CZ279790B6

CZ279790B6 - Mikrobiologický způsob výroby hydroxylovaných de rivátů pyrazinu

Info

Publication number: CZ279790B6
Application number: CS913364A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Dr. Kiener; Klaus Heinzmann; Michael Dr. Bokel
Original assignee: Lonza A.G.
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-07
Publication date: 1995-06-14
Also published as: EP0484908A2; FI915231A7; JPH04365494A; US5173412A; FI915231A0; EP0484908A3; FI915231L; CS336491A3; SK278491B6; CA2055125A1

Abstract

Jsou popsány mikroorganismy, které jsou schopné růst s pyrazinem jako jediným zdrojem uhlíku, dusíku a energie. Tyto mikroorganismy hydroxylují deriváty pyrazinu obecného vzorce I za vzniku hydroxylovaných derivátů pyrazinu obecného vzorce II. Vzniklé produkty se akumulují v růstovém mediu.ŕ

Description

Vynález se týká nových mikroorganismů, které rostou s pyrazinem a hydroxylují deriváty pyrazinu obecného vzorce I

R.

(1)

Ν' kde R-^ znamená atom vodíku nebo atom halogenu a R₂ a R₃ jsou shodné nebo rozdílné skupiny a znamenají atom vodíku nebo C^-C^j-alkylovou skupinu, avšak R^, R₂ a R₃ neznamenají současně atom vodíku. Vynález se dále týká způsobu výroby hydroxylovaných derivátů pyrazinu.

Dosavadní stav techniky

Hydroxylované deriváty pyrazinu jsou například důležitými meziprodukty při výrobě methoxyalkylpyrazinů. Methoxyalkylpyraziny jsou základní složkou aromatických látek (Maga a Sizer, J. Agric. Food Chem., 21, 1973, str. 22 až 30).

Dosud jsou známé pouze chemické způsoby výroby hydroxylovaných pyrazinů, jako například způsob popsaný Karmasem a Spoerrim v J. Amer. Chem. Soc., 74, 1952, str. 1580 až 1584. Podle tohoto způsobu se syntetizuje například 2-hydroxy-5-methylpyrazin, vychází se z methylglyoxalu a glycinamidhydrochloridu. Nevýhodou tohoto způsobu je však to, že je produkt silně znečištěn.

Dále jsou popsány výzkumy, které se týkají biologického odbouráni 2-hydroxypyrazinu v Matley a Harle, Biochem. Soc. Trans, 4, 1976, str. 492 až 493.

Není znám biotechnologický způsob výroby polohově specificky hydroxylovaných derivátů pyrazinů, kdy se vychází ze substituovaných derivátů pyrazinu a mikroorganismů, které rostou s pyrazinem.

Podstata vynálezu

Úlohou předloženého vynálezu je nalézt nové mikroorganismy, které ekonomicky a. jednoduše polohově specificky hydroxylují deriváty pyrazinu biotechnologickým způsobem, přičemž deriváty pyrazinu jsou představovány obecným vzorcem I. Další úlohou vynálezu je nalézt biotechnologický způsob výroby hydroxylovaných derivátů pyrazinu.

Úloha je řešena pomocí mikroorganismů podle patentového nároku 1 a pomocí způsobu výroby hydroxylovaných derivátů pyrazi

-1CZ 279790 B6 nu podle patentového nároku 3. Tyto mikroorganismy jsou schopné růst s pyrazinem jako jediným zdrojem uhlíku, dusíku a energie. Tyto mikroorganismy přeměňují jako substrát deriváty pyrazinu obecného vzorce I (I) kde Rj znamená atom vodíku nebo atom halogenu a R₂ a R₃ jsou shodné nebo rozdílné skupiny a znamenají atom vodíku nebo C^-C^-alkylovou skupinu, avšak R₃, R₂ a R₃ neznamenají současně atom vodíku, na hydroxylovaný derivát pyrazinu obecného vzorce II

(Π) kde R_lř R₂ a R₃ mají shora uvedený význam, přičemž se vzniklé sloučeniny akumulují v růstovém médiu.

Podle vynálezu přicházejí v úvahu všechny mikroorganismy, které využívají pyrazin jako jediný zdroj uhlíku, dusíku a energie a které se běžnými mikrobiologickými technikami oddělují například z prsti, půdních vzorků, čisticích zařízení, mravenišť a kompostů.

Vhodně lze použít všechny gram-positivní a gram-negativní mikroorganismy, které odbourávají pyrazin a které hydroxylují jako substrát derivát pyrazinu obecného vzorce I za vzniku hydroxylovaného derivátu pyrazinu obecného vzorce II a ten akumulují v růstovém médiu.

Výhodným mikroorganismem je Agrobacterium radiobacter DRS 3 s č. DSM 6136, který je dále na základě podrobných identifikačních dat označován jako mikroorganismus Agrobacterium sp. č. DSM 6136. Tento mikroorganismus byl uložen 7. 9. 1990 u Německé sbírky mikroorganismů (DSM) a buněčných kultur GmbH, Mascherodeweg lb, 3300 Braunschweig/NSR.

Vědecký popis Agrobacterium sp. (č. DSM 6136)

buněčná forma	tyčinky	ADH	-
šířka· μιη	0,6 až 0,8
délka μττ. .	1,5 až 3,0	LDC	-
pohyblivost	+	ODC	-
gram-reakce	-	ONPG	+
lyže 3% KOH	+
aminopeptidáza (Cerny)	+	VP	-
spory	-	indol	-
oxidáza	+	no₂ z no₃	+

-2CZ 279790 B6

kataláza	W	dentifrikace	+
růst		fenylalanindesamináza
anaerobní	-
37/41 ’C	-/-	lecitináza	-
pH 5,6	-
Mac-Conkey-agar	+	ureáza	+
SS-agar	-
cetrimid-agar	-	Simmon-citrát	-
2% NaCl		malonát	,
pigmenty	-
nedifunduj ící	-	ketolaktóza	-
difundující	-
fluoreskuj ící	-	hydrolýza
pyokyanin	-	škrobu	-
		želatiny	-
kyselina z (OF-test)		kaseinu	-
glukózy aerobně	-	DNA	-
glukózy anaerobně	-	tween 80	-
		eskulinu	+
plyn z glukózy		odbourání tyrosinu
kyselina z (ASS)
glukózy	+	alkalizace
fruktózy	+	lakmusového mléka	+
xylózy	+
ethanolu	+	potřeba růstové	-
m-erythritolu	+	látky
melecitózy	-	využití substrátu
arabinózy	+	acetát	+
sacharózy	+	adipát	-
celobiózy	+	kaprát	-
trehalózy	+	citrát	-
rhamnózy	+	glykolát	+
dulcitu	-	laktát	+
sorbitu	+-	levulinát	-
glycerolu	+	malát	+
malonátu	-
fenylacetátu	-
suberátu	-
sebakinátu	-
m-tartrátu	-
L-arabinózy	+
fruktózy	+
glukózy	+
mannózy	+
maltózy	-U
xylózy	+
fukózy	-
mannitu	+
2-ketoglukonátu	-
N-acetylglukosaminu	+
L-asparátu	+
L-serinu	+
L-glutamátu	4.
L-histidinu	-

-3CZ 279790 B6 hydroxybutyrátu betainu + methylaminu methanolu ethanolu hlavní chinonové složky: ubichinon 10

Při způsobu výroby hydroxylovaných derivátů pyrazinů se pomocí mikroorganismů převede derivát pyrazinů obecného vzorce I

R₂x^n _Ri (i) kde R^ znamená atom vodíku nebo atom halogenu a R₂ a R₃ jsou shodné nebo rozdílné skupiny a znamenají atom vodíku nebo C-^-C^-alkylovou skupinu, avšak Rj, R₂ a R₃ neznamenají současně atom vodíku, na hydroxylovaný derivát pyrazinů obecného vzorce II

kde R-[_, R₂ a R₃ mají shora uvedený význam. Obohacený produkt se isoluje.

Výhodně se pomocí uvedených mikroorganismů vyrábějí hydroxylované deriváty pyrazinů, kde R-j_ znamená atom vodíku nebo atom chloru a R₂ a R₃ jsou stejné nebo rozdílné skupiny a znamenají atom vodíku, methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu, avšak R_lř R₂ a R₃ neznamenají současně atom vodíku.

Takto se pomocí uvedených mikroorganismů vyrobí nový hydroxylovaný derivát pyrazinů, 6-ethyl-2-hydroxypyrazin.

Obvykle se mikroorganismy před vlastním postupem (reakcí substrátu) kultivují v médiu, které obsahuje růstový substrát.

Růstový substrát pyrazin se používá v množství od 0,001 až 10 % hmot. vztaženo na kultivační médium, výhodně v množství od 0,001 až 5 % hmot, vztaženo na kultivační médium.

Enzymy mikroorganismu, které odpovídají za hydroxylaci, jsou vhodně indukovány pyrazinem.

Sloučenina použitá k indukci může být buď přítomná během reakce-derivátu pyrazinů (substrátu), nebo se zamezí přívod této sloučeniny během reakce. Výhodně se zamezí přívod sloučeniny používané k indukci během reakce derivátu pyrazinů buď ukončením přívodu, nebo odstředěním buněk.

-4CZ 279790 B6

Před přidáním substrátu se kultivují buňky až do optické hustoty 100 při 650 nm, výhodně až do optické hustoty od 10 do 60 při 650 nm.

Jako živné médium pro mikroorganismy lze jak pro kultivaci, tak také pro vlastní způsob použít v oboru běžně užívaná média. Výhodně se používá médium, jehož složení je uvedeno v tabulce 1. Vlastní postup potom obvykle probíhá s buňkami v klidu.

Derivát pyrazinu obecného vzorce I se jako substrát může přidávat k buněčné suspenzi jednorázově nebo kontinuálně, s výhodou tak, že koncentrace substrátu v kultivačním médiu nepřesáhne 20 % (hmot./obj.), přičemž zkratka (hmot./obj.) znamená hmotnost na objem. Zvláště výhodně nepřesáhne-li koncentrace substrátu v kultivačním médiu 5 % (hmot./obj.).

Reakce se účelně provádí v rozmezí pH od 4 do 10, výhodně od 6 do 8.

Obvykle se reakce provádí při teplotě od 0 do 55 °C, výhodně při 20 až 40 °C.

Po reakci trvající obvykle 5 až 100 hodin, se izolují hydroxylované deriváty pyrazinu známým způsobem, například extrakcí vhodným organickým rozpouštědlem. Účelně se hydroxylované deriváty pyrazinu izolují extrakcí chlorovanými organickými rozpouštědly, jako jsou například chlorované uhlovodíky nebo ethylacetát.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Izolace mikroorganismů metabolizujících pyrazin

Aerobní mikroorganismy metabolizující pyrazin se koncentrují v A+N-médiu (Tabulka 1) s přídavkem 0,1 % hmot./obj. pyrazinu jako jediného zdroje uhlíku, dusíku a energie. Obecné postupy pro izolaci mikroorganismů jsou například popsány v G. Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 4. vydání, Springer Verlag, 1983.

Jako inokulum se použijí vzorky z prsti, čisticích zařízení, kompostu a mravenišť. Koncentráty se pěstují v třepacích baňkách při 30 ’C. Po trojnásobném přeočkování do čerstvého média se koncentráty rozetřou na stejné médium s přídavkem 16 g agaru na litr a inkubují se při 30 ’C. Po několikanásobném rozetření na agarové médium lze izolovat čisté kultury.

-5CZ 279790 B6

Tabulka 1: A+N-medium

Složení (nh₄)₂so₄

Na₂HP0₄kh₂po₄NaCl

MgCl₂.6H₂O

CaCl₂.2H₂O

FeCl₃.6H₂O pyridoxalhydrochlorid riboflavin amid kyseliny nikotinové thiaminhydrochlorid biotin kyselina pantothenová p-aminobenzoát kyselina listová vitamín B12

ZnSO₄.7H₂O

MnCl₂.4H₂O h₃bo₃

CoC1₂.6H₂O

CuC1₂.2H₂O

NíC1₂.6H₂O

Na₂Mo0₄.2H₂O

EDTANa₂.2H₂O

FeSO₄.7H₂O

Koncentrace (mg/1)

000

400

14,5

0,8 10.10^-35-10³5'10^-32’10”³2’10^-35'10^-35’10^-32’10^-35Ί0³

100.10³90-10³300-10“³200-10³ío-io^-320’10³30-10^-35Ί0“³2-10“³ (pH roztoku se nastaví na hodnotu 7,0)

Příklad 2

Přeměna 3-chlorpyrazinu na 3-chlor-2-hydroxypyrazin

Agrobacterium sp. (DSM-č. 6136). v A+N-médiu s 0,1 % hmot./obj'. pyrazinem se pěstuje ve fermentátoru při hodnotě pH 7 a při teplotě 30 ’C. Potom se buňky odstředí, resuspendují opět v A+N-médiu a nastaví se optická hustota 10 při 650 nm. Tato buněčná suspenze se dá do třepací baňky a smísí se s 26 mmol

3-chlorpyrazinu na litr (0,3 % hmot./obj.). Po inkubaci při 30 °C po dobu 8 hodin na třepacím zařízení se prokáže 20 mmol

3-chlor-2-hydroxypyrazinu na litr, což odpovídá 77 % výtěžku.

-6CZ 279790 B6

Příklady 3 až 5 se provádějí podle příkladu 2 a jsou shrnuté uvedeny v tabulce 2.

Poloha hydroxylové skupiny se určí podle Mac Donalda JC, Bishopa GG, Mazureka (1976), Tetrahedron 32, str. 655a d.a jejich údajů.

Tabulka 2

Příklad	Substrát	Koncentrace heterocyklů v médiu 1 (hmot/obj)	Reakční doba (h)	Konečný produkt	Výtěžek (¾)
3	2-methylpyrazin	0,2	1	2-hydroxy-6methylpyrazin	50
4	2-ethylpyrazin	0,2	24	6-ethyl-2-hydroxypyrazin	20
•5	2,3-dimetyl- pyrazin	0,2	10	2-hydroxy-5,6dimethylpyrazin	20

Průmyslová využitelnost

Mikroorganismy lze použít všude tam, kde je zapotřebí vyrobit hydroxylované deriváty pyrazinu. Hydroxylované deriváty pyrazinu jsou například důležitými meziprodukty při výrobě methoxyalkylpyrazinů. Methoxyalkylpyraziny jsou základní složkou aromatických látek.

Claims

1. Mikroorganismus Aqrobacterium sp. DSM 6136, který je schopný růst s pyrazinem jako jediným zdrojem uhlíku, dusíku a energie, a jako substrát přeměňovat deriváty pyrazinu obecného vzorce I

R.

(I) kde R^ znamená atom vodíku nebo atom halogenu a R₂ a R₃ jsou shodné nebo rozdílné a znamenají atom vodíku nebo C^-C^-alkylovou skupinu, avšak Rj, R₂ a R₃ neznamenají současně atom vodíku, na hydroxylovaný derivát pyrazinu obecného vzorce II

R.

(II) kde R_lz R₂ a R₃ mají shora uvedený význam, přičemž se vzniklá sloučenina akumuluje v růstovém médiu.

2. Způsob mikrobiologické výroby hydroxylovaných derivátů pyrazinu, vyznačující se tím, že se mikroorganismem rodu Aqrobacterium, který je schopný růst s pyrazinem jako jediným zdrojem uhlíku, dusíku a energie, převádí jako substrát derivát pyrazinu obecného vzorce I kde R-^ znamená atom vodíku nebo atom halogenu a R₂ a R₃ jsou shodné nebo rozdílné a znamenají atom vodíku nebo C₁-C₄~alkylovou skupinu, avšak R^, R₂ a R₃ neznamenají současně atom vodíku, na hydroxylovaný derivát pyrazinu obecného vzorce II (Π)

-8CZ 279790 B6 kde R₃, R₂ a R₃ mají shora uvedený význam, a že se obohacený produkt izoluje.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se reakce provádí pomocí mikroorganismu Aqrobacterium sp. uloženého u DSM pod číslem 6136 a/nebo pomocí jeho spontánních mutantů.

4. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se účinné hydroxylující enzymy mikroorganismu indukují pyrazinem.

5. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že se reakce provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidání substrátu tak, že koncentrace substrátu v kultivačním mediu nepřesáhne 20 % hmot./objem.

6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že se reakce provádí při hodnotě pH od 4 do 10.

7. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 2 až 6, vyznačující se tím, že se reakce provádí při teplotách od 0 do 55 °C. .

8. 6-ethyl-2-hydroxypyrazin.