JPH01108988A - 焦性ぶどう酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵法による焦性ぶどう酸又はその塩の製法
に関する。

焦性ぶどう酸は化学合成、例えば医薬、植物保護剤、重
合体又は食品保讃剤の製造における価値の高い中間体で
ある。その工業的製造のためには数多くの試みがなされ
ている。焦性ぶどう酸はすべての微生物における物質代
謝の中心的代謝物質であるから、その関心が第一に酵素
法及び発酵法に向けられたのは当然である。

報告された生物工学的方法の多くは、適当な炭素源を焦
性ぶどう酸に変えることを目的としている。種々の微生
物が焦性ぶどう酸を生成しうろことは古くから公知であ
る。ビクエーら（ケミカル・アブストラクツ５８巻１４
４６３８１９６３年）は、焦性ぶどう酸が種々の力ンジ
属の声菌株を用いて示している（ケミカル・アブストラ
クツ（Ｃ，Ａ、）６２巻６８３２ａ１９６５年）。アセ
トバクター・サブオキシダンスに属する菌株を使用して
、Ｄ−グルコースかう焦性ぶどう酸を直接に製造するこ
とは同書６３巻１２２８５ｂ１９６５年に、ムコール属
の真菌を使用して、グルコースからこれを製造すること
はＪ、　Ｅｘｐｔｌ、Ｂｏｔａｎｙ　１６巻４８７頁１
９６５年に記載されている。種々のミコバクテリウム菌
を使用して、パラフィンを焦性ぶどう酸及び２−オキソ
グルタル酸に変えることはＣ，Ａ、　６４巻１６３１２
ｂ１９６６年に、コリネバクテリラム菌を使用するＤ−
グルコン酸からの焦性ぶどう酸の製造は、Ｃ，Ａ、　７
０巻８６２７５ｗ１９６９年に記載されている。ノカル
デイア・アセトバクター、ブレビバクテリウム、コリネ
バクテリウム、ミコバクテリウム又はカンジダに属する
種々の菌株による短鎖脂肪酸の焦性ぶどう酸への変換は
、Ｃ，Ａ、　８２巻１２５５０５ｄ１９７５年に記載さ
れ、同じ菌株による短鎖脂肪゛　　酸アミドの変換は、
Ｃ，Ａ、　８２巻１５５７５７ｐ１９７５年に示されて
いる。ノヵルジア・フミフエラ又はプソイドモナス・タ
バチによるＤ−グルコン酸からの焦性ぶどう酸の製法は
、Ｃ，Ａ。

８３巻２０４８１５ｔ１９７５年に、カンジダ・リボリ
テイカのチアミン及びＬ−メチオニン要求変異株による
Ｄ−グルコースからの焦性ぶどう酸の製法は、Ｃ，Ａ、
　８４巻１７８．２１２　ｔｌ　９７６年に記載されて
いる。キサントモナス・カムペストリスの菌株によるグ
リセリンからの焦性ぶどう酸の製法は、ＤＤｔ５５２１
Ｍ（１９７９）Ｋ示されている。デバリオミセス・クー
ゾルティの菌によるカンキツ果実皮からの焦性ぶどう酸
の製造は、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　４
６巻９５５頁（１９８２）に、バシデイオミセテス・シ
ゾフイルムによるＤ−グルコースからの焦性ぶど５酸の
生成は、Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　
６０巻２７７頁（１９８２）に報告されている。アガリ
クス・カムペストリスによるＤ−グルコースからの焦性
ぶどう酸の製法は、Ｃ０Ａ、９８巻１５４９８ｒ（１９
８３）に記載されている。１，２−プロパンジオールを
焦性ぶどう酸に変換するアシネトバクタ−菌は、Ａｇｒ
ｉｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

４６巻２６５６頁（１９８２）に報告されている。プソ
イドモナス・プチダによる酒石酸のピ塩 ルピン酸、への変換は、Ｃ，Ａ、１０４巻２０５５６８
ｄ（１９８６）に記載されている。

これらすべての微生物は公けに入手できないか、あるい
は工業的生産のために不適当なものである。なぜ°なら
ば焦性ぶどう酸は他の酸と共に低濃度で又は低収率で生
成し、経済的な製造が困難だからである。

微生物によりラセミ体乳酸を酸化して焦性ぶどう酸に変
え５ることも報告されている。例えばＣ，Ａ、　５８巻
５７５７ｄ（１９６５）、６７６０（１９６５）には、
公けに入手できない種々の細菌を使用して、ラセミ体乳
酸を酸化することが記載されている。しかしこれら菌株
は焦性ぶどう酸の製造には不適当である。なぜならばこ
の場合は目的物質の収率が不満足（２７〜５２％）であ
るばかりでなく、反応に必要な細胞を生産するために、
大量のグルコース、ペプトン及び肉エキスを必要とする
からである。この高価な培地成分は、焦性ぶどう酸の経
済的製造を妨げる。

焦性ぶどう酸の工業的製造はまだ報告されていない。本
発明の課題は、工業的にかつ経済的に実施し５る焦性ぶ
どう酸の製法を開発することであった。本発明者は、高
い空時収量で安価な培地によって、光学的に純粋なり−
（−）−乳酸を定量的に焦性ぶどう酸に変えうる微生物
を見出した。

本発明は、Ｄ　−（−）−乳酸の存在下にノ（クテリウ
ムーアセトバクターｓｐｅｃ．ＡＴＣＣ２１４０９を好
気性条件下で培養することを特徴とする、焦性ぶどう酸
又はその塩の製法である。

Ｄ−（−１−乳酸は、グルコースから既知の方法で容易
に製造できる。

アセトバクターｓｐｅｃ．　ＡＴＣＣ２１４０９は、ア
メリ、自由に入手できる。

本発明の方法を実施するためには、アセトノ（フタ−ａ
ｐｅｃ、　ＡＴＣＣ２１４０９の菌株を、Ｄ　−（→−
乳酸を含有する培養基に接種して培養する。発酵は連続
的に又は非連続的に行われる。

菌株の細胞は直接に基質に作用する。任意の既知の培養
法を利用することができ、通風及び攪拌の可能な深いタ
ンクの形の発酵装置を使用することが好ましい。特に良
好な結果は、液状培養基を使用して得られる。

微生物を培養するための培養基の選択には特に制限はな
いが、経済性を高める意味で安価な成分を使用すること
が好ましい。適当な培養基は、炭素源、窒素源、無機塩
及び場合により少量の微量元素及びビタミン類を含有す
るものである。窒素源としては、無機又は有機の窒素含
有化合物又はこれらを含有する物質が用いられる。その
例はアンモニウム塩、コーンスチーブリカー・ビール酵
母分解物、大豆粉加水分解物、小麦グルテン、酵母エキ
ス、酵母、尿素又はばれいしょ蛋白である。コーンスチ
ープリカーの使用が特に好ましい。炭素源としては、例
えば糖類例えばＤ−グルコース、マンノース又はガラク
トース、ポリアルコール例えばマンニット又はアルコー
ル例えばエタノールが用いられる。

無機塩の例は、カルシウム、マグネ゛シウム、マンガン
、カリウム、亜鉛、銅、鉄その他の金属の塩である。塩
のアニオンとしては、特に燐酸塩イオンが用いられる。

場合により培養基に生長促進因子、例えばパントテン酸
、ｐ−アミノ安息香酸又はチアミンを添加する。

前記栄養素の混合比は、発酵の種類に依存し、個々の場
合について定められる。本発明の方法を実施するためｋ
は、一般に約１〜１００９／４特に約１０〜ｓ　ｏ　ｇ
７ｐのＤ−（−）−乳酸濃度が好適である。

最良の収率を得るために培養条件は次のように定められ
る。培養温度は２４〜３２℃特に２６〜３０℃、ｐＨ価
は５〜８特に６〜８である。

一般に培養期間は４〜４８時間で足りる。この時間内に
最大量の目的生成物が培地中に蓄積される。棲息培地中
の生成した無性ぶどう酸の量を追跡し、その量が最大に
達したときに反応を中止することが好ましい。

通風には留意すべきである。なぜならば反応は、酸素を
よく供給することによって、高速度及び高収率で進行す
るからである。

Ｄ　−（−１−乳酸の必要量は、培養の初めに１回に、
あるいは培養少数回に分けて添加してよい。

基質であるＤ＝−（−）−乳酸は、塩として培養基に添
加される。その例はＤ−（−）−乳酸のナトリウム塩、
カリウム塩、アンモニウム塩又はカルシウム塩であって
、特にカルシウム塩の使用が好ましい。

生成して培地中に析出した無性ぶどう酸は、常法により
定量できる。この目的のためには酵素による検出法が好
ましい。無性ぶどう酸又はその塩は既知方法により分離
され、そして精製される。このためには例えば塩基性イ
オン交換体が適する。発酵液を真空で濃縮し、生成物を
冷時結晶させてもよい。得られた結晶は遠心分離したの
ち乾燥できる。

無性ぶどう酸を仕上げ処理しないで使用するときは、生
成物がさらに反応することを防止するため、使用菌の細
胞を反応混合物中で死滅させるだけで足りる。これは例
えば０．１％ｎ−オクタツールを添加し、４５℃に３０
分間加熱することにより行われる。発酵液から市販の無
菌Ｆ器を用いて菌体を除去してもよい。この発酵液は、
適当な方法例えば冷却により、微生物の汚染から保護さ
れるべきである。

実施例１ 基本培地の製造： 下記成分を含有する固形培養基（培地Ａ）を製造した。

Ｄ−（−）−マンニット　　　　　　　　１０ｇ／−ｅ
硫酸アンモニウム　　　　　　　　　５ｇ／２硫酸マグ
ネシウム７水和物　　　　　０．５９７４３硫酸マンガ
ン１水和物　　　　　　ａ、ａ５１／ノ酵母エキス　　
　　　　　　　　　０．０５ｇ／Ｊペプトン　　　　　
　　　　　　０．０５ｇ／４燐酸二水素カリウム　　　
　　　　１．５　ｇ／１３燐酸水素二カリウム　　　　
　　　　３．６１／−ｅ寒天　　　　　　　　　　　　
　　２０１１／４３水　　　　　　　　　　を加えて１
Ｊとする。

燐酸塩は他の成分と別に殺菌しく１２１℃で２０分）、
冷却したのち添加した。培地のｐＨ価は７であった。

アセトバクターｓｐｅｃ．　ＡＴＣＣ２ｆ４０９の細胞
を１０倍に希釈し、固形培地上に広げた。２８℃で４８
時間培養したのち、対応希釈においてコロニーが認めら
れた。個々・のクローンを採取し、各２０１ｎｔｃ殺菌
１．たエルシンマイヤーフラスコ中）の前培養培地（培
地Ｂ）に接種した。

Ｄ−（−）−マンニット　　　　　　　１０１１／Ｊ酵
母エキス　　　　　　　　　　　　５Ｉ／！硫酸マグネ
シウム７水和物　　　　０．５１／／Ｊ３水　　　　　
　　　　　　　を加えて１−ｅとする。

ｐＨ調整なしで、１２１℃で２０分間殺菌した。

この前培養物の培養は、市販の振とう培養器中で、２８
℃及び２５（ｔｒｐｌで１６時間行った。

生物による変換度を調べるため、下記の培地Ｃ各’１Ｑ
ｒｎｌを殺菌した１００ゴの栓つきエルレンマイヤーフ
ラスコに充填した。

Ｄ−（−１−マンニット　　　　　１ａｇ７ｐコーンス
チープリカ−４０９７１３ Ｄ　−（−）−乳酸（カルシウム塩）　　１０９／４３
槌離酸として）ｐＨ７（５Ｍ−ＮａＯＨを用いて） １２１℃で４０分間殺菌した。

前培養ウキ’ｌ　ｍｌをこの培地に接種し、２８℃及び
２５（ｌｒｐｌで振と５培養した。Ｄ−（−）−乳酸及
び焦性ぶどう酸の濃度を、市販の酵素試験機により測定
した。５時間後に普通は装入したＤ−ラクテートの１０
０％が変化する。焦性ぶどう酸の濃度は少なくともｔｏ
ｌＡである。この変換力のあるコロニーをさらに培養し
、常法により凍結乾燥した。これは以下の実験において
も接種物として役立つ。

実施例２ 振とうフラスコ中の発酵： 培地Ｃの１００ｍ１を、１００Ｉｌｌの栓つき工／ｌｚ
レンマイヤーフラスコに充填し、殺菌した。対照として
、同じ培地にＬ　−（＋）−乳酸１０９／４（ナトリウ
ム塩、酸として計算）を添加した。

両培養物に実施例１と同様に前培養物１０ｍ１を接種し
た。培養は２８℃及び２５０　ｒＩ’ｌで振とう培養器
により行った。６０分の間隔で試料を取り出し、焦性ぶ
どう酸の含量を測定した。その結果は次のとおりであっ
た。

焦性ぶどう酸濃度（ｇ／ｌり： 時　間　　　　Ｄ−ラクテート　　　Ｌ−ラクテート（
時間）　　　　の添加　　　　　　　の添加ｏ、ｏ　　
　　　　　　　ｏ、ｏ　　　　　　　　　　ｏ、。

１．０　　　　　　　　１．２　　　　　　　　　０．
８２．０　　　　　　　　３．０　　　　　　　　　１
．４３．０　　　　　　　　５．７　　　　　　　　　
１．２４．０　　　　　　　１０．２　　　　　　　　
　０．９５．０　　　　　　　１１．４　　　　　　　
　　０．７発酵液を５時間後に分析すると、Ｄ−（−１
−乳酸が完全に変化したことが認められた。これに対し
Ｌ−（＋）−乳酸の場合は、なお完全に存在していた。

この混合物中に生成した焦性ぶどう酸は、コーンスチー
プリカーを添加したＤ−乳酸の酸化に帰因する。このこ
とはＤ−（−）−乳酸を添加した混合物中の焦性ぶどう
酸の濃度が相当高いことも説明している。

実施例３ 発酵装置中の焦性ぶどう酸の生成： １Ｊの発酵用タンクに、カルシウム塩としてのＤ−乳酸
２０９μを含有する培地Ｃの９００ｍ１を装入し、殺菌
した。前培養物としては、アセトバクターｓｐｅｃ．Ａ
ＴＣＣ２１４０９の菌株を培地Ｂ上で１２時間培養した
もの１００＋＋＋ｌ！が用いられた（実施例１参照）。

発酵は２８℃及び０．５ｖｖｍの通気において、１００
０ｒｐｌの攪拌速度で行われた。消泡剤を添加しなかっ
た。９時間後に、焦性ぶどう酸の濃度はｉ　ｑ、　６１
Ａであった（酵素により測定）。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｄ−（−）−乳酸の存在下にバクテリウム・アセトバク
   ターｓｐｅｃ．ＡＴＣＣ２１４０９を好気性条件下で培
   養することを特徴とする、焦性ぶどう酸又はその塩の製
   法。