PL145712B1 - Method of microbiologically obtaining l-carnitine - Google Patents

Method of microbiologically obtaining l-carnitine Download PDF

Info

Publication number
PL145712B1
PL145712B1 PL1985252628A PL25262885A PL145712B1 PL 145712 B1 PL145712 B1 PL 145712B1 PL 1985252628 A PL1985252628 A PL 1985252628A PL 25262885 A PL25262885 A PL 25262885A PL 145712 B1 PL145712 B1 PL 145712B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
carnitine
crotonobetaine
butyrobetaine
betaine
dsm
Prior art date
Application number
PL1985252628A
Other languages
English (en)
Other versions
PL252628A1 (en
Inventor
Hans Kulla
Pavel Lehky
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of PL252628A1 publication Critical patent/PL252628A1/xx
Publication of PL145712B1 publication Critical patent/PL145712B1/pl

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/007Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/824Achromobacter

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Catalysts (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-karnityny na drodze mikrobiologicz¬ nej. Znane jest wytwarzanie L-karnityny z lf -butyrobetainy. Te tf -butyrobetaine w obecnos¬ ci 2-ketoglutaranu sodowego, srodka redukujacego, zródla jonów zelaza i tlenu z powietrza jako donora grup hydroksylowych doprowadza sie do zetkniecia z enzymem -hydroksylaza, uwolniona z zarodników Neurospora crassa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki US-PS nr k 371 618)• Sposób ten wykazuje taka niedogodnosc, ze niezbedne sa liczne czyn¬ niki pomocnicze. I tak w reakcji tej stechiometryczna ilosc 2-ketoglutaranu oksydacyjnie dokarboksyluje sie do bursztynianu. Fe + jest niezbedne jako aktywator -02 askorbinian jest niezbedny dla utrzymania jonu zelaza w postaci zredukowanej, a katalaza jest niezbed¬ na dla rozkladu sladowo powstajacego, szkodliwego nadtlenku wodoru* Lindstedt i wspólpracownicy (Biochemistry 6, 1262-1270 (1967) "The Formation and Degradation of Camitin in Pseudomonas") wyizolowali mikroorganizm rodzaju Pseudomonas, który rosnie z degradacji bylo hydroksylowanie Jf-butyrobetainy do L-karnityny, przy czym przejsciowo powstajaca L-karnityna byla w calosci dalej katabolizowana do C02, I^O i NH™» Równiez i tef z bakterii uzyskiwane hydroksylazy, gdyby byly stosowane do wytwarzania L-karnitynyf to mialyby omówione, niedogodne zapotrzebowanie na czynniki pomocnicze (Lindstadt i wspól¬ pracownicy, Biochemistry 16, 2181-2188 /1977/ "Purification and Properties of f-Butyro- betaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1").Celem wynalazku Jest znalezienie nowego typu mikroorganizmów, który tych wad zna¬ nych sposobów nie wykazuje i umozliwia na latwej drodze wytwarzanie nie racematu, lecz •nancjo-selektywnej L-karnityny z krotonobetainy, butyrobetainy lub z ich mieszaniny. W2 145 712 odróznieniu od ukladów znanych ze stanu techniki nowy typ mikroorganizmów wykorzystuje H~0 a nie 0« jako donor grup hydroksylowych, jak to mozna bylo stwierdzic droga wlas- 18 18 nych badan z zastosowaniem ^ 0 i 02. Mikroorganizmy nowego typu sa zdolne do wytwarza¬ nia L-karnityny z krotonobetainy i/lub r -butyrobetainy, a nie sa zdolne do katabolizowa- nia L-karnityny.Jak dowiodlo badanie porównawcze próbek glebowych z czterech kontynentów, mikroor¬ ganizmy katabolizujace butyrobetaine i krotonobetaine poprzez L-karnityne sa rozpowszech¬ nione. Równiez z osadu czynnego zbiorników do oczyszczania scieków udaje sie ich wyodreb¬ nianie. V rachube wchodza wszystkie szczepy jako potencjalni wytwórcy L-karnitynyt jezeli podda sie je mutacji nizej omówiona metoda wedlug wynalazku. Takie mutanty otrzymuje sie wedlug nastepujacej metody selekcji: a) mikroorganizmy, które rosna z betaina, f -butyro- betaina, krotonobetaina i L-karnityna Jako zródlem wegla i azotu, poddaje sie mutacji na znanej drodze; b) z hodowli otrzymanych kultur zmutowanych mikroorganizmów wyselekcjono- wuje sie te mikroorganizmy, które sa stabilne, które nie katabolizuja L-karnityny i nie rosna na L-karnitynie, krotonobetainie lub JT -butyrobetainie, lecz dobrze rosna z betaina.Korzystnie po etapie b) wyselekcjonowuje sie te mikroorganizmy, które wytracaja L-karnity- ne i nie rosna na L-karnitynie, krotonobetainie lub jf -butyrobetainie, lecz dobrze rosna z betaina.Zmutowane mikroorganizmy poddaje sie celowo dalszej hodowli w srodowisku betainy, a te dalej w srodowisku betainy hodowane mikroorganizmy, w celu przeprowadzenia etapu se¬ lekcji b) poddaje sie hodowaniu w srodowisku L-karnityny. Hodowanie szczepów rosnacych z betaina, f -butyrobetaina, krotonobetaina i L-karnityna jako zródlem wegla i azotu przeprowadza sie celowo tak, ze z mieszanin bakterii przez zaszczepienie krotonobetainowych roztworów pozyw- kowych uzyskuje sie hodowle mieszane, a z nich za pomoca tradycyjnych technik mikrobiologicznych przygotowuje sie czyste hodowle mikroorganizmów degradujacych krotonobetaine. Mutacje takiej hodowli, która rosnie z betaina, JT-butyrobetaina, krotonobetaina i L-karnityna jako zródlem wegla i azotu, mozna przeprowadzac znanymi metodami (J. H. Miller, Experi- ments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972).Dajacymi sie celowo stosowac metodami wytwarzania stabilnych mutantów sa: metoda zmiany sposobu odczytywania kodu (metoda Frame-Shift), metoda wypadniecia (metoda dele- cji) lub metoda przetnieszczenia-dodania (metoda transpozycji-insercji). Te tak zmutowane mikroorganizmy po dalszej hodowli w srodowisku betainy i po przeprowadzeniu do srodowiska L-karnityny poddaje sie nastepnie etapowi selekcji b), w których za pomoca znanych kontr- selekcjonujacyeh odczynników (P. Gerhardt i wspólpracownicy /redakcja/, Manual of Met- hods for General Bacteriology, Am. Soc. for Microbiology, 1981) wyselekcjonouje sie te mikroorganizmy, które trwale nie katabolizuja L-karnityny i nie rosna na L-karnitynie, krotonobetainie lub T -butyrobetainie, ale dobrze rosna z betaina.Korzystnym mikroorganizmem, który rosnie z betaina, t -butyrobetaina, krotonobeta¬ ina, L-karnityna jako zródlem wegla i azotu, jest szczep HK 4 (DSM nr 2938) i jego potom¬ stwo i mutanty. Szczep ten w dniu 3 marca 1984 r. zostal zlozony w RFN Kolekcji Mikroor¬ ganizmów (DSM « Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), Gesellschaft fdr Biotechnologi- sche Forschung mbH Griesebachstrasse S, 4300 Getynga, Republika Federalna Niemiec, pod numerem DSM 2938. Nizej podano cechy naukowej charakterystyki szczepu HK 4 (DSM nr 2938):145 712 3 Postac komórki I Dlugosc urn I Szerokosc urn I Ruchliwosc I Urzeskowienie I Odczyn Grama I Zarodniki I Tworzenie poli-^ I -hydroksymaslanu I Oksydaza I Katalaza I Wzrost: I anaerobowo 37°C 41°C PH 5,6 I Mac-Conkeya-Agar Agar SS I Agar z cetrimidem I Tworzenie pigmentu nie dyfundujacy I dyfundujacy I fluoryzujacy I Tworzenie kwasu (test OF) z: I glukozy aerobowo I anaerobowc I fruktozy, aerobowo ASS glukoza I ksyloza I trehaloza I I etanol I I Tworzenie gazu z I I glukozy I ONPG I Argininodihydrolozal Dekarboksylaza lizy- nowa I i^_^-^_j_ I Paleczki I czesciowo bleomorficzne 1-2 0,5-0,8 + [otoczkowe - - I - + + - + - - + - - - i - - - - + + + I - I - - I L Dezaminaza fenyloalani- I nowa I Dekarboksylaza ornityno- I wa H2S Reakcja Voges-Proskauera Indol Azotyn z azotanu Denitryfikacja Tworzenie lewanu Lecytynaza Ureaza Degradacja: skrobi zelatyny kazeiny I tyrozyny Tween 80 DNA aeskuliny Wykorzystanie substratu: octan i cytrynian malonian glicyna norleucyna ksyloza fruktoza glukoza Wzrost autotroficzny z H~ 3-Ketolactoza I Wzrost: I betaina I L-karnityna I T-butyrobetaina I krotonobetaina I - I " " I + I + I - + I " - - " - + I + - - - - I - + I + I + I - I - I + I + I + I + I Korzystny mikroorganizm, który zmutowany i wyselekcjonowany zostal z poprzednio opisanego mikroorganizmu, jest stabilny, nie katabolizuje L-karnityny, lecz ja wydziela, nie rosnie na L-lsarnitynie: f krotonobetainie i )f-butyrobetainie, ale dobrze rosnie na betainie i stanowi szczep HK 13. Ten omówiony szczep w dniu 23 stycznia 1984 r. zostal zdeponowany w RFN Kolekcji Mikroorganizmów (DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), Gesellschaft fflr Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse S, 4300 Getynga, Re¬ publika Federalna Niemiec, pod numerem DSM 2903. Nizej podano cechy naukowej charakterys¬ tyki szczepu HK 13 (DSM nr 2903):4 145 712 Postac komórki Dlugosc urn Szerokosc urn Ruchliwosc Urzeskowienie Odczyn Grama Zarodniki Tworzenie poli-A-hyd- roksymaslanu ' Oksydaza Katalaza Wzrost: anaerobowo 37°C 41°C PH 5,6 Agar Mac-Conkeya Agar SS Agar z cetrymidem I Tworzenie pigmentu: nie dyfundujacy dyfundujacy fluoryzujacy I Tworzenie kwasu (test OF) z: I glukozy aerobowo I anaerobowo fruktozy aerobowo I ASS glukoza ksyloza I trehaloza I etanol I Tworzenie gazu z glu¬ kozy ONPG I Argininodihydrolaza I Dekraboksylaza lizyno- I wa I I Paleczki czes- I ciowo plemor- ficzne 1-2 0,5-0,8 I + I otoczkowe - - I - + + - + - - + - - - - - - - - + + + - _ + - - I Dezaminaza fenyloalani- 1 nowa Dekarboksylaza ornity- nowa l^S Reakcja Voges-Proska- uera Indol I Azotyn z azotanu Denitryfikacja Tworzenie lewanu Lecytynaza Ureaza Degradacja: skrobi zelatyny kaseiny tyrozyny Tween 80 DNA aeskuliny Wykorzystanie substratu: octan cytrynian ' malonian glicyna norleucyna ksyloza fruktoza glukoza Wzrost autotroficzny: z H2 3-Ketolaktoza Wzrost: betaina L-karnityna IT-butyrobetaina I krotonobetaina I L-glutaminion i I krotonobetaina I L-glutaminion i I butyrobetaina I L-glutaminion i I L-karnityna I - I " - I _ I - I + I + - - + I - - - - - + I + I - - - I - + I + + I - - + I - - I - + I - + I - I + I - I145 712 5 Przykladem potomka mikroorganizmu HK 13, który jest stabilny, nie katabolizuje lecz wydziela L-karnityne, nie rosnie na L-karnitynie, krotonobetainie i $-butyrobetai- nie, ale rosnie z betaina, z L-glutamianem i krotonobetaina, L-glutamianem i butyrobeta- ina lub z L-glutamianem i L-karnityna, jest szczep HK 1331 b. Zostal on wyodrebniony ja¬ ko samorzutna, dobrze rosnaca kolonia mutantów z powierzchni pozywki zestalonej za pomo¬ ca agaru, zawierajacej L-glutaminian i ^-butyrobetaine. Ten omówiony szczep w dniu 8 lu¬ tego 1985 r. zostal zdeponowany w RFN Kolekcji Mikroorganizmów (DSM « Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), Gesellschaft ftir Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Getynga, Republika Federalna Niemiec, pod numerem DSM 3225. Nizej podano cechy naukowej charakterystyki szczepu HK 1331 b (DSM nr 3225): Postac komórki 1 Dlugosc urn 1 Szerokosc urn 1 Ruchliwosc Urzeskowienie 1 Odczyn Grama Zarodniki 1 Tworzenie poli-/l-hyd- roksymaslanu 1 Oksydaza Katalaza Wzrost: 1 anaerobowo 37°C 41 °C pH 5,6 I Agar Mac-Conkeya Agar SS I Agar z cetrimidem I Tworzenie pigmentu: nie dyfundujacy dyfundujacy fluoryzujacy I Tworzenie kwasu I (test OF) z: I glukozy aerobowo I anaerobowo I fruktozy aerobowo I ASS glukoza I ksyloza I trehaloza I etanol I Tworzenie gazu z glukoz)! I ONPG I Argininodihydrolaza I I Dekarboksylaza lizynowa I Paleczki I czesciowo I pleomorficzne 1-2 0,5-0,8 I + I otoczkowe - - - + + - + - - ! + - - - - - - - - + + + - - + ! I I I Dezaminaza fenyloala- ninowa * I Dekarboksylaza ornitynowa H2S Reakcja Voges-Proska- I uera Indol Azotyn z azotanu Denitryfikacja I Tworzenie lewanu Lecytynaza Ureaza Degradacja: skrobi zelatyny kazeiny tyrozyny Tween 80 DNA aeskuliny Wykorzystanie substratu: octan cytrynian , malonian glicyna norleucyna ksyloza fruktoza glukoza Wzrost autotroficzny z ^ 3-Ketolaktoza Wzrost: betaina I L-karnityna I JT-butyrobetaina I krotonobetaina I L-glutaminian i I krotonobetaina I L-glutaminian i I butyrobetaina I L-glutaminian 1 1 L-karnityna 1 1 j i 1 " - 1 - 1 - + * 1 - + 1 - - - " - + 1 + - - 1 - 1 - 1 - 1 + 1 + 1 + 1 - - + 1 - - 1 - 1 + 1 + 1 + 16 145 712 Sposób wytwarzania L-karnityny przeprowadza sie celowo takf ze hodowle wstepna mikroorganizmu, korzystnie mikroorganizmu oznaczonego symbolem HK 13, poddaje sie hodo¬ waniu w wyjalowionym srodowisku mineralnym, zawierajacym korzystnie witaminy (Kulla i wspólpracownicy, Arch. Microbiol. 135, 1/1983/), w temperaturze 20-40°C, korzystnie w temperaturze 30°C, wobec odczynu o wartosci pH « 6-8, korzystnie o wartosci pH = 7, w ciagu 20-50 godzin, korzystnie w ciagu 30-40 godzin. Ta hodowla wstepna celowo zawiera 0,1-1096 wagowych, korzystnie 0,5-596 wagowych, choliny, glutaminianu, octanu, dwumetylo- glicyny lub betainy Jako substratu wzrostowego. Szczególnie korzystnie stosuje sie be- Nadto zwyczajowo w technice mikrobiologicznej do hodowli wstepnej dodaje sie tez poddawane reakcji zwiazki wyjsciowe, czyli Jf -butyrobetaine, krotonobetaine lub ich mie¬ szaniny w ilosci 0,1-1096 wagowych, korzystnie 0,5-596 wagowych, wzgledem srodowiska re¬ akcyjnego, fi" -butyrobetaina lub krotonobetaina moze wystepowac w postaci soli chlorowo- dorkowej, w postaci wolnej soli wewnetrznej oraz w postaci swych pochodnych.Za pomoca hodowli wstepnej, wytworzonej wyzej omówionym sposobem, moza zaszcze¬ piac dalsze hodowle. Te dalsze hodowle maja celowo taki sam sklad jak hodowle wstepne.Poddawane przemianie: korotonobetaina, $* -butyrobetaina lub ich mieszaniny wystepuja w stezeniu 0,1-1096 wagowych, korzystnie 0,5-596 wagowych. Równiez substraty wzrostowe: cho- line, glutaminian, octan, dwumetyloglicyne i betaine wprowadza sie celowo w stezeniach w hodowli wstepnej. Korzystnie warunki hodowlane w dalszym hodowaniu dostosowuje sie odpowiednio do warunków hodowlanych z hodowli wstepnej. Celowo otrzymuje sie wiec tempe¬ rature 20-40°C, korzystnie temperature 30°C i odczyn o wartosci pH «=6-8, korzystnie o wartosci pH « 7, Tak przeprowadzone wytwarzanie L-karnityny po uplywie 20-30 godzin osiaga stan bezruchu. Stezenie L-karnityny jest wówczas z reguly równowazne wprowadzonej ilosci T-butyrobetainy lub krotonobetainy. Komórki mozna odwirowac lub odsaczyc i stosowac jako szczepionke dla nowej hodowli, \i znany sposób (J. P. Vandecasteele, Appl. Environ, Microbiol. 39, 327 /1980/) mozna L-karnityne za pomoca chromatografii kationitowej wy¬ odrebniac z odwirowanej cieczy i oczyszczac na drodze przekrystalizowania. Sposób wytwa¬ rzania L-karnityny mozna równiez przeprowadzac metoda ciagla tak, ze prowadzi sie wzrost komórek w chemostacie wobec celowych porcji rozcienczajacych równych 0,04-0,2 na 1 go¬ dzine, korzystnie 0,06-0,08 na 1 godzine, w warunkach analogicznych do hodowli okresowej.Przyklad I, Wyodrebnianie mikroorganizmu degradujacego krotonobetaine.Mikroorganizmy ekstrahowano z gleby droga mieszania z obojetnym roztworem buforu fosforanowego, po czym wieksze czastki oddziela sie na bibule filtracyjnej i tak uzyska¬ no mieszanine bakterii zaszczepiono do lekkiego zmetnienia ciekla pozywke krotonobetai- nowa. Po uplywie 9 dni zmetnienie jako miara stezenia komórek wzroslo dziewiecdziesie- ciokrotnie, Krotonobetaina calkowicie znikla z tego roztworu, a mozna bylo stwierdzic obecnosc amoniaku jak produktu degradacji* Z tej hodowli mieszanej za pomoca tradycyj¬ nych technik mikrobiologicznych (zestalone agarem podloze pozywkowe) zalozono czyste hodowle mikroorganizmów degradujacych krotonobetaine. Do dalszych prac wybrano jedna hodowle i nadano Jej symbol HK 4. Szczep ten rosnie równiez z f -butyrobetaina, L-karni- tyna i betaina.Przyklad II. Wyodrebnianie stabilnego mutanta negatywnego wzgledem de¬ hydrogenazy karnitynowej Mutant taki powinien by nie móc dalej katabolizowac L-karnityny, zsyntetyzowa- neJ z f -butyrobetainy lub krotonobetainy, a w idealnym przypadku powinien by zamiast tego wytracac L-karnityne, Hodowle HK 4 stabilnie mutagenizowano za pomoca "Acridin Mu- tagen ICR 191" w ilosci 5 ug na 1 ml, przepisowo w srodowisku bursztynianu (J, H. Mil¬ ler, Ecperiments In Molecular Genetics, Colg Spring Harbor Laboratory, 1972), po czym145 712 7 prowadzono wzrost komórek wzorcowo w "Nutrient Broth" az do ekspresji mutacji, a nas¬ tepnie przeprowadzono do srodowiska betainy. Wyrosnieta hodowle zaszczepiono srodowisko L-karnityny. Po kilku godzinach hodowla osiagnela logarytmiczny wzrost, «V tym momencie dodano penicyline G (15 mg/ml) i D-cykloseryne (0,5 mg/ml) (Ornston i wspólpracownicy, Biochim. Biophys. Res. Comraun. 36, 179 /l9C9/)# Te "kontrselekcjonujace" odczynniki za^- bily tylko bakterie rosnace. Mutanty, które juz dalej z L-karnityna nie mogly rosnac i byly interesujace dla dalszych badan, przezyly i przeto relatywnie nagromadzily sie. Po uplywie 30 godzin liczba komórek zywych cofnela sie do setnej czesci calosci, antybio¬ tyki wymyto, a hodowle przeprowadzono do srodowiska betainowego. Po wzroscie odpowied¬ nie rozcienczenie hodowli rozdzielono na zestalona pozywke agarowa. Tak odosobnione ko¬ mórki wyrosly w kolonie i byly osobno badane. Wybrano mutanty HK 13. Trwale nie mialy one juz dehydrogenazy karnitynowej i dlatego nie rosly juz z L-karnityna, $* -butyrobeta- ina lub korotonobetaina, ale dobrze rosly z betaina. W przypadku wzrostu na betainie, dwumetyloglicynie, cholinie, glutaminianie lub octanie szczep ten przeksztalcal krotono- betaine lub Jr* -butyrobetaine w L-karnityne i wytracal ja.Przyklad III. 5 litrów hodowli wstepnej w ciagu 32 godzin hodowano w wi- taminizowanym srodowisku mineralnym (Kulla i wspólpracownicy, Aren. Microbiol. 135, 1 /1983/), zawierajacym 1% wagowy betainy i 0,5% wagowego chlorku krotonobetainy, w tempe¬ raturze 30°C wobec odczynu o wartosci pH = 7f0. Szarza ta zaszczepiono 15 litrów hodo¬ wli o takim samym skladzie i w ciagu 24 godzin hodowano tak, jak hodowle wstepna (30°C, pH = 7f0, p02« 3 ppm). Gdy wytwarzanie doszlo do stanu bezruchu, odwirowano komórki, które mogly byc stosowane jako szczepionka dla nowej kapieli. Stezenie L-karnityny w odwirowanej cieczy (19t8 litra) zmierzono droga analizy enzymatycznej. Odwirowana ciecz zawierala 4,26 mg L-karnityny 1 ml. Odpowiadalo to wydajnosci 95,0%, liczac na wprowadzo¬ na ilosc chlorku krotonobetainy. Substancji wydzielonych i innych zanieczyszczen nie udalo sie stwierdzic w widmie-MRJ.Jak podano w publikacji (J. P. Vandecasteele, Appl. Emriron. Microbiol. 39f 327 /1980/), L-karnityna moglaby zostac wyodrebniona z odwirowanej cieczy za pomoca chroma¬ tografii kationitowej i oczyszczona za pomoca przekrystalizowania.Przykla^d IV. 5 litrów hodowli wstepnej w ciagu 32 godzin hodowano w wi- taminizowanym srodowisku mineralnym (wedlug przykladu I), zawierajacym 1% choliny i 0,6% chlorku Y -butyrobetainy, w temperaturze 30 C wobec odczynu o wartosci pH = 7,0.Ta hodowla wstepna zaszczepiono hodowle w 15 litrach srodowiska o takim samym skladzie i hodowano w takich samych warunkach jak w przykladzie I. Gdy wytwarzanie po uplywie okolo 30 godzin doszlo do stanu bezruchu, oddzielono komórki droga mikrofiltracji (Ami- con Hollow-fiber cartridge). Te mase komórkowa mozna byloby wykorzystac do dalszego wy¬ twarzania L-karnityny. Stezenie L-karnityny w przesaczu (19t6 litra) oznaczono enzyma¬ tycznie. Przesacz ten zawieral 5f3 mg L-karnityny na 1 ml. Odpowiadalo to analitycznej wydajnosci 97f6%, liczac na wprowadzona ilosc chlorku Jf -butyrobetainy. Zgodnie z ana¬ liza widmowa-MRJ w przesacz nie stwierdzono obecnosci zadnych substancji wydzielonych czy innych obcych organicznych produktów ubocznych. Stad tez mozna byloby z tego roz¬ tworu wyodrebniac L-karnityne np. za pomoca destylacji azeotropowej (opis patentowy Re¬ publiki Federalnej Niemiec DEPS nr 2300492).8 145 712 Przyklad V. Fermentor z wyposazeniem do prowadzenia hodowli ciaglej, za¬ wierajacy 1,5 litra witaminizowanego srodowiska mineralnego (wedlug przykladu I) wraz z 1,596 betainy i 1,0% chlorku jT-butyrobetainy, zaszczepiono za pomoca 150 ml hodowli wstepnej HK 13 w takim samym srodowisku. Po uplywie 20 godzin aerobowego hodowania w temperaturze 30°C wobec pH « 7,0 hodowla byla wyrosnieta i mozna bylo rozpoczac ruch ciagly za pomoca porcji 0,1 litra cieczy na 1 godzine. Odplywajacy z fermentora strumien roztworu hodowlanego odbierano w naczyniu ochlodzonym do temperatury 4°C. Komórki usuwa¬ no droga odwirowania. Zgodnie z analiza enzymatyczna ciecz odwirowana zawierala 8,8 g L-karnityny w 1 litrze hodowli. Odpowiadalo to stwierdzonej analitycznie wydajnosci 99,2%, liczac na wprowadzone stezenie chlorku f-butyrobetainy. Staly chlorek L-karnity¬ ny mozna byloby z tego roztworu wyodrebniac za pomoca chromatografii jonowej i oddziela¬ nia wody.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania L-karnityny na drodze mikrobiologicznej, znamienny t y m, ze nowy mikroorganizm, który z krotonobetainy i/lub Jr -butyrobetainy jest zdolny do wytwarzania L-karnityny, a nie jest zdolny do jej katabolizowania, korzystnie mikro¬ organizm HK 13 (DSM nr 2903), mikroorganizm HK 1331 b (DSM nr 3225), mikroorganizm HK 4 (DSM nr 2938) lub ich potomstwo i mutanty, poddaje sie hodowaniu z krotonobetaina i/lub jf-butyrobetaina w obecnosci substratu wzrostowego, a nagromadzona L-karnityne wyodreb¬ nia sie. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze krotonobetaine, *-bu- tyrobetaine lub ich mieszanine stosuje sie w ilosci 0,1-10% wagowych wzgledem pozywki hodowlanej. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat wzros¬ towy stosuje sie dwumetyloglicyne, choline, glutaminian, octan i/lub betaine. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze substraty wzrostowe stosuje sie w ilosci 0,1-10% wagowych wzgledem pozywki hodowlanej.Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 eg; Ona 400 zl PL PL PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania L-karnityny na drodze mikrobiologicznej, znamienny t y m, ze nowy mikroorganizm, który z krotonobetainy i/lub Jr -butyrobetainy jest zdolny do wytwarzania L-karnityny, a nie jest zdolny do jej katabolizowania, korzystnie mikro¬ organizm HK 13 (DSM nr 2903), mikroorganizm HK 1331 b (DSM nr 3225), mikroorganizm HK 4 (DSM nr 2938) lub ich potomstwo i mutanty, poddaje sie hodowaniu z krotonobetaina i/lub jf-butyrobetaina w obecnosci substratu wzrostowego, a nagromadzona L-karnityne wyodreb¬ nia sie.
2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze krotonobetaine, *-bu- tyrobetaine lub ich mieszanine stosuje sie w ilosci 0,1-10% wagowych wzgledem pozywki hodowlanej.
3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat wzros¬ towy stosuje sie dwumetyloglicyne, choline, glutaminian, octan i/lub betaine.
4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze substraty wzrostowe stosuje sie w ilosci 0,1-10% wagowych wzgledem pozywki hodowlanej. Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 eg; Ona 400 zl PL PL PL PL
PL1985252628A 1984-03-29 1985-03-28 Method of microbiologically obtaining l-carnitine PL145712B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH160084 1984-03-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL252628A1 PL252628A1 (en) 1986-02-25
PL145712B1 true PL145712B1 (en) 1988-10-31

Family

ID=4214209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1985252628A PL145712B1 (en) 1984-03-29 1985-03-28 Method of microbiologically obtaining l-carnitine

Country Status (25)

Country Link
US (1) US5187093A (pl)
EP (1) EP0158194B1 (pl)
JP (1) JPS60224488A (pl)
CN (1) CN1004146B (pl)
AT (1) ATE64154T1 (pl)
AU (1) AU585216B2 (pl)
BG (1) BG50282A3 (pl)
BR (1) BR8501374A (pl)
CA (1) CA1265757A (pl)
CS (1) CS273163B2 (pl)
DD (1) DD232310A5 (pl)
DE (1) DE3583058D1 (pl)
DK (1) DK165191C (pl)
ES (1) ES541663A0 (pl)
FI (1) FI86889C (pl)
HU (1) HU193744B (pl)
IE (1) IE58045B1 (pl)
IL (1) IL74552A (pl)
IN (1) IN164247B (pl)
NO (1) NO164918C (pl)
PL (1) PL145712B1 (pl)
RO (1) RO92477B (pl)
SU (1) SU1435159A3 (pl)
YU (1) YU45708B (pl)
ZA (1) ZA851959B (pl)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59183694A (ja) * 1983-04-05 1984-10-18 Hamari Yakuhin Kogyo Kk 光学活性なカルニチンの生化学的製造法
JPS59192095A (ja) * 1983-04-13 1984-10-31 Ajinomoto Co Inc L−カルニチンの製造法
DD221905B1 (de) * 1983-11-03 1987-03-18 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten
JPS62275689A (ja) * 1985-12-09 1987-11-30 Bio-Le Kk L−カルニチンの製造法
CA2021869C (en) * 1989-07-28 2000-09-05 Frans Hoeks Process for microbiological batch production of l-carnitine
DE4017595A1 (de) * 1990-05-31 1991-12-05 Consortium Elektrochem Ind Maltopentaose produzierende amylasen
DE4106375A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Degussa Eine l-carnitin-amidase produzierender mikroorganismus, l-carnitin-amidase, verfahren zu deren gewinnung und deren verwendung
CN1058995C (zh) * 1996-11-08 2000-11-29 江苏省微生物研究所 L-肉碱或其盐的制备方法
KR100255039B1 (ko) 1997-07-28 2000-05-01 박영구 L-카르니틴의제조방법
DE19749480A1 (de) * 1997-11-08 1999-05-20 Univ Leipzig Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain
ES2282399T3 (es) * 2001-01-31 2007-10-16 Lonza Ag Procedimiento microbiologico para la obtencion de l-carnitina.
US7700074B2 (en) * 2002-02-07 2010-04-20 Pettegrew Jay W Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism
US7407778B2 (en) 2002-02-07 2008-08-05 Pettegrew Jay W Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders
US20060257842A1 (en) * 2003-05-29 2006-11-16 Pettegrew Jay W Cryopreservation media and molecules
US7815894B2 (en) * 2003-05-29 2010-10-19 Jay W. Pettegrew Compounds, compositions and methods for medical imaging of neuropsychiatric disorders
KR101327700B1 (ko) * 2005-07-05 2013-11-11 론자 아게 건조 카르니틴 분말 또는 과립을 제조하는 분무-건조 방법

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2313573A (en) * 1938-01-17 1943-03-09 Gen Aniline & Film Corp Capillary active compounds and process of preparing them
US2367878A (en) * 1939-05-04 1945-01-23 Hoffmann La Roche Betaine esters
NL6511804A (pl) * 1964-11-30 1966-05-31
FR1559839A (pl) * 1968-01-30 1969-03-14
ES370147A1 (es) * 1968-08-29 1971-04-01 Gulf Research Development Co Un procedimiento para fabricar ciclopropilamina.
US3711549A (en) * 1970-05-19 1973-01-16 Gulf Research Development Co Process for manufacturing cyclopropylamine
US3796632A (en) * 1971-12-10 1974-03-12 Toray Industries Process for racemizing alpha-amino-epsilon-caprolactam
DE2751134C2 (de) * 1977-11-16 1986-04-17 Degussa Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von γ-Chlorcarbonsäureestern
IT1142201B (it) * 1980-06-24 1986-10-08 Sigma Tau Ind Farmaceuti Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina
DE3214953A1 (de) * 1982-04-22 1983-10-27 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide
JPS59192095A (ja) * 1983-04-13 1984-10-31 Ajinomoto Co Inc L−カルニチンの製造法
DD221905B1 (de) * 1983-11-03 1987-03-18 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten
CH664374A5 (de) * 1985-02-27 1988-02-29 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von l-carnitin auf mikrobiologischem weg.
IT1190280B (it) * 1986-04-24 1988-02-16 Sigma Tau Ind Farmaceuti Procedimento per la preparazione di gamma-butirrobetaina

Also Published As

Publication number Publication date
CS273163B2 (en) 1991-03-12
US5187093A (en) 1993-02-16
CN1004146B (zh) 1989-05-10
SU1435159A3 (ru) 1988-10-30
RO92477B (ro) 1987-10-01
AU4019285A (en) 1985-10-03
HUT37653A (en) 1986-01-23
EP0158194B1 (de) 1991-06-05
JPS60224488A (ja) 1985-11-08
HU193744B (en) 1987-11-30
ZA851959B (en) 1985-11-27
NO164918B (no) 1990-08-20
CA1265757A (en) 1990-02-13
IL74552A0 (en) 1985-06-30
FI850781A0 (fi) 1985-02-26
IL74552A (en) 1988-12-30
BG50282A3 (en) 1992-06-15
DK138085D0 (da) 1985-03-27
IE850533L (en) 1985-09-29
NO164918C (no) 1990-11-28
ES8602940A1 (es) 1985-12-01
RO92477A (ro) 1987-09-30
DK138085A (da) 1985-09-30
CN85101191A (zh) 1987-06-10
FI86889B (fi) 1992-07-15
CS222085A2 (en) 1990-07-12
FI850781L (fi) 1985-09-30
PL252628A1 (en) 1986-02-25
NO851261L (no) 1985-09-30
AU585216B2 (en) 1989-06-15
DK165191C (da) 1993-03-01
BR8501374A (pt) 1985-11-26
ATE64154T1 (de) 1991-06-15
DD232310A5 (de) 1986-01-22
IN164247B (pl) 1989-02-04
FI86889C (fi) 1992-10-26
IE58045B1 (en) 1993-06-16
YU50485A (en) 1987-12-31
EP0158194A2 (de) 1985-10-16
DE3583058D1 (de) 1991-07-11
ES541663A0 (es) 1985-12-01
DK165191B (da) 1992-10-19
YU45708B (sh) 1992-07-20
EP0158194A3 (en) 1987-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kinoshita et al. Utilization of a cyclic dimer and linear oligomers of ε-aminocaproic acid by achrornobacter guttatus KI 72
PL145712B1 (en) Method of microbiologically obtaining l-carnitine
BLECHER et al. The metabolism of caffeine by a Pseudomonas putida strain
IE860387L (en) L-carnitine
CA1337718C (en) Method of producing acid urease and the use of the urease
CZ279790B6 (cs) Mikrobiologický způsob výroby hydroxylovaných de rivátů pyrazinu
CA1219828A (en) Phenylalanine ammonia lyase-producing microbial cells
US4859592A (en) Production of picolinic acid and pyridine products via pseudomonas
EP0120208A2 (de) Mikrobiologisch hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung
US4654303A (en) Construction of novel mutant microorganisms
US4753882A (en) Urease and process for preparation thereof
Rode et al. Adaptation of Rhodopseudomonas sphaeroides to Growth on d-(—)-Tartrate and Large-Scale Production of a Constitutive d-(—)-Tartrate Dehydratase During Growth on dl-Malate
Kelly Fluoroacetate toxicity in Thiobacillus neapolitanus and its relevance to the problem of obligate chemoautotrophy
Rode et al. Ferrous-or cobalt ion-dependent D-(-)-tartrate dehydratase of pseudomonads: purification and properties
Wang et al. Isolation of a benzoate-utilizing Pseudomonas strain from soil and production of catechol from benzoate by transpositional mutants
US4673646A (en) Production of 2-hydroxymuconic semialdehyde
EP0268331B1 (en) Microbial preparation of catechols
US5496715A (en) Process for preparing indigo
US4666841A (en) Production of picolinic acid and pyridine products
JP2586283B2 (ja) 微生物学的手段によってl−カルニチンを製造する方法
US4617156A (en) 2-hydroxymuconic semialdehyde bisulfite adduct
US5266482A (en) Agrobacterium useful for the microbiological process for the production of hydroxylated pyrazine derivatives
Shiio et al. Genetically altered repression pattern of purine nucleotide synthesizing enzymes and inosine production in 8-azaguanine resistant mutants of Bacillus subtilis
CZ279298B6 (cs) Mikroorganismy Alcaligenes faecalis DSM 6335 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové
Furuyoshi et al. Occurrence of a new enzyme, meso-tartrate dehydratase of Pseudomonas putida