Sciences 2i3 (1981)_v 2931-2938). Die unter L(-)-Carnitin-Behandlung gebesserten Symptome bei menschlicher Hyperthyreose verschlechterten sich unter D-Carnitin drastisch (Sndokrinologie ^8 (1959), 218-225). Die Acyl-D(+)-carnitine werden in der biochemischen Forschung als Blocker der mitochondrialen ß-Oxidation eingesetzt. Pharmakokinetik und Katabolite der beiden optischen Isomeren des DL-Carnitins unterscheiden sich ebenfalls beträchtlich, so daß für die Behandlung von Patienten heute nur noch das L(-)-Carnitin verwendet werden kann.

Dies gilt auch und insbesondere bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz, die keine Möglichkeit zur aktiven Ausscheidung der D-Komponente haben. Bei einem Molekulargewicht von 161,2 wird das endogene L(-)-Carnitin den Patienten in den DialyseZentren mit dem Dialysat ausgewaschen und so ein sekundärer Carnitinmangel induziert. Orale Substitution oder L(-)-Carnit^ugabe zur Spüllösung verhinderte die Carnitindepletion bei Patienten. "

Bei den in den Industrieländern verbreiteten Hyperlipoproteinämien wurde mit L(-)-Carnitin eine signifikante Senkung des Plasmaspiegels der Risikofaktoren Triglyceride und Cholesterol erzielt (Lancet II (1978), 805-807)· Gleichartige V/irkungen ließen sich auch bei Anwendung von Acylcamitinen erreichen (DB-OS 29 03 579).

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen.

Seit der Entdeckung des L-Carnitins im Muskel gewinnt man L(-)-Carnitin in aufwendigen Isolierungs- und Reinigungsverfähren aus tierischem Material· In den 50-er Jahren wurden mehrstufige chemische Synthesen ausgearbeitet, die aber alle zum DL-Caraitin führen. PUr die Isolierung des L(-)-isomeren werden bis in die Gegenwart Verfahren benutzt, die auf der Racematspaltung mittels zahlreicher Kristallisationsschritte unter Anwendung von optisch-aktiven Trennsäuren beruhen. Man geht sowohl von verschiedenen DL-Carnitinderivaten, wie DL-Carnitinnitril und DL-Carnitinamid, als auch vom DL-Carnitin in freier Betainform aus. Als Trennsäuren finden insbesondere die optischen Isomeren der Weinsäure, der Camphersäure und der Camphersulfonsäure Anwendung (z.B. DD-PS 23217; DD-PS 93 347; DE-OS 29 27 672).

Um die fraktionierte Kristallisation zu umgehen, wurde im vergangenen Jahrzehnt das Racemat mit Hilfe der L(^-spezifischen Transferasen aufgespalten. Weil dabei aber zur Herstellung von 1 mol L(-)-Carnitin im mindestens stöchiometrischen Verhältnis Acyl-Coenzym A eingesetzt werden muß, ist dieses Verfahren zu teuer, um industriell Bedeutung zu erlangen.

Allen chemischen Synthesen mit anschließender Racematspaltung haftet der weitere Nachteil an, daß von der synthetisierten Substanz selbst theoretisch nur maximal 50% als L(-)-Camitin isoliert werden können. In den letzten Jahren wurde dieser Nachteil durch stereospezifische enzymatische Synthesen aus achiralen Vorstufen umgangen:

In der US-PS 4,221,869 wird die Rückreaktion der Carnitindehydro —genäse (EG 1*1*1»108) genutzt, um Dehydrocarnitin zu L(~)-Carnitin zu hydrieren· Das Enzym wurde aus Bakterien der Pseudomonas fluores^enz-Gruppe gewonnen* Pur die Reaktion sind jedoch weitere Biοchemikalien und Hilfsenzyme zur Regenerierung des NADH notwendig, z.B. Glukose-Dehydrogenase oder Alkohol-Dehydrogenase. Erschwerend kommt hinzu, daß das Dehydrocarnitin sehr instabil ist und spontan in Acetonyltrimethylammonium und CO₂ zerfällt. -

In der DS-OS 31 23 975 wird ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von L(-)-Caraitin aus ^--Butyrobetain beschrieben, wobei die v- -Butyrobetainhydroxylase (EC 1.14.11.1.) aus dem Schimmelpilz Neurospora crassa eingesetzt wird. Bei dieser Dioxygenasereaktion muß dem Ansatz noch ot-Ketoglutarat und ein Reduktionsmittel, wie z.B. Ascorbinsäure zugesetzt werden. Um die L(-)-Carnitinausbeute zu optimieren, wird außerdem Katalase benötigt. Die y-Butyrobetainhydroxylase wird nach Züchtung des Pilzes, Isolierung und Reinigung der Sporen aus diesen durch Behandlung mit Detergentien, mechanische Vorrichtungen oder Ultraschall-Desintegratoren gewonnen. Der anabole Stoffwechsel des L(-)-Carnitins ist in den letzten Jahren intensiv bearbeitet worden. Es ist bekannt, daß die Biosynthese des L(-)-Carnitins in Mikroorganismen, Säugern und im Menschen von L-Methionin und L-Lysin ausgeht. Über die Zwischenstufen 6-N,N,U-Trimethyllysin, £ -Ν,Ν,Ιί-Trimethyl-ß-hydroxylysin und Ν,Ν,Ν-Trimethylaminobutyroaldehyd entsteht ^--Butyrobetain. Aus diesem wird durch die ^-Butyrobetainhydroxylase in Gegenwart von molekularem Sauerstoff, ©C-Ketoglutarat, Eisen-II-ionen und einem Reduktionsmittel L(-)-Carnitin direkt gebildet. Crotonobetain ist an diesem biogenen Syntheseweg nicht beteiligt*

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, die Nachteile der bekannten Methoden zur L(-}-Carnitinherstellung zu überwinden und ein Verfahren anzugeben, das in ökonomisch vorteilhafter Weise die Herstellung dieser Verbindung auf biochemischem Weg gestattet.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, neue und technisch gangbare Verfahren aufzuzeigen, um L(-)-Carnitin aus leicht zugänglichen Ausgangsstoffen herzustellen, wobei die Reaktionsbedingungen und die Abtrennung von Begleitstoffen unkompliziert sein sollen·

Bisher war lediglich bekannt, daß

1· sowohl L(-)-Carnitin als auch D(+)-Carnitin und Crotonobetain zu y -Butyrobetain verstoffwechselt werden und daß

2· die Reduktion des Crotonobetains zu Jf -Butyrobetain für die wachstumsstimulierende Wirkung auf Enterobakterien verantwortlich ist (Arch. Mikrobiol. 132 (1982), 91-95). Chlostridien sind fähig, Crotonosäure zu Buttersäure unter anaeroben Bedingungen zu hydrieren (PEBS Lett, 291 (1980), 244-246). überraschend stellte sich heraus, daß Bakterien an zugesetztes Crotonobetain unter bestimmten Bedingungen Wasser anlagern und daß diese Hydration stereospezifisch zum £i(-)-Carnitin führt. Diese Reaktion ist an das Crotonobetain gebunden. Wird dem Inkubationsmedium z. B. γ -Butyrobetain zugesetzt, ist keine L(-)-Car- ι nitinbildung aus diesem nachweisbar.

Erfindungsgemäß geeignete Bakterienstämme sind z. B.:

Escherichia coli (Ξ. coli 044 Κ74; 055 K 59; .0 111 Κ58;

0 114 Κ90)

Salmonella (S_e typhimurium LT«; Cottbus; anaturn;

newington)

Proteus (P* vulgaris; mirabilis) Shigella (S_a flexneri 1a) Hafnia (H. alvei Biotyp A und B) Clostridium (Ce kluyverij sporogenes) Citrobacter (C_e freundii)«.

Den auf verschiedenen Komplex- oder Minimalmedien wachsenden oder gewachsenen Bakterien wird erfindungsgemäß das Crotonobetain (4-N,N,N-Trimethylaminocrotonat) oder eines seiner Salze, wie z.B. das Chlorid, Jödid, Perchlorate Nitratj Phosphat oder eines seiner Derivate, aus denen Crotonobetain entsteht, wie z.B. seinem Amid oder Nitril, sowie seinen Alkyl- oder Arylestern zugesetzt und nach einer bestimmten Inkubationszeit das gebildete L(-)-Carnitin aus dem Reaktionsansatz isoliert· Die Konzentrationen des Crotonobetains in den Inkubationsmedien liegen zwischen 10 /umol und 5 mol/1, wobei gemäß Tabellen V, VI und VII die Absolutmenge an L-Carnitin mit steigender Crotonobetainkonzentration zunimmtj die prozentuale Ausbeute, bezogen auf Crotonobetain, Jedoch abnimmt» Das nicht umgesetzte Crotonobetain wird nach Abtrennung des L(-)-Carnitins dem Inkubationsmedium wieder zugeführt. Als Medien für Ruhezellen finden Minimalmedien, Salzlösungen, anorganische oder organische Puffergemische Anwendung, die keine C- und/oder N-Quelle enthalten bzw. deren C- und N-Gehalt von den Bakterien nicht verwertet werden kann«. Die Inkubationszeiten liegen zwischen 3 Stunden und 5 Tagen, bevorzugt werden 12 bis 48 h· Die Hydratation des Crotonobetains wird durch Bakterien ermöglicht, die auf den unterschiedlichsten komplexen oder definierten Medien, fester oder flüssiger Konsistenz

wachsen oder gewachsen sind, so daß Übliche kommerzielle Nährböden und zahlreiche komplexe Substrate, wie Fleisch-, Hefe-, Malzextrakte, Serum, Maisquellwasser, mit zusätzlichen C- und/oder N-Quellen, wie Ammoniak, Harnstoff, Alkohole, Kohlenhydrate, organische Säuren einschließlich der Fettsäuren verwendet werden können und unter einfach zu realisierenden Bedingungen, wie partiell anaeroben Verhältnissen, Stehen der Reaktionsgefäße ohne zusätzliche Begasung oder Schütteln gearbeitet wird· Um Verluste an eingesetztem Crotonobetain über den Weg der Hydrierung zu inertem ^--Butyrobetain zu vermeiden, müssen Bedingungen geschaffen werden, die die Reduktion des Crotonobetains verhindern, den Ablauf der Hydratation jedoch fördern. Aus diesem Grund werden Elektronenakzeptoren der aeroben bzw. anaeroben Atmung und spezielle Substrate zugesetzt· Nichtbeschränkende Beispiele im Sinne der Erfindung sind Sauerstoff und sauerstoffabgebende Verbindungen, Nitrat, Trimethylaminoxid und weitere N-Oxide, Dimethylsulfoxid, Glukose, Fructose, Saccharose, Maltose, Wasserstoffakzeptoren, Fumarat, Crotonat, Acrylat (Tabellen II, III, IV)·

Qbwohl bereits die nach Wachstum auf üblichen kommerziellen Standardmedien mit Zusatz von Fleischwasser oder pankreatischem Pepton gewonnenen Ruhezellen zur Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain fähig sind (Tabelle IX), ist der Umsatz pro Zeiteinheit in' solchen Zellen größer, in denen die "Crotonobetain-Hydratase" durch Wachstum unter Zusatz von Crotonobetain, DL-Carnitin, D-angereicherten DL-Carnitinfraktionen (die bei der chemischen Racematspaltung anfallen), sowie deren Derivaten (ζ·Β· Carboxylester, O-Acylcarnitine oder Doppelester) induziert wurde·

Crotonobetain bzw. seine verwendbaren Salze bzw· Derivate worden nach einem der bekannten Verfahren hergestellt:

1. Abspaltung von Wasser aus DL-Carnitin, D-Carnitin und D-angereichertem DL-Carnitin mittels Schwefelsäure oder Essigsäureanhydrid oder Eliminierung der Säure aus den

0-Acyl-DIr» bzw« -D-camitinen,

2« Permethylierung von 4-Aminocrotonsäure mittels Me-thylhalogeniden, '

3* Anlagerung von Trimethylamin an 4-Halogencrotonsäure.

Die Abtrennung des L(-)-Carnitins von nicht umgesetztem Crotonobetain bzw« gebildetem ^-Butyrobetain kann nach bekanntem Verfahren erfolgen, wie es in "Recent research on carnitine" (Bd₀ G₀ Wolf) S, 11-21 (1965) bzw«, in der US-PS 4,221,869 bzw« DE-OS 31 23 975 beschrieben wird· Bei der begrenzten Trennfähigkeit der Ionenaustauscher für Zwecke der Ionenaustausch-chromatographischen Reinigung eng strukturverwandter Trimethylammoniumverbindungen ist diese Methode nur zur Abtrennung kleinerer Mengen, z»B« von radioaktiv-markiertem L(-)-Carnitin, von den Vorstufen bzw» Reaktionsprodukten geeignet«

Zur Abtrennung größerer L(-)-Carnitinmengen von Crotonobetain und V^-Butyrobetain wird auf die Reaktion der Hydroxylgruppe zurückgegriffen· Geeignet ist der Umsatz mit Säurechloriden lang- und mittelkettiger Fettsäuren· O-Acylcarnitine lassen sich durch Extraktion vom Carnitin^ abtrennen (Biochim. Biophys· Acta 280 (1972), 422-433)· Bei der Extraktion der wäßrigen Phase mit n-Butanol oder iso-Butanol werden die Acyl-L-carnitine auch von Crotonobetain und V^-Butyrobetain abgetrennte Nach Eindampfen der organischen Phase fallen die O-Acyl-L-carnitine an, die nach Umkristallisation als Substrate mehrerer Enzyme in der biochemischen Forschung direkt eingesetzt werden können· Ammoniakalisehe Hydrolyse führt zum L(-)-Carnitin, das für die Substitutionstherapie in den Kliniken genutzt wird· Crotonobetain verbleibt während der Extraktion quantitativ in der wäßrigen Phase und wird erneut dem Inkubationsmedium zugesetzt. -

Umsatzkontrolle des Crotonobetains zu L(-)-Carnitin erfolgt mittels der Garnitin-Acetyl-Transferase nach Zusatz von Acetyl-CoA mit der DTNB-Methode· 10 bis 100-facher Überschuß an Crotonobetain stört den L-Carnitin-

nachweis nicht· .

Einige Vorteile des Verfahrens sind:

1· D(+)-Gamitin und besonders D-angerei chert e DL-Carnitinchargen, die in'großen Mengen bei der chemischen Racematspaltung des DL-Carnitins als Abprodukte anfallen, werden durch wasserentziehende Mittel in Crotonobetain überführt und stellen jetzt eine preiswerte Ausgangssubstanz für die L-Carnitinsynthese dar·

2. Pur die mikrobiologische Carnitinsynthese müssen keine weiteren Biοchemikalien oder Hilfsenzyme eingesetzt werden· ·

3· Der Aufwand für Ausgangssubstanzen, Medien und Energie ist minimal·

Das Verfahren wird im folgenden an einigen Ausführungsbeispielen näher·erläutert:

Beispiel 1:

Mit der Impf suspension (E· c'oli 044 K74), von Blutagarplatten (5%) in steriler Kochsalzlösung C9 g/l) abgeschwemmt, wird ein 500 ml Reaktionsgefäß mit Crotonobetain-haltigern Komplexmedium (20 g pankreatisches Pepton, 5 g NaCl und 50 mraol Crotonobetain/ 1 aqua bidest.) von pH 7fO angeimpft (Δ ^caq = 0,050), anschließend mit Paraffinöl überschichtet und bei 37⁰C stehen gelassen· Die Bildung von L(-)-Carnitin ist in Abhängigkeit'von der Inkubationszeit und dem Wachstum der Bakterien in Tabelle I dargestellt·

Tabelle I:

ZeitaiDhangigkei.it der L-Carnitinsynthese durch wachsende Bakterien

Inku bations zeit	Wachstum	Synthese von L(-)-Carnitin	L(-)-Carnitin /rhol/ „_1Q2
0 '3 6 12 24 .,. 48	0,0 0,100 0,120 . 0,190 0,200 0,175		.drotonobetain Zmol/ ^Λ
• 0,5 2,0 6,7 6,6	0,9 3,9 . 13,4 13,3

Beispiel 2s

Gemäß Beispiel 1 24h in Komplexmedium + Crotonobetain gewachsene Bakterien (E, coli) werden bei 6000 g abzentrifugiertj mit Sb'rensen>«Phosphatpuffer 0,01 mol/1, pH 7,5 (0,20 g KH₂PO₄Zl und 3,05 g Na₂HPO. χ 12 HgO/l) gewaschen und in einem 11 Kolben mit Sörensen-Phosphatpuffer, der zusätzlich 5g Crotonobetain/1 (34,9 mmol/1) enthält, resuspendiert (Δ E^₄₀ = 0,080) und 24 h bei 37°C stehen gelassen» Anschließend werden die Bakterien wieder abzen-'trifugierte Im KuIturfiltrat lagen 9,08 mmoi L(-)-Carnitin/1 vor, das entspricht 26% des eingesetzten Crotonobetainsβ '

Beispiel 3: ' . .

I_l(-)«,Carnitin«'haltiges Komplexmedium (31 mmöl L(-)-Caraitin/1 β 5g/l)jr dem Blektronenakzeptoren der Atmungskette oder weitere Substrate zugesetzt worden waren, wurde gemäß Beispiel 1 mit verschiedenen Stämmen von Enterobakterien beimpft und 48 h inkubiert. Konzentration der Zu-

sätze: Natriumsuccinat, Natriumfumarat und D-Glucose je 10 g/l; Kaliumnitrat und Trimethylaminoxid (O]MO) je 5 g/l. Die JA-Butyrobetainbildung ist in mol ^--Butyrobetain pro mol eingesetztem L(-)-Carnitin χ 10 (mol%) angegeben·

Tabelle II:

Einfluß von Elektronenakzeptoren bzw· weiteren Substraten auf den Abbau von L-Carnitin zu Jf-Butyrobetain

Bakterienstämme	γ· -Butyrobe t ain- ⁴ bildung fmolfoj	-	Suc- ci- nat	Fu- ma- ^v rat	KNO-	TMO	Glu cose
Escherichia coli 044 K74 ¹V " KI2 Hf r I Salmonella typhimurium LT₂ troteus vulgaris	71 45 87 79	77 43 89 81	13 5 68 17	O O O O	0 0 8 17	0 71 0

Beispieles

Dem Komplexmedium (KM) gemäß Beispiel 1 oder einem definierten Minimalmedium (MM), bestehend aus 15,0 g Na₂HPO. • 12 H₂O, 3,0 g KH₂PO₄, 1,0 g NH₄Cl, 0,15 g MgSO₄ · 7 H₃O, 14 mg CaCl₂, 0,2 mg PeCl« und 7,5 g D-Ribose /1 aqua dest·, die zusätzlich je 50 mmol Crotonobetain/1 enthalten, werden Natriumfumarat (iO g/l), Kaliumnitrat (5 g/l) oder Trimethylaminoxid (5 g/l) zugesetzt, mit Paraffinöl-Uberschichtung (0₂-Ausschluß)oder ohne Paraffinb'l (Og-Zutritt) bei 37⁰C mit E. coli 044 K74 48 h inkubiert·

Tabelle III: Einfluß von Elektronenakzeptoren auf die L-Carnitonbildung in wachsenden Bakterien

Züchtungs medium	Synthese von L(-)-Carnitin ßmol/lj	Op-Zu- tritt	Pumarat	KtTO₃	TMO
KM ' MM	Op-Aus- söhluß	2,6 - 1,5	10,7 10,8	0,9 0	5,1 5,9
4,5 2,7

Beispiel 5*

Bakterien (E* coli 044 K74 werden im Komplex- (KM) oder im Minimalmediura (MM), die zusätzlich je 50 mmol Crotonobetain/1 enthalten, gezüchtet und nach 48 h geerntet, 2 χ gewaschen und in 50 mmol Crotonobetain/l enthaltendem Sörensen-Puffer, dem die Elektronenakzeptoren gemäß Beispiel 4 zugesetzt werden, 48 h inkubiert.

Tabelle IVs Einfluß von Elektronenakzeptoren auf die L«»Carnitonbildung in Ruhezellen

Züchtungs medium	Synthese von L(-)-Carnitin ßwaöl/lj	.O₂-Zu- tritt	Pumarat	KlTO₃	TMO
KM MM	Op-Aus- schluß	8,3 12,1	0. 0	7,8 9,8	8,4 10,4
7,5 9,1

Beispiel 6:

Mit gemäß Beispiel 1 vorgezüchteten Bakterien (E. coli 044 K74) werden Minlmalraedien mit D-Ribose als C-Quelle (gemäß Beispiel 4), die unterschiedliche Crotonobetainkonzentrationen enthalten, angeimpft und 48 h bei 37⁰C inkubiert·

Tabelle V:

Synthese von L-Carnitin durch in einem Minimalmedium wachsende Bakterien bei verschiedenen Crotonobetainkonzentrationen

Crotono- betain	Synthese von L-Carnitin	L-Carnitin	/mol7	1	X10²	Wachs tum
fi-οΐΛΖ.	βΰαοΊ/XJ	Örotonobetain Zpiol/	6		0,120
500	5,3	1,	0		0,450
50	4,3	8,	0		0,385
5	0,3				0,220
0,5	0,09	18,

Beispiel 7:

Die Bakterien (Se coli 044 K74) werden entweder auf Komplexmediura gemäß Beispiel 1 (A) oder Minimalmedium + Ribose gemäß Beispiel 4 (B) gezüchtet, wobei die Wachstumsmedien zusätzlich 8 g L-Carnitin/1 enthalten· Nach 48 h werden die Bakterien geerntet, 2 χ gewaschen, auf Sörenjsen-Puffer, der unterschiedliche Crotonobetainkonzentrationen enthält, umgesetzt und 48 h bei 37⁰C inkubiert«

Tabelle VI:

Synthese des L-Camitins aus Crotonobetain durch L-Camitin-induzierte Ruhezellen bei verschiedenen Crotonobetainkonzentrationen

Crotonobetain	Synthese von L-Carnitin	L-Carnitin /rhoiy _in2
Z~mmoi/1_7	Α01Λ7.	Crotonobetain Zmol/ '
A) 500	9,0	1,8
50	7,5	15,1
VJl	2,9	58,4
B) 500	16,2	3,2
50	8,3	16,5
VJJ	3,7	74,0

Beispiel 8:

Bakterien (3 coil 044 K74,) werden auf crotonobetainhaltigem Kompl.exraediura gemäß Beispiel 1 gezüchtet, nach 48 h abzentrifugiert, 2 χ gewaschen und in einem Minimalmedium ohne C- und N-Quelle, das unterschiedliche Crotonobetainkonzentrationen enthält, aufgenommen und 48 h inkubiert·

Tabelle VTI: Synthese des L-Carnitins durch Crotonobetaininduzierte Ruhezellen bei verschiedenen Crotonobetainkonzentrationen

Cro tonobetain

Synthese von L-Carnitin

L-Carnitin /mol7 _ _1Q2 Crotonobetain Zmol/

500 50 5 0,5

24,3 12,2

. 2,4 0,47

4,9 24,5 48,8 94,0

Beispiel 9:

Bakterien (E. coli O44 K74) werden im definierten Miniinalraedium gemäß Beispiel 4, das anstelle des Crotonobetains zusätzlich 50 mmol Camitin/1 enthält, 48 h gezüchtet, geerntet, 2 χ gewaschen und in einem Minimalmedium ohne C- und N-Quelle, aber mit 50 mmol Crotonobetain/1, bei 37⁰C inkubiert· Optische Dichte zu Beginn der Inkubation Δ B₅ .Q - 0,210·

Tabelle VIII: Zeitabhängigkeit der L-Carnitinbildung

durch Ruheζeilen

Inkubations zeit	Synthese von L-Carnitin *	L(-)-Carnitin /raol/ _ ₁₀2
) fh J	£mol/\J	Crotonobetain Zmol/ ·
3	2,5	5,1
6	3,7	7,5
., 12	6,6	13,2
24	9,0	18,0
48	10,1	20,3

Beispiel 1.0:

Bakterien (E· coli 044 K74) werden im Komplexmedium (KM) oder Minimalmedium (MLl) ohne C-Quelle, dem die angegebenen Substanzen jeweils in einer Konzentration von 50 mmol je 1 zugesetzt worden waren, 48 h gezüchtet, geerntet, 2 χ mit Sörensen-Puffer gewaschen und auf Sörensen-Puffer mit Crotonobetain (50 mmol/1) 48 h inkubiert·

Tabelle IX:

Einfluß unterschiedlicher Züchtung auf die L-Carnitinbildung in Ruhezellen

	Wachsende, Zellen	.	D-Ribose	^ΔΕ54Ο nach 48 h	Ruhezellen	L-Carnitin- synthese Z"mraol/1 J
Uedium	Zusätze	D-Glucose	0,315	^ΔΒ540 am Start	1,4
KM	D-Ribose, Pumarat	0,196	0,225	0,3 .-
MM	D-Ribose, GABOB⁺	0,325	0,136	0,6
MM	D-Ribose, L-Carnitin	0,165	0,260	0
wi		0,395	0,100	0,3
MM		0,255	0,220	6,6
MM ..	0,190

⁺ DL- y -Amino-ß-hydrozybutt er säure

Claims

~Αί

Pat entanspräche .

1. Verfahren zur Herstellung von L(-)-Carnitin, dadurch gekennzeichnet, daß von Crotonobetain ausgegangen wird,, das durch .biologische Systeme, wie wachsende und/oder ruhende Bakterien oder deren katalysierende Bestandteile, in L(-)-Carnitin umgewandelt wird·
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen von Sscherichia coli gearbeitet wird, wie zum Beispiel J3. coli K12 Hfr H; 044 K74; 055 K59; 0 111 K58; 0 114 K90.

ν '
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Salmonella-Stämrnen gearbeitet wird, wie z· B. ' , S. typhimurium; S. Cottbus; 5. aratumj S. newington.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Shigella gearbeitet* wird, wie z. B. S. flexneri 1a.
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch.gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Citrobacter gearbeitet wird, wie z. B. C. freundii.
6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Clostridium gearbeitet wird, wie· z. B. C. sporogenes; C. kluyveri.

"7· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Stämmen der Gattung Hafnia gearbeitet wird,wie z. B. H. alvei.

8· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gelL<.mrKv:iicim.et, daß mit Stämmen der Gattung Proteus gearbeitet wird, wie z. B. P. vulgaris; P. mirabilis.
9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß von freiem Crotonobetain, von Salzen des Crotonobetains oder Derivaten des Crotonobetains ausgegangen wird. ,

1O.Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Crotonobetainkonzentration im Reaktiönsansatz zwi-

sehen 10 /umol/1 und 5 raol/.l liegen·

11· Verfahren nach Punkten 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung der Bakterien in einem üblichen kommerziellen Komplexmedium oder einem Minimalmedium erfolgt, wobei den wachsenden und/oder ruhenden Bakterien weitere jülektronenakzeptoren der Atmung, Wasserstoffakzeptoren oder Substrate zugesetzt werden, die die Hydrierung des Crotonobetains zu V"-Butyrobetain verhindern, zum Beispiel Fumarat, Nitrat,. Sauerstoff, IT-Oxide, Glucose.

12· Verfahren nach ,.Punkten 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die I(-)-Carnitinsynthese mit induzierten Ruhezellen, durchgeführt wird, wobei die Induktion durch carnitin- oder crotonobetainhaltige Komplexmedien oder durch Zusatz von L-, D-, oder DL-Carnitin, -derivaten und -salzen sowie Crotonobetain, -derivaten und -salzen zu den Züchtungsmedien ausgelöst wird.

13· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Crotonobetain sowohl direkt eingesetzt wird als auch erst im Ansatz aus Vorstufen gebildet wird und als Intermediat der Synthese des L-Carnitins dient·

14· Verfahren nach Punkten 1-13» dadurch gekennzeichnet, daß mit kopralexen biologischen Systemen gearbeitet wird, in denen die Stämme der angegebenen Gattungen in Reinkultur, in Mischungen untereinander oder in Mischungen mit anderen Stämmen vorhanden sind·

15· Verfahren nach Punkten 1-14» dadurch gekennzeichnet, daß von Isotop-markiertem Crotonobetain, seinen Salzen und Derivaten ausgegangen oder markiertes Wasser . an Crotonobetain^angelagert und auf diesem Wege Isotop-markiertes L(-)-Carnitin hergestellt wird·

16· Verfahren nach Punkt 1-15» dadurch gekennzeichnet, daß das L(-)-Carnitin aus dem Reaktionsgemisch mit Crotonobetain als Acyl-L(-)-carnitin abgetrennt wird·

17· Verfahren nach Punkten 1~16, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Carnitin-Synthese unter anaeroben, partiell anaeroben oder aeroben Bedingungen abläuft·