HU193744B - Microbiological process for preparing l-carnitine - Google Patents

Microbiological process for preparing l-carnitine Download PDF

Info

Publication number
HU193744B
HU193744B HU851012A HU101285A HU193744B HU 193744 B HU193744 B HU 193744B HU 851012 A HU851012 A HU 851012A HU 101285 A HU101285 A HU 101285A HU 193744 B HU193744 B HU 193744B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
betaine
carnitine
gamma
butyrobetaine
crotono
Prior art date
Application number
HU851012A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT37653A (en
Inventor
Hans Kulla
Pavel Lehky
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of HUT37653A publication Critical patent/HUT37653A/hu
Publication of HU193744B publication Critical patent/HU193744B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/824—Achromobacter

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Catalysts (AREA)

Description

A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás L-karnitin előállítására.
Ismert az L-karnitín gamma-butiro-betainból való előállítása, amelynek során a gamma-butiro-betaint nátrium-2-oxo-glu tarát, redukáló anyagok, vasion-forrás és hidroxilcsoport-forrásként szolgáló oxigén jelenlétében a Neurospora crassa mikroorganizmusból felszabadított hidroxiláz enzimmel kezelik (4 371 618 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az eljárás hátránya, hogy számos járulékos tényezőt (kofaktor) igényel: így a reakció során stöchiometrikus mennyiségű 2-oxo-glutarát oxidáció útján szukcináttá dekarboxileződik, az oxigén aktiválásához kétvegyértékű vasionok kellenek, továbbá aszkorbát, hogy a vasionok redukált állapotban maradjanak, és végül kataláz a nyomokban keletkező káros hidrogén-peroxid lebontására.
Lindstedt et al. (Biochemistry 6, 1262-1270 (1967) „The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas”) Pseudomonas nembeli mikroorganizmust izoláltak, amely C- és N-forrásként gamma-butiro-betaint képes hasznosítani. A lebontás első lépcsőjében a gamma-butiro-betain L-karnitinná hidroxileződik, de az intermedierként keletkező L-karnitin a metabolizálás során teljesen lebomlik szén-dioxid, víz és ammónia végtermékre.
Az ebből a mikroorganizmusból nyert hidroxiláz—ha az L-karnitin előállításához hasznosítanák—járulékos tényezők szempontjából a fenti hátrányokkal járna (Lindstedt et al., Biochemistry 16, 2181-2188 (1977), „Purification and Properties of y-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1”).
A találmány célja olyan új típusú mikroorganizmus biztosítása volt, amellyel az ismert eljárások hátrányai kiküszöbölhetők és egyszerű módon nem a racém karnitin, hanem enantio-szelektív módon L-karnitin állítható elő krotono-betaninból, butiro-betainból vagy a kettő keverékéből.
A technika állásából ismert rendszerekkel ellentétben a találmány szerint alkalmazott mikroorganizmusok nem oxigént, hanem vizet alkalmaznak hidroxilcsoport-forrásként, ahogy H2 I8O és ,SO2 jelzett vegyszerekkel végzett saját kísérletek mutatták.
A találmány szerint alkalmazott mikroorganizmusok krotono-betainból és/vagy gamma-butiro-betainból L-karnitint termelnek, de az utóbbit nem katabolizálják.
Ahogy négy kontinensen szedett talajminták összehasonlító vizsgálata kimutatta, a butiro-betaint és krotono-betaint L-karnitinen keresztül katabolizáló mikroorganizmusok mindenütt jelen vannak; szennyvíztisztító berendezések feles eleveniszapjából is sikerül az elkülönítés. Ezek a törzsek potenciálisan mind alkalmasak az L-karnitin termelésére, ha a találmány szerinti elv alapján mutagenizáljuk őket. Alkalmas mutánsokat úgy állíthatunk elő, hogy
a) C- és N-forrásként betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint hasznosítani képes mikroorganizmusokat a szokásos módon mutagenizáljuk, és
b) a tenyésztés során kapott mutált kúltúrából azokat a mikroorganizmusokat izoláljuk, amelyek stabilisak, L-karnitint nem katabolizálják, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint nem képesek hasznosítani, betaint azonban igen.
A b) szelekciós lépést követően előnyösen azokat a mikroorganizmusokat választjuk ki, amelyek az L-karnitint kiválasztják, és L-karnitint, krotono-betaint, gamma-butiro-betaint nem képesek hasznosítani, betaint azonban igen.
A mutált mikroorganizmusokat célszerűen betain-tartalmú közegen kultiváljuk tovább, majd a b) lépés végrehajtására előnyösen L-kamitin-tartalmú közegen tenyésztjük tovább. A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosítani képes törzseket célszerűen úgy tenyésztjük, hogy baktérium keverékeket krotono-betaint tartalmazó tápoldattal oltva keverék kultúrát hozunk létre és a keverék kultúrából hagyományos mikrobiológiai módszerek segítségével krotono-betaint lebontani képes mikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyerjük.
A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosítani képes tenyészet mutációját ismert módszerekkel érhetjük el (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972). Stabil mutánsok előállítására alkalmas a Frame-Shift-módszer, a deletálás módszere, valamint a transzpozon-inzertálás módszere. A mutált mikroorganizmusokat—betain-tartalmú közegben végzett tenyésztés, majd L'-karnitint tartalmazó közegre történő átoltás után—a b) szelekciós lépésnek vetjük alá, amelyben ismert „counter-szelektáló ágensek segítségével (P. Gerhardt et al. (eds.), Manual of Methods of General Bacteriology, Am. Soc. fór Microbiology, 1981) az L-karnitint nem katabolizáló, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint nem hasznosító, de betaint hasznosító mikroorganizmusokat szelektáljuk.
A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosító mikroorganizmusok közül a 2938 szám alatt a Német Mikroorganizmus-Gyűjteményben (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, 4300 Göttingen, Griesebachstr. 8., NSZK) 1984. március 3-án letétbe helyezett, HK 4 jelű törzset, valamint deszcendenseit és mutánsait részesítjük előnyben. (A mikroorganizmus tudományos leírása lásd I. táblázat.)
A HK 4 jelű mikroorganizmusból mutáció és szelektálás révén előállítottuk a HK 13
-2193744 jelű mikroorganizmust, amely stabil, L-karnitint nem katabolizál, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint nem hasznosít, betaint azonban igen. A HK 13 jelű törzset 1984.01.23-án helyeztük letétbe DSM 2903 szám alatt a fent említett törzsgyűjteményben. (A mikroorganizmus tudományos leírása lásd I. táblázat.)
A HK 13 törzs egyik származéka a HK 1331 b jelű törzs, amely stabil, L-karnitint nem katabolizál, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint külön-külön nem hasznosít, betaint, L-glutamátot és krotono-betaint együtt, L-glutamátot és gamma-butiro-betaint együtt, valamint L-glutamátot és L-karnitint együtt azonban igen. Ezt a törzset
I.
A három törzs tudomány
I985.02.08-án helyeztük letétbe DSM 3225 szám alatt a fent említett törzsgyűjteményben. A törzset spontán, jól növekedő mutáns-telepként különítettük el agarral megszilár5 dított, L-glutamátot és gamma-butiro-betaint tartalmazó táptalaj felületéről.
A három törzs tudományos leírását tartalmazó táblázatban az alábbi rövidítéseket használjuk:
Mac-Conkey agar, SS-agar lásd: DIFCO MANUAL, 9. Edition, 131., 132., 134-138. oldal OF-teszt: a savképződést egyszer oxigénnel oxidálva, majd párhuzamos fermentációs úton, oxigén nélkül határoz15 zuk meg
ONPG: o-nitrofenil-p-D-galaktopiranozid táblázat s leírása
paraméter HK 4 HK 13 HK 1331
sej tforma pálcika pálcika pálcika
hossza m részben pleomorf 1-2 rés zben pleomorf 1 -2 re'szben pleomorf 1-2
szelessége m 0,5-0,8 0,5-0,8 0,5-0,8
mozgékonyság + + +
ostorok peritrich per itrich peritrich
Gram-reakció - - -
spórák - - -
poli-B-hidroxi-buti-
rát képződésé - -· -
oxidaz f + + +
katala'z növekedés + + +
anaerob - - -
37°C + + +
41°C - - -
pH 5,6 - - -
Mac-Conkey agar + + +
SS-agar - - -
cetrimid agar - - -
pigment-kepzodes
diffundáló - - -
nem diffundáló - - -
fluoreszkáló - - -
savkepzode's (OF-teszt)
glükózbo'l aerob - - -
glükózból anaerob - - -
fruktózbo’l aerob - - -
ÁSS glükózból + +
xilózból + +
trehalózból + +
etanolból - - -
gázképződés glükózból - - -
ONPG + -f- +
arginin-dihidrolaz - - -
1izin-dekarboxiláz - - -
fenilalanin-dezaminaz - - -
-3193744
I. táblázat (folytatása) A három törzs tudományos leírása
paraméter HK 4 HK 13 HK 1331 b
ornitin-dekarboxilaz — —
h2s - - -
Voges-Proskauer - - -
indol - - -
nitrit nitrátból + + +
denitrifíkalas + + +
levánkápzodes - - -
léc itinaz - - -
ureaz + + +
lebontani kepes
keme'nyito - - -
zselatin - - -
kazein - - -
tirozin - - -
Tween 80 - - -
DNS + + 4-
eszkulin + + +
. Z , / / szubsztratum hasznosítás
acetat - - -
c i trét - - -
malonat - - -
glicin - -
norleucin - - -
xiláz + + +
fruktóz + + +
glükóz + + +
autotróf növekedés
H2 - - -
3-ketolaktoz - - -
növekedés
bétáin + + +
L-karnitin + - -
gamma-butiro-betain + -
krotono-betain + - -
L-glutamat es krotono-
-bétáin + +
L-glutamát es gamma-
-butiro-betain + +
L-glutamát és L-kar-
nitin + +
A találmány szerinti eljárást L-karnitin előállítására előnyösen úgy foganatosítjuk, hogy a mikroorganizmus előkultúráját, előnyösen a HK 13 törzs előkultúráját sterilizált, előnyösen vitamintartalmú ásványi közegben (Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, 1 /1983/) 20-40°C-on, előnyösen 30°C-on 6-8 pH között, előnyösen pH 7 mellett 20—50 órán át, előnyösen 30—40 órán át tenyésztjük. Az előtenyészet előnyösen 0,1 —10 t%, különösen elő 4 nyösen 0,5—5 t% mennyiségben kolint, glutamátot, acetátot, dimetil-glicint vagy betaint tartalmaz növekedési szubsztrátumként. Különösen előnyös a bétáin 0,5—5 t% mennyi50 ségben.
A mikrobiológiai technikában szokásos, hogy az előtenyészet az átalakítani kívánt kiindulási vegyüieteket, tehát gamma-butiro-betaint, krotono-betaint vagy azok keveré65 két is tartalmazza 0,1-10 t%, előnyösen 0,5-4193744
-5 t% mennyiségben, a tápközegre vonatkoztatva. A gamma-butiro-betain, illetve krotono-betain hidroklorid-só, szabad belső só vagy származéka alakjában lehet jelem
A fentiek szerint készített előkultúrával további tenyészeteket olthatunk be. összetételük célszerűen az előkultúra összetételével egyezik. Az átalakítani kívánt krotono-betain, gamma-butiro-betain vagy e kettő keveréke 0,1-10 t%, előnyösen 0,5-5 t% mennyiségben van jelen a tápközegben. A kolin, glutamát, acetát, dimetil-glicin és bétáin növekedési szubsztrátumokat célszerűen szintén az előkultúrával kapcsolatban elmondott koncentrációban alkalmazzuk.
A tenyésztés körülményei az előkultúra tenyésztési körülményeihez hasonlóak, tehát a hőmérséklet előnyösen 20°C és 40°C közötti, különösen 30°C körüli érték, és a pH-értéket általában 6 és 8 között, előnyösen pH 7 mellett tartjuk.
A fentiek szerint elindított fermentálás 20-30 óra elteltével megáll, ekkor az L-karhitin koncentrációja általában a·gamma-butiro-betain vagy krotono-betain kezdeti menynyiségének ekvivalens.
A sejteket centrifugálással vagy szűréssel választhatjuk el és további kultúra beoltásához használhatjuk fel.
Az L-karnitint ismert módon (J.P. Vandecasteele', Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 /1980/) kationcserélő gyantával végzett kromatográfiával a szűrletből elkülöníthetjük, majd átkristályosítással tisztíthatjuk.
A találmány szerinti eljárást folyamatos eljárásként is végrehajthatjuk, oly módon, hogy a sejteket kémosztátba, előnyös hígítási arány (0,04-0,2 óra-1) mellett tenyésztjük, a szakaszos tenyésztéshez hasonló körülmények között.
1. példa
Krotono-betaint lebontó mikroorganizmus elkülönítése
Talajmintát semleges kémhatású foszfát-pufferrel keverve mikroorganizmusokat extrahálunk. A kivonatot nagyobb szilárd részek eltávolítása céljából szűrjük, majd krotono-betaint tartalmazó tápoldatot oltunk be vele enyhe zavarosság bekövetkeztéig. A zavarosság (mint a sejtkoncentráció mértéke) 9 nap elteltével a 90-szeresére megnövekedett. Az oldat krotono-betaint már nem tartalmazott, bomlási termékként ammónia volt kimutatható. A keverék kultúrából hagyományos mikrobiológiai módszerek segítségével a krotono-betaint lebontó mikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyertük (szilárdított agar táptalajon). Az egyik kultúrát a további műveletekhez kiválasztottuk, HK 4-nek neveztük. Ez a törzs gamma-butiro-betaint, L-karnitint és betaint is képes hasznosítani.
2. példa
Stabil, karnitin-dehidrogenáz szempontjából negatív mutáns elkülönítése
A cím szerinti mutánstól kívánható, hogy a gamma-butiro-betainból vagy krotono-be8 ’ainból felépített L-karnitint ne katabolizál;a, sőt ideális esetben kiválassza.
A HK 4 törzs kultúráját az 5 mikrogramm/ml mennyiségben vett „Acridin Mutagen ICR 191” mutagénnel szukcinátos közegben az előírásoknak megfelelően (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Laboratory, /1972/) mutagerizáltuk, majd a sejteket szabvártyszerűen „Nutrient Broth” tápon növesztettük, hogy a mutáció láthatóvá váljék. A sejteket tartalmazó közegre oltottuk át. A kész kultúrával L-karnitint tartalmazó közeget oltottunk.
Néhány óra elteltével a tenyészet elérte a logaritmikus növekedés szakaszát. Ebben az, időpontban 15 mg/ml mennyiségben G-penicillint és 0,5 mg/ml mennyiségben D-cikioszerint adagoltunk (Ornstorn et al., Biochim. Biophys. Rés. Commun. 36, 179 /1969/). Ezek az ellen-szelekcionáló ágensek csak növekvő baktériumokat ölnek, az L-karnitin hasznosítására ,már nem képes, kívánt mutánsok túlélnek, és viszonylagosan feldúsúlnak. Harminc óra elteltével az élő sejtek száma az eredeti érték egyszázadára csökkent. Az antibiotikumokat elmostdk, és a tenyészetet betaint tartalmazó közegbe vittük át. Növekedés után a tenyészet megfelelő hígításait megszilárdított tápagaron szélesztettük. Az elkülönült sejtekből telepek nőttek; a telepeket külön-külön megvizsgáltuk. A HK 13 jelű mutánst választottuk ki. Ebből a mutánsból a karnitin-dehidrogenáz stabilan hiányzik. a mutáns tehát L-karnitint, gamma-butiro-betaint és krotono-betaint nem tud hasznosítani, betaint azonban igen. Ez a törzs — betaint, dimeti 1-glicint, kolint, glutanátot vagy acetátot tartalmazó tápközegben fermentálva — krotono betaint vagy gamma-butiro-be'aint L-karnítinná alakít és az utóbbit kivál asztja.
3. példa \ HK 13 jelű 5 literes előkultúráját 1 t% betaint és 0,5 t% krotono-betain-hidrokloridot tartalmazó, vitamintartalmú ásványi közegben (Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, /1983/) 30°C-on pH 7,0 mellett 32 órán át tenyésztettük. A tenyészettel azonos összetétel 15 literes közeget oltottunk, és az előkultúrával azonos módon (30°C, pH 7,0, pO2= =3 ppm) 24 órán át tenyésztettük. Miután a termelés megállt, a sejteket lecentrifugáltuk, és új szakaszos kultúra oltóanyagaként használtuk fel. A 19,8 liter térfogatú felüluszó részben az L-karnitin koncentrációját enzimes elemzéssel mértük. A felüluszó rész milliliterenként 4,26 mg L-karnitint tartalmazott, ami a krotono-betain-hidroklorid kiindulási mennyiségére vonatkoztatva 95,0%-os hozamnak felel meg. Az NMR-színkép sem kiindulási anyagokat, sem szennyeződéseket nem mutatott ki.
Az L-karnitint az irodalomból ismert módon J.P. Vandesteele, Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 /1980/) kationcserélő gyantán
-5193744 végzett kromatográfiával elkülönítettük az oldatból, majd átkristályosítással tisztítottuk.
4. példa
A HK 13 jelű törzs 5 literes előkultúráját 1 t% kolint és 0,6 t% gamma-butiro-betain-hidrokloridot tartalmazó, vitamintartalmú ásványi közegben (az 1. példa szerinti) 30°Con pH 7,0 mellett 32 órán át tenyésztettük. A tenyészettel 15 liter térfogatú, azonos összetételű közeget oltottunk be. A kultúrát az 1. példában megadott módon tenyésztettük. Mintegy 30 óra elteltével a termelés megállt. A sejteket mikroszűréssel (Amicon Hollow-fiber cartridge) eltávolítottuk. A sejtmasszával további termelő kultúrát oltottunk be. A 19,6 liter térfogatú szőriét L-karnitin-koncentrációja 5,3 mg/ml volt, ami a gamma-butiro-betain kiindulási mennyiségére vonatkoztatva 97,6 %-os hozamnak felel meg. Az NMR-színkép sem kiindulási anyagot, sem szennyeződéseket nem mutatott ki. Ezért az L-karnitint ismert módon, például azeotrop desztillálással (23 00 492 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás) különíthettük el az oldatból.
5. példa
Folyamatos fermentálásra alkalmas, 1,5 liter vitamintartalmú (1. példa szerinti), 1,5 t% betaint és 1,0 t% gamma-butiro-betain-hidrokloridot tartalmazó ásványi tápközeget tartalmazó fermentort a HK 13 törzs azonos közegben készített előkultúrájának 150 ml-jével oltottunk. 20 órán át 30°C-on, pH 7,0 és aerob körülmények mellett végzett tenyésztés után a kultúra kinőtt, és 0,1 I/óra átfolyási sebességgel kezdtük a folyamatos üzemet. A fermentorból kilépő oldatot 4°C-ra hűtött edénybe szedtük, a sejteket centrifugálással elválasztottuk. Az enzimes elemzés szerint a szűrlet L-karnitin-koncentrációja 8,8 g/l volt. Ez az érték a gamma-butiro-betain kiindulási mennyiségére vonatkoztatva 99,2 %-os hozamnak felel meg. Az oldatból ionos kromatográfiával és vízelválasztással különítettük el a szilárd L-karnitin-hidrokloridot.

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás L-karnitin előállítására, azzal jellemezve, hogy a HK 13 jelű, DSM 2903 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust vagy mutánsait krotono-betainnal és/vagy gamma-butiro-betainnal dimetil-glicin, kolin, glutamát, acetát és/vagy bétáin jelenlétében tenyésztjük, majd a feldúsúlt L-karnitint elkülönítjük. (1984.03.29.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a krotono-betaint, gamma-butiro-betaint vagy a kettő keverékét 0,1-10 t% mennyiségben adagoljuk a tápközeg5 hez. (1984.03.29.)
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimetil-glicint, kolint, glutamátot, acetátot és/vagy betaint a tápközeg mennyiségére vonatkoztatva 0,110 -10 t% mennyiségben adagoljuk. (1984.03.29.)
  4. 4. Eljárás L-karnitin előállítására, azzal jellemezve, hogy a HK 13 jelű, DSM 2903 szám alatt letétbe helyezett, vagy a HK 1331 b
    15 jelű, DSM 3225 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust vagy mutánsait krotono-betainnal és/vagy gamma-butiro-betainnal dimetil-glicin, kolin, glutamát, acetát és/vagy bétáin jelenlétében tenyésztjük, majd a fel20 dúsúlt L-karnitint elkülönítjük. (1985.03.19.)
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a krotono-betaint, gamma-butiro-betaint vagy a kettő keverékét 0,1-10 t% mennyiségben adagoljuk a tápközeg25 hez. (1985.03.19.)
  6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dímetil-glícint, kolint, glutamátot, acetátot és/vagy betaint a tápközeg mennyiségére vonatkoztatva 0,1-10 t% meny30 nyiségben adagoljuk. (1985.03.19.)
  7. 7. Eljárás az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmusok előállítására, azzal jellemezve, hogy
    35 a) C- és N-forrásként betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint hasznosítani képes mikroorganizmusokat mutagén kezelésnek vetünk alá, majd
    b) a mutagén kezelés után tenyésztéssel
    40 kapott kultúrából a stabil, L-karnitint nem katabolizáló, L-karnitin, krotono-betain, gamma-butiro-betain hasznosítására képtelen, de betaint hasznosító mikroorganizmusokat szelektáljuk. (1984.03.29.)
    45
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben az L-karnitin, krotono-betain és gamma-butiro-betain hasznosítására képtelen, de betaint hasznosító, emellett L-karnitint kiválasztó mikroorga50 nizmusokat szelektáljuk. (1984.03.29.)
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben mutagén kezelésnek alávetett mikroorganizmust betain-tartalmú közegben tenyésztjük tovább.
    55 (1983.03.29.)
HU851012A 1984-03-29 1985-03-19 Microbiological process for preparing l-carnitine HU193744B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH160084 1984-03-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT37653A HUT37653A (en) 1986-01-23
HU193744B true HU193744B (en) 1987-11-30

Family

ID=4214209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU851012A HU193744B (en) 1984-03-29 1985-03-19 Microbiological process for preparing l-carnitine

Country Status (25)

Country Link
US (1) US5187093A (hu)
EP (1) EP0158194B1 (hu)
JP (1) JPS60224488A (hu)
CN (1) CN1004146B (hu)
AT (1) ATE64154T1 (hu)
AU (1) AU585216B2 (hu)
BG (1) BG50282A3 (hu)
BR (1) BR8501374A (hu)
CA (1) CA1265757A (hu)
CS (1) CS273163B2 (hu)
DD (1) DD232310A5 (hu)
DE (1) DE3583058D1 (hu)
DK (1) DK165191C (hu)
ES (1) ES541663A0 (hu)
FI (1) FI86889C (hu)
HU (1) HU193744B (hu)
IE (1) IE58045B1 (hu)
IL (1) IL74552A (hu)
IN (1) IN164247B (hu)
NO (1) NO164918C (hu)
PL (1) PL145712B1 (hu)
RO (1) RO92477B (hu)
SU (1) SU1435159A3 (hu)
YU (1) YU45708B (hu)
ZA (1) ZA851959B (hu)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59183694A (ja) * 1983-04-05 1984-10-18 Hamari Yakuhin Kogyo Kk 光学活性なカルニチンの生化学的製造法
JPS59192095A (ja) * 1983-04-13 1984-10-31 Ajinomoto Co Inc Ｌ−カルニチンの製造法
DD221905B1 (de) * 1983-11-03 1987-03-18 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten
JPS62275689A (ja) * 1985-12-09 1987-11-30 Bio-Le Kk Ｌ−カルニチンの製造法
CA2021869C (en) * 1989-07-28 2000-09-05 Frans Hoeks Process for microbiological batch production of l-carnitine
DE4017595A1 (de) * 1990-05-31 1991-12-05 Consortium Elektrochem Ind Maltopentaose produzierende amylasen
DE4106375A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Degussa Eine l-carnitin-amidase produzierender mikroorganismus, l-carnitin-amidase, verfahren zu deren gewinnung und deren verwendung
CN1058995C (zh) * 1996-11-08 2000-11-29 江苏省微生物研究所 L-肉碱或其盐的制备方法
KR100255039B1 (ko) 1997-07-28 2000-05-01 박영구 L-카르니틴의제조방법
DE19749480A1 (de) * 1997-11-08 1999-05-20 Univ Leipzig Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain
ES2282399T3 (es) * 2001-01-31 2007-10-16 Lonza Ag Procedimiento microbiologico para la obtencion de l-carnitina.
US7700074B2 (en) * 2002-02-07 2010-04-20 Pettegrew Jay W Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism
US7407778B2 (en) 2002-02-07 2008-08-05 Pettegrew Jay W Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders
US20060257842A1 (en) * 2003-05-29 2006-11-16 Pettegrew Jay W Cryopreservation media and molecules
US7815894B2 (en) * 2003-05-29 2010-10-19 Jay W. Pettegrew Compounds, compositions and methods for medical imaging of neuropsychiatric disorders
KR101327700B1 (ko) * 2005-07-05 2013-11-11 론자 아게 건조 카르니틴 분말 또는 과립을 제조하는 분무-건조 방법

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2313573A (en) * 1938-01-17 1943-03-09 Gen Aniline & Film Corp Capillary active compounds and process of preparing them
US2367878A (en) * 1939-05-04 1945-01-23 Hoffmann La Roche Betaine esters
NL6511804A (hu) * 1964-11-30 1966-05-31
FR1559839A (hu) * 1968-01-30 1969-03-14
ES370147A1 (es) * 1968-08-29 1971-04-01 Gulf Research Development Co Un procedimiento para fabricar ciclopropilamina.
US3711549A (en) * 1970-05-19 1973-01-16 Gulf Research Development Co Process for manufacturing cyclopropylamine
US3796632A (en) * 1971-12-10 1974-03-12 Toray Industries Process for racemizing alpha-amino-epsilon-caprolactam
DE2751134C2 (de) * 1977-11-16 1986-04-17 Degussa Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von γ-Chlorcarbonsäureestern
IT1142201B (it) * 1980-06-24 1986-10-08 Sigma Tau Ind Farmaceuti Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina
DE3214953A1 (de) * 1982-04-22 1983-10-27 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide
JPS59192095A (ja) * 1983-04-13 1984-10-31 Ajinomoto Co Inc Ｌ−カルニチンの製造法
DD221905B1 (de) * 1983-11-03 1987-03-18 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten
CH664374A5 (de) * 1985-02-27 1988-02-29 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von l-carnitin auf mikrobiologischem weg.
IT1190280B (it) * 1986-04-24 1988-02-16 Sigma Tau Ind Farmaceuti Procedimento per la preparazione di gamma-butirrobetaina

Also Published As

Publication number Publication date
CS273163B2 (en) 1991-03-12
US5187093A (en) 1993-02-16
CN1004146B (zh) 1989-05-10
SU1435159A3 (ru) 1988-10-30
PL145712B1 (en) 1988-10-31
RO92477B (ro) 1987-10-01
AU4019285A (en) 1985-10-03
HUT37653A (en) 1986-01-23
EP0158194B1 (de) 1991-06-05
JPS60224488A (ja) 1985-11-08
ZA851959B (en) 1985-11-27
NO164918B (no) 1990-08-20
CA1265757A (en) 1990-02-13
IL74552A0 (en) 1985-06-30
FI850781A0 (fi) 1985-02-26
IL74552A (en) 1988-12-30
BG50282A3 (en) 1992-06-15
DK138085D0 (da) 1985-03-27
IE850533L (en) 1985-09-29
NO164918C (no) 1990-11-28
ES8602940A1 (es) 1985-12-01
RO92477A (ro) 1987-09-30
DK138085A (da) 1985-09-30
CN85101191A (zh) 1987-06-10
FI86889B (fi) 1992-07-15
CS222085A2 (en) 1990-07-12
FI850781L (fi) 1985-09-30
PL252628A1 (en) 1986-02-25
NO851261L (no) 1985-09-30
AU585216B2 (en) 1989-06-15
DK165191C (da) 1993-03-01
BR8501374A (pt) 1985-11-26
ATE64154T1 (de) 1991-06-15
DD232310A5 (de) 1986-01-22
IN164247B (hu) 1989-02-04
FI86889C (fi) 1992-10-26
IE58045B1 (en) 1993-06-16
YU50485A (en) 1987-12-31
EP0158194A2 (de) 1985-10-16
DE3583058D1 (de) 1991-07-11
ES541663A0 (es) 1985-12-01
DK165191B (da) 1992-10-19
YU45708B (sh) 1992-07-20
EP0158194A3 (en) 1987-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU193744B (en) Microbiological process for preparing l-carnitine
IE58779B1 (en) Process for the microbiological production of l-carnitine
Varga et al. Isolation from soil of phenol-utilizing organisms and metabolic studies on the pathways of phenol degradation
HUP0300363A2 (hu) Eljárás pszeudomonsav A előállítására mikrobiológiai eljárás segítségével
KR100233330B1 (ko) 6-히드록시피콜린산을 제조하기 위한 미생물학적 방법
EP0188712B1 (de) Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltenden Mikroorganismen und deren Verwendung zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren
Rode et al. Ferrous-or cobalt ion-dependent D-(-)-tartrate dehydratase of pseudomonads: purification and properties
US4849354A (en) Process for producing menaquinone-4
JPH03191794A (ja) 微生物処理によるｒ―（―）―３―ハロゲノ―１，２―プロパンジオールの製法
US5496715A (en) Process for preparing indigo
JP2586283B2 (ja) 微生物学的手段によってｌ−カルニチンを製造する方法
JP2008178314A (ja) 新規ウリカーゼの製造方法
KR0146493B1 (ko) 발효법에 의한 l-알라닌의 제조 방법
US5716815A (en) Method for preparing dimethylcarboxylic acid compounds
Hong et al. A 3, 5-diaminohexanoate-decomposing Brevibacterium
JP3600803B2 (ja) マンニトール生成菌株カンジダ・マグノリア及びこれを使用したマンニトールの発酵製造方法
JP4197778B2 (ja) 光学活性なα−メルカプトカルボン酸の製造方法
Duménil et al. Production of vitamin B12 by gram-variable methanol-utilizing bacteria
JPH0647395A (ja) ２−ナフタレンスルホン酸の分解法
Maeda et al. Identification of nicotine-1′-N-oxide degrading bacteria
FR2519649A1 (fr) Procede de production de tyramine oxydase
JPH08196288A (ja) 長鎖脂肪酸の製造法
CZ279298B6 (cs) Mikroorganismy Alcaligenes faecalis DSM 6335 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové
JP2008167718A (ja) 新規ウリカーゼの製造方法
JPH08275776A (ja) 新規キチナーゼ及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628