DK165191B - L-carnitin-producerende mikroorganismer samt fremgangsmaade til fremstilling af l-carnitin under anvendelse af mikroorganismerne - Google Patents
L-carnitin-producerende mikroorganismer samt fremgangsmaade til fremstilling af l-carnitin under anvendelse af mikroorganismerne Download PDFInfo
- Publication number
- DK165191B DK165191B DK138085A DK138085A DK165191B DK 165191 B DK165191 B DK 165191B DK 138085 A DK138085 A DK 138085A DK 138085 A DK138085 A DK 138085A DK 165191 B DK165191 B DK 165191B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- carnitine
- butyrobetaine
- microorganisms
- betaine
- culture
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/824—Achromobacter
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Catalysts (AREA)
Description
i
DK 165191 B
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte mikroorganismer, som kan producere L-carnitin ud fra crotono-betain og/eller γ-butyrobetain, samt en fremgangsmåde 5 til fremstilling af L-carnitin under anvendelse af disse mikroorganismer.
Det er kendt, at L-carnitin kan fremstilles ud fra γ-butyro-betain. γ-Butyrobetain bringes i nærværelse af natrium-2-oxo-glutarat, ét reducerende middel, en jernionkilde og oxygen 10 fra atmosfærisk luft som hydroxylgruppedonator i kontakt med et hydroxylaseenzym, som er frigjort fra sporer fra Neurospora crassa, jf. US-patentskrift nr. 4.371.618. Denne kendte fremgangsmåde har den ulempe, at den kræver en række cofaktorer.
Ved omsætningen foregår der således oxidativ decarboxylering 15 af støkiometriske mængder 2-oxoglutarat til succinat. Der kræ-2+ ves Fe som O^-aktivator, ascorbat for at holde jernionen på den reducerende form samt katalase for at sønderdele skadeligt ^2^2' som ^annes ^ spormængder.
En mikroorganisme af slægten Pseudomonas, som vokser med 20 γ-butyrobetain som C- og N-kilde, er blevet isoleret, jf.
Lindstedt et al., Biochemistry 6, 1262-1270 (1967), "The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas". Den første reaktion i nedbrydningsprocessen er hydroxyleringen af γ-butyrobetain til L-carnitin, idet det intermediært dannede L-carnitin 25 fuldstændigt viderekataboliseres til C02, H20 og NH3<
Også denne hydroxylase udvundet fra bakterier ville, såfremt den var blevet anvendt til fremstillingen af L-carnitin, være behæftet med de ovenfor beskrevne ulemper i forbindelse med cofaktor-behov,jf. Lindstedt et al., Biochemistry 16, 30 2181-2188 (1977), "Purification and Properties of γ-Butyro- betaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1".
Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe hidtil ukendte mikroorganismer, som ikke har ulemperne ved de kendte mikroorganismer, og som på enkel måde muliggør at 2
DK 165191 B
fremstille ikke racematet, men enantio-selektiv L-carni-tin ud fra crotonobetain, butyrobetain eller blandinger deraf.
5 Dette opnås med mikroorganismerne ifølge opfindelsen, som kan producere L-camitin ud fra crotonobetain og/eller γ-butyrobetain, men som ikke kan katabolisere L-carni-tin.
Mikroorganismerne ifølge opfindelsen er ejendommelige 10 ved, at de er stammerne HK 4 (DSM nr- 2938) og HK 13 (DSM nr. 2903).
Til forskel frå mikroorganismerne anvendt ved de kendte systemer anvender mikroorganismerne ifølge opfindelsen H2O og ikke O2 som hydroxylgruppedonator, hvilket er 15 fastslået ved undersøgelser foretaget under anvendelse af H2180 og 18θ2·
Mikroorganismerne ifølge opfindelsen kan producere L-car-nitin ud fra crotonobetain og/eller γ-butyrobetain uden at katabolisere L-carnitin.
20 En sammenlignende undersøgelse af jordprøver fra fire kontinenter viser, at mikroorganismer, som kataboliserer butyrobetain og crotonobetain over L-carnitin, forekommer overalt. Det er også muligt at isolere mikroorganismerne fra aktiveret slam fra spildevandsrenseanlæg. Potentielt 25 kan alle disse stammer anvendes til fremstilling af L-carnitin, når de muteres under anvendelse af det nedenfor anførte princip.
Sådanne mutanter fremstilles ved anvendelse af følgende selektionsmetode: 30 a) Mikroorganismer, som vokser med betain, γ-butyrobetain, crotonobetain og L-carnitin som C- og N-kilde, 3
DK 165191 B
muteres på sædvanlig måde.
b) Fra den ved dyrkningen dannede kultur af muterende mikroorganismer selekteres sådanne, som er stabile, 5 som ikke kataboliserer L-carnitin og ikke vokser på L-camitin, crotonobetain og c-butyrobetain, men derimod med betain.
Efter selektionstrin b) udvælges fortrinsvis de mikroorganismer, som udskiller L-carnitin og ikke vokser på Ι-ΙΟ carnitin, crotonobetain og γ-butyrobetain, men derimod betain.
Hensigtsmæssigt fortsættes dyrkningen af de muterede mikroorganismer i et betain-medium, hvorpå disse vide-redyrkede mikroorganismer til gennemførelse af selek-15 tionstrinet (b) fortrinsvis videredyrkes i et L-cami-tin-medium. Dyrkningen af stammer, der vokser med betain, γ-butyrobetain, crotonobetain og L-carnitin som C-og N-kilde, gennemføres hensigtsmæssigt således, at man ud fra bakterieblandinger ved podning af crotonobe-20 tain-dyrkningsopløsninger danner blandingskulturer, og ud fra disse under anvendelse af traditionelle mikrobiologiske metoder danner renkulturer af mikroorganismer, som nedbryder crotonobetain.
Mutationen af en sådan kultur, som vokser med betain, 25 γ-butyrobetain, crotonobetain og L-carnitin som C- og N-kilde, kan gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder, jf. J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.
Hensigtsmæssigt anvendelige fremgangsmåder til 30 fremstilling af stabile mutanter er forskydningsmetoden, deletionsmetoden eller transposon-indsætningsmetoden.
De således muterede mikroorganismer videredyrkes i et betainmedium, hvorpå de overføres til et L-carnitin-me- 4
DK 165191 B
dium og underkastes selektionstrin b), idet der ved hjælp af kendte såkaldte "modselektionsmidler" [P.
Gerhardt et al. (eds.), Manual of Methods for General 5 Bacteriology, Am. Soc. for Microbiology, 1991 ] selekteres sådanne mikroorganismer, som ikke kataboliserer stabilt L-carnitin og ikke vokser på L-carnitin, crotonobetain og γ-butyrobetain, men derimod med betain.
En mikroorganisme ifølge opfindelsen, der vokser med 10 betain, 7-butyrobetain, crotonobetain og L-carnitin som C- og N-kilde, er stammen HK 4 (DSM nr. 2938).
Denne stamme er den 3. marts 1984 deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten i Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft får Biotech-15 nologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300
GiSttingen, Forbundsrepublikken Tyskland, under deponeringsnummeret DSM 2938.
5
DK 165191 B
Beskrivelse af stammen HK 4 (DSM nr. 2938).
Celleform små stave phenylalanindeaminase f.t. plearorf ornithindecarboxylas.e længde ym 1-2 5 bredde ym 0,5-0,8 bevægelighed + H2S - svingtråde peritrich Voges-Proskauer gram-reaktion - indol sporer - nitrit af nitrat + 10 dannelse af poly-β- “ denitrifikation + hydroxybutyrat levandannelse - oxidase + lecithinase catalase + urease + vækst nedbrydning af 15 anaerob - stivelse 37°C + gelatine 41°C ~ casein pH 5,6 - tyrosin
Mac-Conkey-agar + "Tween 80"® 20 SS-agar - DNA + cetrimid-agar - aesculin + pigmentdannelse substratudnyttelse ikke diffunderende - acetat diffunderende - citrat - 25 fluorescerende - · malonat syredannelse (OF-test) ud fra glycin glucose aerob - norleucin anaerob - xylose + fructose aerob - fructose + 30 ASS glucose + glucose + xylose + autotrof vækst trehalose + med H2 ethanol - 3-ketolactose gasdannelse fra glucose - vækst 35 ONPG + betain + arginindihydrolase - L-carnitin + lysindecarboxylase ” γ-butyrobetain + crotonobetain + 6
DK 165191 B
En mikroorganisme ifølge opfindelsen, der er muteret og selekteret ud fra den ovenfor beskrevne mikroorganisme, og som endvidere er stabil og ikke kataboliserer, men 5 derimod udskiller L-carnitin, og som ikke vokser på L-camitin, crotonobetain og γ-butyrobetain, men som vokser på betain, er stammen HK 13.
Denne stamme er deponeret den 23. januar 1984 i overensstemmelse med Budapest-traktaten i Deutschen Sammlung 10 von Mikroorganismen (DSM)., Gesellschaft flir Biotechno-logische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Gftttingen, Forbundsrepublikken Tyskland, under depone-ringsnummeret DSM 2903.
Beskrivelse af stammen HK 13 (DSM nr. 2903).
15 Celleform små stave phenylalanindeaminase - f.t. pleomorf længde μπι 1-2 ornithindecarboxylase - bredde ym 0,5-0,8 bevægelighed + 20 svingtråde peritrich Voges-Proskauer gram-reaktion - indol sporer - nitrit af nitrat + dannelse af ροΐγ-β-hydr- “ denitrifikation + oxybutyrat levandannelse 25 oxidase + lecithinase catalase + urease + vækst nedbrydning af anaerob - stivelse 37°C + gelatine 30 41°C - casein pH 5,6 - tyrosin
Mac-Conkey-agar + "Tween 80" SS-agar - DNA + cetrimid-agar “ aesculin + 7
DK 165191 B
pigmentdannelse substratudnyttelse ikke diffunderende - acetat diffunderende - citrat fluorescerende - malonat 5 syredannelse (OF-test) ud fra glycin glucose aerob - norleucin anaerob - xylose + fructose aerob - fructose + ASS glucose + glucose + 10 xylose + autotrof vækst trehalose + med Η^ ethanol + 3-ketolactose gasdannelse ud fra glucose - vækst ONPG + betain + 15 arginindihydrolase - L-carnitin lysindecarboxylase - γ-butyrobetain crotonobetain L-glutamat og crotonbetain - 20 L-glutamat og -f- butyrobetain L-glutamat og , + L-carmtm
Som eksempel på en mutant af mikroorganismen stamme HK 25 13, som er stabil, og som ikke kataboliserer, men derimod udskiller L-carnitin, ikke vokser på L-carnitin, crotonobetain og γ-butyrobetain, men derimod med betain, L-glutamat og crotonobetain, L-glutamat og butyrobetain, L-glutamat og L-carnitin, er stammen HK 1331 b. Den er iso-30 leret som spontane, godt voksende mutantkolonier fra overfladen af et fast agarsubstrat, som indeholdt L-glutamat og γ-butyrobetain.
Den ovenfor omtalte stamme HK 1331 b er deponeret den 8. februar 1985 i overensstemmelse med Budapest-traktaten i 35 Deutschen Sammlung ftir Mikroorganismen (DSM), Gesell- 8
DK 165191 B
schaft ftir Biotechnologische Forschung mbH, Griesebach-strasse 8, 4300 Gdttingen, Forbundsrepublikken Tyskland, med deponeringsnummeret DSM 3225.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af 5 L-carnitin er ejendommelig ved, at man dyrker en mikroorganisme ifølge opfindelsen med crotonobetain og/eller γ-butyrobetain i nærværelse af et vækstsubstrat og isolerer det koncentrerede L-carnitin.
Fremgangsmåden gennemføres hensigtsmæssigt således, at 10 man dyrker en forkultur af en mikroorganisme, fortrinsvis en mikroorganisme med betegnelsen HK 13, i et steriliseret, fortrinsvis vitaminholdigt mineralmedium [Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)] ved en temperatur på 20-40, fortrinsvis 30°C, ved en hensigtsmæssig pH-værdi 15 fra 6-8, fortrinsvis ved pH-værdien 7, i fra 20 til 50 timer, fordelagtigt fra 30 til 40 timer. Denne forkultur indeholder hensigtsmæssigt 0,1-10 vægtprocent, fortrinsvis 0,5-5 vægtprocent, cholin, glutamat, acetat, dime-thylglycin eller betain som vækstsubstrat. Det fore-20 trækkes især at anvende betain i en mængde på 0,5-5 vægtprocent.
Desuden er det almindeligt i den mikrobiologiske teknik også at sætte udgangs forbindelserne γ-butyrobetain, crotonobetain eller blandinger deraf i mængder på 0,1-10 vægtprocent, for-25 trinsvis 0,5-5 vægtprocent, beregnet på reaktionsmediet, til forkulturen. γ-Butyrobetain eller crotonobetain kan foreligge som hydrochloridsalt, som frit indre salt samt i form af et derivat deraf.
Med forkulturen fremstillet som beskrevet ovenfor kan der fore-30 tages podning af andre kulturer. Disse kulturer har hensigtsmæssigt samme sammensætning som forkulturen.
9
DK 165191 B
Koncentrationen af crotonobetain, γ-butyrobetain eller blandinger deraf, som skal omsættes, ligger i området 0,1-10 vægtprocent, fortrinsvis 0,5-5 vægtprocent.
Endvidere anvendes vækstsubstraterne cholin, glutamat, acetat, 5 dimethylglycin og betain hensigtsmæssigt i de ved forkulturen anvendte koncentrationer.
Fordelagtigt tilpasses dyrkningsbetingelserne ved den videre dyrkning til dyrkningsbetingelserne ved fordyrkningen.
Temperaturerne ligger således hensigtsmæssigt mellem 20 og 10 40°C, fordelagtigt ved 30°C, og pH-værdien holdes i reglen mellem 6 og 8, fordelagtigt ved pH 7.
Fremstillingen af L-carnitin gennemført på denne måde går i stå efter 20-30 timer. Koncentrationen af L-carnitin er da i reglen ækvivalent med den anvendte mængde γ-butyrobetain 15 eller crotonobetain.
Cellerne kan fracentrifugeres eller frafiltreres og anvendes som podemateriale til en ny kultur.
L-carnitin kan isoleres fra supernatanten ved kationbytter-kromatografi på i og for sig kendt måde (J.P. Vandecasteele, 20 Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 [1980]) og renses ved omkrystallisation .
Fremgangsmåden til fremstilling af L-carnitin kan også gennemføres kontinuerligt, idet man dyrker cellerne i en kemostat ved hensigtsmæssige fortyndingsrater fra 0,04 til 0,2 timer 25 fortrinsvis ved 0,06 til 0,08 .timer”'1', ved analoge betingelser som ved Batch-dyrkningen.
Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.
10
DK 165191 B
Eksempel 1.
Isolering af en crotonobetain-nedbrydende mikroorganisme-
Mikroorganismer ekstraheres fra jord med neutral phosphatpuffer-opløsning ved omrøring, hvorefter større bestanddele frafiltre-5 res, og en crotonobetainnæringsopløsning podes med den således udvundne bakterieblanding, indtil opløsningen er svagt uklar. Efter 9 dages forløb er uklarheden som udtryk for cellekoncentrationen 90 gange så stor. Opløsningen indeholder ikke længere crotonobetain, og ammonium kan påvises som nedbryd-10 ningsprodukt.
Blandingskulturen anlægges under anvendelse af traditionel mikrobiologisk teknik (faste agar-substrater) renkulturer af mikroorganismer, som nedbryder crotonobetain. Til det videre arbejde udvælges en kultur, som benævnes HK 4.
15 Denne stamme vokser også med γ-butyrobetain, L-carnitin og betain.
Eksempel 2.
Isolering af en stabil carnitin-dehydrogenasenegativ mutant
En sådan mutant må ikke viderekatabolisere det af γ-butyro-20 betain eller crotonobetain opbyggede L-carnitin, men skal derimod i det ideelle tilfælde udskille dette. En kultur af HK 4 mutageniseres stabilt med "Acridin Mutagen ICR 191", 5 mikrogram pr. ml, i et succinat-medium under anvendelse af forskrifterne ifølge J.H. Miller, Experiments in Molecular 25 Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, hvorefter cellerne dyrkes under anvendelse af standardmetoder i handelssubstratet "Nutrient Broth" fra firmaet Oxoid Ltd., Storbritannien, til ekspression af mutationen, hvorpå der foretages overføring til et betain-medium. Et L-carnitin-medium podes med den udvok-30 sede kultur.
11
DK 165191 B
Efter nogle timer når kulturen logaritmisk vækst. På dette tidspunkt tilsættes Penicillin G (15 mg/ml) og D-cycloserin (0/5 mg/ml), jf. Ornston et al., Biochim. Biophys. Res. Commun. 36/ 179 (1969). Disse såkaldte "modselektionsmidler" dræber kun 5 voksende bakterier. Mutanterne, som ikke længere kan vokse med L-rcarnitin, og som har interesse ved den foreliggende opfindelse, overlever, og der sker således en relativ koncentrering af disse bakterier. Efter 30 timers forløb er antallet af levende celler faldet til 1/100, og antibiotikaene vaskes bort, 10 hvorpå kulturen overføres til et betain-medium. Efter vækst fordeles tilsvarende fortyndinger af kulturen på størknet næringsagar. De således isolerede celler vokser til kolonier, som testes hver for sig. Mutanten HK 13 udvælges. Den er stabil og danner ikke længere carnitin-dehydrogenase og vokser følge-15 lig ikke længere på L-carnitin, γ-butyrobetain eller crotono-betain, men derimod med betain. Ved vækst på betain, dimethyl-glycin, cholin, glutamat eller acetat omdanner denne stamme crotonobetain eller γ-butyrobetain til L-carnitin under udskillelse af dette stof.
20 Eksempel 3.
En 5 liter-forkul tur af HK 13 dyrkes i et vitaminholdigt mineralmedium [Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)]> som indeholder 1 vægtprocent betain og 0,5 vægtprocent crotono-betain-chlorid, ved 30°C og en pH-værdi på 7,0 i 32 timer.
25 15 liter substrat med samme sammensætning som ovenfor podes med en kultur, og der foretages dyrkning i 24 timer på samme måde som ved forkulturen (30°C, pH-værdi 7,0, p©2 = 3 ppm). Når produktionen går i stå, fracentrifugeres cellerne, som kan anvendes som podemateriale ved en ny dyrkning. Koncentratio-30 nen af L-carnitin måles i supernatanten (19,8 1) ved enzymatisk analyse.
Supernatantén indeholder 4,26 mg L-carnitin pr. ml. Dette svarer til et udbytte på 95,0%, beregnet på den anvendte mængde crotonobetain-chlorid.
12
DK 165191 B
Udgangsprodukter eller andre urenheder kan ikke påvises i NMR-spektret.
L-Carnitinet kan udvindes fra supernatanten, ved kationbytter-kromatografi på kendt måde [J.P. Vandecasteele, Appl. Environ.
5 Microbiol. 39, 327 (1980)] og renses ved omkrystallisation.
Eksempel 4«
En 5 liter-forkultur af HK 13 dyrkes i et vitaminholdigt mineralmedium (ifølge eksempel 3), som indeholder 1% cholin og 0/6% γ-butyrobetain-chlorid, ved en pH-værdi på 7,0 og en tem-10 peratur på 30°C i 32 timer. 15 liter dyrkningsmedium med den ovenfor anførte sammensætning podes med forkulturen, og der foretages dyrkning under samme betingelser som beskrevet i eksempel 1. Efter ca. 30 timers forløb er produktionen ophørt, og cellerne isoleres ved mikro filtrering (Arnicon- hul fiberpa tron) . 15 Denne cellemasse kan anvendes til videre produktion af L-carnitin. Koncentrationen af L-carnitin bestemmes enzymatisk i filtratet (19,6 liter). Filtratet indeholder 5,3 mg L-carnitin pr. ml. Dette svarer til et analytisk udbytte på 97,6%, beregnet på den anvendte mængde γ-butyrobetain-chlorid. Ifølge NMR-20 analyse kan der ikke påvises udgangs forbindelser- eller andre fremmede organiske biprodukter i filtratet. L-Carnitin kan derfor isoleres fra opløsningen på kendt måde, f.eks. ved azeotrop destillation som beskrevet i DE-patentskrift nr. 2.300.492.
Eksempel 5.
25 En fermenteringsbeholder til kontinuerlig dyrkning, som indeholder 1,5 liter vitaminholdigt mineralmedium (ifølge eksempel 3) med et indhold af 1,5% betain og 1,0% γ-butyrobetain-chlorid, podes med 150 ml af en HK 13-forkultur i samme medium. Efter 20 timers aerob dyrkning ved 30°C og en pH-værdi på 30 7,0 er kulturen udvokset, og den kontinuerlige drift påbegyn des med en strømningsrate på 0,1 liter/time. Dyrkningsopløs- 13
DK 165191 B
ningen, som udtages fra fermenteringsbeholderen, opfanges i en beholder, som er afkølet til 4°C. Cellerne fjernes ved centrifugering. Ifølge enzymatisk analyse indeholder super-natanten 8,8 g L-carnitin pr. liter kultur.
5 Dette svarer til et analytisk påviseligt udbytte på 99,2%, beregnet på den anvendte koncentration af γ-butyrobetain-chlorid.
Det faste L-carnitinchlorid kan isoleres fra opløsningen ved ionbytterkromatografi og fraskillelse af vand.
Claims (7)
1. Mikroorganismer som kan producere L-carnitin ud fra crotonobetain og/eller 7-butyrobetain, kendetegnet 5 ved, at de er stammerne HK 4 (DSM nr. 2938) og HK 13 (DSM nr. 2903).
2. Mikroorganisme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er mikroorganismen HK 13 (DSM nr. 2903).
3. Mikroorganisme ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at den er mikroorganismen HK 4 (DSM nr. 2938).
4. Fremgangsmåde til fremstilling af L-carnitin, kendetegnet ved, at man dyrker en mikroorganisme ifølge krav 1-3 med crotonobetain og/eller 7-butyrobetain i nærværelse af et vækstsubstrat og isolerer det koncentre- 15 rede L-camitin.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at man anvender crotonobetain, 7-butyrobetain eller en blanding deraf i en mængde på 0,1-10 vægtprocent, beregnet på dyrkningsmediet.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at der som vækstsubstrat anvendes dimethylglycin, cholin, glutamat, acetat og/eller betain.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at vækstsubstratet anvendelses i en mængde på 0,1-10 25 vægtprocent, beregnet på dyrkningsmediet.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH160084 | 1984-03-29 | ||
| CH160084 | 1984-03-29 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK138085D0 DK138085D0 (da) | 1985-03-27 |
| DK138085A DK138085A (da) | 1985-09-30 |
| DK165191B true DK165191B (da) | 1992-10-19 |
| DK165191C DK165191C (da) | 1993-03-01 |
Family
ID=4214209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK138085A DK165191C (da) | 1984-03-29 | 1985-03-27 | L-carnitin-producerende mikroorganismer samt fremgangsmaade til fremstilling af l-carnitin under anvendelse af mikroorganismerne |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5187093A (da) |
| EP (1) | EP0158194B1 (da) |
| JP (1) | JPS60224488A (da) |
| CN (1) | CN1004146B (da) |
| AT (1) | ATE64154T1 (da) |
| AU (1) | AU585216B2 (da) |
| BG (1) | BG50282A3 (da) |
| BR (1) | BR8501374A (da) |
| CA (1) | CA1265757A (da) |
| CS (1) | CS273163B2 (da) |
| DD (1) | DD232310A5 (da) |
| DE (1) | DE3583058D1 (da) |
| DK (1) | DK165191C (da) |
| ES (1) | ES541663A0 (da) |
| FI (1) | FI86889C (da) |
| HU (1) | HU193744B (da) |
| IE (1) | IE58045B1 (da) |
| IL (1) | IL74552A (da) |
| IN (1) | IN164247B (da) |
| NO (1) | NO164918C (da) |
| PL (1) | PL145712B1 (da) |
| RO (1) | RO92477B (da) |
| SU (1) | SU1435159A3 (da) |
| YU (1) | YU45708B (da) |
| ZA (1) | ZA851959B (da) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59183694A (ja) * | 1983-04-05 | 1984-10-18 | Hamari Yakuhin Kogyo Kk | 光学活性なカルニチンの生化学的製造法 |
| JPS59192095A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−カルニチンの製造法 |
| DD221905B1 (de) * | 1983-11-03 | 1987-03-18 | Univ Leipzig | Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten |
| JPS62275689A (ja) * | 1985-12-09 | 1987-11-30 | Bio-Le Kk | Ｌ−カルニチンの製造法 |
| CA2021869C (en) * | 1989-07-28 | 2000-09-05 | Frans Hoeks | Process for microbiological batch production of l-carnitine |
| DE4017595A1 (de) * | 1990-05-31 | 1991-12-05 | Consortium Elektrochem Ind | Maltopentaose produzierende amylasen |
| DE4106375A1 (de) * | 1991-02-28 | 1992-09-03 | Degussa | Eine l-carnitin-amidase produzierender mikroorganismus, l-carnitin-amidase, verfahren zu deren gewinnung und deren verwendung |
| CN1058995C (zh) * | 1996-11-08 | 2000-11-29 | 江苏省微生物研究所 | L-肉碱或其盐的制备方法 |
| KR100255039B1 (ko) | 1997-07-28 | 2000-05-01 | 박영구 | L-카르니틴의제조방법 |
| DE19749480A1 (de) * | 1997-11-08 | 1999-05-20 | Univ Leipzig | Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain |
| ES2282399T3 (es) * | 2001-01-31 | 2007-10-16 | Lonza Ag | Procedimiento microbiologico para la obtencion de l-carnitina. |
| US7700074B2 (en) * | 2002-02-07 | 2010-04-20 | Pettegrew Jay W | Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism |
| US7407778B2 (en) | 2002-02-07 | 2008-08-05 | Pettegrew Jay W | Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders |
| US20060257842A1 (en) * | 2003-05-29 | 2006-11-16 | Pettegrew Jay W | Cryopreservation media and molecules |
| US7815894B2 (en) * | 2003-05-29 | 2010-10-19 | Jay W. Pettegrew | Compounds, compositions and methods for medical imaging of neuropsychiatric disorders |
| KR101327700B1 (ko) * | 2005-07-05 | 2013-11-11 | 론자 아게 | 건조 카르니틴 분말 또는 과립을 제조하는 분무-건조 방법 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2313573A (en) * | 1938-01-17 | 1943-03-09 | Gen Aniline & Film Corp | Capillary active compounds and process of preparing them |
| US2367878A (en) * | 1939-05-04 | 1945-01-23 | Hoffmann La Roche | Betaine esters |
| NL6511804A (da) * | 1964-11-30 | 1966-05-31 | ||
| FR1559839A (da) * | 1968-01-30 | 1969-03-14 | ||
| ES370147A1 (es) * | 1968-08-29 | 1971-04-01 | Gulf Research Development Co | Un procedimiento para fabricar ciclopropilamina. |
| US3711549A (en) * | 1970-05-19 | 1973-01-16 | Gulf Research Development Co | Process for manufacturing cyclopropylamine |
| US3796632A (en) * | 1971-12-10 | 1974-03-12 | Toray Industries | Process for racemizing alpha-amino-epsilon-caprolactam |
| DE2751134C2 (de) * | 1977-11-16 | 1986-04-17 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von γ-Chlorcarbonsäureestern |
| IT1142201B (it) * | 1980-06-24 | 1986-10-08 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina |
| DE3214953A1 (de) * | 1982-04-22 | 1983-10-27 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide |
| JPS59192095A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−カルニチンの製造法 |
| DD221905B1 (de) * | 1983-11-03 | 1987-03-18 | Univ Leipzig | Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten |
| CH664374A5 (de) * | 1985-02-27 | 1988-02-29 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von l-carnitin auf mikrobiologischem weg. |
| IT1190280B (it) * | 1986-04-24 | 1988-02-16 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento per la preparazione di gamma-butirrobetaina |
-
1985
- 1985-02-26 FI FI850781A patent/FI86889C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-03-04 IE IE53385A patent/IE58045B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-07 IN IN177/MAS/854A patent/IN164247B/en unknown
- 1985-03-10 IL IL74552A patent/IL74552A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-03-15 ZA ZA851959A patent/ZA851959B/xx unknown
- 1985-03-19 HU HU851012A patent/HU193744B/hu unknown
- 1985-03-21 AU AU40192/85A patent/AU585216B2/en not_active Expired
- 1985-03-22 EP EP85103420A patent/EP0158194B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-22 AT AT85103420T patent/ATE64154T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-22 DE DE8585103420T patent/DE3583058D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-26 BG BG69432A patent/BG50282A3/xx unknown
- 1985-03-26 BR BR8501374A patent/BR8501374A/pt unknown
- 1985-03-27 DK DK138085A patent/DK165191C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 DD DD85274492A patent/DD232310A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 CS CS222085A patent/CS273163B2/cs unknown
- 1985-03-27 RO RO118151A patent/RO92477B/ro unknown
- 1985-03-28 NO NO851261A patent/NO164918C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-03-28 PL PL1985252628A patent/PL145712B1/pl unknown
- 1985-03-28 SU SU853874110A patent/SU1435159A3/ru active
- 1985-03-28 CA CA000477804A patent/CA1265757A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 ES ES541663A patent/ES541663A0/es active Granted
- 1985-03-28 JP JP60064931A patent/JPS60224488A/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 YU YU50485A patent/YU45708B/sh unknown
- 1985-04-01 CN CN85101191.8A patent/CN1004146B/zh not_active Expired
-
1990
- 1990-03-15 US US07/496,093 patent/US5187093A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR940005654B1 (ko) | L-2-아미노-4-(히드록시메틸 포스피닐)-부티르산의 제조방법 | |
| US4529697A (en) | Process for producing L-glutamic acid by fermentation | |
| DK165191B (da) | L-carnitin-producerende mikroorganismer samt fremgangsmaade til fremstilling af l-carnitin under anvendelse af mikroorganismerne | |
| US4745064A (en) | Process for the degradation of s-triazine derivatives in aqueous solutions | |
| JPH04365494A (ja) | ヒドロキシル化されたピラジン誘導体を製造するための微生物学的方法 | |
| KR100233330B1 (ko) | 6-히드록시피콜린산을 제조하기 위한 미생물학적 방법 | |
| EP0120208A2 (de) | Mikrobiologisch hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung | |
| EP0179864B1 (en) | Process for preparing l-carnitine | |
| Wang et al. | Isolation of a benzoate-utilizing Pseudomonas strain from soil and production of catechol from benzoate by transpositional mutants | |
| US5316929A (en) | Process for the preparation of MA | |
| EP0434393A2 (en) | Process for preparation of R-(-)-3-halogeno-1,2-propanediol by treatment with microorganism | |
| EP1018546B1 (en) | Microorganisms producing 5-aminolevulinic acid and processes for producing 5-aminolevulinic acid by using the same | |
| US5496715A (en) | Process for preparing indigo | |
| JP2586283B2 (ja) | 微生物学的手段によってｌ−カルニチンを製造する方法 | |
| US4699883A (en) | Process for producing N-acylneuraminate aldolase | |
| US4416987A (en) | Method of synthesizing proteins from methanol | |
| JP2638541B2 (ja) | Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸の製法 | |
| KR0146493B1 (ko) | 발효법에 의한 l-알라닌의 제조 방법 | |
| US5716815A (en) | Method for preparing dimethylcarboxylic acid compounds | |
| CZ279298B6 (cs) | Mikroorganismy Alcaligenes faecalis DSM 6335 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové | |
| KR0183447B1 (ko) | 신균주 바실러스 엘케이-1 | |
| Packdibamrung et al. | Occurrence of an Inducible NADP+-Dependent D-Phenylserine Dehydrogenase in Pseudomonas syringae NK-15 Isolated from Soil | |
| WO2000023608A1 (en) | Preparation of amino alcohols | |
| CZ279297B6 (cs) | Mikroorganismy agrobacterium sp. DSM 6336 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxynikotinové | |
| JPH08107791A (ja) | ２，５−ジヒドロキシピリジンの製造法および２，５−ジヒドロキシピリジン生産菌 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AHS | Application shelved for other reasons than non-payment | ||
| PUP | Patent expired |