CN1058995C

CN1058995C - L-肉碱或其盐的制备方法

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Publication number: CN1058995C
Application number: CN96117166A
Authority: CN
Inventors: 孙志浩; 郑璞; 王蕾; 金梅
Original assignee: Jiangsu Institute of Microbiology
Current assignee: Jiangsu Institute of Microbiology
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 2000-11-29
Anticipated expiration: 2016-11-08
Also published as: CN1162018A

Abstract

本发明涉及酶转化生产L-肉碱的方法。其特征是以大肠杆菌为出发株，经紫外线、Co-60诱变，得到不同化L-肉碱的产酶菌株(CGMCC 0276)，经诱导培养，离心收集菌体，以菌体游离细胞或固定化细胞为酶源，以巴豆甜菜碱为底物，酶转化生产L-肉碱。本发明克服或改善了动物组织提取法、化学合成拆分法、微生物直接发酵法制备L-肉碱工艺的缺陷，国外酶法制备L-肉碱工艺其菌体只能进行一次酶转化而与其相比，本发明的菌体游离细胞或固定化细胞可多次反复使用进行酶转化反应，且采用较为廉价的巴豆甜菜碱为原料，简化酶转化工艺，降低了原料成本。

Description

L-肉碱或其盐的制备方法

本发明涉及以巴豆甜菜碱((CH₃)₃NCH₂CH＝CHCOOH)为底物，用大肠杆菌产酶菌株(CGMCC 0276)酶转化生产L-肉碱((CH₃)₃NCH₂CH(OH)CH₂COOH，L-β-羟基-γ-三甲胺丁酸)的方法。

L-肉碱(carnitine)又称维生素B₁是动物体内与脂肪代谢有密切关系的物质。主要生理功能是将长链脂肪酸从线粒体膜外输送到膜内，促进脂肪酸的β-氧化，又将短链脂酰基从线粒体膜内运送到膜外，调节体内酰基比率。临床上可作为药物，主要用于治疗心力衰竭、缺血性心脏病、心律失常、降低血脂、肉碱缺乏综合症、肥胖症。它也是一种重要的机能性食品添加剂，用于婴儿、体弱多病者、素食者和运动员的强化营养。另外，作为饲料添加剂也得到广泛应用。

L-肉碱的制造方法有如下几种：

1、从动物肌体中提取的方法。此法成本高、收率低，一般不采用此法。

2、用化学合成拆分的方法。此法步骤多，收率低，因而成本高，且对环境有严重污染。

3、微生物的发酵方法。

4、酶前体转化方法。有用β-脱氢肉碱(β-Dehydrocarnitine)、γ-丁基甜菜碱(γ-Butyrobetaine)和巴豆甜菜碱(Crotonobetaine)为前体的酶转化法。

美国专利4371618，使γ-丁基甜菜碱转化为L-肉碱，该法的缺点是酶反应需要很多辅助因素，且原料γ-丁基甜菜碱的制备成本高；美国专利4221869，使β-脱氢肉碱转化为L-肉碱，该法的缺点是原料β-脱氢肉碱不稳定，辅酶NADH价格昂贵；欧洲专利0320460，采用从肠杆菌(Enterobacteriaceae)中分离提纯的L-肉碱水解酶，在F因子的参与下，将巴豆甜菜碱转化为L-肉碱，该法的缺点是分离提取的酶不稳定，又受不可知因子F因子的活化；日本专利特开昭61-271995采用各种属的微生物菌体，转化巴豆甜菜碱为L-肉碱，该法的缺点是培养的菌体只进行一次酶转化反应，菌体利用率低。

本发明的目的是提供一种工艺简单的酶转化巴豆甜菜碱生成L-肉碱的方法。产酶菌体可多次反复使用进行酶转化反应。

本发明通过下列方案来实现：

(1)以大肠杆菌(Escherichia Coli为出发株，经紫外线，Co-60诱变处理细胞，得到不同化L-肉碱的L-肉碱水解酶产酶菌株(已贮藏在中国北京中关村、中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，CGMCC 0276)。

(2)该菌株经斜面活化，有氧或厌氧诱导培养后，离心收集菌体(游离细胞)以作为粗酶，或进一步处理成固定化细胞。

(3)将菌体游离细胞或固定化细胞作为酶源，以巴豆甜菜碱溶液为底物，进行酶转化反应，酶转化生成L-肉碱。

(4)从溶液中提取产物L-肉碱内酯或盐。

菌种及其诱变：

从食品工业生产中收集不同种类的20多株细菌，如Proleus，PseudpamonasEscherichia，Corynebacterium，Bacillus等，从中经筛选，其中以EscherichiaColi 12E为产L-肉碱水解酶菌株中产酶能力最强，150g/L巴豆甜菜碱最大可转化积累L-肉碱4.9g/L

选择E.Coli12E为亲株，按常规方法进行紫外线，Co-60诱变处理。紫外线照射为15W，距离27cm，时间0.5-3.0分钟；Co-60照射为剂量2-5万仑琴，时间20-30分钟。经处理的细胞移种到含L-肉碱的基本培养基和完全培养基上，20-40℃培养2天，检出在含L-肉碱基本培养基上不长，在完全培养基上生长的菌落。

含L-肉碱的基本培养基包含Na₂SO₄、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、MgCl₂、CaCl₂FeCl₃、维生素、微量元素溶液和琼脂诸组分。

经诱变获得的菌株，得到的变异株，称为E.ColiCo-17菌株，即CGMCC 0276。该株与亲株相比，外观形态基本一致，但在含L-肉碱基本培养基上不生长，不分解代谢L-肉碱，并且其酶转化生成L-肉碱的能力比亲株提高了20％。这种菌种以保存号CGMCC 0276保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心。

产酶菌体的培养：

斜面活化：配制含蛋白胨0.5-1.0％、牛肉膏0.5-1.0％、葡萄糖0.5-1.0％、氯化钠0.4-1.0％、琼脂2.0-2.5％、PH6.0-7.5的培养基。各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，下同。灭菌后接种，20-40℃，培养10-40小时。

产酶培养：配制含蛋白胨0.5-1.0％、酵母膏0.1-1.0％、富马酸钠0-2.0％、磷酸氢二钠0-0.8％、磷酸二氢钾0-0.5％、硫酸铵0-1.2％、碳酸钙0-5％、柠檬酸氢二铵0-0.5％、硫酸镁0.05-0.1％、硫酸亚铁0-0.001％、巴豆甜菜碱0-3％、PH4.5-7.5的培养基。灭菌后接种。培养时，500ml三角瓶装50-300ml培养基，接种1-4环菌体，20-40℃，120-150rpm转速振荡有氧培养，或20-40℃，40-60小时静止厌氧培养。诱导物为巴豆甜菜碱。也可将γ-丁基甜菜碱或DL-肉碱作为诱导物。

酶转化反应：

培养后的菌体，离心收集。固含量约为10％的湿菌体，与30-35ml0.3-2.5％浓度的巴豆甜菜碱溶液混合，置于Ф25×200容器中，30-40℃静止反应2-24小时，离心后，取上清液提取L-肉碱，菌泥可反复进行多次酶转化反应。

或者，离心收集的菌体制成40-50％的菌悬液，与4-6％1.5倍量卡拉胶溶液在35-60℃下混匀，冷却后加0.2-0.4％KCl溶液硬化3-5小时，即制备所谓该菌体的固定化细胞。然后加入浓度1.0-10.0％等量的巴豆甜菜减溶液，在30-45℃，PH5-8下进行反应2-24小时，过滤后，滤液用于提取L-肉碱，固定化细胞可反复回用，进行多次酶转化反应。

L-肉碱的提取：

酶转化反应的清液加1.0-2.0％的活性碳脱色，加热后膜分离去蛋白，滤液通过阴离子交换柱，加亚硫酸盐去除巴豆甜菜碱，稀释后，上阳柱层析。层析液真空浓缩，加异丁醇共沸回流，蒸发回收异丁醇，真空蒸发烘干得到粗品。再加异丁醇重结晶，并加活性碳脱色，趁热滤去碳，并蒸发回收异丁醇，抽滤，真空干燥得到精品L-肉碱内酯。也可处理成L-肉碱盐酸盐或酒石酸盐。

本发明的工艺流程示意图见附图。

本发明克服了微生物直接发酵生成L-肉碱水平低和动物组织提取法制备L-肉碱提取收率低、组分分离困难的缺点，对化学合成拆分法制备L

肉碱步骤繁多，环境污染的问题有所改善。本发明的优点是：国外酶法制备L-肉碱工艺，其菌体只能进行一次酶转化，而与其相比，本发明的菌体游离细胞或固定化细胞可多次反复使用进行酶转化反应，且采用较为廉价的巴豆甜菜碱为原料，简化酶转化工艺，降低了原料成本。

下面的实施例对本发明作详细说明。

实施例1

斜面培养基：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，葡萄糖1.0％、琼脂2.0％、PH7.0定100ml灭菌。

摇瓶(产酶)培养基：富马酸钠1.0％、蛋白胨1.0％、酵母膏1.0％，硫酸铵0.2％，磷酸氢二钠0.3％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，碳酸钙4.0％，巴豆甜菜碱0.1％，PH7.0，500ml三角瓶装液75ml，灭菌。

从E.Coli Co-17菌株活化斜面上取一环接种到500ml三角瓶中产酶培养基上，30℃，150rpm培养24小时。离心收集湿菌体作为粗酶，75ml培养基液体产3.7g湿菌泥，将其加入33ml1.5％浓度的巴豆甜菜碱溶液，于37℃，22-70小时进行酶转化，每次离心分离，清液测定和提取湿菌泥加底物反复转化，其结果如下：

表1 E.ColiCo-17菌株反复分批转化

转化次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
转化次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	转化时间(小时)	22	22	70	22	22	22	22	70	23	23
L-肉碱(g/L)	3.6	6.0	4.7	3.7	5.0	5.1	4.2	5.0	3.7	2.5	转化时间(小时)	22	22	70	22	22	22	22	70	23	23

注：由于隔日操作，转化时间为22小时，隔双休日操作，转化时间为70小时。

实施例2

斜面培养：同实施例1。

摇瓶培养基：蛋白胨0.5％、柠檬酸氢二铵0.4％、磷酸二氢钾0.3％、酵母膏0.05％、巴豆甜菜碱3％、硫酸镁0.05％、PH7.0、容器500ml三角瓶、每瓶装液300ml。

从E.Coli Co-17活化斜面上接4杯菌体于500ml三角瓶中摇瓶培养基上，30℃，厌氧静止培养46小时，离心收集湿菌泥2.48g，作为粗酶，加入例1相同量的底物，厌氧条件下反复分批酶转化，其结果如下：

表2 厌氧条件的产酶的反复分批转化

转化次数	1	2	3	4	5	6	7
转化次数	1	2	3	4	5	6	7	L-肉碱(gl)	3.6	3.0	5.8	6.3	7.1	5.7	4.2

实施例3

按实施例1的方法制得湿菌体8.89g，加10ml生理盐水制成菌悬液，37℃保温称1.6g卡拉胶加30ml生理盐水，加热溶解后，冷却到55℃保温。两者在52℃混匀，倒入平皿，冷却，加KCl溶液，放冰箱中硬化3小时，称重得35g固定化细胞，加入35ml1.5％浓度的底物溶液，37℃转化20小时，得2.5g/L L-肉碱。

实施例4

按实施例3的方法制得固定化细胞20g，按例3方法加入20ml 1.5％浓度的底物溶液，37℃，20小时反复分批转化，其结果如下：

表3 固定化细胞反复分批转化

转化次数	1	2	3	4	5	6	7
转化次数	1	2	3	4	5	6	7	L-肉碱(g/L)	2.8	2.1	2.6	4.1	3.9	4.0	3.0

实施例5

酶转化清液750ml，含L-肉碱3.1g/L，通过阴离子交换树脂(717OH^-型)，加亚硫酸氢氨溶液去除未反应的巴豆甜菜碱，反应后稀释，流入阳离子交换树脂(732 H⁺型)，用1N氨水洗脱，收集洗脱液真空浓缩，加异丁醇，共沸回流2小时，蒸去异丁醇、得L-肉碱粗品2.40g，含量69％，收率85％，将粗品用异丁醇重结晶3次，得到含量99％的白色L-肉碱内酯结晶1.01g，总收率52％，经红外光谱检测与标准品吻合。

Claims

1.一种制造L-肉碱或其盐的方法，包括：

(1)大肠杆菌(Escherichia Coli)SW-Co 17CGMCC No 0276菌株经斜面活化，有氧或厌氧诱导培养后离心收集菌体游离细胞，或进一步处理成固定化细胞；

(2)以菌体游离细胞或固定化细胞作为酶源，以巴豆甜菜碱溶液为底物，进行酶转化反应，酶转化生成L-肉碱；

(3)纯化和提取L-肉碱或进一步将L-肉碱转化成L-肉碱的盐。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于在将所述菌株进行有氧或厌氧诱导培养的过程中，摇瓶培养基的组成按各组分含量均为重量/体积百分比，即g/100ml为：蛋白胨0.5-1.0％、酵母膏0.05-1.0％，富马酸钠0-2.0％、磷酸氢二钠0-0.8％、磷酸二氢钾0-0.5％、硫酸铵0-1.2％、碳酸钙0-5％、柠檬酸氢二铵0-0.5％、硫酸镁0.05-0.1％、硫酸亚铁0-0.001％、巴豆甜菜碱为0.1或3％、PH4.5-7.5的培养基，灭菌后接种，培养时，500ml三角瓶装50-300ml培养基，接种1-4环菌体，在20-40℃、120-150rpm转速下振荡有氧培养，或在20-40℃下静止厌氧培养40-60小时。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于在所述菌体的固定化细胞处理的过程中，向所述的菌体游离细胞中加入生理盐水制成40-50％的菌悬液，与4-6％1.5倍量的卡拉胶溶液在35-60℃下混匀，冷却后加0.2-0.4％KCl溶液硬化3-5小时，即制得所谓该菌体的固定化细胞。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于在以菌体游离细胞为粗酶的酶转化反应中，所述的菌体游离细胞按固含量约为10％，并以浓度为0.3-2.5％、30-35ml的巴豆甜菜碱溶液为底物，两者混合后于30-40℃静止反应2-24小时，离心后，取清液提取L-肉碱，菌泥可反复进行多次酶转化反应。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于在以巴豆甜菜碱溶液为底物、以所述菌体固定化细胞为酶源的酶转化反应中，以所述的菌体固定化细胞和等量的浓度为1.0-10.0％的巴豆甜菜碱溶液混合，于30-45℃、PH5-8下静止反应2-24小时，过滤后取滤液提取L-肉碱，固定化细胞可反复进行多次酶转化反应。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的纯化和提取L-肉碱或其盐的过程中，酶转化反应所得的清液加1.0-2.0％的活性碳脱色，加热后膜分离去蛋白，滤液通过阴离子交换柱，加亚硫酸盐去除巴豆甜菜碱，稀释后，上阳柱层析，层析液真空浓缩，加异丁醇共沸回流，蒸发回收异丁醇，真空蒸发烘干得粗品，再加异丁醇重结晶，并加活性碳脱色，趁热滤去碳，蒸发回收异丁醇，抽滤，真空干燥得到纯品L-肉碱，或进一步转化成L-肉碱的盐。