FI86889C - Foerfarande foer framstaellning av av l-karnitin pao mikrobiologiskt saett - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av av l-karnitin pao mikrobiologiskt saett Download PDFInfo
- Publication number
- FI86889C FI86889C FI850781A FI850781A FI86889C FI 86889 C FI86889 C FI 86889C FI 850781 A FI850781 A FI 850781A FI 850781 A FI850781 A FI 850781A FI 86889 C FI86889 C FI 86889C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- carnitine
- betaine
- butyrobetaine
- medium
- bacteria
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/824—Achromobacter
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Catalysts (AREA)
Description
! 86889
Menetelmä L-karnitiinin valmistamiseksi mikrobiologisesti
On tunnettua valmistaa L-karnitiiniä jf-butyrobeta-iinista. ,1-butyrobetaiini saatetaan natrium-2-oksogluta-5 raatin, pelkistävän aineen, rauta-ionilähteen ja ilman hapen hydroksyyli-ryhmien luovuttajana läsnä ollessa kosketukseen hydroksylaasi-entsyymin kanssa, joka on vapautettu Neurospora crassan itiöistä (US-patentti 4 371 618). Tällä menetelmällä on se haitta, että tarvitaan lukuisia 10 kofaktoreita. Siten reaktiossa dekarboksyloidaan stökiomet-risiä määriä 2-oksoglutaraattia hapettavasti sukkinaatiksi. Fe2* tarvitaan 02-aktivaattoriksi, askorbaattia rauta-ionin pitämiseksi pelkistetyssä muodossa ja katalaasia pienissä määrissä syntyvän vahingollisen H202:n hävittämiseksi.
15 Lindstedt et ai., [Biochemistry 6, 1262-1270 (1967) "The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas"] eristivät erään Pseudomonas-suvun mikro-organismin, joka kasvaa käyttäen £-butyrobetaiinia C- ja N-lähteenä. Hajotus-menettelyn ensimmäinen reaktio oli ίΓ-butyrobetaiinin hyd-20 roksylointi L-karnitiiniksi, jolloin välissä syntyvä L-kar-nitiini pilkotaan täydellisesti edelleen C02:ksi, H20:ksi ja NH3:ksi.
Myös tällä, bakteereista saadulla hydroksylaasilla olisi, jos sitä käytettäisiin L-karnitiinin valmistukseen, 25 kuvatut haitalliset kofaktoritarpeet [Lindstedt et ai., Biochemistry 16, 2181-2188 (1977) "Purification and Properties of .^-butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1"].
Keksinnön tehtävänä on löytää uusi mikro-organismien tyyppi, jolla ei ole näitä tunnettujen menetelmien haittoja 30 ja joka tekee mahdolliseksi yksinkertaisella tavalla valmistaa ei rasemaattia vaan enantio-selektiivisesti L-karnitii-nia krotonbetaiinista, butyrobetaiinista tai niiden seoksista.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle L-karnitiinin val-35 2 86889 mistamiseksi on tunnusomaista se, mitä vaatimuksessa 1 esitetään.
Erotukseksi tekniikan tasolla tunnetuista systeemeistä käyttävät tässä kuvatut mikro-organismit H20 eikä 02 hyd-5 roksyyliryhmien luovuttajana, kuten omilla tutkimuksilla käyttäen H2180 ja 1802 voitiin todeta.
Keksinnössä käytetyt mikro-organismit pystyvät tuottamaan krotonbetaiinistä ja/tai ^butyrobetaiinista L-kar-nitiinia ja olemaan pilkkomatta jälkimmäistä.
10 Kuten eräs vertaileva tutkimus maanäytteillä neljältä mantereelta osoitti, ovat mikro-organismit, jotka pilkkovat butyrobetaiinia ja krotonbetaiinia L-karnitiinin kautta, ubikvitaarisia. Eristäminen onnistuu myös jäteveden puhdistuslaitosten aktiivilietteestä. Mahdollisesti tulevat kaikki 15 nämä kannat kysymykseen L-karnitiinin tuottajina, kun niitä mutaatiokäsitellään seuraavassa esitetyn, keksinnön mukaisen periaatteen mukaisesti.
Tällaisia mutantteja saadaan seuraavalla valikoin-t imenetelmä11ä: 20 a) Mikro-organismeja, jotka kasvavat käyttäen betaii- nia, ί^-butyrobetaiinia, krotonbetaiinia ja L-karnitiinia C-ja N-lähteenä, mutaatio käsitellään tavalliseen tapaan.
b) Mutaatiokäsiteltyjen mikro-organismien kasvatuksen kautta saadusta viljelystä valitaan ne, jotka ovat pysyviä, 25 eivät pilko L-karnitiinia eivätkä kasva L-karnitiinilla, krotobetaiinilla, ^-butyrobetaiinilla, mutta hyvin betaii-nilla.
Edullisesti valitaan valikoimisvaiheen b) jälkeen ne mikro-organismit, jotka erittävät L-karnitiinia ja eivät 30 kasva L-karnitiinilla, krotobetaiinilla, j^-butyrobetaiinil- la, mutta hyvin betaiini11a.
Tarkoituksenmukaisesti viljellään mutaatiokäsiteltyjä mikro-organismeja edelleen betaiini-alustassa ja näitä edelleen viljeltyjä mikro-organismeja kasvatetaan edelleen vali-35 koimisvaiheen b) toteuttamiseksi edullisesti L-karnitiini 3 86889 alustassa. Betaiinia, 2?-butyrobetaiinia, krotonbetaiinia ja L-karnitiinia C- ja N-lähteenä käyttäen kasvavien kantojen viljely suoritetaan edullisesti niin, että bakteeriseoksista krotonbetaiini-ravintoliuoksilla ymppäämällä tuotetaan seka-5 viljelyjä ja niistä käyttäen apuna perinteisiä mikrobiologisia menetelmiä sitten perustetaan krotonbetaiinia hajottavien mikro-organismien puhdasviljelyjä.
Tällaisen viljelyn, joka kasvaa käyttäen betaiinia, /'-butyrobetaiinia, krotonbetaiinia ja L-karnitiinia C- ja N-10 lähteenä, mutaatio voidaan sitten toteuttaa tunnettujen menetelmien mukaisesti. [J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972].
Tarkoituksenmukaisesti käyttökelpoisia menetelmiä pysyvien mutanttien valmistamiseksi ovat Frame-Shift-mene-15 telmä, deleetio-menetelmä tai transposoni-insertio-menetel- mä.
Tällä tavalla mutaatiokäsitellyt mikro-organismit saatetaan sitten edelleen viljelyn jälkeen betaiini-alustas-sa ja siirtämisen jälkeen L-karnitiini-alustaan valikoimis-20 vaiheeseen b), jossa tunnettujen "vastavalikoivien aineiden" avulla [P. Gerhardt et ai. (toimittajia), Manual of Methods General Bacteriology, Am Soc. for Microbiology 1981] valikoidaan ne mikro-organismit, jotka eivät pilko pysyvää L-karnitiinia ja jotka eivät kasva L-karnitiinilla, kroton-25 betaiinilla, ^-butyrobetaiinilla, mutta hyvin betaiinilla.
Eräs edullinen mikro-organismi, joka kasvaa käyttäen betaiinia, ?f^butyrobetaiinia, krotonbetaiinia, L-karnitiinia C- ja N-lähteenä, on kanta HK 4 (DSM nro 2938) ja sen jälkeläiset.
30 Tämä kanta talletettiin 3.3.1984 kokoelmaan Deutsche
Sammlung von Mikro-organismen (DSM); Gesellschaft ftir Bio-technologische Forschung GmbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, numerolla DSM 2938.
4 868S9
Kannan Hk 4 (DSM Nr. 2938) tieteellinen selostus: Solumuoto Pieniä sauvoja Fenyylialaniinideami- aasi osaksi moni- ornitiinidekarboksy- 5 muotoinen laatti pituus μιη 1-2 leveys μιη 0,5-0,8
liikkuvuus + H2S
värekarvat värekarvainen Voges-Proskauer 10 gram-reaktio - indoli itiöt - nitriitti nitraatista + poly-B-hydroksibu- - denitrifikaatio + tyraatin muodostus levaanin muodostusta oksidaasi + lesitinaasi 15 katalaasi + ureaasi +
Kasvu Hajottaa anaerobinen - tärkkelystä 37° C + gelatiinia 41° C - kaseiinia 20 pH 5,6 - tyrosiinia
Mac-Conkey-agar + Tween 80 SS-agar - DNA +
Cetrimid-agar - eskuliinia +
Pigmentin muodostus Substraatin käyttö 25 ei diffundoituva - asetaatti diffundoituva - sitraatti - fluoresoiva - malonaatti -
Hapon muodostus (OF-testi) Glysiini glukoosista aerobi- 30 sesti - norleusiini anaerobisesti - ksyloosi +
Fruktoosista aerobisesti - fruktoosi +
Ass-glukoosista + glukoosi + 35 ksyloosista + autotroofinen kasvu trehaloosista + H2:lla etanolista - 3-ketolaktoosi 5 86889
Kaasun muodostus glukoosista - Kasvu ONPG + betaiini + arginiinidihydro- 5 laasi - L-karnitiini + lysiinidekarboksy- laasi - ,^-butyrobetaani + krotonbetaiini +
Eräs edullinen mikro-organismi, joka saatiin mu-10 tanttina ja valikoitiin edellä kuvatusta mikro-organismista ja joka on pysyvä, ei pilko L-karnitiinia, vaan erittää eikä kasva L-karnitiinilla, krotonbetaiinilla ja tf^butyro-betaiinilla, mutta hyvin betaiinilla, on HK 13.
Tämä mainittu kanta talletettiin 23.1.1984 kokoel-15 maan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesell-schaft fiir Biotechnologische Forschung GmbH, Griesebach-strasse 8, 4300 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, numerolla DSM 2903.
Kannan HK 13 (DSM Nr. 2903) tieteellinen selostus: 20 Solumuoto Pieniä sauvoja Fenyylialaniinidea- osaksi moni- minaasi muotoisia pituus pm 1-2 ornitiinidekarbok- 25 sylaasi leveys pm 0,5-0,8
Liikkuvuus + H2S
värekarvat värekarvainen Voges-Proskauer gram-reaktio - indoli 30 itiöt - nitriitti nitraatista + poly-B-hydroksibuty- denitrifikaatio + raatin muodostus - levaanin muod.
oksidaasi + lesitinaasi 35 katalaasi + ureaasi +
Kasvu Hajottaa anaerobinen - tärkkelystä 37° C + gelatiinia 41° C - kaseiinia 86889 6 pH 5,6 - tyrosiinia
Mac-Conkey-agar + Tween 80 SS-agar - DNA +
Cetrimid-agar - eskuliinia + 5 Pigmentin muodostus Substraatin käyttö ei diffundoituva - asetaatti diffundoituva - sitraatti fluoresoiva - malonaatti
Hapon muodostus (OF-testi) glysiini 10 glukoosista aerobisesti - norleusiini anaerobisesti - ksyloosi + fruktoosista aerobisesti - fruktoosi + ASS glukoosista + glukoosi + ksyloosista + autotroofinen kasvu 15 trehaloosista + H2:lla etanolista - 3-ketolaktoosi
Kaasun muodostus glukoosista - Kasvu ONPG + betaiini + 20 arginiinidihydrolaasi - L-karnitiini - lysiinidekarboksylaatti - /^-butyrobetaiini krotonbetaiini L-glutamaatti ja krotonbetaiini ± 25 L-glutamaatti ja butyrobetaiini ± L-glutamaatti ja L-karnitiini ±
Esimerkki mikro-organismin HK 13 eräästä jälkeläi-30 sestä, joka on pysyvä, joka ei pilko L-karnitiinia, vaan erittää sitä, ei kasva L-karnitiinilla, krotonbetaiini11a ja f^-butyrobetaiinilla, mutta hyvin betaiinilla, L-gluta-maatilla ja krotonbetaiinilla, L-glutamaatilla ja butyro-betaiinilla, L-glutamaatilla ja L-karnitiinilla, on kanta 35 HK 1331 b.
Se eristettiin spontaanina, hyvin kasvavana mutant-tipesäkkeenä agarilla vahvistetun ravintoalustan, joka sisälsi L-glutamaattia ja y-butyrobetaiinia, pinnalta.
7 86889 Tämä mainittu kanta talletettiin 8.2.1985 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesell-schaft fiir Biotechnologische Forschung GmbH, Griesebach-strasse 8, 4300 Göttingen/BRD, numerolla Nr. DSM 3225.
5 Kannan HK 1331b (DSM Nr 3225) tieteellinen selos tus:
Solumuoto Pieniä sauvoja Fenyylialaniini- osaksi monimuotoisia deaminaasi pituus pm 1-2 ornitiinide- 10 karboksylaasi leveys pm 0,5-0,8
liikkuvuus + HZS
värekarvat värekarvainen Voges-Proskauer gram-reaktio - indoli 15 itiöt - nitriitti nitraatis ta poly-B-hydroksibuty- raatin muodostus - denitrifikaatio + levaanin muodostus - 20 oksidaasi + lesitinaasi katalaasi + ureaasi +
Kasvu Hajottaa anaerobinen - tärkkelystä 37° C + gelatiinia 25 41° C - kaseiinia pH 5,6 - tyrosiinia
Mac-Conkey-agar + Tween 80 SS-agar - DNA +
Cetrimid-agar - eskuliinia + 30 Pigmentin muodostus Substraatin käyttö ei diffundoituva - asetaatti diffundoituva - sitraatti fluoresoiva - malonaatti
Hapon muodostus (OF-testi) glysiini 35 glukoosista aerobisesti - norleusiini anaerobisesti - ksyloosi + fruktoosista aerobisesti - fruktoosi + ASS glukoosista + glukoosi + ksyloosista + autotroofinen kasvu 8 86889 trehaloosista + H2:lla etanolista - 3-ketolaktoosi
Kaasun muodostus glukoosista - Kasvu 5 ONPG + betaiini + arginiinidihydrolaasi - L-karnitiini lysindekarboksylaasi - ^-butyrobetaiini krotonbetaiini L-glutamaatti ja 10 krotonbetaiini + L-glutamaatti ja butyrobetaiini + L-glutamaatti ja L-karnitiini + 15 Menetelmä L-karnitiinin valmistamiseksi toteutetaan tarkoituksenmukaisesti siten, että jonkun mikro-organismin, edullisesti mikro-organismin, joka on nimitetty HK 13:ksi, esiviljelyä viljellään steriloidussa, edullisesti vitamiinipitoisessa mineraalialustassa [Kulia et ai., 20 Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)] 20-40° C:ssa, edullisesti 30° C:ssa, tarkoituksenmukaisessa pH-arvossa 6-8, edullisesti 7, 20-50 tunnin, edullisesti 30-40 tunnin ajan.
Tämä esiviljely sisältää tarkoituksenmukaisesti 0,1-10 paino-%, edullisesti 0,5-5 paino-%, koliinia, glutamaat-25 tia, asetaattia, dimetyyliglysiiniä tai betaiinia kas- vusubstraattina. Erityisen edullisesti käytetään betaiinia määrissä 0,5-5 paino-%.
Lisäksi on mikrobiologisessa tekniikassa tavallista lisätä esiviljelyyn myös reagoimaan saatettavia lähtöyh-30 disteitä, ^"-butyrobetaiinia, krotonbetaiinia tai niiden seoksia määrissä 0,1-10 paino-%, edullisesti 0,5-5 paino-% laskettuna reaktioalustasta.
^"-butyrobetaiini tai krotonbetaiini voi olla hydro-kloridi-suolana, vapaana sisäisenä suolana sekä johdan-35 naisten muodossa.
Edellä mainitun menetelmän mukaisesti valmistetuilla esiviljelyillä voidaan ympätä muita viljelyjä. Näillä 9 86889 uusilla viljelyillä on tarkoituksenmukaisesti sama koostumus kuin esiviljelyillä.
Reagoimaan saatettavan krotonbetaiinin, jf-butyrobe-taiinin tai niiden seosten pitoisuus on 0,1-10 paino-%, 5 edullisesti 0,5-5 paino-%.
Myös kasvusubstraatteja koliini, glutamaatti, ase-taatti, dimetyyliglysiini ja betaiini käytetään tarkoituksenmukaisesti esiviljelyille käytetyissä väkevyyksissä.
Edullisesti sovitetaan jatkoviljelyn viljelyolosuh-10 teet esiviljelyn viljelyolosuhteita vastaaviksi.
Lämpötilat liikkuvat siis tarkoituksenmukaisesti välillä 20-40° C, edullisesti 30° C:ssa ja pH-arvo pidetään yleensä välillä 6-8 pH, edullisesti pH 7:ssä.
Tällä tavalla suoritettu L-karnitiinin valmistus 15 pysähtyy 20-30 tunnin kuluttua. L-karnitiinin pitoisuus on tällöin yleensä samanarvoinen käytetyn X-butyrobetaiinin tai krotonbetaiinin määrän kanssa.
Solut voidaan lingota tai suodattaa erilleen ja käyttää ymppiaineksena uudelle viljelylle.
20 Sinänsä tunnetulla tavalla [J.P. Vandecasteele, Appi. Environ. Microbiol. 39, 327 (1980)] voidaan L-kar- nitiini ottaa talteen kationinvaihtokromatografiällä supernatantista ja puhdistaa uudelleenkiteyttämällä.
Menetelmä L-karnitiinin valmistamiseksi voidaan to-25 teuttaa myös jatkuvalla tavalla siten, että solujen annetaan kasvaa kemostaatissa tarkoituksenmukaisissa laimen-nuserissä 0,04 - 0,2 h'1, edullisesti 0,06 - 0,08 h'1, yhdenmukaisissa olosuhteissa kuin panosviljelyssä.
Esimerkki 1 30 Krotonbetaiinia hajottavan mikro-organismin eristä minen
Mikro-organismeja uutettiin mullasta neutraalilla fosfaatti-puskuriliuoksella sekoittaen, sen jälkeen erotettiin suurimmat aineosat suodatinpaperilla ja ympättiin 35 krotonbetaiini-ravintoliuos näin saadulla bakteeriseoksel-la lievään samentumiseen. 9 päivän kuluttua samennus oli 10 86 8 89 solupitoisuuden mittana noussut 90-kertaiseksi. Kroton-betaiini oli täydellisesti kadonnut liuoksesta ja hajoamistuotteena voitiin osoittaa ammoniuroi.
Sekaviljelystä perustettiin sitten apuna perinnäi-5 siä mikrobiologisia menetelmiä käyttäen (vahvistettuja agar-ravintopohjia) krotonbetaiinia hajottavien mikro-organismien puhdasviljelyjä. Eräs viljely valikoitiin jatkotyöskentelyä varten ja nimettiin HK 4:ksi.
Tämä kanta kasvaa myös y^butyrobetaiinilla, L-kar-10 nitiinilla ja betaiinilla.
Esimerkki 2
Pvsvvän karnitiini-dehvdroaenaasi-neaatiivisen mu-tantin eristäminen Tällaisen mutantin ei tulisi enää voida pilkkoa 15 /^-butyrobetaiinistä tai krotonbetaiinista rakennettua L- karnitiinia ja ihannetapauksessa tulisi sen sijaan erittää sitä.
HK 4:n viljely mutageenikäsiteltiin pysyväksi "Acridin Mutagen ICR 101:llä", 5 Mg/ml, ohjeen mukaisesti 20 sukkinaattialustassa [J.H. Miller, Experiments in Molec ular Genetics, Cold Spring Harbot Laboratory, 1927], sen jälkeen annettiin solujen standardinmukaisesti kasvaa "ra-vintoliemessä" (Nutrient Broth) mutaation ekspres- soitumiseen asti, sen jälkeen siirrettiin betaiinialus-25 taan. Kasvatetulla viljelyllä ympättiin L-karnitiini-alus-ta.
Muutaman tunnin kuluttua viljely saavutti logaritmisen kasvun. Tänä ajankohtana lisättiin penisilliini G:tä (15 mg/ml) ja D-sykloseriiniä (0,5 mg/ml) [Ornston et ai., 30 Biochim, Biophys, Res. Commun. 36, 179 (1969)]. Nämä "vastavalikoivat" aineet tukahduttavat vain kasvavia bakteereja. Mutantit, jotka eivät enää pysty kasvamaan L-kar-nitiinilla ja jotka tässä ovat kiinnostavia, pysyvät elossa ja rikastuvat tämän mukaisesti suhteellisesti. 30 tun-35 nin kuluttua oli elävien solujen lukumäärä alentunut sadasosaan, antibiootit pestiin pois ja viljely siirrettiin 11 86889 betaiini-alustaan. Kasvun jälkeen jaettiin viljelyn vastaavat laimennukset vahvistetulle ravintoagarille. Näin yksilöidyt solut kasvoivat pesäkkeiksi ja testattiin yksittäin. Valikoitiin mutantti HK 13. Sillä ei ole pysyvänä 5 enää karnitiini-dehydrogenaasia eikä sen mukaisesti enää kasva L-karnitiinilla, X-butyrobetaiinilla tai kroton-betaiinilla, mutta kasvaa hyvin betaiinilla. Kasvaessaan betaiinilla, dimetyyliglysiinillä, koliinilla, glutamaa-tilla tai asetaatilla, tämä kanta muuttaa krotonbetaiinin 10 tai ^-butyrobetaiinin L-karnitiiniksi ja erittää tätä.
Esimerkki 3
HK 13:n 5 litran esiviljelyä viljeltiin vitamiinipitoisessa mineraalialustassa [Kulia et ai., Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)], joka sisälsi 1 paino-% betaiinia ja 15 0,5 paino-% krotonbetaiini-kloridia, 30° C:ssa ja pH
7,0:ssa 32 tunnin ajan. Tällä ympättiin 15 litran viljely, jolla oli sama koostumus, ja viljeltiin kuten esiviljelyä (30° C, pH 7,0, p02 = 3 ppm) 24 tuntia. Kun tuotanto pysähtyi, solut lingottiin erilleen ja voitiin käyttää ymppi-20 aineksena uutta panosta varten. L-karnitiinin pitoisuus mitattiin supernatantista (19,8 1) entsymaattisella analyysillä.
Supernatantti sisälsi 4,26 mg L-karnitiinia/ml. Tämä vastasi 95,0 %:n saantoa laskettuna käytetystä kro-: 25 tonbetaiini-kloridi-määrästä.
Irtoamistuotteita tai muita epäpuhtauksia ei voitu osoittaa NMR-kirjossa.
Kuten on selostettu [J.P. Vandecasteele, Appi. Environ. Microbiol. 39, 327 (1980)] voitiin L-karnitiini ke-30 rätä talteen kationinvaihtokromatografiän avulla päällä olevasta nesteestä ja puhdistaa uudelleenkiteyttämällä.
Esimerkki 4 HK 13:n 5 litran esiviljelyä viljeltiin vitamiinipitoisessa mineraalialustassa (esimerkin 1 mukaisesti), 35 joka sisälsi 1 % koliinia ja 0,6 % <£-butyrobetaiini-klori-dia, pH 7,0:ssa ja 30 °C:ssa 32 tunnin ajan. Tällä esivil- 86889 12 jelyllä ympättiin viljely 15 litrassa alustaa, jolla oli sama koostumus, ja viljeltiin samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1. Kun tuotanto n. 30 tunnin kuluttua pysähtyi, erotettiin solut mikrosuodatuksella (Amicon Hollow-5 fiber cartridge). Tätä solumassaa voitiin käyttää L-kar-nitiinin lisätuotantoon. L-karnitiinin pitoisuus suodok-sessa (19,6 1) määritettiin entsymaattisesti. Suodos sisälsi 5,3 mg L-karnitiinia/ml. Tämä vastasi 97,6 %:n analyyttistä saantoa laskettuna käytetystä ^-butyrobetaiini-10 kloridi-määrästä.
NMR-analyysin mukaan eri irtoamistuotteita tai muita vieraita orgaanisia sivutuotteita ei ollut osoitettavissa suodoksessa. Sen tähden voitiin liuoksesta L-kar-nitiini erottaa tunnetulla tavalla, esim. atseotrooppisel-15 la tislauksella (DE-patentti 2 300 492).
Esimerkki 5
Jatkuvaa viljelyä varten varustettu fermentori, joka sisälsi 1,5 1 vitamiinipitoista mineraalialustaa (esimerkin 1 mukaista), jossa oli 1,5 % betaiinia ja 1,0 % 20 (^-butyrobetaiini-kloridia, ympättiin 150 miellä HK 13 esi- viljelyä samassa alustassa. 20 tunnin aerobisen viljelyn jälkeen 30 °C:ssa ja pH 7,0:ssa oli viljely kasvanut loppuun ja jatkuva käyttö voitiin aloittaa virtausnopeudella 0,1 1/h. Fermentorista ulosvirtaava viljelyliuos koottiin 25 4 °C:seen jäähdytettyyn astiaan. Solut poistettiin linkoa malla. Entsymaattisen analyysin mukaan supernatantti sisälsi 8,8 g L-karnitiinia/1 viljelyä.
Tämä vastasi 99,2 %:n analyyttisesti osoitettua saantoa laskettuna käytetystä iT-butyrobetaiini-kloridin 30 pitoisuudesta.
Kiinteä L-karnitiinikloridi voitiin eristää liuoksesta ionikromatografiällä ja vesierotuksella.
Claims (10)
1. Menetelmä L-karnitiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että bakteereja, jotka pystyvät 5 krotonbetaiinista ja/tai j^-butyrobetaiinista tuottamaan L-karnitiinia pilkkomatta jälkimmäistä ja joita saadaan seuraavalla vaiikointimenetelmällä: a) bakteereja, jotka kasvavat käyttäen betaiinia, y^-butyrobetaiinia, krotonbetaiinia ja L-karnitiinia
10 C- ja N-lähteenä, mutaatiokäsitellään tavalliseen tapaan; b) mutaatiokäsiteltyjen bakteerien kasvattamalla saadusta viljelystä valikoidaan ne, jotka ovat pysyviä, eivät pilko L-karnitiinia eivätkä kasva L- 15 karnitiinilla, krotonbetaiinilla, /"-butyrobetaii- nilla, mutta kasvavat hyvin betaiinilla, viljellään krotonbetaiinilla ja/tai K^-butyrobetaiinilla kasvusubstraatin läsnäollessa ja rikastunut L-karnitiini eristetään.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen b) jälkeen valikoidaan ne bakteerit, jotka erittävät L-karnitiinia ja eivät kasva L-karnitiinilla, krotonbetaiinilla, )^-butyro-betaiinilla, mutta kasvavat hyvin betaiinilla.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdassa (a) mutaatiokäsitel-tyjä bakteereja viljellään edelleen betaiini-alustassa.
4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että betaiini-alustassa edelleen 30 kasvatettuja bakteereja valikoimisvaiheen b) suoritta miseksi viljellään edelleen L-karnitiini-alustassa.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään bakteeria HK 13 (DSM Nr. 2903) tai sen jälkeläistä tai spontaania 35 mutanttia. 86389
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään bakteeria HK 1331 b (DSM Nr 3225) tai sen jälkeläistä.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että viljellään bakteeria, joka on saatu mutatoimalla HK 4 (DSM Nr. 2938), tai sen jälkeläistä.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että krotonbetaiinia, 10 j^-butyrobetaiinia tai niiden seoksia käytetään määrissä 0,1 - 10 paino-%, laskettuna viljelyalustasta.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvusubstraattina käytetään dimetyyliglysiiniä, koliinia, glutamaattia, ase- 15 taattia ja/tai betaiinia.
10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvusubstraatteja käytetään määrissä 0,1 - 10 paino-%, laskettuna viljely-alustasta. i5 86889
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH160084 | 1984-03-29 | ||
| CH160084 | 1984-03-29 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI850781A0 FI850781A0 (fi) | 1985-02-26 |
| FI850781L FI850781L (fi) | 1985-09-30 |
| FI86889B FI86889B (fi) | 1992-07-15 |
| FI86889C true FI86889C (fi) | 1992-10-26 |
Family
ID=4214209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI850781A FI86889C (fi) | 1984-03-29 | 1985-02-26 | Foerfarande foer framstaellning av av l-karnitin pao mikrobiologiskt saett |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5187093A (fi) |
| EP (1) | EP0158194B1 (fi) |
| JP (1) | JPS60224488A (fi) |
| CN (1) | CN1004146B (fi) |
| AT (1) | ATE64154T1 (fi) |
| AU (1) | AU585216B2 (fi) |
| BG (1) | BG50282A3 (fi) |
| BR (1) | BR8501374A (fi) |
| CA (1) | CA1265757A (fi) |
| CS (1) | CS273163B2 (fi) |
| DD (1) | DD232310A5 (fi) |
| DE (1) | DE3583058D1 (fi) |
| DK (1) | DK165191C (fi) |
| ES (1) | ES8602940A1 (fi) |
| FI (1) | FI86889C (fi) |
| HU (1) | HU193744B (fi) |
| IE (1) | IE58045B1 (fi) |
| IL (1) | IL74552A (fi) |
| IN (1) | IN164247B (fi) |
| NO (1) | NO164918C (fi) |
| PL (1) | PL145712B1 (fi) |
| RO (1) | RO92477B (fi) |
| SU (1) | SU1435159A3 (fi) |
| YU (1) | YU45708B (fi) |
| ZA (1) | ZA851959B (fi) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59183694A (ja) * | 1983-04-05 | 1984-10-18 | Hamari Yakuhin Kogyo Kk | 光学活性なカルニチンの生化学的製造法 |
| JPS59192095A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−カルニチンの製造法 |
| DD221905B1 (de) * | 1983-11-03 | 1987-03-18 | Univ Leipzig | Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten |
| JPS62275689A (ja) * | 1985-12-09 | 1987-11-30 | Bio-Le Kk | Ｌ−カルニチンの製造法 |
| MX170707B (es) * | 1989-07-28 | 1993-09-08 | Lonza Ag | Procedimiento para la produccion discontinua de l-carnitina por transformacion microbiologica de crotonobetaina y gama-butirobetaina |
| DE4017595A1 (de) * | 1990-05-31 | 1991-12-05 | Consortium Elektrochem Ind | Maltopentaose produzierende amylasen |
| DE4106375A1 (de) * | 1991-02-28 | 1992-09-03 | Degussa | Eine l-carnitin-amidase produzierender mikroorganismus, l-carnitin-amidase, verfahren zu deren gewinnung und deren verwendung |
| CN1058995C (zh) * | 1996-11-08 | 2000-11-29 | 江苏省微生物研究所 | L-肉碱或其盐的制备方法 |
| KR100255039B1 (ko) | 1997-07-28 | 2000-05-01 | 박영구 | L-카르니틴의제조방법 |
| DE19749480A1 (de) * | 1997-11-08 | 1999-05-20 | Univ Leipzig | Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain |
| CN1233832C (zh) * | 2001-01-31 | 2005-12-28 | 隆萨股份公司 | 制造l－肉毒碱的微生物学方法 |
| US7700074B2 (en) * | 2002-02-07 | 2010-04-20 | Pettegrew Jay W | Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism |
| US7407778B2 (en) | 2002-02-07 | 2008-08-05 | Pettegrew Jay W | Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders |
| CN1795198B (zh) * | 2003-05-29 | 2011-08-17 | 杰伊·W·佩特格尤 | 对神经精神疾病进行医学成像所用的甘油磷酸胆碱及其衍生物 |
| US20060257842A1 (en) * | 2003-05-29 | 2006-11-16 | Pettegrew Jay W | Cryopreservation media and molecules |
| CN101912045B (zh) * | 2005-07-05 | 2013-07-31 | 隆萨股份公司 | 生产干肉碱粉末或颗粒的喷雾干燥法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2313573A (en) * | 1938-01-17 | 1943-03-09 | Gen Aniline & Film Corp | Capillary active compounds and process of preparing them |
| US2367878A (en) * | 1939-05-04 | 1945-01-23 | Hoffmann La Roche | Betaine esters |
| NL6511804A (fi) * | 1964-11-30 | 1966-05-31 | ||
| FR1559839A (fi) * | 1968-01-30 | 1969-03-14 | ||
| ES370147A1 (es) * | 1968-08-29 | 1971-04-01 | Gulf Research Development Co | Un procedimiento para fabricar ciclopropilamina. |
| US3711549A (en) * | 1970-05-19 | 1973-01-16 | Gulf Research Development Co | Process for manufacturing cyclopropylamine |
| US3796632A (en) * | 1971-12-10 | 1974-03-12 | Toray Industries | Process for racemizing alpha-amino-epsilon-caprolactam |
| DE2751134C2 (de) * | 1977-11-16 | 1986-04-17 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von γ-Chlorcarbonsäureestern |
| IT1142201B (it) * | 1980-06-24 | 1986-10-08 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina |
| DE3214953A1 (de) * | 1982-04-22 | 1983-10-27 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide |
| JPS59192095A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−カルニチンの製造法 |
| DD221905B1 (de) * | 1983-11-03 | 1987-03-18 | Univ Leipzig | Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten |
| CH664374A5 (de) * | 1985-02-27 | 1988-02-29 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von l-carnitin auf mikrobiologischem weg. |
| IT1190280B (it) * | 1986-04-24 | 1988-02-16 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento per la preparazione di gamma-butirrobetaina |
-
1985
- 1985-02-26 FI FI850781A patent/FI86889C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-03-04 IE IE53385A patent/IE58045B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-07 IN IN177/MAS/854A patent/IN164247B/en unknown
- 1985-03-10 IL IL74552A patent/IL74552A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-03-15 ZA ZA851959A patent/ZA851959B/xx unknown
- 1985-03-19 HU HU851012A patent/HU193744B/hu unknown
- 1985-03-21 AU AU40192/85A patent/AU585216B2/en not_active Expired
- 1985-03-22 EP EP85103420A patent/EP0158194B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-22 AT AT85103420T patent/ATE64154T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-22 DE DE8585103420T patent/DE3583058D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-26 BR BR8501374A patent/BR8501374A/pt unknown
- 1985-03-26 BG BG069432A patent/BG50282A3/xx unknown
- 1985-03-27 DD DD85274492A patent/DD232310A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 CS CS222085A patent/CS273163B2/cs unknown
- 1985-03-27 RO RO118151A patent/RO92477B/ro unknown
- 1985-03-27 DK DK138085A patent/DK165191C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 ES ES541663A patent/ES8602940A1/es not_active Expired
- 1985-03-28 YU YU50485A patent/YU45708B/sh unknown
- 1985-03-28 PL PL1985252628A patent/PL145712B1/pl unknown
- 1985-03-28 NO NO851261A patent/NO164918C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 CA CA000477804A patent/CA1265757A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 JP JP60064931A patent/JPS60224488A/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 SU SU853874110A patent/SU1435159A3/ru active
- 1985-04-01 CN CN85101191.8A patent/CN1004146B/zh not_active Expired
-
1990
- 1990-03-15 US US07/496,093 patent/US5187093A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI86889C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av av l-karnitin pao mikrobiologiskt saett | |
| Engel et al. | Growth and autotrophic metabolism of Nitrosomonas europaea | |
| IE58779B1 (en) | Process for the microbiological production of l-carnitine | |
| US4745064A (en) | Process for the degradation of s-triazine derivatives in aqueous solutions | |
| US5082777A (en) | Process for the production of 6-hydroxynicotinic acid | |
| Van den Tweel et al. | Bioformation of 4-hydroxybenzoate from 4-chlorobenzoate by Alcaligenes denitrificans NTB-1 | |
| JP3026190B2 (ja) | ５−アミノレブリン酸生産微生物及びこれを用いた５−アミノレブリン酸の製造法 | |
| KR100233330B1 (ko) | 6-히드록시피콜린산을 제조하기 위한 미생물학적 방법 | |
| DE3600563C2 (fi) | ||
| US4753882A (en) | Urease and process for preparation thereof | |
| JPH03191794A (ja) | 微生物処理によるｒ―（―）―３―ハロゲノ―１，２―プロパンジオールの製法 | |
| US5212089A (en) | Process for prepartion of s-(+)-3-halogeno-1,2-propanediol by treatment with alcaligenes | |
| US5496715A (en) | Process for preparing indigo | |
| US4275162A (en) | Process for the production of sphingomyelinase | |
| US5246843A (en) | Process for preparation of R-(-)-3-halogeno-1,2,-propanediol by treatment with microorganism | |
| CS195307B2 (en) | Process for the production of microorganisms | |
| EP1018546B1 (en) | Microorganisms producing 5-aminolevulinic acid and processes for producing 5-aminolevulinic acid by using the same | |
| Duménil et al. | Production of vitamin B12 by gram-variable methanol-utilizing bacteria | |
| JP2586283B2 (ja) | 微生物学的手段によってｌ−カルニチンを製造する方法 | |
| US4617156A (en) | 2-hydroxymuconic semialdehyde bisulfite adduct | |
| FR2519649A1 (fr) | Procede de production de tyramine oxydase | |
| SU1377290A1 (ru) | Штамм бактерий ALcaLIGeNeS FaecaLIS, используемый дл очистки сточных вод от 2-хлор-цис,цис-муконовой кислоты | |
| CZ279298B6 (cs) | Mikroorganismy Alcaligenes faecalis DSM 6335 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové | |
| JPH06153915A (ja) | ５−アミノレブリン酸生産微生物および５−アミノレブリン酸の製造方法 | |
| JPS61285994A (ja) | 微生物による２，４，６−トリヒドロキシ安息香酸の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: LONZA AG |
|
| MA | Patent expired |