Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-karnityny na drodze mikrobiologicz¬ nej. Znane jest wytwarzanie L-karnityny z lf -butyrobetainy. Te tf -butyrobetaine w obecnos¬ ci 2-ketoglutaranu sodowego, srodka redukujacego, zródla jonów zelaza i tlenu z powietrza jako donora grup hydroksylowych doprowadza sie do zetkniecia z enzymem -hydroksylaza, uwolniona z zarodników Neurospora crassa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki US-PS nr k 371 618)• Sposób ten wykazuje taka niedogodnosc, ze niezbedne sa liczne czyn¬ niki pomocnicze. I tak w reakcji tej stechiometryczna ilosc 2-ketoglutaranu oksydacyjnie dokarboksyluje sie do bursztynianu. Fe + jest niezbedne jako aktywator -02 askorbinian jest niezbedny dla utrzymania jonu zelaza w postaci zredukowanej, a katalaza jest niezbed¬ na dla rozkladu sladowo powstajacego, szkodliwego nadtlenku wodoru* Lindstedt i wspólpracownicy (Biochemistry 6, 1262-1270 (1967) "The Formation and Degradation of Camitin in Pseudomonas") wyizolowali mikroorganizm rodzaju Pseudomonas, który rosnie z degradacji bylo hydroksylowanie Jf-butyrobetainy do L-karnityny, przy czym przejsciowo powstajaca L-karnityna byla w calosci dalej katabolizowana do C02, I^O i NH™» Równiez i tef z bakterii uzyskiwane hydroksylazy, gdyby byly stosowane do wytwarzania L-karnitynyf to mialyby omówione, niedogodne zapotrzebowanie na czynniki pomocnicze (Lindstadt i wspól¬ pracownicy, Biochemistry 16, 2181-2188 /1977/ "Purification and Properties of f-Butyro- betaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1").Celem wynalazku Jest znalezienie nowego typu mikroorganizmów, który tych wad zna¬ nych sposobów nie wykazuje i umozliwia na latwej drodze wytwarzanie nie racematu, lecz •nancjo-selektywnej L-karnityny z krotonobetainy, butyrobetainy lub z ich mieszaniny. W2 145 712 odróznieniu od ukladów znanych ze stanu techniki nowy typ mikroorganizmów wykorzystuje H~0 a nie 0« jako donor grup hydroksylowych, jak to mozna bylo stwierdzic droga wlas- 18 18 nych badan z zastosowaniem ^ 0 i 02. Mikroorganizmy nowego typu sa zdolne do wytwarza¬ nia L-karnityny z krotonobetainy i/lub r -butyrobetainy, a nie sa zdolne do katabolizowa- nia L-karnityny.Jak dowiodlo badanie porównawcze próbek glebowych z czterech kontynentów, mikroor¬ ganizmy katabolizujace butyrobetaine i krotonobetaine poprzez L-karnityne sa rozpowszech¬ nione. Równiez z osadu czynnego zbiorników do oczyszczania scieków udaje sie ich wyodreb¬ nianie. V rachube wchodza wszystkie szczepy jako potencjalni wytwórcy L-karnitynyt jezeli podda sie je mutacji nizej omówiona metoda wedlug wynalazku. Takie mutanty otrzymuje sie wedlug nastepujacej metody selekcji: a) mikroorganizmy, które rosna z betaina, f -butyro- betaina, krotonobetaina i L-karnityna Jako zródlem wegla i azotu, poddaje sie mutacji na znanej drodze; b) z hodowli otrzymanych kultur zmutowanych mikroorganizmów wyselekcjono- wuje sie te mikroorganizmy, które sa stabilne, które nie katabolizuja L-karnityny i nie rosna na L-karnitynie, krotonobetainie lub JT -butyrobetainie, lecz dobrze rosna z betaina.Korzystnie po etapie b) wyselekcjonowuje sie te mikroorganizmy, które wytracaja L-karnity- ne i nie rosna na L-karnitynie, krotonobetainie lub jf -butyrobetainie, lecz dobrze rosna z betaina.Zmutowane mikroorganizmy poddaje sie celowo dalszej hodowli w srodowisku betainy, a te dalej w srodowisku betainy hodowane mikroorganizmy, w celu przeprowadzenia etapu se¬ lekcji b) poddaje sie hodowaniu w srodowisku L-karnityny. Hodowanie szczepów rosnacych z betaina, f -butyrobetaina, krotonobetaina i L-karnityna jako zródlem wegla i azotu przeprowadza sie celowo tak, ze z mieszanin bakterii przez zaszczepienie krotonobetainowych roztworów pozyw- kowych uzyskuje sie hodowle mieszane, a z nich za pomoca tradycyjnych technik mikrobiologicznych przygotowuje sie czyste hodowle mikroorganizmów degradujacych krotonobetaine. Mutacje takiej hodowli, która rosnie z betaina, JT-butyrobetaina, krotonobetaina i L-karnityna jako zródlem wegla i azotu, mozna przeprowadzac znanymi metodami (J. H. Miller, Experi- ments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972).Dajacymi sie celowo stosowac metodami wytwarzania stabilnych mutantów sa: metoda zmiany sposobu odczytywania kodu (metoda Frame-Shift), metoda wypadniecia (metoda dele- cji) lub metoda przetnieszczenia-dodania (metoda transpozycji-insercji). Te tak zmutowane mikroorganizmy po dalszej hodowli w srodowisku betainy i po przeprowadzeniu do srodowiska L-karnityny poddaje sie nastepnie etapowi selekcji b), w których za pomoca znanych kontr- selekcjonujacyeh odczynników (P. Gerhardt i wspólpracownicy /redakcja/, Manual of Met- hods for General Bacteriology, Am. Soc. for Microbiology, 1981) wyselekcjonouje sie te mikroorganizmy, które trwale nie katabolizuja L-karnityny i nie rosna na L-karnitynie, krotonobetainie lub T -butyrobetainie, ale dobrze rosna z betaina.Korzystnym mikroorganizmem, który rosnie z betaina, t -butyrobetaina, krotonobeta¬ ina, L-karnityna jako zródlem wegla i azotu, jest szczep HK 4 (DSM nr 2938) i jego potom¬ stwo i mutanty. Szczep ten w dniu 3 marca 1984 r. zostal zlozony w RFN Kolekcji Mikroor¬ ganizmów (DSM « Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), Gesellschaft fdr Biotechnologi- sche Forschung mbH Griesebachstrasse S, 4300 Getynga, Republika Federalna Niemiec, pod numerem DSM 2938. Nizej podano cechy naukowej charakterystyki szczepu HK 4 (DSM nr 2938):145 712 3 Postac komórki I Dlugosc urn I Szerokosc urn I Ruchliwosc I Urzeskowienie I Odczyn Grama I Zarodniki I Tworzenie poli-^ I -hydroksymaslanu I Oksydaza I Katalaza I Wzrost: I anaerobowo 37°C 41°C PH 5,6 I Mac-Conkeya-Agar Agar SS I Agar z cetrimidem I Tworzenie pigmentu nie dyfundujacy I dyfundujacy I fluoryzujacy I Tworzenie kwasu (test OF) z: I glukozy aerobowo I anaerobowc I fruktozy, aerobowo ASS glukoza I ksyloza I trehaloza I I etanol I I Tworzenie gazu z I I glukozy I ONPG I Argininodihydrolozal Dekarboksylaza lizy- nowa I i^_^-^_j_ I Paleczki I czesciowo bleomorficzne 1-2 0,5-0,8 + [otoczkowe - - I - + + - + - - + - - - i - - - - + + + I - I - - I L Dezaminaza fenyloalani- I nowa I Dekarboksylaza ornityno- I wa H2S Reakcja Voges-Proskauera Indol Azotyn z azotanu Denitryfikacja Tworzenie lewanu Lecytynaza Ureaza Degradacja: skrobi zelatyny kazeiny I tyrozyny Tween 80 DNA aeskuliny Wykorzystanie substratu: octan i cytrynian malonian glicyna norleucyna ksyloza fruktoza glukoza Wzrost autotroficzny z H~ 3-Ketolactoza I Wzrost: I betaina I L-karnityna I T-butyrobetaina I krotonobetaina I - I " " I + I + I - + I " - - " - + I + - - - - I - + I + I + I - I - I + I + I + I + I Korzystny mikroorganizm, który zmutowany i wyselekcjonowany zostal z poprzednio opisanego mikroorganizmu, jest stabilny, nie katabolizuje L-karnityny, lecz ja wydziela, nie rosnie na L-lsarnitynie: f krotonobetainie i )f-butyrobetainie, ale dobrze rosnie na betainie i stanowi szczep HK 13. Ten omówiony szczep w dniu 23 stycznia 1984 r. zostal zdeponowany w RFN Kolekcji Mikroorganizmów (DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), Gesellschaft fflr Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse S, 4300 Getynga, Re¬ publika Federalna Niemiec, pod numerem DSM 2903. Nizej podano cechy naukowej charakterys¬ tyki szczepu HK 13 (DSM nr 2903):4 145 712 Postac komórki Dlugosc urn Szerokosc urn Ruchliwosc Urzeskowienie Odczyn Grama Zarodniki Tworzenie poli-A-hyd- roksymaslanu ' Oksydaza Katalaza Wzrost: anaerobowo 37°C 41°C PH 5,6 Agar Mac-Conkeya Agar SS Agar z cetrymidem I Tworzenie pigmentu: nie dyfundujacy dyfundujacy fluoryzujacy I Tworzenie kwasu (test OF) z: I glukozy aerobowo I anaerobowo fruktozy aerobowo I ASS glukoza ksyloza I trehaloza I etanol I Tworzenie gazu z glu¬ kozy ONPG I Argininodihydrolaza I Dekraboksylaza lizyno- I wa I I Paleczki czes- I ciowo plemor- ficzne 1-2 0,5-0,8 I + I otoczkowe - - I - + + - + - - + - - - - - - - - + + + - _ + - - I Dezaminaza fenyloalani- 1 nowa Dekarboksylaza ornity- nowa l^S Reakcja Voges-Proska- uera Indol I Azotyn z azotanu Denitryfikacja Tworzenie lewanu Lecytynaza Ureaza Degradacja: skrobi zelatyny kaseiny tyrozyny Tween 80 DNA aeskuliny Wykorzystanie substratu: octan cytrynian ' malonian glicyna norleucyna ksyloza fruktoza glukoza Wzrost autotroficzny: z H2 3-Ketolaktoza Wzrost: betaina L-karnityna IT-butyrobetaina I krotonobetaina I L-glutaminion i I krotonobetaina I L-glutaminion i I butyrobetaina I L-glutaminion i I L-karnityna I - I " - I _ I - I + I + - - + I - - - - - + I + I - - - I - + I + + I - - + I - - I - + I - + I - I + I - I145 712 5 Przykladem potomka mikroorganizmu HK 13, który jest stabilny, nie katabolizuje lecz wydziela L-karnityne, nie rosnie na L-karnitynie, krotonobetainie i $-butyrobetai- nie, ale rosnie z betaina, z L-glutamianem i krotonobetaina, L-glutamianem i butyrobeta- ina lub z L-glutamianem i L-karnityna, jest szczep HK 1331 b. Zostal on wyodrebniony ja¬ ko samorzutna, dobrze rosnaca kolonia mutantów z powierzchni pozywki zestalonej za pomo¬ ca agaru, zawierajacej L-glutaminian i ^-butyrobetaine. Ten omówiony szczep w dniu 8 lu¬ tego 1985 r. zostal zdeponowany w RFN Kolekcji Mikroorganizmów (DSM « Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), Gesellschaft ftir Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Getynga, Republika Federalna Niemiec, pod numerem DSM 3225. Nizej podano cechy naukowej charakterystyki szczepu HK 1331 b (DSM nr 3225): Postac komórki 1 Dlugosc urn 1 Szerokosc urn 1 Ruchliwosc Urzeskowienie 1 Odczyn Grama Zarodniki 1 Tworzenie poli-/l-hyd- roksymaslanu 1 Oksydaza Katalaza Wzrost: 1 anaerobowo 37°C 41 °C pH 5,6 I Agar Mac-Conkeya Agar SS I Agar z cetrimidem I Tworzenie pigmentu: nie dyfundujacy dyfundujacy fluoryzujacy I Tworzenie kwasu I (test OF) z: I glukozy aerobowo I anaerobowo I fruktozy aerobowo I ASS glukoza I ksyloza I trehaloza I etanol I Tworzenie gazu z glukoz)! I ONPG I Argininodihydrolaza I I Dekarboksylaza lizynowa I Paleczki I czesciowo I pleomorficzne 1-2 0,5-0,8 I + I otoczkowe - - - + + - + - - ! + - - - - - - - - + + + - - + ! I I I Dezaminaza fenyloala- ninowa * I Dekarboksylaza ornitynowa H2S Reakcja Voges-Proska- I uera Indol Azotyn z azotanu Denitryfikacja I Tworzenie lewanu Lecytynaza Ureaza Degradacja: skrobi zelatyny kazeiny tyrozyny Tween 80 DNA aeskuliny Wykorzystanie substratu: octan cytrynian , malonian glicyna norleucyna ksyloza fruktoza glukoza Wzrost autotroficzny z ^ 3-Ketolaktoza Wzrost: betaina I L-karnityna I JT-butyrobetaina I krotonobetaina I L-glutaminian i I krotonobetaina I L-glutaminian i I butyrobetaina I L-glutaminian 1 1 L-karnityna 1 1 j i 1 " - 1 - 1 - + * 1 - + 1 - - - " - + 1 + - - 1 - 1 - 1 - 1 + 1 + 1 + 1 - - + 1 - - 1 - 1 + 1 + 1 + 16 145 712 Sposób wytwarzania L-karnityny przeprowadza sie celowo takf ze hodowle wstepna mikroorganizmu, korzystnie mikroorganizmu oznaczonego symbolem HK 13, poddaje sie hodo¬ waniu w wyjalowionym srodowisku mineralnym, zawierajacym korzystnie witaminy (Kulla i wspólpracownicy, Arch. Microbiol. 135, 1/1983/), w temperaturze 20-40°C, korzystnie w temperaturze 30°C, wobec odczynu o wartosci pH « 6-8, korzystnie o wartosci pH = 7, w ciagu 20-50 godzin, korzystnie w ciagu 30-40 godzin. Ta hodowla wstepna celowo zawiera 0,1-1096 wagowych, korzystnie 0,5-596 wagowych, choliny, glutaminianu, octanu, dwumetylo- glicyny lub betainy Jako substratu wzrostowego. Szczególnie korzystnie stosuje sie be- Nadto zwyczajowo w technice mikrobiologicznej do hodowli wstepnej dodaje sie tez poddawane reakcji zwiazki wyjsciowe, czyli Jf -butyrobetaine, krotonobetaine lub ich mie¬ szaniny w ilosci 0,1-1096 wagowych, korzystnie 0,5-596 wagowych, wzgledem srodowiska re¬ akcyjnego, fi" -butyrobetaina lub krotonobetaina moze wystepowac w postaci soli chlorowo- dorkowej, w postaci wolnej soli wewnetrznej oraz w postaci swych pochodnych.Za pomoca hodowli wstepnej, wytworzonej wyzej omówionym sposobem, moza zaszcze¬ piac dalsze hodowle. Te dalsze hodowle maja celowo taki sam sklad jak hodowle wstepne.Poddawane przemianie: korotonobetaina, $* -butyrobetaina lub ich mieszaniny wystepuja w stezeniu 0,1-1096 wagowych, korzystnie 0,5-596 wagowych. Równiez substraty wzrostowe: cho- line, glutaminian, octan, dwumetyloglicyne i betaine wprowadza sie celowo w stezeniach w hodowli wstepnej. Korzystnie warunki hodowlane w dalszym hodowaniu dostosowuje sie odpowiednio do warunków hodowlanych z hodowli wstepnej. Celowo otrzymuje sie wiec tempe¬ rature 20-40°C, korzystnie temperature 30°C i odczyn o wartosci pH «=6-8, korzystnie o wartosci pH « 7, Tak przeprowadzone wytwarzanie L-karnityny po uplywie 20-30 godzin osiaga stan bezruchu. Stezenie L-karnityny jest wówczas z reguly równowazne wprowadzonej ilosci T-butyrobetainy lub krotonobetainy. Komórki mozna odwirowac lub odsaczyc i stosowac jako szczepionke dla nowej hodowli, \i znany sposób (J. P. Vandecasteele, Appl. Environ, Microbiol. 39, 327 /1980/) mozna L-karnityne za pomoca chromatografii kationitowej wy¬ odrebniac z odwirowanej cieczy i oczyszczac na drodze przekrystalizowania. Sposób wytwa¬ rzania L-karnityny mozna równiez przeprowadzac metoda ciagla tak, ze prowadzi sie wzrost komórek w chemostacie wobec celowych porcji rozcienczajacych równych 0,04-0,2 na 1 go¬ dzine, korzystnie 0,06-0,08 na 1 godzine, w warunkach analogicznych do hodowli okresowej.Przyklad I, Wyodrebnianie mikroorganizmu degradujacego krotonobetaine.Mikroorganizmy ekstrahowano z gleby droga mieszania z obojetnym roztworem buforu fosforanowego, po czym wieksze czastki oddziela sie na bibule filtracyjnej i tak uzyska¬ no mieszanine bakterii zaszczepiono do lekkiego zmetnienia ciekla pozywke krotonobetai- nowa. Po uplywie 9 dni zmetnienie jako miara stezenia komórek wzroslo dziewiecdziesie- ciokrotnie, Krotonobetaina calkowicie znikla z tego roztworu, a mozna bylo stwierdzic obecnosc amoniaku jak produktu degradacji* Z tej hodowli mieszanej za pomoca tradycyj¬ nych technik mikrobiologicznych (zestalone agarem podloze pozywkowe) zalozono czyste hodowle mikroorganizmów degradujacych krotonobetaine. Do dalszych prac wybrano jedna hodowle i nadano Jej symbol HK 4. Szczep ten rosnie równiez z f -butyrobetaina, L-karni- tyna i betaina.Przyklad II. Wyodrebnianie stabilnego mutanta negatywnego wzgledem de¬ hydrogenazy karnitynowej Mutant taki powinien by nie móc dalej katabolizowac L-karnityny, zsyntetyzowa- neJ z f -butyrobetainy lub krotonobetainy, a w idealnym przypadku powinien by zamiast tego wytracac L-karnityne, Hodowle HK 4 stabilnie mutagenizowano za pomoca "Acridin Mu- tagen ICR 191" w ilosci 5 ug na 1 ml, przepisowo w srodowisku bursztynianu (J, H. Mil¬ ler, Ecperiments In Molecular Genetics, Colg Spring Harbor Laboratory, 1972), po czym145 712 7 prowadzono wzrost komórek wzorcowo w "Nutrient Broth" az do ekspresji mutacji, a nas¬ tepnie przeprowadzono do srodowiska betainy. Wyrosnieta hodowle zaszczepiono srodowisko L-karnityny. Po kilku godzinach hodowla osiagnela logarytmiczny wzrost, «V tym momencie dodano penicyline G (15 mg/ml) i D-cykloseryne (0,5 mg/ml) (Ornston i wspólpracownicy, Biochim. Biophys. Res. Comraun. 36, 179 /l9C9/)# Te "kontrselekcjonujace" odczynniki za^- bily tylko bakterie rosnace. Mutanty, które juz dalej z L-karnityna nie mogly rosnac i byly interesujace dla dalszych badan, przezyly i przeto relatywnie nagromadzily sie. Po uplywie 30 godzin liczba komórek zywych cofnela sie do setnej czesci calosci, antybio¬ tyki wymyto, a hodowle przeprowadzono do srodowiska betainowego. Po wzroscie odpowied¬ nie rozcienczenie hodowli rozdzielono na zestalona pozywke agarowa. Tak odosobnione ko¬ mórki wyrosly w kolonie i byly osobno badane. Wybrano mutanty HK 13. Trwale nie mialy one juz dehydrogenazy karnitynowej i dlatego nie rosly juz z L-karnityna, $* -butyrobeta- ina lub korotonobetaina, ale dobrze rosly z betaina. W przypadku wzrostu na betainie, dwumetyloglicynie, cholinie, glutaminianie lub octanie szczep ten przeksztalcal krotono- betaine lub Jr* -butyrobetaine w L-karnityne i wytracal ja.Przyklad III. 5 litrów hodowli wstepnej w ciagu 32 godzin hodowano w wi- taminizowanym srodowisku mineralnym (Kulla i wspólpracownicy, Aren. Microbiol. 135, 1 /1983/), zawierajacym 1% wagowy betainy i 0,5% wagowego chlorku krotonobetainy, w tempe¬ raturze 30°C wobec odczynu o wartosci pH = 7f0. Szarza ta zaszczepiono 15 litrów hodo¬ wli o takim samym skladzie i w ciagu 24 godzin hodowano tak, jak hodowle wstepna (30°C, pH = 7f0, p02« 3 ppm). Gdy wytwarzanie doszlo do stanu bezruchu, odwirowano komórki, które mogly byc stosowane jako szczepionka dla nowej kapieli. Stezenie L-karnityny w odwirowanej cieczy (19t8 litra) zmierzono droga analizy enzymatycznej. Odwirowana ciecz zawierala 4,26 mg L-karnityny 1 ml. Odpowiadalo to wydajnosci 95,0%, liczac na wprowadzo¬ na ilosc chlorku krotonobetainy. Substancji wydzielonych i innych zanieczyszczen nie udalo sie stwierdzic w widmie-MRJ.Jak podano w publikacji (J. P. Vandecasteele, Appl. Emriron. Microbiol. 39f 327 /1980/), L-karnityna moglaby zostac wyodrebniona z odwirowanej cieczy za pomoca chroma¬ tografii kationitowej i oczyszczona za pomoca przekrystalizowania.Przykla^d IV. 5 litrów hodowli wstepnej w ciagu 32 godzin hodowano w wi- taminizowanym srodowisku mineralnym (wedlug przykladu I), zawierajacym 1% choliny i 0,6% chlorku Y -butyrobetainy, w temperaturze 30 C wobec odczynu o wartosci pH = 7,0.Ta hodowla wstepna zaszczepiono hodowle w 15 litrach srodowiska o takim samym skladzie i hodowano w takich samych warunkach jak w przykladzie I. Gdy wytwarzanie po uplywie okolo 30 godzin doszlo do stanu bezruchu, oddzielono komórki droga mikrofiltracji (Ami- con Hollow-fiber cartridge). Te mase komórkowa mozna byloby wykorzystac do dalszego wy¬ twarzania L-karnityny. Stezenie L-karnityny w przesaczu (19t6 litra) oznaczono enzyma¬ tycznie. Przesacz ten zawieral 5f3 mg L-karnityny na 1 ml. Odpowiadalo to analitycznej wydajnosci 97f6%, liczac na wprowadzona ilosc chlorku Jf -butyrobetainy. Zgodnie z ana¬ liza widmowa-MRJ w przesacz nie stwierdzono obecnosci zadnych substancji wydzielonych czy innych obcych organicznych produktów ubocznych. Stad tez mozna byloby z tego roz¬ tworu wyodrebniac L-karnityne np. za pomoca destylacji azeotropowej (opis patentowy Re¬ publiki Federalnej Niemiec DEPS nr 2300492).8 145 712 Przyklad V. Fermentor z wyposazeniem do prowadzenia hodowli ciaglej, za¬ wierajacy 1,5 litra witaminizowanego srodowiska mineralnego (wedlug przykladu I) wraz z 1,596 betainy i 1,0% chlorku jT-butyrobetainy, zaszczepiono za pomoca 150 ml hodowli wstepnej HK 13 w takim samym srodowisku. Po uplywie 20 godzin aerobowego hodowania w temperaturze 30°C wobec pH « 7,0 hodowla byla wyrosnieta i mozna bylo rozpoczac ruch ciagly za pomoca porcji 0,1 litra cieczy na 1 godzine. Odplywajacy z fermentora strumien roztworu hodowlanego odbierano w naczyniu ochlodzonym do temperatury 4°C. Komórki usuwa¬ no droga odwirowania. Zgodnie z analiza enzymatyczna ciecz odwirowana zawierala 8,8 g L-karnityny w 1 litrze hodowli. Odpowiadalo to stwierdzonej analitycznie wydajnosci 99,2%, liczac na wprowadzone stezenie chlorku f-butyrobetainy. Staly chlorek L-karnity¬ ny mozna byloby z tego roztworu wyodrebniac za pomoca chromatografii jonowej i oddziela¬ nia wody.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania L-karnityny na drodze mikrobiologicznej, znamienny t y m, ze nowy mikroorganizm, który z krotonobetainy i/lub Jr -butyrobetainy jest zdolny do wytwarzania L-karnityny, a nie jest zdolny do jej katabolizowania, korzystnie mikro¬ organizm HK 13 (DSM nr 2903), mikroorganizm HK 1331 b (DSM nr 3225), mikroorganizm HK 4 (DSM nr 2938) lub ich potomstwo i mutanty, poddaje sie hodowaniu z krotonobetaina i/lub jf-butyrobetaina w obecnosci substratu wzrostowego, a nagromadzona L-karnityne wyodreb¬ nia sie. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze krotonobetaine, *-bu- tyrobetaine lub ich mieszanine stosuje sie w ilosci 0,1-10% wagowych wzgledem pozywki hodowlanej. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat wzros¬ towy stosuje sie dwumetyloglicyne, choline, glutaminian, octan i/lub betaine. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze substraty wzrostowe stosuje sie w ilosci 0,1-10% wagowych wzgledem pozywki hodowlanej.Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 eg; Ona 400 zl PL PL PL PL